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Monolayerkulturen von bovinen Chondrozyten:Immunzytochemische Charakterisierung
des Phänotypsim zeitlichen Verlauf der Kultur
Gerhard Dyckhoff
Monolayerkulturen von bovinen Chondrozyten:Immunzytochemische Charakterisierung des Phänotyps
im zeitlichen Verlauf der Kultur
Der Medizinischen Fakultätder Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
vorgelegte Dissertation zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Medizin
von
Gerhard Dyckhoffaus
Aachen
Meinen Eltern
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Knorpelzellkultur
1.1.1 Chondrozyten und hyaliner Knorpel
1.1.2 Das Problem der Entdifferenzierung
1.1.3 Zellkulturmodelle
1.1.4 Klassische histochemische Färbungen
1.2 Immunzytochemie
1.2.1 Grundlagen der Immunzytochemie
1.2.3 Kollagene
1.2.4 S-100-Protein
1.3 Zielsetzung
II
2 Material und Methoden
2.1 Knorpelzellkultur
2.1.1 Bovine Chondrozyten in Monolayerkultur (P0-P6)
2.1.2 Biologische Kontrolle: Bovine Fibroblasten in Monolayerkultur (P0-P2)
2.1.3 In-situ-Kontrolle: Gewebeschnitte
2.1.4 Prä-kulturelle Kontrolle: Ausstriche frisch isolierter Zellen
2.1.5 Zusatzversuche
1.) Perkonfluenzstudie
2.) Trypsinstudie
3.) P0-Metachromasiestudie
2.1.6 Histochemische Referenzfärbungen
2.2 Immunzytochemie
2.2.1 Indirekte-Immunperoxidase-Methode
III
3 Ergebnisse
3.1 Orientierende histochemische Darstellung
3.1.1 Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie
3.1.2 Basophilie und Metachromasie
3.2 Immunzytochemische Charakterisierung
3.2.1 Kollagen-Typ I und II
3.2.2 Kollagen-Typ III und V
3.2.3 S-100, S-100-α, S-100-β
3.3 Fibroblasten als biologische Kontrolle
3.3.1 Histochemische Darstellung
1.) Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie
2.) Basophilie und Metachromasie
3.3.2 Immunzytochemische Charakterisierung
1.) Kollagen Typ I und II
2.) Kollagen Typ III und V
3.) S-100, S-100-α, S-100-β
3.4 Synoptische Darstellung der Ergebnisse
IV
4 Diskussion
4.1 Orientierende histochemische Darstellung
4.1.1 Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie
4.1.2 Basophilie und Metachromasie
4.2 Immunzytochemische Charakterisierung
4.2.1 Kollagen-Typ I und II
4.2.2 Kollagen-Typ III und V
4.2.3 S-100, S-100-α, S-100-β
4.3 Fibroblasten als biologische Kontrolle
4.4 Synoptische Auswertung
5 Zusammenfassung
6 Literaturverzeichnis
7 Danksagung
8 Lebenslauf
1
1 Einleitung
Ziel der experimentellen Pathologie ist es, Ätiologie und Pathogenese von
Krankheiten und Syndromen aufzuklären. Deren Kenntnis ist eine wesentliche
Grundlage, um durch Prävention Krankheiten zu vermeiden oder aber in
Krankheitsabläufe kausal einzugreifen und so eine Heilung zu ermöglichen.
Solche Erfolge stehen bis heute beispielsweise in der Rheumatologie noch aus. So
ist die Therapie etwa der Rheumatoiden Arthritis weitgehend symptomatisch
(Entzündungshemmung mit nicht-steroidalen Antirheumatika oder
Glukokortikosteroiden) oder in der sogenannten Basistherapie (Chloroquin,
Goldsalze, Penicillamin u.a.) überwiegend empirisch begründet (194, 203). Erst
eine kausale Therapie wird eine wirkliche Heilung erlauben.
Ein Ansatz der experimentellen Pathologie ist es, solche Krankheiten im Modell
nachzuvollziehen. So wurden zur Erforschung der Rheumatoiden Arthritis und
anderer Gelenkkrankheiten Zellkulturmodelle von Knorpelzellen eingesetzt.
2
1.1 Knorpelzellkultur
1910 unternahm Alexis Carrel als erster den Versuch, Knorpelgewebe „außerhalb
des Körpers“ zu kultivieren (196). Für Knorpelzellen versuchte A. Fischer 1922
erstmalig eine „Reinkultur“ anzulegen (54) und beobachtete dabei zugleich als erster
eine „Transformation der Zellen“, die in der späteren Geschichte der
Knorpelzellkultur als Entdifferenzierung bezeichnet wurde (s.u.).
Als herausragend sind die Pionierarbeiten von H.B. Fell anzusehen. In
ausführlichen Studien an Organkulturmodellen von Extremitätenknospen von
Hühnerembryonen beschrieb sie 1925 die Chondrogenese, d.h. die embryonale
Entwicklung des Knorpelgewebes, sowie das Knochenwachstum der
Extremitätenknochen (51). Der entscheidende Durchbruch in der Knorpelzellkultur
gelang A. Moscana erst knapp 30 Jahre später: er entdeckte 1952 die Möglichkeit,
lebensfähige Knorpelzellen durch enzymatische Andauung mit Trypsin aus dem sie
umgebenden embryonalen Gewebe herauszulösen (196). Doch aufgrund des hohen
Kollagenfaseranteils in erwachsenem hyalinen Knorpel war diese Methodik nur auf
embryonalen Knorpel anwendbar. Nahezu gleichzeitig setzten hier die beiden
Arbeitsgruppen um Smith und Kawiak den nächsten Meilenstein. 1965 gelang es
ihnen unter zusätzlicher Verwendung von Clostridien-Kollagenase, Chondrozyten
aus ausgewachsenem Knorpelgewebe zu isolieren (97, 196, 197). Darauf basierend
etablierten Manning und Bonner 1967 die erste echte Zellkultur von menschlichen
Gelenkknorpelzellen (137). Von diesem Zeitpunkt an stand der Forschung eine
neuartige Technologie zur Verfügung, die sich in zahlreichen Anwendungen
weltweit bewährt hat.
Zunächst erlaubt die Kultur wie hier z.B. von Knorpelzellen die Erforschung ihres
physiologischen Stoffwechsels. So wurden in großem Umfang die Wirkungen
untersucht von Wachstumsfaktoren (37, 40, 72, 95, 96, 90, 108, 135, 172, 211,
213), Hormonen (70, 76, 149, 195) und Vitaminen (46, 114), wobei meist der
Einfluß auf den Kollagen- bzw. Proteoglykanstoffwechsel und die
Proliferationsrate der Chondrozyten beurteilt wurde. Die Kenntnis des
physiologischen Stoffwechsels auch unter verschiedenen Einflüssen ist
Grundvoraussetzung für das Verstehen jeglicher pathologischer Prozesse (16).
Sodann lassen sich auch Teilschritte komplexer Krankheitsabläufe in vitro
nachvollziehen. Zahlreiche Studien an Zellkulturmodellen haben uns beispielsweise
Einblick verschafft, welche Faktoren bei der Rheumatoiden Arthritis zur
Gelenkzerstörung führen. Einerseits kommt es zu einer direkten enzymatischen
Knorpelzerstörung durch das Pannusgewebe (hyperplastische Synovialmembran
mit lymphoplasmazellulären Infiltraten) sowie durch Granulozyten und
Makrophagen aus der Synovialflüssigkeit (49, 55, 112, 117, 151, 181, 187).
3
Andererseits stehen die Entzündungszellen untereinander durch Botenstoffe
(Zytokine) in Verbindung. Durch diese aktivieren und stimulieren sie sich nicht nur
gegenseitig, sondern regen in gleicher Weise auch die Knorpelzellen an, das von
ihnen selbst gebildete Knorpelgewebe zu zerstören (44, 48, 52, 60, 61, 85, 100,
109, 110, 111, 145, 169, 171, 178, 183). Erst bei Kenntnis dieser
Pathomechanismen kann zielgerichtet in den Krankheitsablauf eingegriffen werden.
Zur Entwicklung kausaler Therapieansätze ist es von ebenso großem Interesse,
nicht nur den Krankheitsablauf zu verstehen, sondern auch die Ursache bzw.
Auslöser der Erkrankung zu erforschen. Hypothesen über die Ätiologie und
Pathogenese lassen sich am Zellkulturmodell prüfen. In verschiedenen Ansätzen hat
man versucht, die Rheumatoide Arthritis im Modell nachzuvollziehen (125, 168,
202, 203, 209).
Die Bedeutung der Zellkultur für die Erforschung von Gelenkkrankheiten, wie sie
sich exemplarisch an der Rheumatoiden Arthritis darstellen läßt, gilt in gleicher
Weise auch für viele weitere Erkrankungen, die den Gelenkknorpel betreffen, auch
wenn nicht alle in gleichem Ausmaß Gegenstand der wissenschaftlichen Forschung
sind: Osteoarthrose (24, 75, 88, 143, 150, 153, 166, 193), Gelenkveränderungen
bei der Vitamin-A-Hypervitaminose (10, 32, 47, 53, 130, 199, 210),
Chondrokalzinose (197), ochronotische Arthropathie (121, 106), Hämophilie-
Arthropathie (105), Gichtarthritis (104) u.a.m. Nicht nur bei degenerativen und
entzündlichen Gelenkerkrankungen spielt die Zellkultur eine große Rolle. Sie dient
ebenso der Erforschung der Molekularpathologie der angeborenen Kollagen-
Stoffwechselkrankheiten wie Ehlers-Danlos-Syndrom Typen I-VIII, Osteogenesis
imperfecta Typen I-IV, Marfan-Syndrom, Cutis laxa, Epidermolysis bullosa und
anderen (28, 31, 56, 113, 177, 184).
Es liegt nahe, auf dem gleichen Wege, wie man die Krankheiten erforscht, auch
deren Therapie zu prüfen. So gibt es unzählige Untersuchungen über die
Wirksamkeit sowie die unerwünschten Wirkungen von Pharmaka wie Gluko-
kortikosteroiden und nicht-steroidalen Antirheumatika (22, 24, 38, 69, 80, 98, 122,
128, 165, 166, 170, 202, 203, 215, u.v.a.), antimikrotubulären Wirkstoffen wie
Colchizin und Vinblastin (50, 89, 127, 152, 206), sogenannten Basistherapeutika
wie D-Penicillamin (86, 158, 177), Chloroquin und Goldsalzen (202, 203) sowie
den Präparationen von Knorpelbestandteilen wie Rumalon und Arteparon (11,
134, 155, 198, 214).
Durch die Verwendung der Zellkulturtechnologie konnte auf eine Großzahl von
Tierversuchen verzichtet werden.
Von ganz besonderer Bedeutung ist die Knorpelzellkultur bei einem völlig anderen
Therapieansatz bei Gelenkknorpelschäden: der Knorpeltransplantation (5, 62, 157,
186).
4
1.1.1 Chondrozyten und hyaliner Knorpel
Von besonderem Interesse bei der Erforschung von Gelenkkrankheiten sind
Kulturmodelle der Zellen von hyalinem Gelenkknorpel. Dabei interessieren nicht
nur menschliche Knorpelzellen, sondern auch Chondrozyten etwa von Kaninchen,
Hühnern oder Rindern. Mit der Anzahl der Kulturmodelle, für die sich ein
Sachverhalt schlüssig nachvollziehen läßt, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, daß
vergleichbare Verhältnisse auch in situ vorliegen.
Hyaliner Knorpel bedeckt die Fläche der Gelenke und ermöglicht so deren
reibungsarme Beweglichkeit und eine optimale Übertragung und Verteilung der
mechanischen Druckkräfte auf den Knochen. Gewährleistet wird die dazu
erforderliche elastische Verformbarkeit bei gleichzeitig enormer Festigkeit durch
eine Extrazellulärmatrix, deren Trockensubstanz im wesentlichen aus Kollagen und
Proteoglykanen besteht (zusammen etwa 95%) (84, 121). Die poly-anionischen
Proteoglykane vermitteln durch ihre außergewöhnlich hohe Wasserbindung die
Elastizität und Tragkraft des Knorpels (8, 91, 166). Ein feines Netzwerk aus
Kollagenfasern ist verantwortlich für die Aufnahme von Scherkräften und vermittelt
so die Verbiegungsbelastbarkeit des Knorpels. Die gesamte Extrazellulärmatrix wird
von den darin verstreut liegenden Chondrozyten gebildet. Dabei liegen die
Knorpelzellen, die jeweils mitotisch aus einer Mutterzelle hervorgegangen sind, in
sogenannten isogenen Gruppen von 2-4 (-8) Chondrozyten in einer Knorpelhöhle.
Umgeben wird die die Höhle abschließende Knorpelkapsel von einem Knorpelhof
mit einem besonders hohen Glykosaminoglykananteil. Knorpelhöhle und
Knorpelhof bilden gemeinsam ein Chondron, welches auch als Territorium
bezeichnet wird. Getrennt werden die Territorien durch Interterritorien aus
Extrazellulärmatrix, die nicht nur von den Chondrozyten gebildet, sondern auch
ständig in einem Fließgleichgewicht zwischen Auf- und Abbau aufrechterhalten
wird (8, 91, 142, 175). Trotz dieser hohen Stoffwechselleistung genügt den
Knorpelzellen ein weitgehend anaerober glykolytischer Stoffwechsel (91, 138, 142,
167). Sie sind auf eine Ernährung durch Diffusion aus der Synovialflüssigkeit und
den Kapillaren der umgebenden Gewebe angewiesen, da der hyaline Gelenkknorpel
selbst physiologischerweise völlig frei von Gefäßen sowie auch von Nerven ist (62,
64, 91, 124, 142, 167, 191, 198).
Das wiederum läßt Chondrozyten als besonders geeignet für die Zellkultur
erscheinen. Eine Ernährung durch Diffusion läßt sich angemessen durch
entsprechendes Nährmedium simulieren. Neben der Linse des Auges ist hyaliner
Knorpel überdies das einzige Gewebe des Körpers, das nur von einer einzigen
Zellart gebildet wird (64, 124, 198). Somit könnte eine Reinkultur von
Knorpelzellen ein adäquates Modell für hyalinen Knorpel darstellen.
5
1.1.2 Das Problem der Entdifferenzierung
Problematisch bei der Knorpelzellkultur ist der bereits in ihren Anfängen
beschriebene Verlust der charakteristischen phänotypischen Eigenschaften der
Chondrozyten, wenn sie in Monolayerkultur gehalten werden.
Der Phänotyp einer Zelle läßt sich definieren als die Gesamtheit ihrer äußeren
Erscheinungsmerkmale und ihrer funktionellen Eigenschaften. Jede Zellart
exprimiert einen für sie charakteristischen Phänotyp.
So ist die typische Knorpelzelle morphologisch
- regelmäßig rund bis polygonal geformt (3, 11, 12, 58, 101, 140, 160,
186, 188),
- größenmäßig zwischen Lymphozyt und Fibroblast beziehungsweise
Endothelzelle einzuordnen (54),
- in situ in einer Höhle gelegen, umgeben von durch sie selbst gebildete
Extrazellulärmatrix, in vitro epithelähnlich pflastersteinartig wachsend, ortsständig
(3, 11, 12, 137, 139, 188, 216),
- durch eine Neigung zur Aneinanderlagerung (Kohäsion) und
entsprechender Zellhaufenbildung gekennzeichnet (3, 64, 118, 160, 186),
- durch ein stark granuläres Zytoplasma charakterisiert, dem elektronen-
mikroskopisch ein Reichtum an rauhem endoplasmatischen Retikulum und ein
ausgeprägter Golgiapparat entsprechen als morphologisches Korrelat einer hohen
biosynthetischen Stoffwechselaktivität (3, 30).
Funktionell charakteristisch ist die Biosynthese von
- Kollagen-Typ II (6, 11,12, 19, 43, 58, 60, 66, 101, 115, 133, 136, 139,
140, 160, 186, 188, 189, 197, 207, 216)
- knorpelspezifischen, besonders hochmolekularen und große Aggretgate
bildenden Proteoglykanen (CS-PG) (11, 12, 46, 59, 79, 129, 131, 133, 136, 139,
207, 208)
- einer typischen Glykosaminoglykan-Zusammensetzung (viel sulfatiertes
Chondroitinsulfat, wenig Hyaluronsäure, nur geringe Anteile an Dermatan- und
Keratansulfat) (46, 101, 129, 139, 188, 189, 208)
- großen Mengen an sulfatierten Glykosaminoglykanen, die zu einer meta-
chromatischen Anfärbung führen (3, 66, 81, 82, 101, 137, 139, 186, 197, 216).
6
Die klassische Definition nach Holtzer (1960) beschreibt nun alterierte oder
entdifferenzierte Knorpelzellen als Abkömmlinge von Chondrozyten, die, obwohl
sie sich unter Kulturbedingungen vermehren, die die Knorpelentstehung erlauben,
kein Chondroitinsulfat synthetisieren (3, 81, 82).
Als entscheidend für die Expression des charakteristischen Phänotyps wurde
anfangs also die Chondroitinsulfatsynthese angesehen. Diese ließ sich durch die
metachromatische Anfärbung mit Toluidinblau oder Methionin nachweisen. Auf
Dauer kamen andere Kriterien hinzu.
Die typische entdifferenzierte Knorpelzelle ist morphologisch gekennzeichnet durch
- eine unregelmäßige abgeflachte, bipolar spindelähnliche Form mit langen
Zytoplasmaausläufern (3, 58, 66, 140, 160, 188)
- Zytoplasmavermehrung mit einer Größenzunahme um etwa das 3-10fache
(3, 82)
- amöboide Beweglichkeit und fischzugartiges Wachstum (3, 96, 140, 160,
188, 189)
- Neigung zur Haftung an Oberflächen (Adhäsion) (64, 82)
- elektronenmikroskopisch drastische Verarmung an rauhem
endoplasmatischem Retikulum und Golgiapparat, jedoch mit einer großen Anzahl an
zytoplasmatischen Filamenten, wie sie für amöboid bewegliche Zellen typisch sind
(3, 82).
Funktionell charakteristisch ist die Biosynthese von
- Kollagen-Typ I an der Stelle von Kollagen-Typ II (6, 19, 43, 58, 60, 66,
133, 140, 160, 188, 189, 197)
- hydrodynamisch kleineren und nicht-aggregierenden Proteoglykanen (46,
115, 129, 131, 133, 139, 208)
- mit geringeren Anteilen an sulfatiertem Chondroitinsulfat und größeren
Anteilen an Hyaluronsäure sowie Keratan- und Dermatansulfat in der Glykosamino-
glykanzusammensetzung (46, 129, 139, 188, 208)
- vor allem aber insgesamt wesentlich geringeren Mengen an Glykosamino-
glykanen (3, 46, 66, 81, 82, 160, 197).
7
Sowohl über die Ursachen der Entdifferenzierung als auch deren Zeitpunkt im
Verlauf der Kultur gehen die Vorstellungen der Autoren weit auseinander. Es
herrscht sogar Uneinigkeit darüber, ob es sich tatsächlich um eine echte
Entdifferenzierung handelt, d.h. um den echten Verlust der Synthesefähigkeit
bestimmter Stoffwechselprodukte (3, 81, 82, Abbott et al.[1966], Shulman et al.
[1968], Prockop et al. [1964] in 198), oder etwa lediglich um eine reversible
Modulation von nahe verwandten Zellen (204, Hall [1970] in 198).
Die Validität eines Zellkulturmodells für hyalinen Knorpel hängt aber davon ab, daß
es sich bei den gezüchteten Zellen wirklich um Chondrozyten handelt, und seine
Reliabilität ist abhängig von der Konstanz der Expression des charakteristischen
Phänotyps. Entsprechend hat man sich bemüht, Zellkulturverfahren zu entwickeln,
die den charakteristischen Phänotyp aufrechterhalten oder sogar wiederherstellen.
8
1.1.3 Zellkulturmodelle
Im Rahmen jeder Versuchsplanung in der Zellkultur sollte an erster Stelle die
Überlegung stehen, welches Modell den entsprechenden Anforderungen am besten
genügt.
Prinzipiell hat man die Wahl zwischen Organkultur, Monolayerkultur und
Suspensionskultur (142, 103). Die Organkultur als Zellkultur im weiteren Sinne
bietet den Vorteil, daß die Zellen in ihre Extrazellulärmatrix eingebettet bleiben.
Selbst die Rezeptoren an der Zelloberfläche werden nicht zerstört. So kann die
wechselseitige Einflußnahme der Zellen untereinander, diejenige mit den
Makromolekülen der Extrazellulärmatrix und die Wechselwirkungen der
Matrixmoleküle untereinander untersucht werden (17, 20, 51, 74, 87, 99, 120,
142, 192). Nachteile sind jedoch lange Diffusionswege, die Komplexität der
Wechselwirkungen sowie die Behinderung durch bereits vorhandene Matrix, die die
Untersuchungen der Synthese und Ablagerung neuer Extrazellulärmatrix nahezu
unmöglich macht.
Für letztgenannte Versuche eignet sich daher besser ein Modell, bei dem die Zellen
komplett aus ihrer Matrix herausgelöst worden sind. In der Literatur werden dafür
die verschiedensten enzymatischen Verfahren beschrieben (Trypsin alleine, nur
ausreichend bei embryonalem Knorpelgewebe [s.o.] [Moscana, 1952, vgl. 102,
196]; Trypsin in Kombination mit Kollagenase sukzessiv [97] oder simultan [39]mit Einwirkzeiten von 10 bis 40 Minuten; ausschließlich Kollagenase, jedoch mit
Einwirkzeiten bis zu 18 Stunden [137, 71] und schließlich sequentielle Enzym-
andauung mit Hyaluronidase, Trypsin oder Pronase und Kollagenase [18, 35 64,
116]). Die Zellen können nach der Befreiung aus ihrer Zwischenzellsubstanz in
Kulturflaschen ausgesät werden, wo sie an der Unterlage anhaften (Adhärenz),
sich ausbreiten (Spreading) und im Verlauf der Kultur eine einfache Zellage
(Monolayer) bilden. Man spricht daher auch von einer Monolayerkultur
(Anwendungsbeispiele: 2, 18, 36, 58, 64, 71, 73, 95, 115, 116, 123, 126, 132,
137, 142, 190, 200, 208). Vorteile dieser Methode: die Zelldichte ist beliebig
variierbar; der Einfluß definierter Substanzen auf den Stoffwechsel und die
Zelldifferenzierung läßt sich gut beurteilen; auch bei kleinsten Zellproben, z.B. zur
Bestimmung von Gendefekten, ist dieses Verfahren anwendbar; die Zellen zeigen
eine ausgeprägte mitotische Aktivität, so daß sich in relativ kurzer Zeit große
Zellmengen gewinnen lassen; die Technik dieser Zellkulturform ist vergleichsweise
leicht praktikabel. Ein großer Nachteil der Monolayerkultur ist jedoch, daß es im
zeitlichen Verlauf der Kultur zu der obengenannten Entdifferenzierung kommt.
9
In zahlreichen Ansätzen hat man versucht dieser Entwicklung entgegenzuwirken.
Den meisten von ihnen ist gemeinsam, daß man anstrebt, die rundliche Form der
Chondrozyten aufrechtzuerhalten, indem man ihre Anheftung an Oberflächen und
das darauf folgende Spreading verhindert. Dazu hält man die Zellen entweder durch
einen Rührmechanismus in Suspension (bewegte Suspensionskultur) (12, 83,
115, 116, 142, 156, 160, 163, 204) oder man bringt sie in einer hoch-
viskösen Flüssigkeit (z.B. Methylzellulose-Lösung) oder in einem Gel (weiches
Agar [83], Agarose [7, 17, 26, 42, 142, 207], Kollagengele [58, 101, 142, 216])in einen unbewegten Schwebezustand (stationäre Suspensionskultur). Vorteile:
neu gebildete Matrixbestandteile können nicht wegdiffundieren, so daß Schritt für
Schritt eine Matrix abgelagert wird, die derjenigen in vivo sehr ähnlich ist; Erhalt
des differenzierten Phänotyps; Möglichkeit der Untersuchung der Matrixsynthese
unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Nachteile: nur geringe
Zellproliferation, technisch wesentlich aufwendiger als die Monolayerkultur.
Technisch am einfachsten anzuwenden und das wohl am meisten verwandte
Verfahren ist die Monolayerkultur.
Zur Bestimmung der Validität sowie der Reliabilität bedarf jedoch gerade dieses
Zellkulturmodell exakt definierter Parameter, die die phänotypische Expression im
Verlauf der Kultur kontrollieren.
10
1.1.4 Klassische histochemische Färbungen
Zur Charakterisierung des Phänotyps von Zellen bieten sich bei der vorliegenden
Fragestellung - wie unter 1.2 weiter ausgeführt - besonders immunzytochemische
Färbemethoden an. Diese weisen zwar das Vorhandensein und ggfs. die
Lokalisation bestimmter Antigene nach. Doch kommt das Zytoskelett hier meist
nicht befriedigend kontrastreich zur Darstellung. Aus diesem Grunde bietet es sich
an, für alle Präparate zum Vergleich auch histochemische Färbungen
durchzuführen.
Besonders kontrastreich sind sogenannte Mehrfachfärbungen. Sie werden deshalb
auch als Kontrastfärbungen bezeichnet. Ein Beispiel dafür und wohl die
bekannteste Färbung überhaupt ist die Färbung mit Hämatoxylin-Eosin (HE). Dabei
färbt das basische Hämatoxylin alle selbst sauren und daher basophilen Zell- und
Gewebestrukturen blau und umgekehrt das saure Eosin alle basischen und damit
azidophilen Anteile rot. Hämatoxylin wird häufig auch als Gemisch mit
Natriumjodat und Kaliumalaun verwandt und wird dann als Hämalaun bezeichnet.
Die Azan- (Azokarmin-Anilin-Orange-) Färbung nach dem Tübinger Anatom Martin
Heidenhain (1864-1949) macht sich die Erfahrung zunutze, daß sich
Bindegewebsfasern nach Beizung mittels Phosphorwolframsäure mit Anilinblau
besonders intensiv blau darstellen lassen (91). Als weitere typische
Bindegewebsfärbung sei die nach Ladewig genannt.
Gerade für hyalinen Knorpel aber bieten sich spezielle basische Farbstoffe an, die
sich durch eine besondere Eigenschaft auszeichnen: sie färben Strukturen mit einer
sehr hohen Dichte negativer Ladungen in einem anderen Farbton als dem der
angebotenen Farblösung (Metachromasie). So färbt z.B. Toluidinblau solche
Substanzen rot-violett, während es orthochromatische Strukturen blau färbt (173).
Hier ist auch die Färbung nach dem Hamburger Chemiker und Bakteriologen
Gustav Giemsa (1867-1948) einzuordnen. Es ist eine Kontrastfärbung, bei der
basophile Strukturen durch Methylenblau blau und azidophile durch Eosin rot
gefärbt werden. Durch langes Stehen bildet sich in alkalischen
Methylenblaulösungen Azur, ein Farbstoff der Thioninreihe, der Metachromasie
bewirkt. Dieses Azur ist in der Lösung nach Giemsa enthalten und färbt
metachromatische Strukturen leuchtend blau-violett. Sowohl Thionin selbst (81),
Methylenblau (51) als auch sehr häufig Toluidinblau (3, 34, 58, 64, 65, 71, 101,
137, 186, 206, 207, 216) werden wegen ihrer Metachromasie in der Literatur zur
Darstellung der charakteristischen metachromatischen Knorpelmatrix eingesetzt.
Die Giemsa-Färbung bietet diesen Färbungen gegenüber den Vorteil, daß sie die
Vorzüge der Kontrastfärbung mit denen der Metachromasie vereinigt und kann
daher als optimale Referenzfärbung für unsere immunzytochemischen
Untersuchungen an hyalinem Knorpel und Chondrozyten angesehen werden.
11
Ursache für die metachromatische Anfärbbarkeit der Extrazellulärmatrix des
Glasknorpels ist der besonders große Reichtum an Chondroitinsulfat bei den
Glykosaminoglykanen der Proteoglykane. Zum besseren Verständnis sei kurz der
Aufbau der Proteoglykane angerissen, die immerhin neben dem Kollagen den
Hauptbestandteil der Trockensubstanz der Knorpelmatrix ausmachen (etwa
40-45%) (91).
Proteoglykane können definiert werden als Proteine mit kovalent daran
gebundenen sulfatierten Kohlenhydraten, den Glykosaminoglykanen (182). Diese
Zuckerketten, die wie die Borsten einer Flaschenbürste an dem Rückgrat aus Eiweiß
gebunden sind, stellen sich dar als unverzweigte Kettenmoleküle aus 50-100 sich
wiederholenden Disaccharideinheiten. Diese wiederum bestehen jeweils aus einem
N-acetylierten oder N-sulfatierten Aminozucker (daher ihr Name) und einer
Uronsäure bzw. Galaktose (29).
Es werden vier Hauptgruppen von Glykosaminoglykanen unterschieden:
1.) Heparin und Heparansulfat, 2.) Chondroitinsulfat (in den unterschiedlich
sulfatierten Formen C-4-S, C-6-S und C-4-6-S) und Dermatansulfat,
3.) Keratansulfat und 4.) Hyaluronsäure, die als einzige in freier Form, d.h. nicht
an Protein gebunden und unsulfatiert auftritt (29, 182).
An einem Kernprotein (Molekulargewicht: 11-220 000 Dalton) können ein bis
100 Glykosaminoglykanseitenketten gebunden sein (182). An den besonders
großen Proteoglykanen des hyalinen Knorpels wurden sogar bis zu
150 Chondroitinsulfatketten (zu je 1-2 x 104 Dalton), 50 Keratansulfatketten (zu je
5 x 103 Dalton) und zusätzlich etwa 100 N- oder O-glykosidisch gebundene
Oligosaccharide beschrieben (33, 174). Insgesamt ergibt sich so pro
Proteoglykanmonomer ein Molekulargewicht von etwa 2,5 Millionen Dalton. Diese
Monomere aggregieren nun noch zusätzlich mit Hyaluronsäure, und zwar bis zu 100
Proteoglykanmonomere pro Hyaluronsäuremolekül. Eine Stabilisierung der
bindenden Wechselwirkungen erfolgt durch sogenannte Verbindungsproteine (33).
Es wird deutlich, daß die Proteoglykane des Knorpels letztlich riesige Aggregate
bilden, die für sich genommen ein Gel mit einer hohen Dichte fixer negativer
Ladungen darstellen. Über diese treten die Proteoglykane in Form von Ionen-
bindungen mit anderen Makromolekülen, insbesondere den Kollagenen, in
Wechselwirkung. Je stärker sulfatiert und je länger die einzelne Glykosamino-
glykankette ist und je dichter die Ketten wiederum am Proteinrückgrat arrangiert
sind, umso größer ist die Bindungsstärke (182).
12
Eine besonders hohe Bindungsstärke zeichnet die knorpelspezifischen
Chondroitinsulfatproteoglykane des hyalinen Knorpels aus. In freier Lösung
nähmen diese Proteoglykane das fünffache Volumen von dem ein, was sie
tatsächlich in dem dreidimensionalen Netzwerk aus Kollagenfasern
zusammengedrängt einnehmen können (79). So verleiht letztlich das
Kollagenfasernetzwerk dem hyalinen Knorpel seine Festigkeit. Durch ihren hohen
Kohlenhydratanteil und die hohe Ladungsdichte bedingen die Proteoglykane die
enorm hohe Wasserbindungskapazitiät der Extrazellulärmatrix. Diese ist
verantwortlich für die federnde Druckelastizität des hyalinen Knorpels.
Die hohe Dichte negativer Ladungen, insbesondere der reichlich sulfatierten
Chondroitinsulfatseitenketten der knorpelspezifischen Proteoglykane (CS-PG),
verursacht bei der klassischen histochemischen Färbung nach Giemsa die
Metachromasie und bei denjenigen mit Hämalaun eine ausgeprägte Basophilie. In
dieser Arbeit sollen sie als Referenzfärbemethoden zur Anwendung kommen.
Die eigentliche phänotypische Charakterisierung der Chondrozyten erfolgt durch
immunzytochemische Färbungen mit monospezifischen Antikörpern gegen
Kollagene und ein spezielles Glykoprotein.
13
1.2 Immunzytochemie
Der Phänotyp einer Zelle ist definiert als Gesamtheit ihrer äußeren
Erscheinungsmerkmale und ihrer funktionellen Eigenschaften (vgl. 1.1.2).
Grundsätzlich ergeben sich daher zwei Ansätze zur Bestimmung des Phänotyps:
1.) Untersuchung und Beschreibung der äußeren Erscheinungsform
2.) Bestimmung von Stoffwechselleistungen etwa durch die qualitative und
quantitative Analyse der Stoffwechselprodukte.
Der morphologische Ansatz bietet keine ausreichende Spezifität. Die
Unterscheidung etwa zwischen differenzierten polygonalen und entdifferenzierten
fibroblastenartigen Knorpelzellen ist nicht eindeutig. Es werden Übergangsformen
beschrieben (34). Werden dagegen vom funktionellen Ansatz her die
Stoffwechselprodukte einer gesamten Zellkultur bestimmt - seien es diejenigen, die
in das Kulturmedium abgegeben, oder diejenigen, die in der Zell-Matrix-Lage
abgelagert werden -, so ist eine Zuordnung der Syntheseprodukte zu den einzelnen
Zellen nicht mehr möglich (vgl. 45). Insbesondere bei Mischkulturen aus noch
differenzierten und schon entdifferenzierten Zellen ist somit eine eindeutige
Bestimmung des Differenzierungsgrades der einzelnen Zelle anhand der
Stoffwechselprodukte nicht möglich.
In dieser Situation bietet die Immunzytochemie als Bindeglied zwischen Morphe
und Funktion enorme Vorteile. Die gewünschten Stoffwechselprodukte lassen sich
als Antigene durch spezifische Antikörper auf der jeweiligen Zelle oder in ihrer
Umgebung nachweisen. Somit wird eine topographische Zuordnung der
Syntheseprodukte zu den einzelnen Zellen möglich. Es läßt sich z.B. darstellen,
inwiefern eine Zelle, die ihrer Form nach bereits entdifferenziert ist, von ihrer
Funktion her noch den differenzierten Phänotyp zeigt (136, 140)
Die Immunzytochemie als Bindeglied zwischen morphologischem und
funktionellem Ansatz könnte also die Spezifität bei der Bestimmung des
Differenzierungsgrades einer Zellpopulation sowie der Einzelzelle entscheidend
erhöhen.
14
1.2.1 Grundlagen der Immunzytochemie
In der Immunzytochemie gibt es verschiedene Techniken, mit Hilfe von
Antikörpern entsprechende Epitope in einem Präparat sichtbar zu machen. Dazu
wird ein chromogener Komplex entweder direkt an den Erstantikörper gebunden
(z.B. direkte-Peroxidase-Methode) oder aber über einen oder mehrere
Brückenantikörper (z.B. indirekte-Peroxidase-Methode, Peroxidase-
Antiperoxidase-Methode). Der chromogene Komplex selbst kann z.B. ein
radioaktives Isotop, ein fluoreszierender Farbstoff oder - wie in den genannten
Methoden - ein Enzym sein, das dann ein entsprechendes chromogenes Substrat
umsetzt (180).
Die Immunzytochemie, bzw. - entsprechend auf Gewebe angewandt - die
Immunhistochemie, hat inzwischen einen unbestrittenen Stellenwert in der
experimentellen wie aber auch in der diagnostischen Pathologie gewonnen. So kann
sie z.B. Hinweise auf den Ursprung von Metastasen geben, deren Primarius (noch)
nicht bekannt ist, kann Hormonrezeptoren nachweisen oder der Klassifikation von
Lymphomen dienen.
In der vorliegenden Arbeit soll die Immunzytochemie die phänotypische Expression
von Chondrozyten im Verlauf der Kultur kontrollieren. Sie soll damit anzeigen,
inwieweit und ab wann die Validität und Reliabilität des Zellkulturmodells nicht
mehr in ausreichendem Maße gegeben ist. Entscheidend ist hierbei die Wahl solcher
Syntheseprodukte als Antigene, die den charakteristischen Phänotyp von hyalinen
Knorpelzellen repräsentativ beschreiben.
Chondrozyten synthetisieren physiologischerweise vor allem zwei große Klassen
von Matrixbestandteilen: Proteoglykane und Kollagene. Als knorpelspezifisch wird
klassischerweise ein außergewöhnlich großes komplexebildendes Proteoglykan
angesehen, das sogenannte CS-PG (cartilage-specific proteoglycan) (vgl. 1.1.2).
Es wurden monospezifische Antikörper gegen seinen Proteinanteil hergestellt und
zur Charakterisierung von Knorpelzellen angewandt (12, 101, 136, 139).
Herkömmlicherweise wurden die Knorpelproteoglykane bzw.
-glykosaminoglykane durch die metachromatische Anfärbbarkeit mit Toluidinblau
(65, 71, 137, 206), Methylenblau (51), Thionin (81), Safranin O (64) und anderen
Farbstoffen nachgewiesen. Immunzytochemische Färbemethoden wurden jedoch
als vergleichsweise spezifischer angesehen (1).
Unter den Kollagenen haben bisher Antikörper gegen die Typen I und II eine
herausragende Rolle gespielt: Anti-Kollagen-Typ II sollte hyalinen Knorpel
spezifisch nachweisen, Anti-Kollagen-Typ I reagierte typischerweise mit fibro-
blastenartig veränderten Chondrozyten sowie mit Fibroblasten selbst (vgl. 1.1.2).
15
In der vorliegenden Arbeit kommt eine Kombination von klassischerweise
verwendeten mit bisher im Zusammenhang mit der phänotypischen
Charakterisierung noch nie benutzten Antikörpern zur Anwendung.
16
1.2.3 Kollagene
Unter Kollagenen versteht man extrazelluläre Strukturproteine, deren funktionelle
Eigenschaften wesentlich von einer Tripelhelixdomäne abhängen (28, vgl. auch 144,
176). Bisher sind 14 verschiedene Kollagentypen (als Typen I-XIV bekannt)
in unterschiedlichem Ausmaß beschrieben und charakterisiert worden. Die fünf
„klassischen“ Kollagenmoleküle bestehen aus drei spiralförmigen Polypeptid-
ketten, bezeichnet als α-Ketten, die miteinander wiederum spiralförmig in Form
einer Tripelsuperhelix verwunden sind. Durch Aneinanderlagerung der Moleküle
entstehen Faserstrukturen, die charakterisiert sind durch eine gegenseitige
Versetzung der Moleküle um ein Viertel ihrer Länge („quarter-stagger“). Dies
erscheint elektronenmikroskopisch als Querstreifung (28, 121, 144, 158, 176,
177). Kollagene mit dieser typischen Viertelstaffelung sind die Typen I, II, III, V
und XI. Sie werden von verschiedenen Autoren zu den Kollagenen der Gruppe I
zusammengefaßt (28, 147). Ihnen gemeinsam ist ein Molekulargewicht von
mindestens 95.000 Dalton und insbesondere eine etwa 300 nm lange
ununterbrochene helikale Domäne. Die Helixstruktur entsteht durch eine
charakteristische Aminosäurenfolge, bei der jede erste einer Dreiergruppe ein
Glycinrest ist. Man spricht von Gly-X-Y-Tripletts. Dabei sind 30% von X und Y
durch Prolin und Hydroxyprolin besetzt. Nur die Tatsache dieser jeweils von
Glycin angeführten Dreierfolge von Aminosäuren erlaubt, daß sich die drei links-
drehenden Polypeptidspiralen der α-Ketten zu einer rechts-drehenden Superhelix
umeinanderwinden in der Art, daß jeweils ein Glycinrest in der Mitte der Spirale
liegt, während die sterisch eher hindernden X- und Y-Reste nach außen weisen
(176). Die Regelmäßigkeit der Anordnung bedingt die hohe Stabilität der
Tripelhelixkonformation und damit die hohe Reißfestigkeit der Kollagenfasern.
Die α-Ketten der Gruppe-I-Kollagene sind zwar nicht identisch, jedoch bezüglich
ihrer Länge und Ladungsverteilung derart gleichartig aufgebaut, daß die einzelnen
Kollagenfasern aus verschiedenen Kollagentypen aufgebaut sein können. So
bestehen Cornea-Bindegewebsfasern aus den Kollagentypen I und V und die der
Haut aus den Typen I, III und V. Durch Veränderung der Zusammensetzungs-
verhältnisse variieren die Fasereigenschaften, so daß die Fasern je nach Gewebeart
und dem jeweiligen ontogenetischen Entwicklungsstand des Gewebes den
unterschiedlichen Erfordernissen optimal angepaßt sind (28, 176).
17
Die übrigen Kollagene werden von den verschiedenen Autoren je nach
zugrundeliegenden Kriterien unterschiedlich eingeteilt. Nach Miller und Gay sind in
der Gruppe II solche Kollagene zusammengefaßt, die zwar ein Molekulargewicht
von mindestens 95.000 Dalton haben, jedoch aus mehreren deutlich voneinander
getrennten helikalen Bereichen bestehen: Kollagen-Typen IV, VI, VII und VIII.
Van der Rest und Garrone fassen mehr von der Funktion ausgehend die Typen IV
und VIII (möglicherweise auch Typ X) als lagenbildende Kollagene zusammen
(Typ IV→ Basalmembran, Typ VIII → Descemet-Membran der Cornea). Typ VI
hingegen bildet perlschnurartige Filamente und Typ VIII ist an der Bildung von
Verankerungsfasern im Bereich des Übergangs von der Basalmembran zum
subepithelialen Stroma beteiligt.
Die kurzkettigen Gruppe-III-Kollagene (Molekulargewicht < 95 000) (Miller und
Gay, 147) entsprechen funktionell etwa den „Fasern-assoziierten Kollagenen mit
unterbrochenen Tripelhelices“ („ FACITs“) nach Olsen: IX, XII und XIV (161,
176).
Dem Kollagen-Typ X kommt eine Sonderstellung zu: Es ist ein
knorpelspezifisches, relativ niedermolekulares Kollagen, das vorwiegend in der
Zone des hypertrophischen Knorpels im Bereich der Wachstumsfuge gebildet wird.
Dies legt eine Bedeutung bei der Umwandlung von Knorpel in Knochen nahe (25,
57, 58, 107, 119, 147, 163, 176).
Das von Endothelzellen gebildete Kollagen-Typ-XIII ist in seiner Struktur und
Funktion noch nicht ausreichend aufgeklärt (176). Insbesondere unter den relativ
niedermolekularen Kollagenen ist die Beschreibung weiterer Typen zu erwarten
(147).
Die verschiedenen Kollagentypen sind bezüglich der Charakterisierung des
Phänotyps von Chondrozyten deshalb von besonderem Interesse, weil bestimmte
Kollagentypen fast ausschließlich in hyalinem Knorpel vorkommen. Miller und
Matukas beschrieben 1969 als erste ein nur in Knorpel vorkommendes Kollagen,
das in der Folge als Kollagen-Typ II bezeichnet wurde (155). Anfangs war man der
Überzeugung, daß hyaliner Knorpel als Kollagen nur den Typ II enthalte, bzw.
umgekehrt, daß Kollagen-Typ II nur in hyalinem Knorpel zu finden sei (43, 56,
115, 139, 140, 160, 188, 189). Daher wird Kollagen-Typ II klassischerweise als
„Knorpelkollagen“ bezeichnet (140, 147). Später jedoch wurden weitere
knorpelspezifische Kollagene beschrieben (die sogenannten niedermolekularen
Knorpelkollagene Typen IX, X und XI). Außerdem zeigte sich, daß in der frühen
mesenchymalen Knorpelentwicklung von Chondrozyten auch Kollagen-Typ I
gebildet wird. Umgekehrt fand man auch z.B. im primitiven Achsenskelett oder im
Cornealepithel von Hühnerembryonen Kollagen-Typ II (136, 139, 147, 155). Im
18
ausgewachsenen Gewebe scheint es aber eine deutliche Zweiteilung zu geben. Es
gibt Kollagentypen, die hauptsächlich, wenn nicht ausschließlich im hyalinen
Gelenkknorpel (oder knorpelähnlichem Gewebe wie dem Nucleus pulposus der
Bandscheibe oder dem Corpus vitreum des Auges) vorkommen: Kollagen-
Typen II, IX, X und XI. Dabei lassen sich interessante Homologien feststellen: Mit
Ausnahme des Kollagen-Typs X hat jedes der „Knorpelkollagene“ eine
Entsprechung im Nicht-Knorpelgewebe. Funktionell und mengenmäßig
entsprechen die Kollagen-Typen I und III des Nicht-Knorpelgewebes dem
Kollagen-Typ II des Knorpels, das ebenfalls fasernbildende Kollagen-Typ XI des
Knorpels dem Kollagen-Typ V des Nicht-Knorpelgewebes.
Die Annahme, daß es auch für das fasernassoziierte Kollagen mit unterbrochener
Tripelhelix Typ IX des Knorpels eine Entsprechung im Nicht-Knorpelgewebe
geben müsse, führte Gordon, Gerecke und Olson 1987 zur Entdeckung des
Kollagens Typ XII, dem später ein homologes, aber nicht identisches Typ XIV
folgte (176). Es lassen sich daher nach Gruppen geordnet folgende sich in Funktion
und mengenmäßigem Gewebeanteil entsprechende Kollagene gegenüberstellen:
Knorpel Nicht-
Knorpelgewebe
Gruppe I
(quergestreifte Kollagene
mit einem Molekular-
gewicht von mindestens
95.000 Dalton)
Kollagen Typ II
Kollagen Typ XI
Kollagen Typen I u. III
Kollagen Typ V
Gruppe III
(fasernassoziierte
Kollagene mit unter-
brochenen Helices, MG
kleiner als 95.000 D)
Kollagen Typ IX Kollagen Typen
XII u. XIV
Tab. 1
Gegenüberstellung der Kollagenverteilung in Knorpel und Nicht-Knorpelgewebe
19
Für die Kollagentypen der Gruppe II (aus mehreren deutlich getrennten helikalen
Bereichen, Molekulargewicht von mindestens 95.000 D) mit ihren speziellen
Aufgaben in komplexeren Gewebeverbänden (Kollagentypen IV und VIII sowie VI
und VII [s.o.]) sind im hyalinen Knorpel keine Entsprechungen beschrieben
worden.
Es existiert also offensichtlich eine Zweiteilung in quasi für hyalinen Knorpel
spezifische auf der einen und normalerweise im Knorpel nicht vorkommende
Kollagentypen auf der anderen Seite. Dies legt einen Einsatz von Antikörpern gegen
diese Kollagentypen nahe, wenn es um die Charakterisierung des Phänotyps von
Chondrozyten im Verlauf der Kultur gehen soll, bei der eine Entdifferenzierung zu
fibroblastenartigen Zellen zu erwarten ist.
Einschränkend für die Praxis ist dabei zu bemerken, daß bisher nur Antikörper
gegen die Kollagentypen I-V frei im Handel erhältlich sind. Will man daher auf eine
laborchemisch sehr aufwendige eigene Antikörperproduktion verzichten, so wird
man aus obiger Gegenüberstellung nur die Kollagentypen I, II, III und V wählen.
Dies stellt insofern eine Erweiterung der klassischen Marker für Knorpel- und
Nicht-Knorpelgewebe dar, als bisher zu deren Unterscheidung praktisch nur
Antikörper gegen die Kollagentypen I und II verwandt wurden.
Ein weiterer neuer Ansatz in diesem Zusammenhang ist der Einsatz von
Antikörpern gegen ein erst vor relativ kurzer Zeit weitergehend untersuchtes
Glykoprotein bzw. seine Untereinheiten: das S-100-Protein.
20
1.2.4 S-100-Protein
Das S-100-Protein ist ein von B.W. Moore 1969 erstbeschriebenes saures Protein
mit einer Molmasse von 21-24.000 Dalton (68, 201). Funktionell gehört es zu einer
Familie aus Calcium-bindenden Proteinen wie Troponin C, Calmodulin und der
leichten Kette von Myosin (68). Ursprünglich hatte man das Molekül als spezifisch
für Gliazellen und davon abstammende Tumoren angesehen (67). Später entdeckten
es verschiedene Arbeitsgruppen in den unterschiedlichsten Geweben auch nicht-
ektodermalen Ursprungs (67, 68, 92, 93, 94, 102, 159, 201). In Chondrozyten
wurde das S-100-Protein erstmalig 1982 von der Arbeitsgruppe um Stefansson
beschrieben, als sie eigentlich das fetale Nervensystem auf dieses Molekül hin
untersuchen wollte (201). Das Protein existiert mindestens in drei unterschiedlichen
Formen, nämlich S-100-a0, S-100-a und S-100-b, die jeweils als Dimere aus
folgenden Untereinheiten bestehen: αα, αβ und ββ.
Karabela-Bouropoulou beobachtete 1988 einen interessanten Zusammenhang
zwischen der Zusammensetzung der Knorpelgrundsubstanz in Abhängigkeit von
ihrem Entwicklungsstadium (embryonal, jung, erwachsen, hyperplastisch sowie
auch neoplastisch) und der Immunreaktivität für S-100: solange nur wenig
Grundsubstanz bzw. hauptsächlich Hyaluronsäure gebildet wird, sind die
Chondrozyten negativ für das S-100-Protein. Mit zunehmender Differenzierung und
entsprechend vermehrter Ablagerung von Chondroitinsulfat und Kollagen-Typ II
zeigen die Zellen intrazytoplasmatisch eine stark positive Immunreaktivität für
S-100. Er spekuliert über einen zellulären Kontrollmechanismus, bei dem das
S-100-Protein an der Regulation der Glykosaminoglykan-Kollagen-
Wechselwirkungen beteiligt ist (92). Es wäre daher interessant zu prüfen, ob sich
das S-100-Protein bzw. seine α- und β-Untereinheiten als Marker für den
phänotypisch charakteristischen Chondrozyten eignen.
21
1.3 Zielsetzung
Das gebräuchlichste Zellkulturmodell zur Erforschung pathogenetischer
Zusammenhänge in der experimentellen Pathologie ist die Monolayerkultur. Die
Aussagekraft einer solchen Zellkultur ist insbesondere abhängig von der Konstanz
der Expression des charakteristischen Phänotyps der zu untersuchenden Zellen. Es
ist daher erforderlich, Verfahren zu entwickeln, die dieses Gütekriterium eines
Zellkulturmodells suffizient kontrollieren.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die phänotypische Expression von bovinen
Chondrozyten in der Monolayerkultur in ihrem zeitlichen Verlauf mittels
immunzytochemischer Marker zu charakterisieren.
Zur Anwendung kommen dabei Antikörper gegen Kollagen-Typ II als das für
hyalinen Knorpel charakteristische fasernbildende Kollagen sowie entsprechend als
charakteristisch für Nicht-Knorpelgewebe Antikörper gegen die Kollagentypen I,
III und V. Als neuer Ansatz kommen zusätzlich Antikörper gegen das
S-100-Protein und seine α-und β-Untereinheiten zum Einsatz.
22
2 Material und Methoden
2.1 Zellkultur
2.1.1 Bovine Chondrozyten in Monolayerkultur (P0-P6)
Aus je einem Metacarpophalangealgelenk von sechs adulten Rindern werden in
nachfolgend beschriebener Technik sechs getrennte Monolayerkulturen angelegt
und parallel bis zur sechsten Passage (P6) fortgeführt.
Um eine bzw. drei Wochen versetzt werden erneut Kulturen von jeweils vier
weiteren Individuen angesetzt. Dadurch ist es später möglich, auf ein und
demselben Objektträger getrennt kultivierte Chondrozytenpopulationen
verschiedener Passagen gleichzeitig histochemisch und immunzytochemisch
aufzuarbeiten.
Vorversuche ergaben eine positive Korrelation zwischen der Weite des Umfangs über dem
Gelenkspalt des Metacarpophalangealgelenks und der Ausbeute an Knorpel gemessen in der
Zellzahl bei der ersten Passage. Männliche Individuen weisen durchweg größere Umfangsweiten
mit entsprechend dickeren Gelenkknorpelschichten und höheren Zellausbeuten auf. Bezogen auf
die Weite des Umfangs über dem Gelenkspalt ist die Zellausbeute jedoch bei männlichen und
weiblichen Individuen nicht signifikant verschieden. Auch morphologisch und
proliferationskinetisch waren keine geschlechtsspezifischen Unterschiede festzustellen. Ebenfalls
ohne Einfluß auf die Zellausbeute sowie das Zellverhalten, insbesondere die Lebensfähigkeit in
Kultur, waren das Alter (im Bereich zwischen 1 und 7 Jahren) sowie die Art der Rinder. Für die
Versuchsreihen wurde jeweils ein Vorderfuß einer entsprechenden Anzahl von nacheinander
geschlachteten Rindern ausgewählt. Bei dem nach diesem Zufallsprinzip ausgewählten Individuen
handelte es sich um insgesamt 25 weibliche Rinder, davon 15 rot-weiß und 10 schwarz-weiß
gescheckt, im Alter zwischen 3 und 5 Jahren (vom Schlachtmeister anhand der Anzahl X der
bleibenden Zähne bestimmt: X/2 + 2 = Lebensalter).
Bei der Präparation der Metacarpophalangealgelenke wurde darauf geachtet, pathologisch
veränderte Gelenke als Quelle für die Knorpelentnahme auszuschließen. Erschien die
Gelenkflüssigkeit trüb oder die Gelenkoberfläche ulzerös verändert, so wurde das Gelenk
verworfen. Bei Vorversuchen waren die Knorpelzellen in solchen Fällen in Kultur wesentlich
schlechter angegangen.
Unter Aussparung von jeglichem Nicht-Knorpelgewebe werden unter aseptischen
Kautelen Knorpelscheiben aus dem Metacarpophalangealgelenk gewonnen.
23
Eine relativ hohe Infektionsrate bei fehlerhafter Gewinnung der Knorpelproben zur Etablierung
einer Knorpelzellkultur aus Rinderfüßen legt eine ausführlichere Beschreibung der Vorgehensweise
nahe.
Der möglichst frische, in der Höhe des oberen Sprunggelenks resezierte Rinderfuß wird zunächst
unter fließendem, handwarmen Wasser mit einer Bürste gründlich gesäubert. Mit einem Skalpell
wird nun die Haut auf der ventralen Seite von proximal nach distal durchtrennt. Dieser Schnitt wird
um den Huf herum T-förmig fortgesetzt. Dann wird die Haut in seitlicher Richtung mobilisiert,
nach dorsal umgeschlagen und schließlich hufwärts abgezogen. Dabei sollte die nun freigelegte
Faszienschicht nicht mit der behaarten Seite der Haut in Berührung kommen. Der gehäutete Fuß
wird aufrechtgestellt und mit 70%igem Alkohol desinfiziert. Von nun an wird nur noch unter
sterilen Kautelen gearbeitet, d.h. auf sterilen OP-Tüchern, mit sterilen Handschuhen, Skalpellen,
Pinzetten und Transportgefäßen sowie mit Mundschutz. Es wird als nächstes ein zirkulärer Schnitt
5 cm unterhalb des Metacarpophalangealgelenkspaltes gelegt, wobei die Faszie und die unmittelbar
daruntergelegenen Bänder bzw. Sehnen durchtrennt werden. Diese Gewebsschicht wird mobilisiert
und ohne Berührung der darunterliegenden Gelenkkapselmembran bis auf 5 cm oberhalb des
Gelenkspalts nach proximal umgeschlagen. Vor der nun erfolgenden Eröffnung der Gelenkkapsel
werden die bisher gebrauchten Handschuhe, Skalpelle und Pinzette gegen neue sterile
ausgewechselt. Die freigelegte Kapselmembran wird 0,5 cm distal der soeben entstandenen
Umschlagfalte semizirkulär inzidiert und nach distal über den Gelenkspalt geschlagen. Um die
Kapsel vollends zu eröffnen, wird auf beiden Kondylenseitenflächen in einem Abstand von 2 mm
parallel zur Gelenkoberfläche ein Schnitt gelegt, der der Krümmung der Gelenkflächen folgt. Dabei
werden die Kollateralbänder durchtrennt. Um schließlich das Gelenk aufzuklappen, wird als letzte
eine zentral im Gelenk verlaufende Sehne ohne Berührung der Gelenkflächen durchschnitten. Der
derart aufgeklappte Rinderfuß wird in einen Ständer mit Schraubzwingen fixiert und bis auf die
Gelenkflächen mit einem sterilen Tuch bedeckt. Sodann werden die Gelenkflächen mit sterilen
Kompressen von der viskösen Synovialflüssigkeit befreit, damit sich die Knorpelstückchen
anschließend besser von der Pinzette lösen. Denn nun wird der Knorpel wie aus Abb. 1 auf Seite 23
ersichtlich in kleinen Scheiben mit einem neuen sterilen Skalpell von der Gelenkoberfläche
abgetragen. Dabei wird peinlich genau darauf geachtet, den Schnitt nicht so tief zu legen, daß Teile
der an die subchondrale Schicht angrenzende kalzifizierten Knorpelschicht mitentfernt werden.
Einerseits spürt man an dem vermehrten Widerstand, daß der Schnitt zu tief liegt, andererseits weist
die entsprechende Knorpelscheibe eine im Gegensatz zur gewöhnlich glänzenden opaleszierenden
Glasknorpelschnittfläche in solchem Fall eine matte weißliche Stelle auf und wird daher verworfen.
Desweiteren wird peinlich genau vermieden, den Knorpel aus dem Bereich in der Nähe des
Übergangs in die Synovialmembranschicht zu gewinnen. Die Knorpelscheiben werden pro
Rinderfuß separat in ein steriles Zentrifugenröhrchen mit Transportpuffer gegeben und innerhalb
der nächsten 60 Minuten weiterverarbeitet.
24
Abb. 1
Gewinnung von hyalinem Knorpel
aus dem steril eröffneten Metacarpophalangealgelenk von Rindern
25
In einer Laminar-flow-Einrichtung erfolgen nun alle weiteren Arbeitsschritte unter
sterilen Kautelen. Die Knorpelscheiben werden quantitativ in eine Petrischale
überführt. Nach Absaugen des HEPES-Transportpuffers wird mehrmals mit
HEPES-Gebrauchspuffer gespült, um Verunreinigungen durch Synoviozyten und
andere Nicht-Knorpelzellen weitestgehend auszuschließen. Da die Knorpelscheiben
bei bovinem Knorpel lediglich eine Stärke von 0,5 bis maximal 1,2 mm
aufweisen, wird auf eine weitergehende mechanische Zerkleinerung verzichtet. Der
Gebrauchspuffer wird möglichst vollständig abgesaugt. Anschließend werden die
Knorpelstückchen mit 4 ml 0,2%iger Kollagenaselösung bei 37 °C inkubiert. Es
wird darauf geachtet, daß alle Knorpelscheiben vollständig mit Kollagenaselösung
bedeckt sind. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird die Kollagenase-
Knorpelzellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt und mit 30 ml
Kulturmedium verdünnt. Nach Erstellung einer homogenen Suspension durch
wiederholtes Spülen durch eine englumige Pipette wird diese bei 1200 U.p.M. für
10 Minuten zentrifugiert. Nach möglichst vollständigem Dekantieren des
Überstandes wird das Sediment mit 35 ml Nährlösung resuspendiert und erneut in
gleicher Weise zentrifugiert. Nach dem nun folgenden Dekantieren wird der
Bodensatz mit 12 ml Kulturmedium resuspendiert. Das Kulturmedium wird jeweils
mit 1 µg Insulin und 50 µg Ascorbinsäure pro ml Medium angereichert. Aus der
homogenen Einzelzellsuspension werden 0,1 ml zur Zellzahlbestimmung mittels
Neubauerkammer abgezweigt. Die übrige Zellsuspension wird quantitativ in eine
T75-Gewebekulturflasche überführt. Die Inkubation erfolgt in einem Brutschrank
bei 37 °C und einer CO2-Sättigung von 5 %. Alle 48 Stunden wird das alte
Kulturmedium abgesaugt und durch 12 ml frisches Nährmedium ersetzt. Das
Zellwachstum sowie insbesondere der Konfluenzgrad werden jeweils im
Durchlichtmikroskop kontrolliert.
Sobald die Zellen den Boden der Kulturflasche flächendeckend ausfüllen,
bezeichnet man die Kultur als konfluent. Sie ist damit reif zur Zellpassage. Das
Kulturmedium wird möglichst vollständig abgesaugt. Anschließend werden die am
Kulturflaschenboden adhärenten Zellen mit 4 ml 0,25%iger Trypsinlösung
inkubiert. Unter dem Durchlichtmikroskop wird der Ablösungsvorgang der Zellen
beobachtet. Sobald sich die Chondrozyten abgerundet haben und die ersten bei
leichtem Schwenken der Kulturflasche zu schwimmen beginnen (nach etwa
4-minütiger Inkubation) werden die noch adhärenten Zellen mechanisch durch
Schlagen der Kulturflasche gegen die Handinnenfläche abgelöst. Dies verkürzt die
erforderliche Inkubationszeit. Die enzymatische Aktivität des Trypsin wird
unmittelbar danach durch den Zusatz von 20 ml Nährmedium abgestoppt.
26
(Das Serum in dem Medium enthält physiologischerweise aktive
Proteinaseinhibitoren). Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen
überführt und nach Erstellen einer Einzelzellsuspension bei 1000 U.p.M. für
10 Minuten zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes werden die Zellen mit
12 ml Nährsuspension resuspendiert. Aus der Einzelzellsuspension werden
0,1 ml entnommen, um nach Zusatz von 0,2 ml 1%iger Trypanblau-Lösung und
erneutem Durchmischen die Zellzahl mittels Neubauerkammer zu bestimmen sowie
die Lebensfähigkeit nach dem sog. „dye-exclusion-test“ („Farbstoff-Ausschluß-
Test“: lebende Zellen nehmen gewisse Farbstoffe wie Trypanblau nicht auf,
während sich bei toten und geschädigten Zellen sowohl das Zytoplasma als auch der
Kern anfärben, vgl. 7, 61, 62, 64, 186, 216 u.a.). Durch Hinzufügen einer
entsprechenden Menge von Nährmedium wird nun eine Einzelzellsuspension mit
einer definierten Zellkonzentration von 1,25 x 105 / ml erstellt.
In Vorversuchen wurde die optimale Aussaatdichte ermittelt. Getestet wurden Zellkonzentrationen
zwischen 1 x 104 und 2,5 x 105. Als Maß für die Proliferationskapazität der Chondrozyten wurde
jeweils der Proliferationsquotient Q ermittelt. Q entspricht dem Verhältnis der Zellzahl nach
einwöchiger Zellkultur zu derjenigen bei Zellaussaat. Bei höheren Konzentrationen, z.B. 2,5 x 105
Zellen/ml lag der Proliferationsquotient zwischen 1 und 2. Bei Konzentrationen kleiner als 5 x 104
war sogar eine Abnahme der absoluten Zellzahl zu beobachten: Q<1. Die optimale
Zellkonzentration für eine Primärkultur von 7tägiger Dauer lag bei 1,25 x 105 Chondrozyten pro
Milliliter Medium: Q=2,88, d.h. es kam innerhalb einer Woche Monolayerzellkultur nahezu zu
einer Verdreifachung der Zellzahl. Ursächlich für die geringere Teilungsrate bei höheren
Zellkonzentrationen dürfte die Tatsache sein, daß Chondrozyten in Monolayerkultur sich offenbar
beim Erreichen der Konfluenz deutlich weniger teilen; denn bei einer Konzentration von 2,5 x 105
erreichten die Zellen bereits nach 3 Tagen das Konfluenzstadium.
Von dieser Einzelzellsuspension wird ein definiertes Volumen nach Maßgabe der
jeweiligen Bodenfläche in eine neue Kulturflasche sowie zur späteren
zytochemischen Aufarbeitung in Objektträger-Zellkulturkammern überführt. Es
folgt die erneute Inkubation in oben beschriebenem Brutschrank.
27
2.1.2 Biologische Kontrolle:
Bovine Fibroblasten in Monolayerkultur (P0-P2)
Bei der Präparation der Rinderfüße zur Knorpelentnahme werden Proben einer
Sehne als Beispiel für straffes Bindegewebe sowie Proben von lockerem
Bindegewebe unterhalb der inneren Faszienschicht entnommen. Die Gewebeproben
werden in Petrischalen für 48 Stunden in einem Gemisch aus gleichen Teilen einer
jeweils 0,2%igen Kollagenase-I- bzw. -II-Lösung inkubiert. Anschließend wird
nach Zusatz von 10 ml Kulturmedium das nicht enzymatisch aufgelöste
Restgewebe entfernt. Die zurückbleibende Zellsuspension wird in ein
Zentrifugenröhrchen überführt und mit Kulturmedium auf 35 ml aufgefüllt. Das
restliche Verfahren entspricht der Isolierung der Chondrozyten mit den
Unterschieden, daß die zweifache Zentrifugation nur bei 1000 U.p.M. für
10 Minuten erfolgt und als Nährmedium das Fibroblasten-Kulturmedium verwandt
wird. Derart aus straffen und lockerem Bindegewebe von drei unterschiedlichen
Individuen gewonnene Fibroblasten werden als biologische Kontrolle in der
Primärkultur P0 sowie in den beiden ersten Subkulturen P1 und P2 in gleicher Weise
wie die Chondrozyten histochemisch und immunzytochemisch aufgearbeitet.
2.1.3 In-situ-Kotrolle: Gewebeschnitte
Aus frisch gewonnenen Knorpelscheiben sowie aus Gewebeproben von einer
Sehne bzw. von lockerem Bindegewebe - wie in 2.1.2 beschrieben - werden
Gefrierschnitte erstellt und auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gebracht.
Die Beschichtung erfolgt zum Schutz vor dem Abschwimmen der Schnitte bei der
nachfolgenden histochemischen und immunzytochemischen Aufarbeitung.
2.1.4 Prä-kulturelle Kontrolle: Ausstriche frisch isolierter Zellen
Wie unter 2.1.1 beschrieben wird eine Einzelzellsuspension aus frisch isolierten
Chondrozyten hergestellt. Als einzige Modifikation beträgt die Inkubationszeit in
Kollagenase einmal 24 Stunden wie im regulären Versuchsprotokoll und in einem
Zusatzversuch 42 Stunden. Die Zellsuspension wird bei 1200 U.p.M. für
10 Minuten zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Sediment auf mit
Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern ausgestrichen. Die nachfolgende
Aufarbeitung erfolgt wieder wie unter 2.2 beschrieben.
28
2.1.5 Zusatzversuche
1.) Perkonfluenz-Studie
Die Chondrozyten erreichen normalerweise nach einer Woche das Stadium der
Konfluenz und werden dann passagiert (vgl. 2.1.1). Davon abweichend wird eine
gesonderte Kultur von der 2. Passage an nicht mehr passagiert, sondern unter
regelmäßigem Medienwechsel für 3 Wochen weitergeführt. Die Einzelzell- und
Zellverbandsmorphologie werden regelmäßig unter dem Phasenkontrastmikroskop
kontrolliert.
2.) Trypsin-Studie
Bei einer Passage werden die Zellen normalerweise nach Maßgabe der
mikroskopischen Kontrolle durch ein etwa vierminütiges Einwirken von Trypsin
von ihrer Unterlage abgelöst (vgl. 2.1.1). Davon abweichend wird bei fünf
gesonderten Zellpopulationen in der ersten Passage die Inkubationszeit mit 1, 2, 3, 4
bzw. 6 Minuten vorgegeben. Die nach dieser Einwirkzeit abgelösten Zellen
werden in fünf getrennten Zellkulturkammern auf einem Objektträger ausgesät und
in der üblichen Weise histochemisch und immunzytochemisch aufgearbeitet.
3.) P0-Metachromasie-Studie
Frisch isolierte Chondrozyten werden in acht Objektträger-Zellkulturkammern
ausgesät. In der Primärkultur, d.h. in den ersten acht Tagen der Zellkultur noch vor
der regulären ersten Passage, werden vom zweiten Tag an täglich die Zellen eines
Objektträgers fixiert. So ergibt sich am Ende eine Folge von sieben Präparaten mit
einer jeweiligen Kulturdauer von ein bis sieben Tagen. Die Zellen des verbleibenden
achten Objektträgers werden nach der Fixierung vier Stunden in Hyaluronidase
präinkubiert. Die Färbung erfolgt jeweils nach Giemsa.
29
2.1.6 Histochemische Referenzfärbungen
Zur orientierenden Beurteilung des Wachstumsverhaltens, zur kontrastreicheren
Darstellung der Zellform und zur Prüfung des metachromatischen Färbeverhaltens
werden ergänzend folgende histochemischen Färbemethoden in z.T. modifizierter
Form durchgeführt:
a.) Giemsa
b.) Hämalaun-Eosin
c.) Azan
d.) Ladewig
Die Vorbehandlung und Fixierung erfolgte wie bei den immunzytochemischen
Präparaten.
Die für die Färbungen verwendeten Lösungen wurden von der Firma Merck,
Darmstadt, bezogen.
Färbeprotokolle
a.) Metachromatische Färbung nach Giemsa
1.) Spülen in Leitungswasser 3 x 5 Min.
2.) Färben mit Giemsa-Lösung 5 % in Aqua bidest. 15 Min.
(immer frisch ansetzen!)
3.) Entbläuen in Aqua bidest. mit Essigsäure (4 Tropfen auf 50 ml)
(unter mikroskopischer Kontrolle)
4.) Differenzierung in Alkohol 96 %
(ggfs. mehrmaliger Wechsel zwischen 3.) und 4.) zur Verbesserung der
Differenzierung; jedoch nicht zu häufig, da das Präparat dann verblaßt)
5.) Abstoppen mit Isopropanol 1
6.) Isopropanol 2 2 x 5 Min.
7.) Eintauchen in Xylol 2 x 1 Sek.
8.) Eindeckeln mit Vitro-Clud
30
b.) Hämalaun-Eosin (modifiziert)
1.) Spülen in Leitungswasser 5 Min.
2.) Färben mit Hämalaun 10 Min.
3.) Bläuen in Leitungswasser 15 Min.
4.) Gegenfärben mit Eosin 6 Min.
5.) Aufsteigende Alkoholreihe je 5 Sek.
6.) Eindeckeln mit Vitro-Clud
c.) Azan-Färbung
1.) Spülen in Leitungswasser 5 Min.
2.) Färbung mit Azokarmin 10 Min.
(im Wärmeschrank bei 56 °C)
3.) Spülen in Leitungswasser 3 Sek.
4.) Eintauchen in Anilinalkohol 1 Sek.
5.) Eintauchen in Essig-sauren Alkohol 1 Sek.
6.) Beizen in Phosphorwolframsäure 1 Min.
7.) Spülen in Leitungswasser 5 Sek.
8.) Anilinblauorange 8 Min.
9.) Spülen in Leitungswasser 5 Sek.
10.) Aufsteigende Alkoholreihe (70 %, 96 %, 1. 100%) je 3 Sek.
2. 100 % 1 Min.
Xylol 5 Min.
11.) Eindeckeln mit Vitro- Clud
d.) Ladewig Bindegewebsfärbung (modifiziert)
1.) Vorfärbung mit Weigert A + B 8 Min.
2.) Spülen mit Aqua dest. 5 Sek.
3.) Phosphorwolframsäure 5 % 5 Min.
4.) Spülen mit Aqua dest. 5 Sek.
5.) Ladewig 90 Sek.
6.) Bläuen in Leitungswasser 10 Min.
7.) Spülen mit Aqua dest. 5 Sek.
8.) Aufsteigende Alkoholreihe je 3 Sek.
9.) Eindeckeln mit Vitro-Clud
31
Verwendete Produkte:
- Kulturflaschen T25 bzw. T75 sowie Petrischalen: FALCON, Becton
Dickinson, Heidelberg, Deutschland
- Lab-Tek tissue culture chambers: NUNC, Wiesbaden-Bibrich, Deutschland
- HEPES Buffer ( 1molar, pH 7,3): GIBCO/BRL GmbH, Eggenstein,
Deutschlank 043-05630
- Dulbeco´s PBS: GIBCO (s.o.) 041-4190-M
- Insulin: SIGMA, I 1882
- L(+)-Ascorbinsäure, kristallin, reinst: MERCK, Darmstadt, Deutschland
- L-Glutamin ( 200 mM): GIBCO ( s.o.), 043-5030
- Foetales Kälberserum, steril: BOEHRINGER, Mannheim, Deutschland,
0210471
- Penicillin-Streptomycin-Lösung: GIBCO (s.o.) 043-5140H
(10.000 U/ml Penicillin, 10.000 µg/ml Streptomycin)
- Fungizone: GIBCO (s.o.) 043-5290 F
- Collagenase Type I bzw. II ( from clostridium histolyticum):
WORTHINGTON biochemical corporation
- Trypsin Type III, salt free: SIGMA (s.o.), T 8253
- Trypanblau-Lösung 0,5 % in NaCl-Lösung: BOEHRINGER (s.o.) 295833
- Poly-L-Lysin-Lösung: SIGMA (s.o.)
- EDTA-Pulver: SIGMA (s.o.)
32
Verwendete Lösungen
1.) HEPES-Puffer
a.) HEPES-Stammlösung (10fache Konzentration)
40 g NaCl + 1,5 g KCl +11,9 g HEPES + 10,0 g Glucose
bei Zimmertemperatur in etwa 450 ml Aqua bidest. auflösen
mit 4 N NaOH auf pH = 7,55 einstellen
mit Aqua bidest. auf 500 ml auffüllen, filtrieren
b.) HEPES-Fertiglösung (= Gebrauchslösung) (1fache Konzentration)
55,6 ml HEPES-Stammlösung + 500 ml steriles Aqua dest.
c.) HEPES-Transportpuffer
55,6 ml HEPES-Stammlösung + 500 ml steriles Aqua dest.
+ 4 ml Fungizone + 4 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung
2.) Chondrozyten-Kulturmedium
450 ml Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM)
+ 50 ml fetales Kälberserum (FKS)
+ 4 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung
3.) Fibroblasten-Kulturmedium
450 ml DMEM
+ 4 ml L-Glutamin
+ 50 ml FKS
+ 4 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung
33
4.) Kollagenase-Lösung 0,2 %
1.) 0,2 g Kollagenase I (bzw. II) abwiegen
2.) mit 90 ml HEPES-Gebrauchslösung (kalt) 5-10 Minuten rühren
3.) zentrifugieren (6000 U.p.M. für 30 Minuten)
4.) pH-Wert auf pH = 7,55 einstellen
5.) mit HEPES-Puffer auf 100 ml auffüllen
6.) steril filtrieren
7.) in Portionen abfüllen und bei -20 °C lagern
5.) Trypsin-EDTA-Fertiglösung
(Konzentrationen: Trypsin 0,25 %, EDTA 0,25 %)
1.) 0,5 g Trypsinpulver + 0,5 g EDTA-Pulver abwiegen
2.) EDTA mit 190 ml PBS auflösen (kurz in Ultraschallbad stellen!)
3.) pH auf 7,55 einstellen
4.) erst wenn die Lösung klar ist und der pH-Wert stabil bleibt,
Becherglas ins Ultraschallbad stellen und das Trypsinpulver einstreuen
5.) nach völliger Auflösung des Trypsin (etwa nach 15 Minuten)
pH-Wert auf pH = 7,55 einstellen
6.) Trypsin-EDTA-Lösung mit PBS auf 200 ml auffüllen
7.) steril filtrieren
8.) portionieren
34
2.2 Immunzytochemie
2.2.1 Indirekte-Peroxidase-Methode
Als immunzytochemisches Färbeverfahren kommt die Indirekte-Peroxidase-
Methode (modifiziert nach Nakane und Pierce; 1966 [154]) nach folgendem Rezept
zur Anwendung:
1.) 3 x spülen in PBS je 5 Min.
2.) Kontrolle K1 in PBS bis 13.) beiseite stellen
3.) Hemmung der endogenen Peroxidase durch
Inkubation in 1 % H2O2 in Methanol 20 Min.
4.) 3 x spülen in PBS je 5 Min.
5.) Kontrolle K2 in PBS bis 10.) beiseite stellen
6.) Inkubation mit Normalserum der Spezies des sek. Ak. 15 Min.
7.) 3 x spülen in PBS je 5 Min
8.) Inkubation mit dem primären Antikörper (bei 37 °C) 30 Min.
9.) unter fließendem PBS spülen, dann 3 x spülen in PBS je 5 Min.
10.) K2 wieder einfügen
11.) Inkubation mit dem sekundären Antikörper (bei 37 °C) 45 Min.
12.) unter fließendem PBS spülen, dann 3 x spülen in PBS je 5 Min.
13.) K1 wieder einfügen
14.) DAB-Entwicklung: - 40 mg DAB in 100 ml DAB-Gebrauchspuffer lösen
- lichtgeschützt rühren lassen 10 Min.
- filtrieren
- 30µ(!)l H2O2 zugeben
- kurz rühren lassen 15 Sek.
- sofort inkubieren 3 Min.
15.) in fließendem Leitungswasser wässern 15 Min.
16.) gegenfärben mit Hämalaun 2 Sek.
17.) gut in Leitungswasser spülen
18.) in Leitungswasser bläuen lassen 10-15 Min.
19.) Alkoholreihe aufsteigen
(Alk. 70 %, Alk. 96 %, 2 x Alk. 100 %, Xylol 100 %) je 5 Min.
20.) Eindeckeln mit Vitroclud
35
Als primäre Antikörper werden gegen die Kollagentypen I, II, III und V jeweils
Ziegen-Antikörper in einer Verdünnung von 1:50 in Tween-PBS verwendet. Als
primäre Antikörper gegen das S-100-Protein werden Kaninchen-Antikörper in einer
Verdünnung von 1:100 bzw. bei den Untereinheiten α und β von 1:50 eingesetzt.
Sekundäre Antikörper sind bei den Kollagenen Kaninchen-Antikörper gegen
Ziegen-Immunglobuline und bei S-100 bzw. seinen Untereinheiten Schweine-
Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobuline. Die Verdünnung beträgt bei den
sekundären Antikörpern jeweils 1:40.
Die Austestung der optimalen Antikörper-Konzentrationen erfolgte in einer Reihe
von Vorversuchen.
Die Fixierung mit Methanol/Ethanol (1:1) erwies sich gegenüber Formalin 4 % und
dem Kunststoff-Fixationsspray Merckofix überlegen (schonende Fixierung).
Zur Demaskierung der Kollagen-Fasern erfolgt bei der Hälfte der mit Kollagen-
Antikörpern zu färbenden Präparaten eine zusätzliche Präinkubation mit 0,2 %iger
Hyaluronidase-Lösung für 4 Stunden bei 37 ° C. Diese Form der Demaskierung
hatte sich in einer Reihe von Vorversuchen gegen eine Vorbehandlung mit Trypsin
sowie Hyaluronidase bei anderen Inkubationszeiten durchgesetzt.
Das chromogene Substrat Diaminobenzidin (DAB) ist äußerst kanzerogen und mit
entsprechender Vorsicht zu handhaben und zu entsorgen. Mit Gebrauchspuffer
angesetzt ist es maximal 30 Minuten verwendbar.
Hämalaun benötigt zum Bläuen die Mineralien des Leitungswassers. Darum kein
destilliertes Wasser verwenden!
36
Verwendete Produkte:
1.) Immunglobuline
- goat-anti-type-I-collagen, 1310-01, ATLANTA, Heidelberg, Deutschland
- goat-anti-type-II-collagen,1320-01, ATLANTA, (s.o.)
- goat-anti-type-III-collagen, 1330-01, ATLANTA, (s.o.)
- goat-anti-type-V-collagen, 1350-01, ATLANTA, (s.o.)
- rabbit-immunoglobulins-to-S-100-protein, DAKOPATS
- peroxidase-conjugated-rabbit-immunoglobulins-to-goat-immunoglobulins,
DAKOPATS
- peroxidase-conjugated-swine-immunoglobulins-to-rabbit-immunoglobulins,
DAKOPATS
Die Kaninchen-Antikörper gegen die α- bzw. β-Untereinheit des S-100-Proteins
wurden uns freundlicherweise von Dr. K. Kato, Department of Biochemistry,
Institute for Developmental Research, Aichi, Japan, zur Verfügung gestellt.
2.) Normalseren
- normal swine serum, X 901, DAKOPATTS
- normal rabbit serum, X 902, DAKOPATTS
3.) Verschiedenes
- Äthanol, Methanol, Xylol: Apotheke, Klinikum, RWTH Aachen
- Hyaluronidase from bovine testes, 5000 U/mg, 25116 SERVA
- H2O2 30 %: MERCK
- Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB): SIGMA
- Bovines Serumalbumin (BSA): AUREON
- Triton-x-100 und Tween 20 (Detergentien): MERCK
- Vitro Clud: LANGENBRINCK
37
Verwendete Lösungen
1.) PBS (phosphate buffered saline; Phosphatpuffer)
- 40 g NaCl + 5,7 g NaH2PO4 + 1,0 g KH2PO4 + 1,0 g KCl
- mit Aqua bidest. auf 4,5 l auffüllen
- bis zur völligen Auflösung rühren lassen
- pH mit 1 M HCl auf pH = 7,6 einstellen
- mit Aqua bidest. auf 5 l auffüllen
- filtrieren
2.) Tween-PBS-Lösung
- 2 g BSA in 200 ml PBS lösen
- 200 µl Triton-X-100 und 200 µl Tween 20 zusetzen
- rühren lassen
3.) DAB-Gebrauchslösung
(0.05 M Tris/HCl-Puffer, pH = 7,6)
- 25 ml Stammlösung I (24,2 g Tris + A. bidest auf 1l [0,2 M] )+ 19,6ml Stammlösung II (0,2 n HCl)
- mit A. dest. auf ca. 95 ml auffüllen
- pH = 7,6 mit 0,2 n HCl (= Stammlösung II) einstellen
- mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen
38
3 Ergebnisse
3.1 Orientierende histochemische Darstellung
3.1.1 Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie
Die meisten der als Monolayer kultivierten Chondrozyten sind zwar nach acht
Stunden bereits am Boden der Kulturflasche adhärent, viele von ihnen behalten aber
ihre abgerundete Gestalt während der ersten beiden Tage in der Primärkultur noch
bei. Erst am dritten Tag zeigt sich bei einem Großteil der Knorpelzellen eine
ausgeprägte Abflachung und Ausbreitung der Zellen (Spreading). Die
Chondrozyten nehmen eine für sie charakteristische polygonale Form an. In der
Präkonfluenz - bevor sich die Zellen flächendeckend zu berühren beginnen - hat das
Spreading sein größtes Ausmaß erreicht. Bis zur ausgeprägten Konfluenz, bei der
die Kultur reif zur Passage ist, rücken die Zellen dichter zusammen, behalten dabei
aber ihre vieleckige bis leicht abgerundete Form bei, so daß sich insgesamt das
typische Bild eines Kopfsteinpflasters ergibt. Diese Zellverbandsmorphologie setzt
sich in den ersten Subkulturen unverändert fort. Erst in den späteren Passagen
deutet sich ein fischzugartiges Wachstumsverhalten an. Ausgeprägte fischzugartige
Formationen aus langgestreckten Zellen, die teilweise sogar in Wirbel übergehen,
zeigen sich dagegen nur in der Perkonfluenzstudie, d.h. wenn die Knorpelzellen
über die normale Konfluenz hinaus ohne Passage über Wochen kultiviert werden
(vgl. 2.1.5). Bei den regelmäßig bei Erreichen der Konfluenz passagierten Zellen
kann eine derart deutliche Änderung der Zellverbandsmorphologie nicht beobachtet
werden.
Die Einzelzellmorphologie zeigt bereits zu einem wesentlich früheren Stadium
Veränderungen. Beim Erreichen der Konfluenz erscheinen die Chondrozyten zwar
auch in den späteren Subkulturen im wesentlichen wieder in ihrer polygonalen
Form. Jedoch schon nach der ersten Passage dauert es nicht mehr wie bei der
Primärkultur zwei Tage, bis die Knorpelzellen sich am Boden der Kulturflasche
ausbreiten. Ein deutliches Spreading ist bei vielen Zellen schon nach wenigen
Stunden zu beobachten. Zudem zeigen sich schmale Zytoplasmafortsätze, deren
Ausmaß ein Vielfaches des Durchmessers des eigentlichen Zelleibes erreichen kann.
Die Knorpelzellen nehmen z.T. ein bizarres, unregelmäßig sternförmiges Aussehen
an, z.T. mit einer deutlich bipolaren Ausrichtung. Diese Formunterschiede zu den
Chondrozyten in der Primärkultur sind jedoch nur in der Präkonfluenz zu
beobachten, wenn die Zelldichte noch sehr gering ist. Beim Erreichen der
Konfluenz sind - wie oben beschrieben - kaum noch Unterschiede zur Primärkultur
festzustellen.
39
3.1.2 Basophilie und Metachromasie
Im Gefrierschnitt von nativem hyalinen Knorpel fällt insbesondere im Bereich der
Chondrone eine intensive bläulich-violette metachromatische Anfärbung bei der
Färbung nach Giemsa auf (s. Abb.2 a). Bei den Färbungen, bei denen Hämalaun
verwendet wird, zeigt sich in den gleichen Arealen eine starke Basophilie. Nach
vierstündiger Präinkubation mit Hyaluronidase imponiert die Knorpelgrundsubstanz
nur noch blaß rosa. Die Chondrozyten sind teilweise aus ihren Höhlen
herausgelöst. Der um die isogenen Gruppen herum gelegene Knorpelhof ist als
solcher nicht mehr erkennbar (s. Abb. 2 b)
Abb. 2 a u. b
Gefrierschnitte von nativem hyalinem Knorpel, links vor rechts nach vierstündiger
Inkubation in Hyaluronidase. Die besonders kräftige metachromatische Anfärbung
im Bereich der Territorien verschwindet praktisch vollständig.
40
Dasselbe Färbeverhalten wie beim nativen unbehandelten Knorpel jedoch in
schwächerer Form, findet sich im Ausstrich frisch isolierter Knorpelzellen.
Insbesondere nach der längeren Inkubationszeit von 42 Stunden ist vermehrt ein
schmaler, schwach metachromatisch bzw. basophil gefärbter Saum zu sehen.
In den Präparaten der Primärkultur fällt schon bei der Betrachtung mit dem bloßen
Auge eine deutliche Blaufärbung auf, die in sämtlichen Subkulturen nicht
nachweisbar ist. Besonders eindrücklich stellt sich dieses Phänomen an den
Präparaten dar, bei denen Zellen einer Primärkultur gemeinsam mit denen einer
ersten und dritten Passage in einzelnen Kulturkammern aber auf demselben
Objektträger gehalten wurden. Etwa bei der immunzytochemischen Färbung mit
Immunglobulinen gegen Kollagen Typ I stellen sich bei einem solchen Präparat
makroskopisch zwei bräunlich gefärbte Rechtecke für die erste und dritte Subkultur
dar entsprechend ihrer positiven Immunreaktivität für Kollagen Typ I sowie ein
bläulich gefärbtes Rechteck für die Primärkultur. Mikroskopisch entspricht diese
Blaufärbung einer intensiven Basophilie der perizellulär abgelagerten Matrix. Sie ist
sowohl bei der Färbung mit Hämalaun-Eosin als auch bei der Gegenfärbung mit
Hämalaun bei den immunzytochemischen Färbungen zu beobachten.
Bei der Färbung nach Giemsa stellt sich ebenfalls ausschließlich in der Primär-,
nicht aber in den Subkulturen, eine deutliche bläulich-violette metachromatische
Verfärbung der Extrazellulärsubstanz dar, während das Zytoplasma der
Chondrozyten zart rosa gefärbt ist. Wie oben erwähnt konnte schon in dem
Zellausstrich frisch isolierter boviner Chondrozyten vereinzelt ein kleiner, schwach
bläulich-violetter Hof um die Zellen herum beobachtet werden. Ursprünglich mit
der Fragestellung, ob es sich hier um Reste der nativen Knorpelmatrix handelt oder
um von den isolierten Chondrozyten neu gebildete Zwischenzellsubstanz, wurde die
unter 2.1.5 beschriebene P0-Metachromasie-Studie als Zusatzversuch durchgeführt.
Schon mit dem bloßen Auge läßt sich an den sieben Präparaten eine von Tag zu Tag
zunehmende metachromatische Färbung feststellen. Mikroskopisch sieht man
zunächst ganz spärliche metachromatisch angefäbte extrazelluläre
Matrixablagerungen. Vom ersten bis zum letzten Tag der Primärkultur nimmt die
Menge der abgelagerten Extrazellulärsubstanz und die Intensität der
metachromatischen Färbung stark zu (s. Abb. 3 a-e, S. 41). Nach der ersten
Passage ist bis auf einen bläulich violetten Hauch in der ersten Subkultur keine
Metachromasie mehr nachweisbar. Werden die Präparate der Primärkultur vor der
Giemsafärbung vier Stunden in Hyaluronidase präinkubiert, so zeigt sich lediglich
eine zarte Rosafärbung. Es fehlt jegliche Metachromasie.
41
Abb. 3 a-e
P0-Metachromasie-Studie: in den nach Giemsa gefärbten Präparaten zeigen die
Chondrozyten eine von Tag zu Tag zunhemende Ablagerung einer stark
metachromatischen Extrazellulärsubstanz (von oben nach unten Tage 1, 2, 4, 5 u.6)
42
3.2 Immunzytochemische Charakterisierung
3.2.1 Kollagen-Typ I und II
Gefrierschnitte von nativem hyalinen Knorpel stellen sich in der
immunzytochemischen Färbung mit Antikörpern gegen Kollagen-Typ I negativ dar
(s. Abb. 4 a). Sowohl vor wie nach einer vierstündigen Inkubation mit
Hyaluronidase zeigen die Chondrozyten (soweit nicht aus ihrer Matrix herausge-
löst), die Territorien als auch die Interterritorien keine positive Immunreaktivität.
Was jedoch auffällt, ist eine nach Hyaluronidase-Präinkubation noch deutlicher zu
Tage tretende positive Reaktion in einem schmalen bandförmigen Bereich
unmittelbar unter der natürlichen Knorpeloberfläche. Diese Braunfärbung findet
sich jedoch bei allen der hier ausgetesteten Antikörperfärbungen.
Für Kollagen-Typ II zeigen die Gewebeschnitte dagegen eine schwach positive
Reaktion, die sich durch Vorbehandlung mit Hyaluronidase deutlich verstärkt
(s. Abb. 4 b u. c). Allerdings sind die Strukturen nach der Inkubation mit dem
Enzym deutlich verwaschener. Das Zytoplasma der Chondrozyten (soweit sie nicht
herausgelöst sind) ist negativ. Eine eindeutige Zuordnung der positiven
Immunreaktivität zu entweder territorialer oder interterritorialer Matrix ist nicht
möglich.
Abb. 4 a-c
Nativer hyaliner Knorpel, Anfärbbarkeit mit den klassischen Kollagen-Antikörpern:
Negative Reaktivität für Kollagen-Typ I unabhängig von einer Hyaluronidase-
präinkubation (links, ohne Vorbehandlung), leichte Reaktion ohne Demaskierung
der Kollagen-Typ II-Fasern (Mitte) und deutliche Reaktion auf Anti-Kollagen-
Typ II nach vierstündiger Inkubation in Hyaluronidase (rechts).
43
Im Ausstrich frisch isolierter Chondrozyten ist wie im Gewebeschnitt keinerlei
Kollagen-Typ I nachweisbar. Alle Zellen sind negativ (s. Abb. 5 a).
Bei der Färbung mit Immunglobulinen gegen Kollagen-Typ II ist dagegen ein
interessantes Phänomen zu beobachten. Während nach einer 24stündigen
Inkubation mit Kollagenase zur Zellisolierung nur etwa 10- 30 % der Chondrozyten
eine deutlich positive Immunreaktion zeigen, sind es nach 42 Stunden über 50 %
der Zellen. Die Stärke der Reaktion kann dabei semiquantitativ mit ++ bis +++
angegeben werden (s. Abb. 5 b).
Abb. 5 a u. b
Im Ausstrich frisch isolierter Chondrozyten (prä-P0) sind sämtliche Chondrozyten
negativ für Kollagen-Typ I (links); für Kollagen-Typ II zeigen die Knorpelzellen
dagegen eine deutliche Reaktivität; dabei nimmt die Anzahl der positiv gefärbten
Zellen mit der Dauer der Inkubationszeit zu (rechts, nach 42stündiger Inkubation in
Kollagenase)
44
In der Primärkultur zeigt sich für die beiden ersten Kollagentypen ein
spiegelbildlich entgegengeseztes Muster. Für Kollagen-Typ I ist die Reaktion bei
fast allen Chondrozyten negativ. Jedoch werden vereinzelt Zellen gesehen, die zwei-
, z.T. sogar dreifach positiv gefärbt sind (s. Abb. 6 a). Die Immunglobuline gegen
Kollagen-Typ II reagieren dagegen mit den meisten Knorpelzellen. Nur wenige sind
negativ (s. Abb. 6 b).
Bereits in der ersten Subkultur dreht sich dieses Bild vollständig um. Die
überwiegende Zahl der Knorpelzellen ist zwei- bis dreifach positiv für Kollagen-
Typ I (s. Abb. 6 c) und negativ für Typ II (s. Abb. 6 d). Nur bei wenigen Zellen ist
noch das in der Primärkultur gezeigte Färbeverhalten sichtbar. In den späteren
Passagen sind praktisch keine Zellen mehr zu finden, die positiv für Kollagen-
Typ II oder negativ für Kollagen-Typ I sind (s. Abb. 6 e u. f).
Abb. 6 a-f
Immunreaktivität boviner Chondrozyten für Kollagen-Typ I bzw. II in
Monolayerkultur: links jeweils gefärbt mit Anti- Kollagen-Typ I, rechts mit Anti-
Kollagen-Typ II, oben die Primärkultur, in der Mitte die erste und unten die vierte
Subkultur: die Anfärbbarkeit für Kollagen-Typ I nimmt kontinuierlich zu, die für
Kollagen-Typ II nimmt spiegelbildlich ab.
45
3.2.2 Kollagen-Typ III und V
In den Knorpelschnitten färben sich vor der Hyaluronidaseinkubation nur die
Chondrone mit Antikörpern gegen Kollagen-Typ III leicht positiv an, während die
Chondrozyten selbst und die Interterritorien negativ bleiben. Nach der
Enzymbehandlung werden die Chondrone noch deutlicher positiv. Auch der
interterritorielle Raum zeigt eine ganz leicht positive Immunreaktion für Kollagen-
Typ III.
Die Chondrone färben sich bei Kollagen-Typ V wesentlich deutlicher an, besonders
nach enzymatischer Vorbehandlung (+++). Die darin nicht eindeutig abgrenzbaren
Knorpelzellen sind leicht immunopositiv. Die Interterritorien nehmen erst nach der
Kollagenase-Präinkubation eine leicht bräunliche Tönung an. Wie in allen der hier
angewandten immunzytochemischen Färbungen zeigt sich auch für diese beiden
Antikörper ein schmaler positiver Saum unmittelbar unter der natürlichen
Knorpeloberfläche. Im Chondrozytenausstrich sind nur ganz vereinzelte Zellen
positiv für Kollagen-Typ III. Für Kollagen-Typ V ist die Immunreaktivität dagegen
fast durchgehend zumindest einfach positiv, für einige auch zweifach.
In der Primärkultur ist ein Teil der Zellen negativ bis ganz schwach positiv für
Kollagen-Typ III, der andere Teil zeigt dagegen eine deutlich positive Reaktion. Für
Kollagen-Typ V kann eine durchgehend z.T. mehr, z.T. weniger intensive positive
Immunrektivität beobachtet werden.
Von der ersten Subkultur an wird eine gleich starke etwa zweifach positive Reaktion
bei quasi allen Zellen für Kollagen-Typ III wie -Typ V gefunden (s. Abb. 7 a u. b).
Abb. 7 a u. b
Chondrozyten nach der ersten Passage (P1): für Kollagen-Typ III (links) und Typ V
(rechts) findet sich praktisch dasselbe Färbeverhalten.
46
3.2.3 S-100, S-100-α und S-100-β
In Kryostat-Schnitten des hyalinen Knorpels zeigt sich bei der Anfärbung mit
Antikörpern gegen S-100 eine deutliche intrazytoplasmatische, perinukleär
verdichtete braune Granulierung (+++), während das Stroma ohne
Hyaluronidasevorbehandlung negativ erscheint. (s. Abb. 8 a) Nach der
Präinkubation sind die Chondrone jedoch auch als dreifach positiv erkennbar,
während sich die interterritorielle Matrix bis auf den Bereich unmittlelbar unter der
Knorpeloberfläche nur leicht positiv anfärbt (s. Abb. 8 b).
Bei der Reaktion gegen die α-Untereinheit fällt dagegen eine dreifach positive
unmittelbar perizelluläre Braunfärbung auf, während die Zellen selbst negativ
erscheinen. Erst nach der Inkubation mit Hyaluronidase werden die Territorien
außerhalb der Kapsel positiv, während die Interterritorien ähnlich wie bei dem
Gesamtprotein nahezu negativ bleiben.
Bei der β-Untereinheit findet sich bereits bei dem unbehandelten Kryostatschnitt
sowohl eine deutliche intra- als auch eine etwas schwächere perizelluläre positive
Reaktion. Das Färbeverhalten nach Präinkubation mit Hyaluronidase entspricht dem
des S-100-Gesamtproteins.
Abb. 8 a u. b
Nativer hyaliner Knorpel, Färbung mit Anti-S-100-α: im Gegensatz zu der
β-Untereinheit und dem Gesamtprotein findet sich praktisch keine intrazelluläre
Immunreaktion, jedoch eine dreifach positive Braunfärbung perizellulär innerhalb
der Knorpelkapsel (links); erst nach der Hyaluronidasebehandlung werden die
Territorien kräftig positiv (rechts).
47
Von dem Zellausstrich bis zur sechsten Passage findet sich für die Knorpelzellen
quasi unverändert eine dreifach positive Immunreaktivität für das S-100-Protein
(vgl. Abb. 9 a-c)
Abb. 9 a-c
Knorpelzellen in Monolayerkultur, Färbung mit Anti-S-100, von oben nach unten:
Primärkultur, erste und vierte Subkultur: es zeigt sich durchgehend eine kräftig
braune Anfärbung.
48
Bei den Untereinheiten des S-100-Proteins sind hingegen Veränderungen im
Verlauf der Kultur zu beschreiben.
Die intra- bzw. perizellulär bevorzugte Verteilung der Untereinheiten setzt sich im
Zellausstrich fort. Dort wo Chondrozyten von einem schmalen Saum von
Extrazellulärmatrix umgeben sind, zeigt sich für S-100-α eine positive
Immunreaktivität in Form von dreifach positiven Granula. Gleichzeitig ist das
Zytoplasma nur ganz leicht bräunlich getönt. Bei S-100-β weisen die Knorpelzellen
hingegen eine dreifach positive intrazelluläre Färbung auf, die nach 42 Stunden in
Kollagenaselösung noch etwas deutlicher hervortritt.
In der Primärkultur zeigen die Chondrozyten eine wechselnd stark ausgeprägte
Immunreaktivität für S-100-α, die zwischen den Zellen von einfacher bis dreifacher
Positivität schwankt (s. Abb. 10 a, S. 49). Auch für S-100-β werden
Schwankungen in der Färbeintensität gesehen, doch ist die Immunreaktivität
insgesamt deutlich positiver (++ bis +++) (s. Abb. 10 b). Während sich die
phänotypische Expression in Bezug auf S-100-β in der ersten Subkultur nicht
ändert (vgl. Abb. 10 d), wird nach der ersten Passage deutlich weniger S-100-αnachweisbar (vgl. Abb. 10 c). Semiquantitativ könnte man die Intensistät der
Färbung nur noch mit + angeben. In den späteren Subkulturen nimmt die
Färbeintensität sukzessive weiter ab und wird ab der 5. Passage quasi negativ (vgl.
Abb. 10 e). Die Reaktion von Anti-S-100-β-Immunglobulinen mit den
Knorpelzellen wird hingegen nur unwesentlich schwächer und bleibt bis zur
sechsten Passage etwa zweifach positiv (vgl. Abb. 10f).
49
Abb. 10 a-f
S-100-α und S-100-β im Vergleich, von oben nach unten: Primärkultur, erste und
vierte Subkultur. Bei der α-Untereinheit (links) entwickelt sich aus dem anfangs
gemischten Bild (+ bis +++) eine immer weiter abnehmende Immunreaktivität,
während das insgesamt kräftiger gefärbte bunte Bild bei der β-Untereinheit (rechts)
sich bis in die höheren Passagen in eine gleichmäßige zweifach positive
Immunreaktivität wandelt.
50
3.3 Fibroblasten als biologische Kontrolle
3.3.1 Histochemische Darstellung
1.) Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie
Die Fibroblasten des straffen wie die des lockeren Bindegewebes zeigen von
Anfang an ein im Vergleich zu den Chondrozyten andersartiges
Wachstumsverhalten. Sie haften schneller an der Unterlage und breiten sich danach
rasch aus. Sie nehmen dabei eine eher langgestreckte Form an und wachsen mehr in
Form von längsorientierten Ketten, die sich verzweigen können. Bei zunehmenden
Zellzahlen entwickelt sich so primär ein fischzugartiges Bild, das beim Erreichen
der Konfluenz auch wirbelartige Formen annehmen kann.
2.) Basophilie und Metachromasie
Weder in den Gewebeschnitten von straffem oder lockerem Bindegewebe noch bei
den isolierten und in Kultur gebrachten Fibroblasten zeigte sich zu irgendeinem
Zeitpunkt eine Metachromasie in der Färbung nach Giemsa oder eine wie für die
Chondrozyten beschriebene verstärkte Basophilie in einer Hämatoxylinfärbung.
51
3.3.2 Immunzytochemische Charakterisierung
1.) Kollagen-Typ I und I I
Eine Vorbehandlung der Bindegewebsproben mit Hyaluronidase verändert die
Immunreaktivität der Bindegewebsproben nicht. Die Fasern erscheinen lediglich
strukturierter, und viele der Zellen sind aus dem Gewebe herausgelöst. Für
Kollagen-Typ I zeigt sich in den Gewebeschnitten die stärkste Immunreaktivität
unter den Kollagen-Typen, obschon sie sehr diffus und absolut gesehen nicht sehr
ausgeprägt ist (+). Bei Kollagen-Typ II ergibt sich eine diffuse ganz leichte
Grundtönung, die sich in gleicher Form in der Kontrolle K2 wiederfindet. Die
Reaktion muß daher als unspezifisch angesehen werden.
Im Zellausstrich und in der Zellkultur sind die Unterschiede in den
Immunreaktivitäten deutlich ausgeprägter. Während die bovinen Fibroblasten
durchweg zweifach positiv für Kollagen-Typ I sind (s. Abb. 11), zeigen sie ebenso
durchgehend keinerlei Reaktion für Kollagen-Typ II.
Abb. 11
Bovine Fibroblasten in Monolayerkultur als biologische Kontrolle, erste Subkultur:
Es zeigt sich eine deutlich positive Immunreaktivität für Kollagen-Typ I
52
2.) Kollagen-Typ III und V
Sowohl im straffen wie im lockeren Bindegewebe läßt sich Kollagen-Typ III wie
auch Typ V nachweisen. Neben einer relativ homogenen Grundtönung, die in ihrer
Intensität jedoch stärker ist als die der Kontrolle K2 (vgl. o.), sind einzelne
septenartige Faserzüge verstärkt positiv dargestellt. Sowohl im Zellaussstrich als
auch in der Primär- und in den Subkulturen ergibt sich für beide Antikörper ein
buntes Bild. In unterschiedlichen Verteilungen ohne konstante Anteilsverhältnisse
finden sich Zellen, die negativ oder ganz schwach positiv sind, bis hin zu solchen
Fibroblasten, die eine zweifach positive Anfärbung zeigen.
3.) S-100, S-100-α und S-100-β
Die Immunreaktivität für S-100 und seine β-Untereinheit stellt sich für das straffe
Bindegewebe sehr ähnlich dar: mittelstark positive Septen (++) trennen Areale aus
sehr schwach bis schwach positiven Fasern. Dazwischen liegen die basophilen
Zellen von Flügelzellen. Im lockeren Bindegewebe finden sich dagegen
zigarrenförmige bis ovale basophile Kerne in mit Anti-S-100 und Anti-S-100-βleicht positiv gefärbten Nestern.
Für S-100 und seine β-Untereinheit findet sich im Zellausstrich vor der
Primärkultur ein buntes Bild von negativen bis zweifach positiven Zellen für S-100
und von negativen bis einfach positiven Zellen für S-100-β. In den nachfolgenden
Kulturen zeigt sich eine mäßig stark positive Immunreaktivität für S-100 und eine
schwach positive für seine β-Untereinheit.
53
Für S-100-α hingegen zeigt lockeres wie straffes Bindegewebe im Kryostatschnitt
keine positive Immunreaktivität.
In der Folge bleiben die Fibroblasten bis in die Subkulturen ohne Reaktion für
Antikörper gegen die α-Untereinheit des S-100-Proteins (s. Abb. 12).
Abb. 12
Primärkultur von bovinen Fibroblasten, Färbung mit Anti-S-100-α: Im Gegensatz
zu den Darstellungen mit Anti-S-100 und Anti-S-100-β findet sich keinerlei positive
Immunreaktion.
54
3.4 Synoptische Darstellung der Ergebnisse
Bei einer Einzeldarstellung der Ergebnisse kann eine differenzierte Beschreibung
der Antigenlokalisation erfolgen. Auch lassen sich Feinheiten in der Entwicklung
des Antigenexpressionsverhaltens veranschaulichen, etwa wenn ganz vereinzelt
Zellen in der Primärkultur schon den Phänotyp zeigen, der bei dem Großteil der
Zellen erst nach der ersten Passage zu sehen ist. Jedoch birgt diese Darstellung die
Gefahr, daß Tendenzen der Gesamtentwicklung nicht in hinreichender
Übersichtlichkeit deutlich werden. Um die Änderung des Antigenexpressions-
verhaltens von Chondrozyten im zeitlichen Verlauf der Monolayerkultur im
Überblick zu verdeutlichen, folgt eine synoptische Darstellung der Ergebnisse.
Die jeweiligen Intensitäten der Anfärbungen pro Antikörper und Passage sind
dreifach gemittelt:
1.) über die verschiedenen Zellen einer Population,
2.) über die verschiedenen Populationen unterschiedlicher Individuen, die auf
verschiedenen Objektträgern jedoch am gleichen Tag parallel mit identischen
Lösungen gefärbt wurden und
3.) über die verschiedenen Gruppen von Populationen aus zu unterschiedlichen
Zeitpunkten etablierten Kulturen (um eine bzw. drei Wochen versetzt), die
entsprechend eine bzw. drei Wochen später erst in der gleichlautenden Passage
gefärbt wurden.
In den späten Subkulturen P4-P6 werden praktisch keine Unterschiede in den
verschiedenen Immunreaktivitäten von Passage zu Passage beobachtet. Schon von
der zweiten Subkultur an sind die Unterschiede nur minimal. Daher werden der
Übersichtlichkeit halber die Passagen P2-P6 durch „ P6“ repräsentiert.
Die semiquantitative Auswertung erfolgt nach dem bekannten Schema ( - / + / ++ /
+++).
Mit einem Sternchen (*) sind die Reaktivitäten gekennzeichnet, die in einem
ausgesprochen großem Umfang in ihrer Intensität schwanken („buntes Bild“), ohne
daß im Grunde eine Intensität als die vorherrschende angegeben werden könnte
(siehe z.B. in der P0 bei Kollagen-Typ III und V).
55
Nativer
hyaliner
Knorpel
prä-P0 P0 P1 P6Sehne/
lockeres
BG
P0 P1 P2
Baso-
philie +++ + +++ - - - - - -
Meta-
chromasie +++ + +++ - - - - - -
Coll I - - - +++ +++ + ++ ++ ++
Coll II ++ ++ ++ - - - - - -
Coll III + + +* ++ ++ (+) +* +* +*
Coll V ++ ++ ++* ++ ++ + +* +* +*
S-100 +++ +++ +++ +++ +++ + + + +
S-100-α +++ +++ +++ + - - - - -
S-100-β ++ ++ ++ ++ ++ (+) (+) (+) (+)
Tab. 2
Darstellung der Ergebnisse im Überblick
56
4 Diskussion
4.1 Orientierende histochemische Darstellung
4.1.1 Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie
Zellbiologisch zeigen die Chondrozyten schon nach der ersten Passage erste
Unterschiede zu den Zellen der Primärkultur. Die Ausbreitung am Boden der
Kulturflasche (Spreading) erfolgt bereits nach wenigen Stunden in ausgeprägter
Form, während sie in der Primärkultur erst nach zwei Tagen und dann eher zaghaft
beginnt. Genauso beschreibt Mallein-Gerin (136), daß differenzierte Chondrozyten
in der primären Monolayerkultur ihre runde Form nach ihrer Adhäsion noch 48
Stunden beibehalten (vgl. ebenso 137 und 140), während Fibrozyten schon nach
wenigen Stunden abgeflacht und langgestreckt gefunden werden. Durch das Fehlen
solcher rasch sich ausbreitender Zellen in seinen Kulturen schließt Mallein-Gerin
sogar eine Kontamination durch Fibrozyten aus (136). Ein verzögertes Spreading
wird somit als Charakteristikum des differenzierten Chondrozyten gewertet.
Folgerichtig könnte ein nach der ersten Passage stark beschleunigtes Spreading auf
eine Entdifferenzierung der Knorpelzellen hinweisen.
Zellmorpholgisch fällt bei den Chondrozyten nach dem Spreading zumindest noch
während der Präkonfluenz ein Verlust des rundlichen bis polygonalen Aussehens
und stattdessen eine bizarre sternförmige Gestalt auf. Dies trifft sowohl für die
Primärkultur zu wie für die Zellen nach der ersten Passage. Dabei kann mit der
Anzahl der Passagen eine zunehmend bipolare Orientierung beobachtet werden. In
der Literatur wird bei der Entdifferenzierung der Übergang von einem rundlich-
polygonalen, seßhaften, differenzierten Chondrozyt in einem epitheloidzelligen
Verband zu einem abgeflachten, in Abhängigkeit von der Zelldichte stern- bis
spindelförmigen, amöboid beweglichen, fibroblastenartig entdifferenzierten
Chondrozyten beschrieben, der eine bis zum Zehnfachen vergrößerte Zelloberfläche
aufweist (3, 58, 60, 66, 82, 140, 160, 188). Dieser Übergang wird in der
Monolayerkultur boviner Chondrozyten somit zumindest vorübergehend bereits in
der Primärkultur während der Präkonfluenz beobachtet. Chacko und Mitarbeiter
beschreiben die Chondrozyten in dieser Phase entsprechend bereits als
„entdifferenziert“ und gehen von einer Redifferenzierung aus, die eintritt, wenn die
Zellen in Kontakt zueinander kommen (34).
57
Tatsächlich nehmen die Chondrozyten bei Erreichen der Konfluenz ihre mehr
rundlich-polygonale Form wieder an. Diese „ Redifferenzierung“ beim Erreichen
der Konfluenz findet nach der ersten Passage nicht mehr in dem gleichen Ausmaß
statt. Die Zellen behalten auch in der Konfluenz eine mehr bipolare Ausrichtung bei
und erinnern so bereits mehr an Fibroblasten. Jedoch unterscheiden sich diese
„fibroblastenartig“ genannten Chondrozyten noch recht deutlich von echten
Fibroblasten. Bovine Fibroblasten aus straffem oder lockerem Bindegewebe, wie
wir sie als biologische Kontrolle separat kultiviert haben, sind weitaus stärker
langgestreckt und bilden typische fischzug- und teilweise wirbelartige Formationen
im Stadium der Konfluenz. Solche Bilder zeigen sich bei den Chondrozyten erst,
wenn sie über mehrere Wochen nicht passagiert wurden (Perkonfluenzstudie).
Andeutungsweise finden sie sich in der späten sechsten Subkultur.
Diese Beobachtung legt den Eindruck nahe, daß die Entdifferenzierung - zumindest
vom morphologischen Gesichtspunkt aus - stufenweise erfolgt:
1.) Zellbiologisch zeigen die Chondrozyten nur in der Primärkultur das von
Mallein-Gerin als charakteristisch für den differenzierten Phänotyp angesehene
Verhalten, nach der Zellaussaat zwar am Boden der Kulturflasche zu haften, sich
aber erst nach etwa 48 Stunden auszubreiten.
2.) Es kommt zu einer reversiblen einzelzellmophologischen Veränderung während
der Primärkultur im Sinne einer sternförmigen Abflachung, die Chacko als
Entdifferenzierung mit anschließender Redifferenzierung beim Erreichen der
Konfluenz interpretiert.
3.) Sowohl nach längerer Kultur im Stadium der Perkonfluenz wie auch nach mehr
als fünf Passagen ändert sich die Zellverbandsmorphologie im Sinne eines dann
mehr fischzugartig bis wirbelförmigen Wachstums von dann deutlich
langgestreckten Zellen.
Morphologisch erfolgt demnach eine zumindest zweistufige Entdifferenzierung von
fraglich auch unterschiedlicher Reversibilität: die einzelzell- und
zellverbandsmorphologische Entdifferenzierung erfolgen zu unterschiedlichen
Zeiten.
Wir werden anhand der histochemischen und immunzytochemischen Ergebnisse zu
prüfen haben, inwieweit sich diese morphologischen Entdifferenzierungsschritte in
entsprechenden funktionellen Veränderungen widerspiegeln.
58
Von großer klinischer Bedeutung ist weiterhin die Frage, inwieweit mit dem
zweiten Entdifferenzierungsschritt möglicherweise auch die Redifferenzierbarkeit
verlorengeht. Denn eine Möglichkeit zur Gewinnung großer Mengen differenzierter
Knorpelzellen, etwa zum Zwecke der Transplantation bei Gelenkknorpeldefekten,
ist die sequentielle Kultur in Monolayer- und Rührkultur. Dabei nutzt man bei der
Monolayerkultur die hohe Proliferationsrate und nimmt dafür die Entdifferenzierung
in Kauf. In der nachfolgenden Suspensionskultur redifferenzieren die Zellen zu
funktionsfähigen Chondrozyten (142, 160, 204).
Sollte daher nach dem zellverbandsmorphologischen zweiten Entdifferenzierungs-
schritt keine Redifferenzierbarkeit mehr gegeben sein, wäre es von entscheidender
Wichtigkeit, einen Marker für diesen zweiten Schritt zu finden, damit im klinischen
Gebrauch sofort erkennbar ist, wenn es zu einer solchen irreversiblen
Entdifferenzierung kommt.
59
4.1.2 Basophilie und Metachromasie
Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der immunzytochemischen Charakterisierung
von Knorpelzellen. Insofern stellen die histochemischen Färbungen lediglich
Referenzmethoden dar. Da sie jedoch im wesentlichen auf dem Nachweis des
anderen der beiden Hauptbestandteile der Knorpelmatrix beruhen - der
Proteoglykane bzw. der Glykosaminoglykane nämlich -, sind sie eine wertvolle
Ergänzung. Ich möchte daher im Rahmen der Diskussion der Frage nachgehen,
inwiefern diesen klassischen Färbemethoden für das Erkennen der
Entdifferenzierung von Chondrozyten im Verlauf der Zellkultur heute noch
Bedeutung zugemessen werden sollte.
Lange bevor immunzytochemische Färbetechniken zur Verfügung standen, wurde
der charakteristische Phänotyp von Chondrozyten mit Hilfe histochemischer
Methoden nachgewiesen. Dabei spielen vor allem Färbungen mit
metachromatischen Farbstoffen eine große Rolle, so z.B. Toluidinblau (3, 34, 58,
64, 65, 71, 101, 137, 186, 206, 207, 216), Giemsa (104, 66), Methylenblau (51),
Thionin (81) und Safranin O (7, 65, 179). Auch Alzianblau (7, 12, 21, 81, 137,
179), wenn auch ohne metachromatisches Färbeverhalten, bindet vor allem an
Proteoglykane, die reich an Chondroitinsulfat sind und in Form großer Aggregate
vorliegen, beides Charakteristika der Proteoglykane des hyalinen Knorpels
(vgl. 1.2.2). Als Übersichtsfärbung ist die Hämalaun-Eosin-(HE-) Färbung wegen
ihrer kontrastreichen Darstellung wohl die am meisten verbreitete histologische
Färbung überhaupt (91). Bei der Knorpelfärbung wird nicht nur das Kernchromatin
(DNS mit „ S“ für Säure [!]) sondern auch die ebenfalls sauren polyanionischen
Glykosaminoglykane mit dem basischen Farbstoff Hämalaun (= Hämatoxylin +
Alaun) kräftig blau angefärbt. Man spricht daher auch von einer ausgeprägten
Basophilie insbesondere der perizellulären Matrix des hyalinen Knorpels (14, 81,
137). Speziell für die Elektronenmikroskopie sind Rutheniumrot (45, 65), Acridin-
Orange (23) und Cupromeronisch Blau (162) geeignet. Als elektronendichte
polykationische Farbstoffe stellen sie ebenfalls die polyanionischen
Glykosaminoglykane dar (162).
Zweifelsohne spielten die klassischen histochemischen Färbemethoden also schon
lange vor, aber auch noch während der immunzytochemischen Ära beim Nachweis
des charakteristischen Phänotyps von Knorpelzellen eine bedeutende Rolle. Jedoch
wurde die Ansicht geäußert, diese Methoden seien zu unspezifisch (139). Mit dem
Einsatz monospezifischer Antikörper in immunzytochemischen Färbetechniken
erhoffte man sich spezifischere Nachweismethoden.
60
Dies ist auch in großem Umfang gelungen. Besonders erwähnenswert sind hier
etwa die Untersuchungen mit zweifacher Immunfluoreszenzmarkierung von Klaus
von der Mark und Kollegen. Es gelang ihnen zu zeigen, welcher Kollagentyp Zelle
für Zelle im Zuge der Entdifferenzierung synthetisiert wird (noch Kollagen-Typ II,
schon Kollagen-Typ I oder auch beide simultan). Gleichzeitig konnten sie
feststellen, inwieweit dieser funktionelle Entdifferenzierungsschritt mit dem
morphologischen korreliert (140).
Haben durch solche spezifischeren Nachweismethoden die histochemischen
Färbemethoden ihre Bedeutung z.B. bei der Beurteilung des Differenzierungs-
grades von Chondrozyten verloren?
Nach der Definition des Phänotyps von Zellen hatten wir zwei mögliche Ansätze
seiner Charakterisierung unterschieden: den morphologischen und den funktionellen
Ansatz (vgl 1.2). Es ist zunächst festzuhalten, daß ebenso wie die
Immunzytochemie auch die klassische Histochemie ein Bindeglied zwischen
Morphe und Funktion darstellt. Und das in größerem Maße, als daß natürlich jede
Struktur letztlich aus einem molekularen Vorgang resultiert (91). Die zumindest
relative Spezifität der genannten histochemischen Färbungen beruht auf ihrer
Anfärbung ganz bestimmter Stoffwechselprodukte der Chondrozyten, nämlich der
polyanionischen Glykosaminoglykane, die als charakteristische Stoffwechsel-
produkte durchaus auch deren differenzierten Phänotyp beschreiben können.
Phosphorwolframsäure, die in der Ladewig-Färbung zur Anwendung kommt,
erfüllt dieses Kriterium z.B. nicht. Sie bindet zwar mit hoher Affinität an ein
Stoffwechselprodukt von Knorpelzellen, nämlich Kollagen-Typ II, jedoch gilt
diese hohe Affinität Kollagenfasern überhaupt (3) und somit beispielsweise auch
Kollagen--Typ-I-Fasern, die nicht spezifisch für Knorpelzellen sind, sondern auch
von Fibroblasten gebildet werden und bei den Knorpelzellen sogar als Zeichen der
Entdifferenzierung angesehen werden.
Die Basophilie bei Anfärbung mit Hämalaun und die verschiedenen
metachromatischen Färbungen sind wie oben bereits angedeutet nur relativ
spezifisch. Viele Substanzen können eine basophile und sogar eine
metachromatische Anfärbung zeigen. Voraussetzung ist lediglich das Vorkommen
einer großen Anzahl dicht benachbarter saurer Gruppen. So färben sich
beispielsweise auch Mastzellgranula je nach Farbstoff basophil oder
metachromatisch an. Denn das in den Granula enthaltene Heparin ist ein stark
saures, vielfach sulfatiertes Glykosaminoglykan.
61
Die Spezifität dieser Färbemethoden ist also sicher nicht als ausreichend zu
bezeichnen.Doch diese ist auch nicht erforderlich. Entscheidend für den Nachweis
der Entdifferenzierung von Knorpelzellen in der Zellkultur ist vielmehr die
jahrzehntelang bewiesene hohe Sensitivität dieser histochemischen
Nachweismethoden für Knorpel-Glykosaminoglykane. Als Kriterium für die
Entdifferenzierung war zwar unter 1.1.2 von vielen Autoren auch eine qualitative
Veränderung der gebildeten Proteoglykane angeführt worden, jedoch steht, wie
auch unsere Versuchsergebnisse zeigen, der quantitative Aspekt deutlich im
Vordergrund: Wenn bis einschließlich zur Primärkultur bei nativem Knorpel wie bei
daraus isolierten Chondrozyten eine basophile bzw. metachromatische Matrix
darzustellen ist, die von der ersten Subkultur an praktisch nicht mehr nachgewiesen
werden kann, dann ist das ein äußerst aussagekräftiges Kriterium für einen
stattgefundenen Entdifferenzierungsschritt. Offenbar haben die Chondrozyten die
für ihren differenzierten Phänotyp charakteristische Synthese knorpelspezifischer
Glykosaminoglykane eingestellt oder zumindest stark reduziert. Da sich diese
Umstellung des Biosyntheseprogramms in den hier angewandten klassischen
histochemischen Färbemethoden sehr klar und eindrücklich darstellt, sehen wir sie
zur Darstellung des Phänotyps von Chondrozyten nicht nur als Referenzfärbung zu
immunzytochemischen Färbungen als ungedingt empfehlenswert an.
Die Frage soll aber noch einmal explizit aufgenommen werden: Werden bei diesen
Färbemethoden tatsächlich knorpelspezifische Stoffwechselprodukte nach-
gewiesen?
Beim Vergleich mit der Literatur wird zunächst einmal deutlich, daß dieses
metachromatische Färbeverhalten als das Charakteristikum der Matrix des hyalinen
Knorpels schlechthin angesehen wurde. Honor B. Fell etwa beschreibt in ihrer
bedeutenden Pionierarbeit über die Histogenese von Knorpel und Knochen 1925
die metachromatische Färbung mit Methylenblau (Zellen: hell smaragd-grün,
Matrix: tief blau-violett) als die beste Methode, um die charakteristische Matrix bei
der Chondrogenese schon im frühesten Stadium festzustellen (51).
Die Tatsache, daß man rein empirisch die Metachromasie als charakteristisches
Kriterium für den differenzierten Phänotyp angesehen hat, mag allein noch nicht
überzeugen. Gibt es Hinweise dafür, daß die Produktion und Ablagerung
knorpelspezifischer Proteoglykane das funktionelle Korrelat der Metachromasie und
ausgeprägten Basophilie ist?
62
Dieser funktionelle Aspekt kam in der Geschichte der Knorpelforschung tatsächlich
in der nächsten Nachweismethode des differenzierten Chondrozytenphänotyp zum
Tragen. Denn nun wurde der charakteristische Phänotyp des hyalinen Knorpels mit
dem Nachweis des Einbaus von 35S-Sulfat in das Chondroitinsulfat mittels
Autoradiographie nachgewiesen. Regelmäßig bildete jedoch auch hier die
Metachromasie bei histochemischen Färbungen die Referenzmethode (z.B. 81, 137,
206).
Mit Rutheniumrot gelang es auf elektronenmikroskopischer Ebene die
Proteoglykane sichtbar zu machen, die für die Metachromasie verantwortlich sind
(vgl. 65). Als elektronendichter polykationischer Farbstoff bindet er genau an
dieselben polyanionischen Glykosaminoglykane, die die ebenfalls basischen
Farbstoffe wie Toluidinblau oder das Azur in der Färbung nach Giemsa so
verändern, daß sie in einem anderen Farbton erscheinen.
Als man schließlich in der Lage war, die Proteoglykane zu extrahieren und
biochemisch zu charakterisieren, fanden die metachromatischen Färbungen
wiederum als Referenzmethode Verwendung (z.B. 78, 205).
Immunzytochemisch gelang es umgekehrt, mit polyklonalen Antikörpern gegen das
nun biochemisch charakterisierte Kernprotein die Proteoglykane in situ
nachzuweisen und zwar sowohl in der Extrazellulärmatrix wie auch in den
intrazytoplasmatischen Organellen der Chondrozyten (164).
Mit monoklonalen Antikörpern gegen die Chondroitinsulfatketten und einer
Markierung mittels Goldpartikeln konnten im kryotechnisch vorbehandelten
Gewebe schließlich immunelektronenmikroskopisch die Proteoglykane mit den
vorbeschriebenen Rutheniumrot-gefärbten Granula korreliert werden.
Insgesamt besteht also kein Zweifel darüber, daß mit den metachromatischen
histochemischen Färbungen eben dieselben Proteoglykane dargestellt werden, die
sich autoradiographisch, elektronenmikroskopisch und immunzytochemisch
nachweisen lassen und biochemisch charakterisiert wurden.
Diese Proteoglykane werden in der Literatur als charakteristisch für den
differenzierten Phänotyp der Chondrozyten angesehen. Insbesondere werden dabei
folgende Kriterien angeführt (vgl. auch 1.1.2):
1.) besonders große Mengen an sulfatierten Glykosaminoglykanen (hohe
proteingebundene negative Ladungsdichte), die zu einer metachromatischen
Anfärbung bzw. zu einer ausgeprägten Basophilie bei entsprechenden
histochemischen Färbemethoden führen (3, 66, 81, 82, 101, 137, 139, 186, 197,
216)
63
2.) relativ hochmolekulare Proteoglykane, die sich wiederum zu besonders großen
Aggregaten zusammenlagern, sogenannte Knorpel-( = cartilage) spezifische
Proteoglykane (CS-PG) (11, 12, 46, 59, 79, 129, 131, 133, 136, 139, 207,
208)
3.) eine typische Glykosaminoglykanzusammensetzung (viel sulfatiertes
Chondroitinsulfat, wenig Hyaluronsäure, nur geringe Anteile an Dermatan- und
Keratansulafat) (46, 101, 129, 139, 188, 189, 208).
Wie aber verhalten sich unsere konkreten Untersuchungsergebnisse im Vergleich zu
den Befunden anderer Arbeitsgruppen?
Für unser Chondrozyten-Monolayer-Kulturmodell bilden Kryostatschnitte von
nativem hyalinem Knorpel die In-situ-Kontrolle. Im Bereich der Chondrone zeigt
sich dort eine intensive bläulich-violette Anfärbung bei der Färbung nach Giemsa
und eine deutliche Basophilie bei den Färbungen mit Hämalaun. Die Tatsache, daß
in unseren Gewebeschnitten von nativem Glasknorpel somit die vorbeschriebenen
knorpelspezifischen Proteoglykane nachweisbar sind, entspricht genau den
Erwartungen, die sich aus der Literatur ergeben, und kann als positive In-situ-
Kontrolle gewertet werden.
Nun findet sich das gleiche Färbeverhalten zudem mit gleicher Intensität auch in
unserer Primärkultur P0, d.h. in der Monolayerkultur von bovinen Chondrozyten
nach der Befreiung aus der sie umgebenden Extrzellulärmatrix bis zur 1. Passage
nach einer Woche. Hier ergeben sich nun einige Unterschiede im Vergleich zu
früheren Beobachtungen.
Manning und Bonner (137) waren 1967 die ersten, die Monolayerkulturen aus
humanen adulten Gelenkknorpelzellen erstellten. Sie beschreiben jedoch, daß die
Chondrozyten in der Monolayerkultur kein metachromatisches Material um die
Zellen herum ablagerten. Lediglich wenn die Zellen als „Organkultur“ in Form
eines durch Zentrifugieren frisch isolierter Zellen gewonnenen dreidimensionalen
Zellhaufens gezüchtet wurden, zeigte sich nach Färbung mit Toluidinblau eine
ausgeprägte charakteristische Metachromasie. In unserer Monolayerkultur läßt sich
dagegen in der Primärkultur eindeutig die Synthese und Ablagerung einer für den
differenzierten Chondrozyten charakteristischen metachromatischen
Extrazellulärmatrix nachweisen. Besonders eindrücklich weist dies unsere
P0-Metachromasie-Studie nach. Wie unter 3.1.2 beschrieben, läßt sich mit dem
bloßen Auge an den sieben Präparaten eine von Tag zu Tag zunehmende
metachromatische Färbung feststellen.
64
Mikroskopisch sieht man zunächst ganz spärlich metachromatisch angefärbte
extrazelluläre Matrixablagerungen. Vom ersten bis zum letzten Tag der
Primärkultur nimmt die Menge der abgelagerten Extrazellulärsubstanz und die
Intensität der metachromatischen Färbung stark zu. (Vgl. Abb. 3 a-e, S.41) Es läßt
sich also feststellen, daß hier von den isolierten und dann als Monolayer kultivierten
Chondrozyten eindeutig neu gebildete Proteoglykane abgelagert werden. Dies
verneinen Manning und Bonner für ihre primäre Monolayerkultur. Eine mögliche
Erklärung dieser scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse könnte in folgendem
liegen: Manning und Bonner hielten die Zellen über 90 Tage in Kultur, bevor es zu
einer Infektion durch Bakterien oder Pilze kam. Eine Passage wird in ihrer
Versuchsbeschreibung nicht erwähnt, so daß von einer Primärkultur über drei
Monate hinweg ausgegangen werden kann. Übereinstimmend zeigen die Ergebnisse
unserer Perkonfluenzstudie eine deutliche fibroblastenartige Entdifferenzierung bei
einer Kultivierung der Zellen ohne Passagierung sogar bereits nach weniger als drei
Wochen. Denkbar wäre daher, daß die Autoren die erste Färbung mit Toluidinblau
erst durchführten, als es bereits zu der Entdifferenzierung gekommen war. Insofern
schließen sich die beschriebenen Ergebnisse nicht notwendig aus.
In der Primärkultur wird somit eindeutig metachromatische Matrix neu synthetisiert
und abgelagert. Interessant ist nun zu diskutieren, wie der schmale, schwach
metachromatische bzw. basophile Saum im Ausstrich von bovinen Chondrozyten
unmittelbar nach der Zellisolierung (prä-P0) zu bewerten ist. Manning und Bonner
beschreiben in mit Toluidinblau gefärbten Zellausstrichen frisch isolierter humaner
Knorpelzellen bei einigen Zellen einen ebensolchen Hof von leicht
metachromatischem Material und halten es für „wahrscheinlich nicht entfernte
Matrix“ (137). Es stellt sich die Frage, ob es sich tatsächlich um Matrixreste oder
etwa um von den frisch isolierten Chondrozyten neu synthetisierte Matrix handelt.
Diese Fragestellung ist deshalb von besonderem Interesse, weil es hier letztlich um
die Frage geht, wann die Knorpelzellen mit ihren spezifischen
Stoffwechselleistungen in der Zellkultur beginnen.
Man muß sich vergegenwärtigen, daß eine enzymatische Zellisolierung mittels
Kollagenase etwa einen Tag dauert (Manning und Bonner: 18 Stunden, bei uns: 24
Stunden regulär). Das Einsetzen einer verstärkten Stoffwechselaktivität - anfangs
als Wiedereinsetzen des Chondrozytenstoffwechsels überhaupt angesehen - wäre
daher bei bereits früh in diesem Prozeß freigewordenen Chondrozyten durchaus
denkbar.
65
In einem Zusatzversuch verlängerten wir die Dauer der Kollagenaseinkubation
von 24 auf 42 Stunden. Sollte es sich tatsächlich um Matrixreste handeln, so
sollten diese Reste bei fast doppelter Enzymeinwirkzeit deutlich reduziert werden,
insofern die Reste neben Proteoglykanen auch Kollagen enthielten. Es zeigt sich
hingegen eine genau entgegengesetzte Entwicklung. Das Ausmaß der
Metachromasie nimmt nicht nicht etwa ab. Vielmehr nimmt die Intensität der
bläulich-violetten Färbung zu. Vor allem aber wächst die Anzahl der Zellen mit
einem metachromatischen Saum deutlich an. Entsprechend ist es offenbar eine
Funktion der Zeit, wieviele Zellen nach der Isolierung aus der sie umgebenden
Matrix mit der Synthese knorpelspezifischer Stoffwechselprodukte beginnen. Was
hier bei einer Verlängerung der Inkubationszeit in Kollagenase in dem
anschließenden präkulturellen Zellausstrich plausibel erscheint, wurde für die
Primärkultur anhand der oben beschriebenen P0-Metachromasie-Studie geprüft. Die
Folge der sieben Präparate mit einer Dauer der Primärkultur von ein bis sieben
Tagen zeigt eine von Tag zu Tag zunehmende Metachromasie von einem schmalen
leicht metachromatischen Saum am 1. Tag bis hin zu einer intensiven blau-violetten
Färbung einer die Zellen großflächig umgebenden Interzellularsubstanz am 7. Tag.
Dieser Zusatzversuch macht sehr anschaulich deutlich, in welchem Maß der
Glykosaminoglykanstoffwechsel durch die Isolierung der Knorpelzellen angeregt
wird. Schon mit bloßem Auge kann man an der zunehmenden Blau-Violett-Färbung
der Präparate die enorm zunehmende Stoffwechselaktivität der Chondrozyten
ermessen. Die beschriebene Entwicklung nach der Zellisolierung gemeinsam mit der
Beobachtung bei verlängerter Kollagenaseinkubationszeit legt die Vermutung nahe,
daß die vermehrte Stoffwechselaktivität schon während der Zeit der
Enzymeinwirkung durch die Befreiung aus der Matrix induziert wurde und dann
sukzessive immer mehr Zellen erfaßt. Es ist daher unwahrscheinlich, daß es sich bei
dem Matrixsaum im Zellausstrich prä-P0 - wie von Manning und Bonner
angenommen - um Matrixreste handelt. Ein eindeutiger Beweis der Neusynthese
von Glykosaminoglykanen bereits vor 18 Stunden nach Beginn der
Kollagenaseinkubation wäre z.B. autoradiographisch durch eine Knorpelzell-
isolierung in einer mit 35S-Sulfat angereicherten Kollagenaselösung zu erbringen.
Zeigt der perizelluläre Saum eine Radionuklidanreicherung an, so hat die
Glykosaminoglykansynthese offenbar in vitro stattgefunden. Darüber hinaus wäre
mit dieser weiteren Methode nochmals gezeigt, daß die Chondrozyten in der
Primärkultur auch als Monolayer den differenzierten Phänotyp exprimieren.
66
Im Rahmen der Diskussion der Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie wurde
schon erwähnt, daß Chacko, Abbott und S.u.H. Holtzer (34) während der
Primärkultur im Stadium der Präkonfluenz zunächst eine Entdifferenzierung
beschreiben, sowie dann beim Erreichen des Konfluenzstadiums eine
Redifferenzierung. Interessanterweise beobachtet Chacko diese Redifferenzierung
nur, wenn die fibroblastenartig erscheinenden Chondrozyten innerhalb von 7- 10
Tagen die Konfluenz erreichen. Nur dann nehmen sie wieder ihre runde Form an
und lagern eine metachromatische Extrazellulärmatrix ab. Wurden die
morphologisch entdifferenzierten Chondrozyten allerdings länger als 14 Tage in der
Primärkultur gehalten, bevor sie dann Kontakt mit anderen Zellen derselben
Population bekamen, dann nahmen sie weder ihre rundliche Form wieder an, noch
synthetisierten sie Chondroitinsulfat. Die Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Chacko
stimmen insofern mit den unseren überein, als wir beide am Ende der ersten Woche
der Primärkultur im Stadium der Konfluenz eine Population differenzierter
Chondrozyten mit einer neusynthetisierten phänotypisch charakteristischen
metachromatischen Extrazellulärmatrix beschreiben.
Die Ergebnisse der P0-Metachromasie-Studie wiedersprechen hingegen der
Vorstellung von einer zwischenzeitlichen Entdifferenzierung und Redifferenzierung
während der Primärkultur. Auch bevor die Zellen einander berühren, beginnen sie
von Tag zu Tag kontinuierlich zunehmende Mengen klassischer metachromatischer
Extrazellulärmatrix abzulagern. Funktionell kann also keineswegs von einer
Entdifferenzierung während der Primärkultur gesprochen werden. Chacko
beschrieb abgeflachte sternförmige Chondrozyten als morphologisch
entdifferenziert. Aus unseren Beobachtungen erscheint es sinnvoll, den
morphologisch entdifferenzierten Chondrozyten genauer zu definieren. Nicht die
Abflachung an sich scheint das entscheidende Kriterium für die Entdifferenzierung
zu sein, denn zumindest funktionell sind diese Chondrozyten ja ganz offensichtlich
nicht entdifferenziert. Ein klarer morphologischer Hinweis auf die
Entdifferenzierung ergibt sich hingegen aus einer deutlich bipolaren Ausrichtung,
wie wir sie sowohl in höheren Passagen, in denen die Zellen auch funktionell
entdifferenziert erscheinen, als auch bei den als biologische Kontrolle kultivierten
Fibroblasten beobachten. Wir schlagen daher abweichend von der Literatur als
entscheidendendes morphologisches Kriterium für die Entdifferenzierung nicht die
Abflachung, die relative Zytoplasmavermehrung oder ein sternförmiges Aussehen
vor, sondern die bipolare spindelförmige Ausrichtung, d.h. vereinfacht, daß die
Zellen deutlich länger als breit sind. In unseren Versuchen wurde eine deutliche
Bipolarität auch während des präkonfluenten Spreadings nicht vor der ersten
Passage beobachtet.
67
Betrachtet man die Bipolarität als das entscheidende Kriterium für die
morphologische Entdifferenzierung, dann korreliert auch weitgehend der Zeitpunkt
der morphologischen mit dem der funktionellen Entdifferenzierung. Dies ist jedoch
nicht zwingend notwendig (vgl. 136, 140). Auch hat die grundsätzliche Abflachung
mit allen zellbiologischen Konsequenzen zweifelsohne eine wesentlich größere
Relevanz als eine langgestreckte Form, wenn es um Überlegungen eines
ursächlichen Zusammenhangs zwischen der Zellform und der Entdifferenzierung
geht. Diese führten ja auch zu den verschiedenen und durchaus erfolgreichen
Formen der Suspensionskultur (13, 15, 45, 206). Sicherlich wird hier aber auch zu
differenzieren sein zwischen Ursache der bzw. Voraussetzung für die
Entdifferenzierung und dem Zustand der bereits erfolgten Entdifferenzierung.
Jedenfalls aber bleibt von der ersten Passage an in der Präkonfluenz die auffällige
Korrelation zwischen der morphologischen Bipolarität und dem funktionellen
Sistieren der Ablagerung einer metachromatischen Matrix festzuhalten. Interessant
wäre es in diesem Zusammenhang zu wissen, ob die Zellen, die in Chackos
Versuch erst nach 14 Tagen die Konfluenz erreichten und dann kein
Chondroitinsulfat mehr bildeten, ebenfalls und insbesondere von welchem Zeitpunkt
an eine bipolare Ausrichtung zeigten. Die Frage ist also: wann kam es hier zur
Entdifferenzierung?
Neben dem oben behandelten Zeitpunkt des Einsetzens der charakteristischen
Stoffwechselleistungen der Chondrozyten, die ja den differenzieten Phänotyp
widerspiegeln, interessiert vor allem, wann die Knorpelzellen diese wieder
einstellen, denn damit fällt funktionell die Entdifferenzierung zusammen. Bereits
nach der ersten Passage findet sich in den verschiedenen Präparaten noch maximal
ein Hauch von Metachromasie bzw. Basophilie. Mit dem Erreichen der ersten
Subkultur (P1) haben die Knorpelzellen im wesentlichen also schon ihren
differenzierten Phänotyp verloren - zumindest was die Proteoglykane bzw.
Glykosaminoglykane anbelangt. Wie verhält es sich aber diesbezüglich bei den
Kollagenen?
68
4.2 Immunzytochemische Charakterisierung
4.2.1 Kollagen-Typ I und II
Antikörper gegen Kollagen-Typ I und II können als die beiden klassischen
immunzytochemischen Marker für die De- und Redifferenzierung von
Chondrozyten angesehen werden. Als klassisches Charakteristikum für den Verlust
des differenzierten Phänotyps von Chondrozyten wird das Einstellen der Synthese
von Kollagen-Typ II und der Beginn der Produktion von Kollagen-Typ I
beschrieben (6, 11, 12, 19, 43, 58, 60, 66, 101, 115, 133, 136, 139, 140, 160,
186, 188, 189, 197, 207, 216). Bei unserer Anwendung dieser klassischen Marker
bestätigt sich, was die histochemischen Färbungen schon orientierend zeigen: im
Übergang von der Primärkultur P0 zur ersten Subkultur P1 stellen die Knorpelzellen
ihre für sie charakteristische Biosynthese von Kollagen-Typ II ein und beginnen
die Produktion eines Kollagen-Typs der normalerweise charakteristisch für Nicht-
Knorpelgewebe ist: Kollagen-Typ I. Die für Kollagen-Typ II bis zur Primärkultur
beobachtete zweifach positive Immunreaktivität wird nach der ersten Passage
negativ und behält dieses Färbeverhalten bis zum Abbruch der Versuchsreihe nach
der sechsten Passage bei. Für Kollagen-Typ I verhält es sich genau umgekehrt: Bis
zur Primärkultur P0 einschließlich ist die Antikörperfärbung negativ und wird von
der ersten Subkultur P1 an (sogar dreifach) positiv.
Von der Mark (140) beobachtete 1977 an embryonalen Hühnerchondrozyten eine
recht abrupte Umstellung der Synthese von Kollagen Typ II auf Typ I und
bezeichnete dies als „switch“, d.h. also als „Umschalten“ bzw. „An- und
Ausschalten“ wie bei einem Lichtschalter. Er beschrieb, daß die Zahl der
Kollagen-Typ I produzierenden Zellen kontinuierlich zunahm und die derjenigen
mit Kollagen-Typ II-Produktion in gleichem Maße weniger wurde. Dabei zeigte er
sehr eindrücklich anhand einer Doppelfärbetechnik mit Fluoreszein und Rhodamin,
daß nur 1 % der Chondrozyten gleichzeitig die beiden unterschiedlichen
Kollagentypen produzierten, d.h. fast alle Chondrozyten synthetisierten entweder
den einen oder den anderen Kollagentyp. Einen langsamen Übergang in der
Synthese der verschiedenen Kollagene gibt es also offenbar für die Einzelzelle
nicht. Exakt dasselbe Umschalten beobachten wir in unserem Monolayer-
Zellkulturmodell von bovinen Chondrozyten im Übergang von der Primär- zur
ersten Subkultur.
69
Nun stellt sich die Frage: Was ist die Ursache für dieses Umschalten der
Kollagensynthese bzw. - grundsätzlicher formuliert - für die Entdifferenzierung der
Chondrozyten in unserem Zellkulturmodell genau zum Zeitpunkt der ersten
Passage.
Wie unter 1.1.2 erwähnt gibt es eine Vielzahl von Erklärungsversuchen für das
Phänomen der Entdifferenzierung. Ein Zusammenhang mit der Passagierung der
Zellen wurde in der Literatur bislang nicht beschrieben. Die vorliegenden
Ergebnisse bieten die Möglichkeit, den Einfluß der beiden verwendeten
Enzymlösungen (Trypsin und Kollagenase) auf den differenzierten Phänotyp von
Chondrozyten zu beurteilen.
Bei einer Passage werden bekanntlich die konfluenten Zellen mittels Trypsin von
ihrer Unterlage abgelöst, zentrifugiert und verteilt auf mehrere Kulturflaschen neu
ausgesät. Nun läge es nahe anzunehmen, daß dieser erste Vorgang des
Passagierens, d.h. insbesondere der erstmalige Kontakt mit dem vergleichsweise
aggressiven Enzym Trypsin (vgl. 81), die Ursache für die Änderung des
phänotypischen Expressionsverhaltens sei. Tatsächlich beschreibt Benya 1990, daß
durch Trypsin Strukturen der Zelloberfläche geschädigt oder zerstört werden, z.B.
Rezeptoren, die auch an der Genexpression regulatorisch beteiligt sein könnten
(142).
In der Tat konnten wir in einem orientierenden Zusatzversuch (Trypsin-Studie)
zeigen, daß unterschiedliche Einwirkzeiten von Trypsin zwischen 0 und 6 Minuten
ein deutlich unterschiedliches Ausmaß des Umschaltens in der Kollagensynthese
bewirkt: die Dauer der Trypsininkubation korrelierte direkt mit dem Anteil von
Kollagen-Typ-I-positiven Zellen. Der angeführte Versuch hat jedoch nur grob
orientierenden Charakter und entbehrt sowohl einer ausreichenden Fallzahl als auch
einer angemessenen Quantifizierung. Dennoch soll diese orientierende Beobachtung
dazu anregen, diesen Einfluß genauer zu untersuchen. Gegebenenfalls könnte sich
dabei die Empfehlung ergeben, in der Monolayerkultur grundsätzlich auf das zum
Passagieren allgemein übliche Trypsin zu verzichten und zum Preis einer mehrfach
längeren Einwirkzeit auf Kollagenase zu wechseln.
Ist es indes berechtigt, das Trypsin alleine für den Verlust des charakteristischen
Phänotyps verantwortlich zu machen? Zum einen stammen die Präparate mit der
Bezeichnung „P1“ vom Ende (!) der ersten Subkultur. Die Knorpelzellpopulation
ist zu diesem Zeitpunkt also bereits 14 Tage alt. Nach der ersten Passage ist also
wiederum eine Woche Zellkultur vergangen. Zum anderen zeigen bereits die
Präparate der Primärkultur eindeutig, daß die Trypsinexposition die alleinige
Ursache nicht sein kann.
70
Denn bereits in der Primärkultur P0 tauchen die ersten Zellen auf, die eindeutig
negativ für Kollagen-Typ II und dreifach positiv für Kollagen-Typ I sind. (vgl.
Abb. 6a, S. 44). Bereits in der Primärkultur, also vor dem ersten Kontakt mit
Trypsin, schalten die ersten Chondrozyten ihre Kollagensynthese um. Sollte daher
die primäre Inkubation in Kollagenase die Ursache für die Entdifferenzierung sein?
Bei der genauen Betrachtung der Untersuchungsergebnisse fallen zwei
Beobachtungen auf, die gegen diese Annahme sprechen.
1.) Die Inkubation in Kollagenase dient der Isolierung der Chondrozyten aus der sie
umgebenden Extrazellulärmatrix. In der Zeit nach der Isolierung, sprich im
Normalfall in der Primärkultur, zeigen aber alle Chondrozyten zumindest eine
leicht, meist aber eine ausgeprägt positive Immunreaktivität für Kollagen-Typ II.
Diese Beobachtung spricht gegen eine unmittelbar knorpelzellschädigende Wirkung
von Kollagenase.
2.) Ähnlich wie bei der Metachromasie und Basophilie beschrieben (vgl. 4.1.2)
sind nach einer 24-stündigen Inkubation in Kollagenase 10 -30 % der Zellen im
Zellausstrich vor der Primärkultur (prä-P0) Kollagen-Typ II positiv. Wird die
Dauer der Inkubation aber auf 42 Stunden erhöht, so finden sich bis über 50 % der
Knorpelzellen zweifach positiv für Kollagen-Typ II (vgl. Abb. 5 b, S. 43) Die
Anzahl der Zellen, die den charakteristischen differenzierten Phänotyp der
Chondrozyten exprimieren, nimmt somit mit zunehmender Dauer der Inkubation in
Kollagenase sogar noch deutlich zu. Ein knorpelzellschädigender Einfluß der
Kollagenase erscheint daher unwahrscheinlich.
Zusammenfassend wäre also ein die Entdifferenzierung vorantreibender Einfluß des
Trypsins weiter zu prüfen, während der Kollagenase in diesem Zusammenhang
zumindest keine unmittelbare Bedeutung zuzukommen scheint.
Als weitere Beobachtung bestätigt sich auch hier die Arbeitshypothese aus 4.1.2,
daß die Anzahl der den charakteristischen Phänotyp exprimierenden Chondrozyten
eine Funktion der Zeit nach ihrer Isolierung aus der sie umgebenden Knorpelmatrix
ist. Für diese Annahme spricht auch eine zweite Beobachtung: Nach der Inkubation
mit Hyaluronidase erscheint die Grundsubstanz des nativen hyalinen Knorpels
deutlich positiv für Kollagen-Typ II. Das Zytoplasma der Chondrozyten im
Gewebeschnitt ist dagegen unverändert negativ (vgl. Abb. 4 b, S. 42). Früher
herrschte die Vorstellung, daß Knorpelzellen in reifem Gelenkknorpel inaktive,
stoffwechselarme Zellen seien. Inzwischen hat es jedoch bereits Einzug in die
Lehrbücher genommen, daß das Gegenteil der Fall ist.
71
Es wird beschrieben, daß die Knorpelzellen des hyalinen Gelenkknorpels einen sehr
regen Stoffwechsel haben. Elektronenmikroskopisch spiegelt sich diese hohe
Stoffwechselaktivität in einem Reichtum an Mitochondrien und an rauhem
endoplasmatischen Retikulum sowie einem großen Golgi-Apparat wieder (3, 30,
91). Diese hohe Stoffwechselaktivität ist für den ständigen Umsatz der
Extrazellulärmatrix auch im reifen Gelenkknorpel erforderlich (175). Eine Störung
dieses Gleichgewichts zwischen kontinuierlichem Auf- und Abbau der
Matrixbestandteile ist ein entscheidender pathogenetischer Gesichtspunkt in
Überlegungen zur Entstehung von degenerativen Gelenkerkrankungen (24, 75, 98,
121, 166, 193, 185 u.a.). „Ruhende“ Zellen im Sinne von stoffwechselinaktiven
Knorpelzellen scheinen die Chondrozyten des Gelenkknorpels demzufolge im
Normalfall nicht zu sein. Dennoch kann man sie offenbar in einem Zustand
antreffen, in dem sie gerade kein Kollagen-Typ II produzieren. Denn
intrazytoplasmatisch, wo die Kollagensynthese ablaufen müßte, ist kein
Kollagen-Typ II darstellbar, wie es ja hingegen in der Primärkultur der Fall ist.
Entweder die Kollagen-Typ II-Produktion verläuft also diskontinuierlich, oder aber
die entsprechende Synthese verläuft kontinuierlich, aber auf so niedrigem Niveau,
daß sie unserer immunzytochemischen Darstellung entgeht. So beziffert R. Putz die
Halbwertszeit der zellulären und extrazellulären Anteile des Knorpels mit 800-1000
Tagen (14). In jedem Fall aber scheint die Befreiung der Chondrozyten aus der sie
umgebenden Extrazellulärmatrix ein Stimulus zu sein, der sie innerhalb von
Stunden bis Tagen in überaus stoffwechselaktive Zellen verwandelt. Diese
Beoachtung hatten wir bereits bei der P0-Metachromasie-Studie gemacht (vgl.
4.1.2). Da diese Zunahme der für den hyalinen Knorpel charakteristischen
Stoffwechselaktivität nach der Isolierung der Zellen aber selbst in Kollagenase-
lösung zunimmt, kann - wie oben bereits festgestellt - die Inkubation in eben dieser
Lösung schwerlich Ursache für den Verlust der Expression des knorpelspezifischen
Phänotyps sein.
72
4.2.2 Kollagen-Typ III und V
In der Primärkultur boviner Chondrozyten zeigt sich für Kollagen-Typ III und
Typ V ein buntes Bild. Von Zelle zu Zelle finden sich sehr unterschiedlich intensive
Anfärbungen. Für Kollagen-Typ III liegt die Färbeintensität zwischen nahezu
negativ bis stark positiv (+++), für Kollagen-Typ V zwischen ein- bis dreifach
positiv (In diesem Fall bewirkt die Mittelung der Intensitäten der Immunreaktivität
über der Gesamtheit der Zellen pro Population wie bereits erwähnt einen deutlichen
Verlust an Aussagekraft in der synoptischen Darstellung unter 3.4, daher das
Sternchen [* ]). Im Zellausstrich prä-P0 hingegen zeigen sich nur ganz vereinzelt
Zellen, die positiv für Kollagen-Typ III sind, während fast alle Chondrozyten eine
ein- bis zweifach positive Reaktion für Typ V aufweisen. Nach der ersten Passage
ist das Bild für beide Antikörper dagegen recht homogen: mit nur unwesentlichen
Intensitätsunterschieden zeigen sich nahezu alle Zellen zweifach positiv, wobei
Kollagen-Typ V tendenziell etwas intensiver gefärbt ist (vgl. Abb. 7, S. 45).
Bei Kenntnis der Literatur läßt dieses Ergebnis zuerst an eine Fehlbestimmung
denken. Man würde erwarten, daß die Färbungen für Kollagen-Typ III und V als
„Nicht-Knorpel-Kollagene“ genauso wie für Kollagen-Typ I bis zur Primärkultur
negativ sind und hätte ab der ersten Subkultur mit einer positiven Immunreaktivität
gerechnet. Wodurch jedoch eine Fehlbestimmung etwa durch Verwechslung von
Antikörpern quasi ausgeschlossen ist, möchte ich in einer kurzen Fehlerdiskussion
ausführen.
Jede der Antikörperfärbungen ist parallel am gleichen Tag wie auch in der Folge an verschiedenen Tagen
durchgeführt worden. Parallel am gleichen Tag, das bedeutet mit anderen Schnitten bzw. Zellpopulationen
von unterschiedlichen Individuen auf anderen Objektträgern, jedoch mit identischen Färbelösungen. In
der Folge an verschiedenen Tagen, d.h. mit entsprechend neu angesetzten Lösungen. Eine Verwechslung
der Schnitte, eine Fehlbeschriftung der Objektträger oder eine Inkubation mit einem falschen Antikörper
sind daher unwahrscheinlich. Bei erneuter Versuchsdurchführung mit neuen Schnitten bzw.
Zellpopulationen von anderen Individuen unter peinlich genauer Beachtung und Kontrolle der
Beschriftung der Objektträger und der entsprechenden Antikörperinkubation erhielten wir die gleichen
Ergebnisse. Eine unspezifische Anfärbung durch eine endogene Gewebeperoxidase oder eine
unspezifische Bindung der Kaninchen-Zweitantikörper ist ausgeschlossen. Die Hemmung der endogenen
Peroxidase durch 1%iges H2O2 in Methanol sowie die Abdeckung unspezifischer Bindungsstellen durch
normales Kaninchenserum erfolgte protokollgemäß. Zudem waren die entsprechenden Kontrollen K1 und
K2, die simultan in der gleichen Küvette in DAB entwickelt wurden, zweifelsfrei negativ.
73
Eine zusätzliche Kontrolle war dadurch gegeben, daß die verwendeten 4- bzw. 8-Kammer-Lab-Teks die
gleichzeitige Anfärbung von 4 bis 8 getrennten Populationen auf einem Objektträger erlauben. Dabei
wurden sowohl Populationen von verschiedenen Passagen (z.B.P0/ P1/ P3) als auch unterschiedliche
Zellarten (Chondrozyten/ Fibroblasten) streng getrennt also ohne Kontaminationsmöglichkeit auf
einem Objektträger kultiviert und dann aufgearbeitet. Jegliche Unregelmäßigkeit der Färbeergebnisse
innerhalb des Kulturverlaufs einer Zellpopulation oder innerhalb der gleichen Subkultur bei
verschiedenen Populationen hätte somit beim Vergleich auffallen müssen.
Da wir pro Antikörper nur mit einer Charge gearbeitet haben, wäre theoretisch (!) ein Verpackungs- oder
Beschriftungsfehler durch die Hersteller denkbar, da alle Versuche in diesem Falle durchweg mit dem
falschen Antikörper durchgeführt worden wären. Dann aber hätte der fälschlich z.B.als „ Goat-Anti-
Type-V-Collagen“ bezeichnete Antikörper keiner der damals käuflichen fünf Ziegenantikörper (gegen die
Kollagen-Typen I, II, III, IV und V) sein können. Denn Antikörper gegen Typ IV färben nur das Kollagen
von Basalmembranen und zeigten sich in Vorversuchen wie erwartet negativ für Chondrozyten und
Fibroblasten. Die übrigen Antikörper haben wir alle durchgehend verwendet, konnten jedoch kein
identisches Verteilungsmuster der Immunreaktivitäten für zwei nominell unterschiedlich Antikörper
feststellen. Insgesamt ist eine wirkliche Verwechslung der Antikörper also praktisch nicht möglich.
Leider werden auch weiterhin außer dem inzwischen zusätzlich verfügbaren Anti-Kollagen-Typ VI keine
weiteren Antikörper gegen die übrigen der 14 bekannten Kollagene angeboten. Insbesondere ein Anti-
Kollagen-Typ XI hätte Aufschluß über das jetzt leider nur spekulativ klärbare Färbeverhalten geben
können.
Wie in der Einleitung bereits dargestellt, besitzen die „Knorpel-Kollagene“ der
Gruppen I und III jeweils homologe Gegenstücke unter den „Nicht-Knorpel-
Kollagenen“. Das dem Kollagen-Typ V entsprechende Knorpel-Gegenstück ist das
Kollagen-Typ XI. Die Kollagene Typ V und XI sind sich gemäß der Literatur in
Struktur und Funktion sehr ähnlich. Denkbar wäre hier daher die Möglichkeit einer
ausgeprägten Kreuzreaktivität. In diesem Falle läge es nahe anzunehmen, daß beim
Übergang von der relativ homogenen Anfärbung in dem prä-kulturellen Ausstrich
prä-P0 über das „bunte Bild“ in der Primärkultur P0 zur homogenen Anfärbung in
der ersten Subkultur P1 möglicherweise ein Umschalten vom als Knorpel-Kollagen
bekannten Typ XI auf das bisher als Nicht-Knorpel-Kollagen angesehene Typ V
erfolgt. Ein vergleichbares Verhalten finden wir ja bei den analogen Kollagenen
Typ II und I, bei denen es zu einem Umschalten von der Primär- zur ersten
Subkultur kommt. Eine sichere Klärung dieser Frage wäre erst durch die
Anwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen-Typ XI zu erreichen.
Bedauerlicherweise sind diese jedoch bisher nicht käuflich zu erwerben. Auf
Anfrage war von der Herstellerfirma zu erfahren, daß bei der Prüfung der Spezifität
der Anti-Kollagen-Typ-V-Antikörper leider auch keine Prüfung auf Kreuzreaktivität
mit Kollagen-Typ XI erfolgte.
74
Somit sind unsere Ergebnisse bezüglich des Nachweises von Kollagen-Typ V in
hyalinem Knorpel und Chondrozyten unter dem Vorbehalt zu betrachten, daß eine
Kreuzreaktivität mit Kollagen-Typ XI denkbar wäre.
Für Kollagen-Typ III gibt es kein spezielles auf seine Kreuzreaktivität
möglicherweise ungeprüftes Analogon, wie es der Kollagen-Typ V in dem Typ XI
hat. Desweiteren würde es überraschen, nur bei einem der vier verwendeten Anti-
Kollagen-Antikörper eine derart ausgeprägte unspezifische Färbung zu finden. Wo
eine Zellpopulation für Kollagen-Typ I oder II negativ ist, zeigt sich dort kein
Anhalt für eine unspezifische Grundtönung. Wie in der Fehlerdiskussion bereits für
Anti-Kollagen-Typ V ebenso auch für Anti-Kollagen-Typ III gültig besprochen,
wurde eine unspezifische Färbung zudem durch die beiden Kontrollen K1 und K2
ausgeschlossen. Jedoch nicht nur die Zellen des Zellausstrichs prä-P0 und der
Primärkultur P0 zeigen eine positive Reaktion für Kollagen-Typ III, auch die
Chondrone der Gefrierschnitte von hyalinem Knorpel zeigen eine schwache, aber
deutlich positive Immunreaktivität. Es ist daher anzunehmen, daß hier tatsächlich
ein bestimmtes Antigen mit dem verwendeteten „Kollagen-Typ III“-
Immunglobulinen nachgewiesen wird. Da diese Antikörper aber durch Injektion von
gereinigetem Kollagen-Typ III aus humanen und bovinen Plazentarvilli
gewonnen wurden und auf ihre Spezifität vom Hersteller an Kollagen-Typ III
geprüft wurden, liegt es selbst bei Kenntnis der Literatur nahe, daß das
nachgewiesene Antigen nichts anderes als tatsächlich Kollagen-Typ III ist.
Weshalb würde man ausgehend von der Literatur für hyalinen Knorpel und daraus
isolierten Chondrozyten keinen Nachweis von Kollagen-Typ III oder V erwarten?
Miller und Gay stellen 1987 unter den faserbildenden Kollagenen die
Typen I, III und V als Kollagene von Nicht-Knorpelgewebe den
„Knorpelkollagen-Typen“ II und K (heute als Typ XI bezeichnet) gegenüber (147,
vgl. Tab. 1). Auch van der Rest und Garrone, 1991, sehen „eine dichotome
Sicht von zwei Systemen“ sich abzeichnen, „eines um Kollagen-Typ I verbunden
mit Typ III und V und das andere um Kollagen-Typ II verbunden mit Typ XI“
(176). Heißt das nun definitiv, daß man davon ausgeht, daß die Kollagen-
Typen III und V nicht in hyalinem Knorpel vorkommen? Beide Arbeitsgruppen
legen zwar diese Zweiteilung der Kollagene in solche von Knorpel- auf der einen
und von Nicht-Knorpelgewebe auf der anderen Seite nahe. Sie schließen aber ein
Vorkommen von Kollagen-Typ III und V im hyalinen Knorpel nicht kategorisch
aus. Explizit erfolgt ein solcher Ausschluß nur in der anderen Richtung: für das
Vorkommen von Knorpelkollagenen in Nicht-Knorpelgewebe.
75
Auch da formulieren Miller und Gay noch vorsichtig: „ (...) 4 der 11 (1987
bekannten [Anmerkung des Autors]) Kollagene sind hauptsächlich, wenn nicht
ausschließlich, im hyalinen Knorpel oder knorpelartigen Geweben abgelagert (...)“
(147). Burgeson, 1988, drückt es entschiedener aus, aber ebenfalls mit dem Blick
in obige Richtung: „Die Typen II und XI sind auf Knorpelgewebe beschränkt.“(28)
Schon die Erstbeschreiber des Kollagen-Typ II Miller und Matukas hatten 1969
dieses Kollagen als „in Knorpel, nicht aber in Knochen und Haut vorhanden“
beschrieben (148). Der hyaline Knorpel wurde zwar um „knorpelartige Gewebe“
wie den Nucleus pulposus der Bandscheibe und das Corpus vitreum des Auges
ergänzt. In dieser Form ist die auf Knorpel beschränkte Verteilung des Kollagen-
Typ II jedoch wiederholt bestätigt worden (58, 141, 161).
Später kamen dann zwei weitere knorpelspezifische Kollagene hinzu. Der Kollagen-
Typ XI war anfangs als 1α2α3α-Kollagen oder Kollagen-Typ K bekannt
(Burgeson und Hollister, 1979 in 147). Kollagen-Typ IX war Anfang der achtziger
Jahre von verschiedenen Arbeitsgruppen um Schimokomaki, Ayad und Reese
zunächst in Form Pepsin-unlöslicher Fragmente in einer verwirrenden Vielzahl von
Bezeichnungen beschrieben worden. Erst die Arbeitsgruppen um Ninomiya, M.
von der Rest, Mayne und Olsen konnten 1984/85 gemeinsam zeigen, daß es sich
um Fragmente eines einzigen neuen Kollagentyps handelte. Sie nannten ihn
Kollagen-Typ IX (147). Alle drei Kollagentypen (II, IX und XI) werden also
übereinstimmend als knorpelspezifisch angesehen. Das bedeutet, daß diese
sogenannten Knorpelkollagene nicht in Nicht-Knorpelgewebe vorkommen.
Allerdings heißt das nicht automatisch, daß die Autoren umgekehrt davon ausgehen,
daß Nicht-Knorpelkollagene nicht zusätzlich zu den Knorpelkollagenen auch in
hyalinem Knorpel vorkommen könnten. Diesbezüglich fand sich keine definitive
Aussage in der Literatur. Auf der anderen Seite hat bisher noch niemand das
Vorkommen der Kollagen-Typen III und V in hyalinem Knorpel berichtet. Unter
dem obengenannten Vorbehalt, daß eine Kreuzreaktivität mit Kollagen-Typ XI
noch auszuschließen ist, beschreibe ich daher hiermit als einer der ersten das
Vorhandensein und die Synthese der normalerweise in Nicht-Knorpelgewebe
gefundenen Kollagen-Typen III und V in hyalinem Gelenkknorpel und daraus
isolierten Chondrozyten.
Bei der Reaktion mit Kollagen-Typ III wie Typ V fällt in der Primärkultur auf, daß
die Intensität der Immunopositivität enorm schwankt („buntes Bild“). Manche
Zellen reagieren nur sehr schwach, andere dagegen sehr ausgeprägt mit den
Antikörpern. Dies legt das Vorliegen von verschiedenen Subpopulationen nahe, die
in verschiedenem Maße die genannten Kollagentypen synthetisieren.
76
Auch in dem Zellausstrich prä-P0 beobachten wir zwar für Kollagen-Typ III, daß
nur manche Chondrozyen mit den Antikörpern reagieren und ein Großteil keine
Reaktion zeigt. Dieses Phänomen hatten wir jedoch auf die unterschiedliche Latenz
bis zur aktiven Expression des charakteristischen Phänotyps nach der Befreiung aus
der Extrazellulärmatrix zurückgeführt. Dabei beträgt diese Latenzzeit bei den
anderen histochemisch oder immunhistochemisch nachgewiesenen
Biosyntheseprodukten maximal wenige Tage. Zumindest für die
Glykosaminoglykane und die beiden anderen Kollagentypen I und II ergab sich
zum Zeitpunkt der Färbung der Primärkultur P0, d.h. nach sieben Tagen
Monolayerkultur, ein homogenes Bild. Daher wäre es bei dem bunten Bild selbst
noch in der Primärkultur durchaus denkbar, daß in der P0 verschiedene
Subpopulationen von Knorpelzellen vorliegen, die zwar alle Kollagen-Typ II, aber
in unterschiedlichem Ausmaß auch Typ III und V synthetisieren.
Dabei müssen mindestens die drei folgenden unterschiedliche Möglichkeiten
erwogen werden.
1.) Es handelt sich um echte Chondrozytensubpopulationen, die sich jedoch nur
durch den Zeitpunkt des Einsetzens der vermehrten Stoffwechselaktivität oder durch
eine verfrühte Entdifferenzierung unterscheiden.
Das bunte Bild ergibt sich aus Knorpelzellen, die nach der Befreiung aus der
Extrazellulärmatrix erst verspätet beginnen, den charakteristischen Phänotyp zu
exprimieren (d.h. zum Teil länger als eine Woche dazu benötigen) und/oder einer
verfrühten Entdifferenzierung unterliegen. In letzterem Fall sähe man das Kollagen-
Typ III also nicht als in hyalinem Knorpel regulär vorkommendes Protein sondern
bereits als Entdifferenzierungsprodukt an.
Eine verspätete Aktivierung des Stoffwechsels für diesen speziellen Kollagentyp ist
zwar aufgrund der etwa gleich langen Latenzzeit für die anderen
Stoffwechselprodukte (s.o.) unwahrscheinlich, aber nicht unmöglich. Ebenso kann
man eine im Vergleich zur Expression der Kollagen-Typen II und I sowie der
Glykosaminoglykane verfrühte Entdifferenzierung nicht ausschließen, wenn sie
auch nicht wahrscheinlich ist. In diesem Fall wäre Kollagen-Typ III als ein
besonders empfindlicher Marker für die Entdifferenzierung anzusehen, da die
Chondrozyten unter entsprechenden Kulturbedingungen offenbar zuerst mit einer
für sie untypischen Kollagen-Typ III-Synthese beginnen. In diesem Falle müßte
man jedoch die zwar nur leichte, aber doch deutlich positive Immunreaktivität der
Chondrone in den Gefrierschnitten von hyalinem Knorpel als unspezifische
Reaktion ansehen (was de facto durch die negativen Kontrollen K1 und K2
ausgeschlossen ist). Eine derart ausgeprägte unspezifische Kreuzreaktivität würde
einen Antikörper indes als besonders empfindlichen Marker disqualifizieren.
77
2.) Es handelt sich zwar um eine echte Mischpopulation, jedoch nicht aus
verschiedenen Chondrozytenpopulationen, sondern aus Knorpelzellen und Nicht-
Knorpelzellen. D.h. es liegt eine Kontamination mit Synoviozyten, Osteoblasten
oder Fibroblasten aus dem Perichondrium vor, die quasi fälschlich in dem Ausstrich
prä-P0 und in der Primärkultur P0 von Chondrozyten eine partielle
Immunopositivität für Kollagen-Typ III vortäuschen.
Das Problem der Überwucherung durch Fibroblasten bildete früher bei der
Erstellung von Knorpelzellkulturen aus embryonalem Hühnerknorpel ein
Hauptproblem (124). Dabei wurde der Knorpel meist aus dem Brustbein oder aus
Extremitätenknospen von Hühnerembryonen entnommen. Die Überwucherungs-
theorie stellte sogar einen Erklärungsversuch für die Entdifferenzierung von
Knorpelzellen in Kultur dar (27, 160, 198). Extrinsische Perichondriumzellen
unterdrückten die phänotypische Expression von embryonalen Hühner-
chondrozyten in Kultur (198). Der Gelenk(!)knorpel von Säugetieren ist jedoch
nicht nur avaskulär und damit frei von jedem fibrovaskulären Begleitgewebe (124,
191), sondern ist auch von keinem Perichondrium überzogen (14, 16). Hyaliner
Gelenkknorpel ist neben der Linse des Auges das einzige Gewebe des menschlichen
Körpers, das nur aus einer einzigen Zellart aufgebaut ist (64, 124). Der
Gelenkknorpel ist also optimal geeignet, um echte Reinkulturen einer einzigen
Zellart zu gewinnen. Wie ausführlich unter 2.1.1 beschrieben, wurde äußerste
Sorgfalt darauf gelegt, bei der Probenentnahme jegliche Kontamination mit
subchondralen Knochen oder angrenzender Synovialmembran zu verhindern.
Etwaige an der Knorpeloberfläche haftende Synoviozyten wurden mit der
Synovialflüssigkeit mittels steriler Kompressen entfernt und schließlich durch das
wiederholte Spülen mit Pufferlösung sicher beseitigt. Was darüber hinaus eine
Verunreinigung durch Fibroblasten vollends unwahrscheinlich macht, sind zwei
Tatsachen:
a.) In gleicher Weise wie es Manning und Bonner (137) für ihre Primärkultur von
humanen Chondrozyten beschreiben, finden sich auch bei uns in den ersten 48
Stunden keine Zellen, die ein ausgeprägtes Spreading zeigen, was für Fibroblasten
bekanntlich nach wenigen Stunden charakteristisch ist. Zudem hätten dann gerade
die in dem Zellausstrich prä-P0 bereits immunopositiven Zellen ein ausgeprägtes
Spreading zeigen müssen. Eine solche Korrelation ist indes nicht zu beobachten.
b.) Die beschriebenen Zellen sind nur für Kollagen-Typ III und - falls die Zellen
identisch sein sollten - eventuell noch für Kollagen-Typ V positiv. Kollagen-Typ I
aber konnte in dem präkulturellen Zellausstrich prä-P0 überhaupt nicht und in der
Primärkultur P0 nur ganz vereinzelt nachgewiesen werden.
78
Unsere biologischen Kontrollen aber zeigen: von einem Fibroblasten wäre zu
erwarten, daß er sich mit Anti-Kollagen-Typ I deutlich positiv anfärbt. Denn zu
jedem Zeitpunkt der Kultur von bovinen Fibroblasten, sowohl von straffen wie von
lockerem Bindegewebe, war die positive Immunreaktivität für Kolagen-Typ I am
stärksten.
Eine Verunreinigung durch Nicht-Knorpelzellen erscheint also sehr
unwahrscheinlich.
3.) Es handelt sich um echte Chondrozytensubpopulationen, die auch in situ
Kollagen-Typ III synthetisieren und für die leichte Immunopositivität des hyalinen
Knorpels für Kollagen-Typ III in der In-situ-Kontrolle verantwortlich sind.
Tatsächlich werden in Abhängigkeit von den verschiedenen Zonen des
Gelenkknorpels (dünne oberflächliche oder tangentiale Schicht, mittlere oder
Übergangsschicht, tiefe Radiärschicht und schließlich kalzifizierte Schicht [7, 41])auch unterschiedliche Subpopulationen von Knorpelzellen mit voneinander
abweichenden charakteristischen Biosyntheseprofilen beschrieben. Aydelotte und
Mitarbeiter (9) isolierten 1990 Chondrozyten aus verschiedenen Tiefen des
Gelenkknorpels. Sie beschreiben, wie die Zellen unter gleichen Kulturbedingungen
in Agarose-Kultur ihre für die jeweilige Schicht charakteristischen metabolischen
Unterschiede beibehalten. Sie beziehen sich dabei insbesondere auf den Anteil an
Keratansulfat von der Gesamtheit der Glykosaminoglykane. Solch eine
unterschiedlich ausgeprägte Synthese für verschiedene Chondrozyten-
subpopulationen wäre auch für die Kollagen-Typen III und V denkbar.
Einschränkend muß dabei jedoch angemerkt werden, daß sich in unseren
Gewebeschnitten keine differenzielle Verteilung der Immunopositivität für
Kollagen-Typ III oder V in Abhängigkeit von dem Abstand zu der natürlichen
Knorpeloberfläche zeigt.
Betrachtet man die Immunreaktivitäten für Kollagen-Typ III und V über den
gesamten Kulturverlauf, dann fällt in jedem Fall beim Übergang von der
Primärkultur P0 zur ersten Subkultur P1 eine deutliche Änderung im
Antigenexpressionsverhalten der Chondrozyten auf. Bei beiden wandelt sich ein
buntes Bild unterschiedlicher Intensitäten in eine gleichmäßige etwa zweifach
positive Anfärbung. (Durch die Mittelung der Intensitäten in der synoptischen
Darstellung unter 3.4 entstünde übrigens ohne das Sternchen (*) der Eindruck, als
fände für Kollagen-Typ V überhaupt kein Wandel statt.). Für Kollagen-Typ III ist
dieser Wandel mit einer Zunahme der mittleren Färbeintensität verbunden, d.h. es
wird insgesamt mehr Antigen synthetisiert.
79
Für Kollagen-Typ V bleibt die mittlere Färbeintensität erhalten. Manche Zellen
synthetisieren also mehr Antigen, andere jedoch weniger. Ab der ersten Subkultur
produzieren somit alle Zellen eine etwa gleich große Menge von Antigenen, die sich
durch Antikörper gegen Kollagen-Typ III und V darstellen lassen. Es fällt auf, daß
dieser Wandel im Antigenexpressionsverhalten genau zu demselben Zeitpunkt im
Verlauf der Kultur stattfindet wie auch bei den Kollagen-Typen I und II sowie bei
der Metachromasie bzw. Basophilie der Glykosaminoglykane.
Zusammenfassend läßt sich sagen: Wenn auch nicht so eindeutig wie bei den
Kollagen-Typen I und II, so findet doch ebenso bei den Kollagentypen III und V
ein Umschalten im Biosyntheseprogramm beim Übergang von der Primär- zu der
ersten Subkultur statt. Bei den bisher als Marker gebräuchlichen Kollagen-Typen I
und II erfolgt ein vollständiges An- bzw. Abschalten: Synthese ja oder nein. Beim
Übergang zur ersten Passage wird Kollagen-Typ II „abgeschaltet“ und die Typ I-
Produktion „angeschaltet“. Bei den Kollagen-Typen III und V erfolgt ein
Umschalten von einer in verschiedenen Chondrozytenpopulationen offenbar
unterschiedlichen Syntheseaktivität in eine für alle Zellen gleich starke
Antigenproduktion. In diesem Sinne sind die Chondrozytenpopulationen offenbar
„gleichgeschaltet“ worden. Zudem ist die Synthese von Kollagen-Typ III von einer
mittleren Produktionsstufe „1“ auf „2“ „hochgeschaltet“ worden, um das Bild von
Klaus von der Mark zu modifizieren. Inwieweit bei der Immunreaktivität für
„Kollagen-Typ V“ evt. auch ein Umschalten von initial tatsächlichem Kollagen-Typ
XI auf tatsächliches Kollagen-Typ V erfolgt, läßt sich wie gesagt mit den z.Z.
erwerblichen Antikörpern letztlich nicht eindeutig klären.
80
4.2.3 S-100, S-100-α ,S-100-β
Für das S-100-Protein findet sich im gesamten Verlauf der Kultur keine Änderung
in der Antigenexpression. Vom Gewebeschnitt über den präkulturellen
Zellausstrich prä-P0 und die Primärkultur P0 bis hin zur 6. Passage sind die
Chondrozyten durchweg dreifach positiv gefärbt (vgl. Abb. 9 a-c, S. 47). Beim
Übergang von der Primär- zur ersten Subkultur hatten wir in den histochemischen
Färbungen ein deutliches Nachlassen in der knorpelspezifischen
Glykosaminoglykansynthese beschrieben. Da das S-100-Protein nach der ersten
Passage keine solche Änderung in der Immunreaktivität zeigt, muß die These von
Karabela-Bouropoulou (92) in Frage gestellt werden. Er hatte 1988 darüber
spekuliert, ob S-100 möglicherweise an einem zellulären Kontrollmechanismus
beteiligt sei, der die Glykosaminoglykan-Kollagen-Wechselwirkungen reguliert. In
diesem Fall wäre zumindest ein Rückgang der Immunopositivität für S-100 zu
erwarten gewesen. Dies ist aber insbesondere nach der 1. Passage nicht der Fall. Da
das Antigenexpressionsverhalten sich bei der Entdifferenzierung zwar für die
spezifischen Hauptsyntheseprodukte der Chondrozyten (Kollagen-Typ II und
knorpelspezifische Proteoglykane) ändert, nicht aber für das S-100-Protein, scheint
dieses saure Protein nicht charakteristisch für den differenzierten
Chondrozytenphänotyp zu sein.
Die Arbeitsgruppe um die Japaner Haimoto und Kato (67) beschreibt hingegen eine
differenzielle Verteilung der Untereinheiten des S-100-Proteins für
Chondrozyten (+) und Fibroblasten (-). Tatsächlich zeigt sich auch bei uns für eine
dieser beiden Untereinheiten ein charakteristischer Wandel im Antigenexpressions-
verhalten beim Übergang von der Primär- zur ersten Subkultur. Die β-Untereinheit
ist über die erste Passage hinaus unverändert zwei- bis dreifach positiv in ihrer
Immunreaktivität. S-100-α dagegen wird von der ersten Subkultur an deutlich
weniger nachweisbar und nimmt bei den folgenden Passagen kontinuierlich ab, bis
schließlich keine Reaktion mehr zu beobachten ist. Auch die In-situ-Kontrolle legt
nahe, daß die Expression der α-Untereinheit charakteristisch für den differenzierten
Phänotyp des Chondrozyten ist. Nach der Demaskierung der Epitope mittels
Hyaluronidase wird eine zwei- bis dreifach positive territoriale Anfärbung für
S-100-α sichtbar. Diese Verteilung entspricht derjenigen der Metachromasie bzw.
der Basophilie in den histochemischen Färbungen und somit den durch Giemsa
bzw. Hämalaun nachgewiesenen knorpelspezifischen Proteoglykanen.
81
Das wiederum läßt die von Karabela-Bouropoulou diskutierte These in einem neuen
Licht erscheinen. Es wäre denkbar, daß S-100-a0 an dem von ihm genannten
zellulären Kontollmechanismus bei der Regulation zwischen Glykosaminoglykanen
und Kollagen beteiligt ist. Als S-100-a0 wird die Form des dimeren S-100-Proteins
bezeichnet, die nur aus zwei α-Untereinheiten besteht (αα). Die beiden anderen
Formen, S-100-a (αβ) und S-100-b (ββ) bestehen jeweils aus mindestens einer
β-Untereinheit (Isobe et al. in 67, 68, 93, 94). Die Antikörpergewinnung gegen
S-100 erfolgt jedoch zumeist und so auch bei uns durch Immunisierung gegen
S-100-Protein aus Rinderhirn. Dieses besteht aber fast ausschließlich aus S-100-a
und S-100-b. Daher wird mit derart gewonnenen Antikörpern quasi kein S-100-a0
nachgewiesen (68). Die von uns verwendeten Immunglobuline gegen S-100-αweisen im Gegensatz zu denen gegen S-100 gerade diese S-100-a0-Form nach,
eben weil sie aus zwei α-Untereinheiten besteht. Es wäre also denkbar, daß unsere
Antikörper gegen S-100-α speziell die S-100-a0-Form des S-100-Proteins
nachweist. Unabhängig davon, ob das mutmaßliche S-100-a0 tatsächlich
regulatorische Aufgaben wahrnimmt, scheint es jedenfalls vorwiegend extrazellulär
zu liegen und zwar vorwiegend im Bereich der Chondrone, wo auch die
knorpelspezifischen Proteoglykane abgelagert sind.
Beim S-100-β fällt eine im Gegensatz zur α-Untereinheit vor allem auch
intrazelluläre Verteilung auf. Wissend, daß unsere S-100-Antikörper vornehmlich
durch Immunisierung mit S-100-a und -b (αβ bzw.ββ) gewonnen werden,
überrascht es nicht, daß die Verteilung der Immunreaktivität für S-100 und seine
β-Untereinheit einander entsprechen. Beide zeigen neben einer positiven Anfärbung
der Territorien intrazellulär eine perinukleär verdichtete braune Granulierung. Wie
bereits erwähnt, ändert sich im Gegensatz zu der von S-100-α bei diesen beiden
diese Immunreaktivität nicht im Zuge der Entdifferenzierung zu fibroblastenartigen
Zellen. Auch hier zeigt sich, daß die resultierenden Zellen zwar den Fibroblasten
ähnlicher werden, aber durchaus nicht mit ihnen identisch sind. Haimoto und
Mitarbeiter beschreiben die Fibrozyten im Gegensatz zu den für S-100-α- und
-β-positiven Chondrozyten in beiden Fällen als negativ (67). Das entspricht
annähernd unseren Ergebnissen der bovinen Fibroblasten als biologische Kontrolle,
die sich für S-100-α als negativ (vgl. Abb.12, S. 53) und für S-100-β lediglich als
ganz schwach positiv (+) zeigen. Auf die biologische Kontrolle zu den
Chondrozyten möchte ich im kommenden Abschnitt gesondert eingehen.
82
4.3 Fibroblasten als biologische Kontrolle
Das Wachstumsverhalten der Fibroblasten ist im Vergleich zu dem der
Chondrozyten derart andersartig, daß Manning und Bonner das Fehlen eines
solchen Verhaltens als Ausschlußkriterium für die Kontamination durch
Fibroblasten anführen (137). Schon unter 4.1.1 wurde angedeutet, daß
Fibroblasten zur Abgrenzung gegen differenzierte Chondrozyten insbesondere drei
Charakteristika zeigen:
1.) rasches Spreading nach Adhäsion der Zellen innerhalb weniger Stunden
2.) lang-gestreckte spindelförmige Einzelzellmorphologie mit amöboider
Beweglichkeit und
3.) kettenförmiges Wachstum in der Präkonfluenz und eine fischzugartige bis
wirbelförmige Zellverbandsmorphologie in der Konfluenz.
Fibroblasten zeigen weder eine Metachromasie in der Färbung nach Giemsa noch
eine ausgeprägte Basophilie in den Färbungen mit Hämalaun.
Für die histochemischen wie für die immunzytochemischen Färbemethoden fällt
auf, daß keine Änderung des Antigenexpressionsverhaltens während der gesamten
Zellkultur vom Zellausstrich frisch isolierter Zellen bis hin zur 2. Subkultur zu
beobachten ist. Die In-situ-Kontrollen für Kollagen Typen I und III zeigen eine
relativ schwache, aber positive Immunreaktivität. Die Fibroblasten zeigen als Nicht-
Knorpelzellen wie auch in der Literatur beschrieben keine Immunreaktivität für
Kollagen-Typ II (vgl. 28, 58, 141, 147, 161). Alle Fibroblasten bieten eine
positive Reaktion für Kollagen-Typ I (vgl. Abb. 11, S. 51), während sich für
Kollagen-Typen III und V jeweils ein buntes Bild unterschiedlicher
Färbeintensitäten zeigt. Wie für die differenzierten Knorpelzellen wären hier
Mischpopulationen oder auch verschiedene Funktionszustände zu diskutieren.
In gleicher Weise zeigt sich auch für S-100 und seine β-Untereinheit ein buntes Bild
unterschiedlich starker Färbungen jedoch nur in dem Zellausstrich prä-P0. Man
könnte hier eine Analogie zu den Arealen schwach positiver Fasern und den stärker
positiven Septen im Gewebeschnitt des Bindegewebes sehen. Es wäre denbar, daß
die Zellen stärkerer Immunreaktivität am Aufbau der positiver gefärbten Strukturen
in situ beteiligt sind.
83
Ab der Primärkultur zeigen die Fibroblasten hingegen eine homogene Anfärbung.
Interessant ist hier jedoch, daß die Fibroblasten in Monolayerkultur im Vergleich zu
den differenzierten wie auch den entdifferenzierten Chondrozyten durchweg eine
deutlich schwächere Anfärbung mit Antikörpern gegen das S-100-Protein und seine
beiden Untereinheiten zeigen. S-100-β zeigt eine nur ganz schwache
Immunreaktivität, während bei S-100-α überhaupt keine positive Immunreaktion
mehr zu finden ist. Dies entspricht -wie oben bereits erwähnt- annähernd dem, was
Haimoto und Mitarbeiter gefunden haben. Auch das S-100-Protein zeigt bei den
Fibroblasten eine im Vergleich zu den durchweg dreifach positiven Chondrozyten
eine gerade mal einfache Positivität. Hier wird deutlich, daß sich der Phänotyp von
bovinen Fibroblasten unterschiedlichen Ursprungs deutlich nicht nur von
differenzierten, sondern auch entdifferenzierten Chondrozyten unterscheidet.
Inwiefern dieser Befund die drei S-100-Antikörper damit allerdings als neu zu
empfehlende Marker zur Charakterisierung des Phänotyps von Chondrozyten im
Verlauf der Kultur qualifiziert, soll bei der Diskussion der synoptischen Darstellung
der Ergebnisse besprochen werden.
84
4.4 Synoptische Auswertung
Betrachtet man die soeben im einzelnen diskutierten Ergebnisse in der synoptischen
Darstellung, so fällt als erstes das Umschalten des Biosyntheseprofils beim
Übergang von der Primärkultur zur ersten Subkultur auf. Am eindrücklichsten ist
dies bei der histochemischen Darstellung der knorpelspezifischen Proteoglykane
und bei den immunzytochemischen Färbungen von Kollagen-Typ I und II sowie
von S-100-α zu sehen: die ausgeprägte Basophilie bzw. Metachromasie ist nach der
ersten Passage völlig verschwunden, Kollagen-Typ II wird - wie in der Literatur
oftmals beschrieben - durch Kollagen-Typ I ersetzt, und S-100-α erscheint in der
ersten Subkultur in seiner Immunreaktivität stark abgeschwächt, um dann nach den
folgenden Passagen nicht mehr nachweisbar zu sein.
Der Vergleich mit der biologischen Kontrolle läßt in dieser Darstellung deutlich
hervortreten, in welche Richtung die Entdifferenzierung der Chondrozyten erfolgt:
für die eben erwähnten Antigene, die bereits nach der ersten Passage ein
vollständiges Umschalten ihrer Synthese zeigen, setzt sich das
Antigenexpressionsverhalten quasi nahtlos bei den Fibroblasten bzw. deren
Ursprunggeweben fort. Diese äußerst klaren Verhältnisse bestätigen daher die
Kollagen-Typen II und I als bereits bekannte Marker für den differenzierten bzw.
entdifferenzierten Phänotyp und stellen als ganz neuen Marker die α-Untereinheit
des S-100-Proteins heraus. Da das Umschalten jedoch nicht ebenso schlagartig
erfolgt wie bei den beiden Kollagen-Typen, bietet das Anti-S-100-α ihnen
gegenüber jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach für die Praxis keinen Vorteil.
Weder das S-100-Protein noch seine β-Untereinheit zeigen ein Umschalten in ihrer
Synthese in der gesamten Monolayerkultur. Es zeigt sich ein in der gemittelten
Intensität identisches Färbeverhalten vom nativen Knorpel bis hin zur 6. Subkultur
(+++ bzw. ++). Somit eignen sich Antikörper gegen diese beiden Proteine nicht als
Marker für den differenzierten Phänotyp von Chondrozyten in Abgrenzung zu
entdifferenzierten Chondrozyten. Sehr wohl aber verdeutlichen sie, daß die
Chondrozyten sich - wenn auch phänotypisch in Richtung von - keineswegs aber zu
wirklichen Fibroblasten entdifferenzieren. Denn in beiden Fällen zeigen die
fibroblastenartig entdifferenzierten Chondrozyten eine bei weitem ausgeprägtere
Immunreaktivität als die Fibroblasten.
85
In dieser Arbeit sind Antikörper gegen Kollagen-Typ III und V versuchsweise zur
Charakterisierung des Phänotyps von Chondrozyten im Verlauf der
Monolayerkultur verwendet worden. Auf den ersten Blick scheint die synoptische
Darstellung eine nur eingeschränkte Aussagekraft dieser Antikörper nahezulegen,
wenn es um die Abgrenzung gegen entdifferenzierte Zellen geht. Die Unterschiede
in den Immunreaktivitäten sowohl zwischen differenzierten und entdifferenzierten
Chondrozyten als auch zwischen Chondrozyten und Fibroblasten sind gering oder
fehlen. Scheinbar erschwerend kommt hinzu, daß sowohl bei den differenzierten
Chondrozyten wie auch bei den Fibroblasten große Intensitätsunterschiede auftreten
(sog. buntes Bild, gekennzeichnet durch das Sternchen [* ]). Bei beiden sind
Subpopulationen zu diskutieren (s.o.). Gerade dieses Umschalten von
Chondrozytenpopulationen mit sehr ausgeprägten Intensitätsunterschieden zu
solchen mit ausgesprochen einheitlicher Anfärbung kann jedoch als Kriterium für
eine Änderung der phänotypischen Differenzierung gewertet werden. Das Auftreten
des sog. bunten Bildes bei den Fibroblasten im Gegensatz zu den entdifferenzierten
Chondrozyten verdeutlicht aufs neue, daß entdifferenzierte Chondrozyten streng
von Fibroblasten zu unterscheiden sind. Soll jedoch aufgrund des
immunzytochemischen Färbeverhaltens eines einzelnen Chondrozyten auf seinen
Differenzierungsgrad geschlossen werden, dann sind die Antikörper gegen die
Kollagentypen III und V ungeeignet.
86
5 Zusammenfassung
Die Validität und Reliabilität eines Zellkulturmodells von hyalinem Knorpel hängen
entscheidend davon ab, ob es gelingt, die Entdifferenzierung der Knorpelzellen
durch geeignete Marker zu kontrollieren. In der vorliegenden Arbeit wird der
Phänotyp von bovinen Chondrozyten im Verlauf der Monolayerkultur
immunzytochemisch charakterisiert. Dabei kommen neben den bereits als Marker
etablierten Antikörpern gegen Kollagen-Typ I und II auch Immunglobuline gegen
die Kollagen-Typen III und V zur Anwendung, sowie als neuer Ansatz in diesem
Zusammenhang Antikörper gegen das Glykoprotein S-100 sowie seine α- und
β-Untereinheiten. Als Referenzfärbungen dienen klassische histochemische
Färbemethoden.
Differenzierte Chondrozyten zeigen charakteristischerweise erst etwa 48 Stunden
nach der Adhäsion ein ausgeprägtes Spreading. Bereits nach der ersten Passage
erfolgt dieses Spreading ebenso wie bei den als biologische Kontrolle dienenden
Fibroblasten innerhalb weniger Stunden. Dieses Verhalten wird als zellbiologisches
Entdifferenzierungsmerkmal gedeutet.
Die sternförmige Abflachung während der Präkonfluenz in der Primärkultur wird
nicht wie in der Literatur als Entdifferenzierung mit anschließender
Redifferenzierung in der Konfluenz interpretiert. Vielmehr wird als entscheidendes
einzelzellmorphologisches Kriterium für die Entdifferenzierung die spindelförmige
bipolare Ausrichtung der Chondrozyten angesehen, wie sie nach der ersten Passage
zunehmend beobachtet wird. Zellverbandsmorphologisch zeigt sich ein weiterer
Entdifferenzierungsschritt in Richtung eines fibroblastenartigen
Wachstumsverhaltens erst nach fünf bis sechs Passagen bzw. nach drei Wochen
konfluenter Kultur ohne Passage. Die Zellen wachsen dann mehr fischzugartig bis
wirbelförmig.
Die klassische histochemische Färbung nach Giemsa wird aufgrund der sehr
sensitiven metachromatischen Anfärbung der knorpelspezifischen Proteoglykane
trotz seiner im Vergleich zu immunzytochemischen Färbemethoden geringeren
Spezifität als in der Routine sehr geeignete Nachweismethode für den Verlust bzw.
das Wiedererlangen des differenzierten Phänotyps empfohlen.
Sowohl immunzytochemisch als auch histochemisch wird nachgewiesen, daß bereits
während der Inkubation in Kollagenase wie auch in der Primärkultur in
Abhängigkeit von der Zeit seit der Isolierung aus der Extrazellulärmatrix
zunehmend mehr Zellen zu einer verstärkten Synthese knorpelspezifischer
Stoffwechselprodukte (CS-PG, Kollagen-Typ II) angeregt werden.
87
Einzelne Zellen, die bereits Kollagen-Typ I synthetisieren, weisen darauf hin, daß
die Entdifferenzierung ansatzweise auch schon vor der ersten Passage beginnt.
Doch die bei weitem überwiegende Zellzahl zeigt während der Primärkultur eine
klare chondrozytenspezifische funktionelle Differenzierung: ausgeprägte Basophilie
und Metachromasie, Immunopositivität für Kollagen-Typ II und Immuno-
negativität für Kollagen-Typ I. Die α-Untereinheit des Glykoproteins S-100 zeigt
eine gleichartige Anfärbbarkeit und insbesondere nach der ersten Passage dasselbe,
wenn auch nicht ebenso schlagartige Umschalten wie die etablierten Marker des
differenzierten Phänotyps. Insofern kann Anti-S-100-α bedingt als neuer Marker
für den charakteristischen Phänotyp des differenzierten Chondrozyten angesehen
werden. Da S-100-α in Kryostatschnitten von hyalinem Knorpel ebenso wie die
Proteoglykane vor allem im Bereich der Chondrone abgelagert wird, wäre ein
funktioneller Zusammenhang zwischen S-100-α und den knorpelspezifischen
Proteoglykanen denkbar. S-100 selbst sowie seine β-Untereinheit zeigen bis zur
sechsten Passage und somit weit über den Zeitpunkt der Entdifferenzierung hinaus
ein gleichartig positives Färbeverhalten. Sie können daher nicht als spezifisch für
den differenzierten Chondrozyten angesehen werden. Allerdings kann mit Hilfe der
Antikörper gegen diese Proteine der fibroblastenartig entdifferenzierte Chondrozyt
von dem als biologische Kontrolle dienenden wirklichen Fibroblasten deutlich
unterschieden werden. Eine ähnliche, aber weniger klare Unterscheidung ist anhand
der neu verwendeten Antikörper gegen Kollagen-Typ III und V möglich. Bei den
differenzierten Chondrozyten wie bei den Fibroblasten zeigt sich ein „buntes Bild“
sehr unterschiedlicher Intensitäten. Hier können jeweils unterschiedliche
Subpopulationen von Zellen diskutiert werden. Lediglich die entdifferenzierten
Chondrozyten zeigen interessanterweise eine einheitliche Anfärbung. Die
Möglichkeit einer Kreuzreaktivität der verwendeten Antikörper gegen
Kollagen-Typ V mit Kollagen-Typ XI konnte bislang noch nicht sicher
ausgeschlossen werden. Jedoch zeichnet sich die Möglichkeit ab, daß in hyalinem
Knorpel nicht nur sogenannte „Knorpelkollagene“ enthalten sind, sondern auch
„Nicht-Knorpelkollagene“. In dieser Arbeit wird möglicherweise erstmalig die
Synthese und Ablagerung von Kollagen-Typ III durch differenzierte Chondrozyten
beschrieben.
88
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7 Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Universitätsprofessor C.J. Kirkpatrick, M.D.
Ph.D., D.Sc.. Er war so freundlich, mir das Thema der vorliegenden Dissertation zu
überlassen und mich mit vielerlei Anregungen wie auch in der praktischen Durchführung
meiner Arbeit zu unterstützen. Sowohl als Wissenschaftler wie auch als Mensch habe ich
ihn als Vorbild schätzen gelernt.
Für die intensive Betreuung in der praktischen Durchführung und der Auswertung der
Arbeit möchte Frau Dr. Helma Motherby meinen herzlichen Dank sagen. Ihr verdanke ich
viele wichtige Anregungen.
Frau Elfriede Bilo bin ich sehr dankbar, daß sie mich mit viel Geduld an ihrem
Erfahrungsreichtum in den histochemischen Färbetechniken hat teilhaben lassen.
Frau Petra Mertens danke ich, daß sie mich in die immunzytochemischen Techniken
eingeführt hat und mir immer hilfreich zur Seite stand.
8 Lebenslauf
Gerhard Dyckhoff
Lessingstr. 34
69469 Weinheim
1965 Am 26. März in Aachen geboren
als Sohn der Eheleute Oberstudienrat Heinrich Dyckhoff
und Regina Dyckhoff, geb. Scholz
1971 Einschulung in die Grundschule Oberforstbach
1975 Eintritt in das Inda-Gymnasium, Kornelimünster
1984 Abschluß mit dem Abitur
1985 Im Wintersemester Beginn des Studiums der Humanmedizin
an der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
1992 Am 25. Januar Eheschließung mit Birgit Dyckhoff, geb. Vierfuß
1992 Am 3. November Abschluß des Studiums mit dem 3. Staatsexamen
1993/94 Arzt im Praktikum in der Praxis für Kinderheilkunde
von Herrn Dr. M. Blatzheim, Stolberg
1994 Seit Juli Assistent an der Univ.-Hals-Nasen-Ohren-Klinik Heidelberg