MONOFLUOTM KIT - Bio-Rad Laboratories€¦ · MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 1+2 (código 52211) MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 3 (código 52212) 34 ETIQUETA REACTIVOS PRESENTACIÓN R1

MONOFLUOTM KIT

MONOFLUOTM KIT INFLUENZA 2 X 45 PRUEBAS 52209

MONOFLUOTM KIT ADENOVIRUS 45 PRUEBAS 52210

MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 1+2 45 PRUEBAS 52211MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 3 45 PRUEBAS 52212

DETECCION DE LA INFLUENZA A Y B, LAPARAINFLUENZA 1 Y 2, LA PARAINFLUENZA 3 OEL ADENOVIRUS MEDIANTE LAINMUNOFLUORESCENCIA

IVD

INDICE

1 – VALOR CLINICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

2 - PRINCIPIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

3 – COMPOSICION DEL KIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

4 – PRECAUCIONES DE USO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35

5 - MUESTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .365.1 – TÉCNICA PARA LA RECOGIDA DE MUESTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . .36

5.2 – TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS ANTES DEL EXAMEN I.F. . . . . . . .37

5.3 - AISLAMIENTO DEL VIRUS EN EL CULTIVO DE CÉLULAS . . . . . . . . . .37

6 - PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .386.1 – MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38

6.2 – RECONSTITUCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS . . . . . . . . . . .39

6.3 - PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39

7 – INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .407.1 – CONTROL DE CALIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40

7.2 – LECTURA E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . .40

8 – LIMITES DE LA PRUEBA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

9 – CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

10 – CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

11 – REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

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1- VALOR CLINICOLos virus Respiratorio Sincitial, Influenza A y B, para-influenza 1, 2 y 3 ylos Adenovirus son los responsables de las infecciones respiratoriasgraves en niños, ancianos y enfermos. El diagnóstico del origen vírico obacteriano de estas infecciones es fundamental para aplicar las medidasterapéuticas adecuadas.El diagnóstico de estas enfermedades víricas se basa en el aislamientodel virus. De hecho, el diagnóstico sexológico no ofrece unos resultadossatisfactorios; los títulos de anticuerpos aumentan significativamente a los10 ó 15 días después de empezar los síntomas clínicos y generalmenteson difícilmente detectables en los niños.El método de referencia se refiere al aislamiento del virus del cultivo decélulas (células Hela, KB, Hep2 o líneas celulares fibroblásticas de origenembrionario) y su identificación, desde una muestra naso-faríngea o un fluidode lavado bronco-alveolar. La muestra se obtiene durante la fase de máximaexcreción del virus, 1 ó 6 días después de la aparición de la enfermedad.La asociación de los anticuerpos monoclonales típicos de estos virus conel tropismo respiratorio y la técnica de la inmunofluorescenciapermitieron el rápido diagnóstico de estas enfermedades (mediante elexamen directo de las muestras) sin necesidad de recurrir al método decultivo de células, que es bastante difícil de realizar.Para cada uno de estos virus, se han seleccionado los anticuerposmonoclonales dirigidos contra las proteínas del virus, primero por suespecificidad y segundo por la calidad de la imagen observada en unaaplicación de la inmunofluorescencia; el aspecto habitual es unfluorescencia granular o formada por partículas claramente visible en elcitoplasma de las células infectadas. Estos anticuerpos monoclonalestambién pueden utilizarse para identificar a cada uno de estos virus trasaislarlos del cultivo de células.La prevalencia de estas diversas infecciones hizo que Bio-Rad propusierala elaboración del rápido diagnóstico de las enfermedades de etiologíavírica, con arreglo a lo siguiente:• El Virus Respiratorio Sincitial (RSV) es el responsable de más del 60%

de estas infecciones; MONOFLUOTM SCREEN R.S.V. se utiliza paraidentificar este virus mediante una técnica de inmunofluorescenciadirecta de fase única en las muestras recogidas.

• Los virus de la Influenza A y B, de la para-influenza 1, 2 y 3 y el

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Adenovirus causan, de varias maneras según las regiones y los períodosdel año, aproximadamente el 30% de estas infecciones. MONOFLUOTM

SCREEN INFLUENZA, PARA-INFLUENZA, ADENOVIRUS se utiliza paraconfirmar o anular la presencia de uno de estos virus mediante una técnicade inmunofluorescencia directa de fase única en las muestras; en caso derespuesta positiva, el virus implicado puede identificarse utilizando:- MONOFLUOTM Kit INFLUENZA (código 52209)- MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 1 + 2 (código 52211)- MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 3 (código 52212)- MONOFLUOTM KIT KIT ADENOVIRUS (código 52210)

2- PRINCIPIOEl kit de prueba MONOFLUOTM KIT Influenza está destinado a ladetección del virus de la Influenza A y B en las células infectadas pormedio de la técnica de inmunofluorescencia indirecta que utilizaanticuerpos monoclonales específicos para cada uno de estos virus.El kit de prueba MONOFLUOTM KIT Adenovirus está destinado a ladetección de las diversas cepas de Adenovirus.El kit de prueba MONOFLUOTM KIT para-Influenza 1+2 está destinado a ladetección de los tipos 1 ó 2 del virus de la para-influenza y el kit de pruebaMONOFLUOTM KIT para-Influenza 3 está destinado a la detección del virusde la para-influenza del tipo 3. Estos anticuerpos monoclonales se unen alantígeno expresado en el citoplasma de las células infectadas obtenidas delas muestras que contienen secreciones o exudados de las células del tractorespiratorio, o tras aislar el virus de los cultivos de las células.La adición de conjugado de ratón anti-IgG etiquetado con fluoresceínamuestra las células que han fijado el fluorescente del anticuerpomonoclonal. Las células que se unen a los anticuerpos monoclonalesespecíficos dirigidos contra las proteínas del virus muestran sufluorescencia, principalmente citoplásmica, con un aspecto granular o enforma de partículas cuando se examinan en el microscopio fluorescente.

3- COMPOSICION DEL KITEn lo que se refiere a las condiciones de almacenaje y a la fecha decaducidad, consulte la etiqueta de la caja. Los reactivos almacenados a+2-8ºC, si no se produce contaminación bacteriana, se mantienenestables hasta la fecha de caducidad que figura en la etiqueta (inclusouna vez abierta).

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MONOFLUOTM KIT INFLUENZA (código 52209)

MONOFLUOTM KIT ADENOVIRUS (código 52210)

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ETIQUETA REACTIVOS PRESENTACIÓNR1a Monoclonal Anticuerpos monoclonales (ratón) 1 x 2,5 ml

Antibody Anti-Influenza A (clon IA52/9) (frascoanti-Influenza A Conservante : azida de sodio < 0.1% cuentagotas)

R1b Monoclonal Anticuerpos monoclonales 1 x 2,5 mlAntibody Anti-Influenza B (clon IB82/2) (frascoanti-Influenza B Conservante: azida de sodio < 0.1% cuentagotas)

R2 Negative Negative control (culture supernatant) 1 x 2,5 mlcontrol Preservative: < 0.1% sodium azide (frasco

cuentagotas)R3 Concentrated Conjugado concentrado (10X) : 1 x 1 ml

Conjugate Anticuerpo (oveja), tampón anti-IgG de ratón (frasco(10X) etiquetado con isotiocianato de fluoresceína cuentagotas)

que contiene Evans azul Conservante: azida de sodio < 0.2%

R4 Mounting Medio de ensamblaje (listo para su uso): 1 x 3 mlmedium Glicerol tamponado para inmunofluorescencia (frasco

Conservante: azida de sodio < 0.1% cuentagotas)

ETIQUETA REACTIVOS PRESENTACIÓNR1 Monoclonal Anticuerpos monoclonales (ratón) 1 x 2,5 ml

Antibody anti-Adenovirus (clon H60 y H72) (frascoAdenovirus Conservante: azida de sodio < 0.1% cuentagotas)

R2 Negative Control negativo (capa superior del cultivo) 1 x 2,5 mlcontrol Conservante: azida de sodio < 0.1% (frasco



que contiene Evans azulConservante: azoturo de sodio < 0.2%


Conservante: azoturo de sodio < 0.1% cuentagotas)

MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 1+2 (código 52211)

MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 3 (código 52212)

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Antibody anti-paraInfluenza 1 y 2 (clon P2 128/14) (frascoparaInfluenza 1 + 2 Conservante: azida de sodio < 0.1% cuentagotas)








Antibody anti-paraInfluenza 3 (clon Pi3 5/12) (frascoparaInfluenza 3 Conservante: azida de sodio < 0.1% cuentagotas)







4- PRECAUCIONES DE USOLa calidad de los resultados depende de la observancia de las siguientesbuenas prácticas de laboratorio:• No utilice reactivos caducados.• En un mismo procedimiento, no mezcle ni combine reactivos de kits

que tengan diferentes números de lote.• Antes de utilizarlos, deje que los reactivos se estabilicen a temperatura

ambiete (+18-30ºC).• Utilice cristales lavados cuidadosamente y aclarados con agua

desionizada o, preferiblemente, material desechable.• Utilice una nueva punta de pipeta para cada muestra.• Compruebe la calidad del agua desionizada. Si observa organismos

fluorescentes en un control negativo, esterilice el agua usada para elfiltrado.

• No deje que el conjugado se seque en el portaobjetos durante el tinte.

INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD• Póngase guantes desechables.• No “pipetee con la boca”.• Considere todos los materiales que estén en contacto directo con las

muestras como materiales altamente infecciosos y contaminados.• Evite los derrames.• Siga siempre las técnicas y las precauciones vigents referentes a la

protección contra los peligros microbiológicos, a la manipulación y ala eliminación de los productos materiales y biológicos utilizados en lareacción.

PRECAUCIÓN: el reactivo R3 (conjugado concentrado) contiene azida desodio a una concentración del <0.2%.

R22-32 : Nocivo si se ingiere. El contacto con los ácidoslibera un gas altamente tóxico.S28-60 : En caso de contacto con la piel, láveseinmediatamente con agua abundante. Este material y suenvase deberán ser eliminados como un residuo peligroso.

Si nos lo solicita, le facilitaremos la ficha técnica de seguridad delmaterial.

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Xn - Nocivo

5- MUESTRAS Estos virus se limitan a las secreciones y a los exudados de las células deltracto respiratorio superior.Para proceder a un diagnóstico directo a través de la fluorescencia,recoja células descamadas de las secreciones nasales o tráqueo-bronquiales. Si el virus va a ser aislado de los cultivos de las células, latécnica de la inmunofluorescencia también puede aplicarse a las célulasque han resultado infectadas in vitro, tan pronto como se detecte elefecto citopático.

5.1. TÉCNICA PARA LA RECOGIDA DE MUESTRASLos virus de la Influenza A y B, la para-influenza 1, 2 y 3 y el Adenovirusse investigan en muestras que contienen secreciones nasals otraqueobronquiales obtenidas limpiando con un Q-tip® de algodón omediante la aspiración o el lavado nasal con una solución tampón dePBS. Para el examen directo de las muestras en la inmunofluorescencia,se recogen las secreciones con un adecuado medio de transporte paramantener el virus: preferiblemente, una solución salina – o un medioMEM tamponado (ya que algunos virus con tropismo respiratorio pierdensu naturaleza infecciosa en un medio ácido) y enriquecido condeterminadas sustancias para proteger los virus: albúmina bovina,gelatina, suero de pollo, sacarosa y antibióticos. La fórmula siguiente esun ejemplo de ello• MEM, 5 mg/ml de albúmina bovina, 4,76 mg/ml HEPES, 0,22 mg/ml

de bicarbonato sódico, 1 500 U/ml de penicilina, 1 000 mcg/ml deestreptomicina.

Para aislarlas, las muestras deben transportarse congeladas o frías. Unelemento clave es conseguir una suficiente cantidad de secreciones.Normalmente es más efectivo y conveniente recoger secrecionesrespiratorias, a menudo mucosas, por aspiración, utilizando un pequeñotubo conectado a una botella de recogida de muestras, con el tubointroducido en la nariz del niño. Este sistema se encuentra disponiblecomercialmente con el nombre de “bomba de succión de lasmucosidades”. Cuando no puede procederse a la aspiración junto a lacama del niño, puede utilizarse una jeringa de gran capacidad (50 ml),una bomba de vacío manual o, si es posible, un sistema de aspiracióneléctrica.Algunas veces, por ejemplo en los casos de bronquiolitis, la nariz del

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niño está seca y no es posible conseguir una cantidad suficiente desecreciones. En este caso, puede utilizarse el lavado con un enemanasal: en un orificio nasal se instilan unos cuantos milílitros de solución ydespués se aspira este fluido inmediatamente.En la mayoría de los casos, la aspiración nasal permite recoger, comomínimo, de 0,2 a 0,5 ml de secreciones. A continuación, este material setraslada al laboratorio o se coloca en el medio de transporte adecuadopara el aislamiento del virus en el cultivo de células.A temperatura ambiente (18-30°C), el almacenaje durante menos de 3horas no alterará la calidad de los antígenos virales de la muestra. Serecomienda almacenar a temperatura fría (+2 – 8ºC) en el caso delaislamiento viral, pero la inoculación de los cultivos de células no deberetrasarse demasiado ya que su poder infeccioso disminuye inclusodespués de su congelación a -70ºC.

5.2. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS ANTES DEL EXAMEN I.F.En el laboratorio se procederá a varios lavados sucesivos del materialaspirado para conseguir una suspensión de células nasales libres democos.• Prepare el volumen necesario de tampón de PBS para los tratamientos

y lavados diluyendo una solución concentrada 10 veces en aguadestilada estéril.

• Añada 5 ml de PBA a aproximadamente 0,5 – 1 ml de secreciones.Agite suavemente.

• Centrifugue durante 10 minutos a 500 g y a +2 – 8ºC. Trasvase elfluido que sobrenada.

• Añada 5 ml de PBS al precipi tado y centr i fugue. Repita elprocedimiento de lavado 2 ó 3 veces hasta eliminar totalmente lasmucosidades.

• Tras el último centrifugado, añada 1 ml de PBS al precipitado de lascélulas. Homogenice la suspensión pipeteándola.

• Coloque las células en los portaobjetos• Proceda a la fijación de las células y al tinte (véase técnica del tinte)

5.3. AISLAMIENTO DEL VIRUS EN EL CULTIVO DE CÉLULASPuesto que algunos de estos virus con tropismo respiratorio sontermolábiles, es importante inocular cultivos de células lo antes posibletras la recogida de las muestras.

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En el laboratorio, congele y descongele las muestras de prueba demanera que las células se abran y suelten las partículas de los virus.Centrifugue durante 10 minutos a 500 g y a +2 – 8ºC para eliminar losresiduos celulares (2.000 rpm)Inocule el cultivo de células destinado para ello con las muestras obtenidas.Las células utilizadas son las Hep2, la Hela o la Kb, así como las líneascelulares diploides procedentes de los fibroblastos embriónicos humanos enun medio MEM que contiene de un 5 a un 8% de suero fetal de ternera.Según el frasco utilizado para el cultivo de células, variarán losvolúmenes de inóculo u del medio de cultivo.• Si utiliza tubos Leighton, inocule con 1 ml de muestra. Incube a 37ºC

durante 2h30m y después diluya hasta 12 ml con el medio de cultivo. • Si utiliza un frasco de 25 cm3, inocule con 1 ml de muestra. Incube a37ºC durante 2h30m y después diluya hasta 12 ml con el medio decultivo. Incube la células a +37ºC hasta que observe el efecto citopáticodel virus (de unos 4 a 6 días).

Observación del efecto citopáticoObserve la célula inoculada con un microscópico óptico de fase inversa ysiga el desarrollo del efecto citopático: progresiva separación de pequeñascélulas más o menos redondas y refringentes con algunas inclusionesnucleares en el caso de los virus de la Influenza y la para-Influenza, grandescélulas redondas formando conglomerados en el caso del Adenovirus.Si, al cabo de 6 u 8 días, todavía no se observa el efecto citopático, trasinocular una muestra proceda de todos modos al tinte. La multiplicaciónviral puede ser suficiente para ser detectada en esta fase por lainmunofluorescencia. Si es así, se podría considerar un segundo paso por las células.

6- PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

6.1 – MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO• Agua destilada o totalmente desionizada• Blanqueador• Papel absorbente• Guantes desechables• Tampón de fosfato (PBS) pH 7,2 para IF (concentrado 10X) – 50 ml –

código 74901• Acetona

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• Pipetas Pasteur estériles• Pipetas automáticas o semiautomáticas, ajustables o preconfiguradas

para dispensar de 10 a 200ml y 1 mL.• Tubos de ensayo graduados de 10 ml ó 25 ml• Tubos desechables• Tubos para el centrifugado• Portaobjetos para la inmunofluorescencia – código 50569 (2 pozxos)

ó 50566 (6 pozos)• Cubreobjetos• Microscópico fluorescente• Contenedor de residuos biocontaminantes

6.2 – RECONSTITUCIÓN Y ALMACENAJE DE LOS REACTIVOSR3 : Diluya el contenido del vial con 9 ml de tampón de fosfato paraobtener una dilución de la solución lista para su uso. Tras la dilución,conjugado anti-IgG de ratón, almacene a +2-8°C y, en ausencia decontaminación microbiana, se mantendrá estable durante 3 meses-.

6.3 - PROCEDIMIENTO

6.3.1. APLICACIÓN Y FIJACIÓN CELULAR

• Examen directo de la muestra- Coloque 20 µl de la muestra tratada (residuos de centrifugación de

la célula) en un pozo del portaobjetos.- Seque con aire los portaobjetos utilizando un secador o a

temperatura ambiente (18-30°C).- Colóquela en un baño de acetona a -20°C durante 5 minutos.- Deje secar el portaobjetos al aire.

• Cultivo de células en el portaobjetos- Lave el portaobjetos dos veces durante 1 minuto en un baño de PBS- Deje secar el portaobjetos al aire- Colóquela en un baño de acetone a -20°C durante 5 minutos..

• Cultivo de células en un frasco- Retire el medio. Recoja las células mediante raspado en 1 ml de PBS- Vuelva a suspender las células aspirando y descargando varias

veces utilizando una pipeta afilada.

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- A continuación, proceda a la aplicación y fijación de las célulaspara poder examinar directamente la muestra.

6.3.2. APLICACIÓN DEL ANTICUERPO

1. Prepare el volumen necesario de tampon de fosfato (PBS) para lavar ydiluir la solución 10 veces concentrada en agua destilada estéril.

2. Prepare el Conjugado R3 (véase el capítulo 6.2)3. Coloque una gota de los anticuerpos específicos monoclonales R1

(R1a y R1b para la Influenza A y B) en los primeros pozos (primer ysegundo pozo para la Influenza A y B) asegurándose que toda lasuperficie del círculo quede cubierta.

4. Coloque una gota de control negativo (R2) en el siguiente pozo.5. Incube el portaobjetos durante 30 minutos a +37ºC en una

incubadora húmeda.6. Una vez f inalizada la incubación, lave cuidadosamente el

portaobjetos con PBS utilizando un frasco de lavado.7. Lave dos veces de 2 a 5 minutos con PBS. Agite suavemente.8. Deje secar el portaobjetos al aire9. Agite suavemente el conjugado diluido (R3); coloque una gota de

conjugado diluido (R3) en cada pozo.10.Incube durante 30 minutos a 37ºC en una cámara húmeda.11.Tras la incubación, lave cuidadosamente el portaobjetos con PBS.

Agite suavemente.12.Sumerja el portaobjetos (unos pocos segundos) en agua destilada.13.Deje secar el portaobjetos al aire.14.Ensamble con el cubreobjetos utilizando el glicerol tamponado (R4).

Compruebe que el portaobjetos no contiene burbujas de aire. Recubrael portaobjetos con el barniz.

7- INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

7.1 – CONTROL DE CALIDADTinte al mismo tiempo un portaobjetos de referencia que utilice célulaspositivas y negativas.

7.2 – LECTURA E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSExamine los portaobjetos utilizando un microscópico fluorescente a unamagnificación de X100 y X400:

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• Lectura del pozo de control negativa: no se observa ninguna célulafluorescente tras examinar todo el pozo.

• Reacción positiva: fluorescencia granular intra-citoplásmica entre otrascélulas rojizas; se observa como mínimo una célula fluorescentecaracterística.

• Reacción negativa: no se observa ninguna célula fluorescente trasexaminar todas las paredes.

Nota: Lea los portaobjetos inmediatamente para conseguir unos mejoresresultados. No obstante, puede guardar los portaobjetos a +2 – 8ºC en laoscuridad durante 24 horas.

8- LIMITACIONES DE LA PRUEBAÚnicamente puede establecerse el diagnóstico de una reciente infecciónsobre la base de una combinación de las observaciones clínicas y losdatos sexológicos. El resultado de una única prueba no constituye laprueba suficiente para diagnosticar una reciente infección.

9- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBALos resultads de los MONOFLUOTM KITS se controlan utilizandoportaobjetos recubiertos con controles positivos y negativos.Los resultados son los siguientes:• Con anticuerpos monoclonales: presencia de células fluorescentes,

intensidad ≥ ++• Con cultivo que sobrenada: ninguna célula fluorescente.

10-CALIDAD DE CONTROL DEL FABRICANTETodos los reactivos fabricados se someten a nuestro Control de Calidad,desde la recepción de las materias primas a la comercialización final delproducto. Todos los lotes se someten a las evaluaciones del control decalidad y únicamente se procede a su lanzamiento al mercado una vezse ha demostrado su conformidad con los criterios de aceptaciónpreviamente establecidos. Los registros relacionados con la producción yel control de todos y cada uno de los lotes se efectúan con Bio-Rad.

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11-REFERENCES

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