MolekulMolekulááris farming kutatris farming kutatáása, sa, fejlesztfejlesztéése se éés alkalmazs alkalmazáása nsa nöövvéényeknnyeknééll

Dr. Miskei MártonDr. Miskei Márton

DE, AMTC, MTK, DE, AMTC, MTK, Kertészettudományi és Növényi Kertészettudományi és Növényi

Biotechnológiai Tsz.Biotechnológiai Tsz.

DNS

Az RNS virusok kivételével az élőlények örökítő anyaga a DNS (dezoxiribonukleinsav)

A növények genomi DNS-e a sejtmagban található kromoszómákba kondenzálódva

A növények extranukleáris DNS-e a mitokondriumokban és a plasztiszokban található gyűrűs formában

A transzkripció és a transzláció folyamata

Géntechnológia: Növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai Géntechnológia: Növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai változtatása molekuláris biológiai módszerekkelváltoztatása molekuláris biológiai módszerekkel

GM (géntechnológiával módosított, transzgénikus) növények: GM (géntechnológiával módosított, transzgénikus) növények: Olyan növények, melyek genetikai állományába a géntechnológia Olyan növények, melyek genetikai állományába a géntechnológia molekuláris genetikai módszereivel idegen gént (transzgént) molekuláris genetikai módszereivel idegen gént (transzgént) juttatnak be, amely beépűl, működik és öröklődik. juttatnak be, amely beépűl, működik és öröklődik.

A géntechnológia történeti áttekintéseA géntechnológia történeti áttekintése

1979 Az első kísérletek a növényi géntechnológiában1979 Az első kísérletek a növényi géntechnológiában

1980-as évek Transzformációs rendszerek kidolgozása1980-as évek Transzformációs rendszerek kidolgozása

1983-84 Az első transzgénikus növények1983-84 Az első transzgénikus növények

Fraley és mtsai.Fraley és mtsai.

Horsch és mtsai.Horsch és mtsai.

De Block és mtsai.De Block és mtsai.

1986 Az első vírus- 1986 Az első vírus- (Powel és mtsai., Baulcombe és mtsai.),(Powel és mtsai., Baulcombe és mtsai.), rovar- rovar- (Vaeck (Vaeck

és mtsai.),és mtsai.), herbicidrezisztens herbicidrezisztens (Shah és mtsai.)(Shah és mtsai.) GM növények GM növények

1986-tól GM növény szántóföldi kísérlete (USA)1986-tól GM növény szántóföldi kísérlete (USA)

1988-tól GM növény szántóföldi kísérlete 1988-tól GM növény szántóföldi kísérlete (Európa)(Európa)

1994 GM növény forgalomba kerülése1994 GM növény forgalomba kerülése

A géntechnológia történeti áttekintéseA géntechnológia történeti áttekintése

Első generációs transzgénikus növényekElső generációs transzgénikus növények

A mezőgazdasági termelés segítéseA mezőgazdasági termelés segítése

(vírus-, gomba-, baktérium-, rovar-, herbicid reszisztencia)(vírus-, gomba-, baktérium-, rovar-, herbicid reszisztencia)

Második generációs transzgénikus növényekMásodik generációs transzgénikus növények

A növények anyagcseréjének és fejlődésének módosításaA növények anyagcseréjének és fejlődésének módosítása

(fehérje-, zsírsav-, szénhidrát anyagcsere, érés, hímsterilitás)(fehérje-, zsírsav-, szénhidrát anyagcsere, érés, hímsterilitás)

Harmadik generációs transzgénikus növényekHarmadik generációs transzgénikus növények

Különféle speciális anyagok előállításaKülönféle speciális anyagok előállítása

(élelmiszeripar, műanyagipar, gyógyszeripar)(élelmiszeripar, műanyagipar, gyógyszeripar)

A géntechnológia történeti áttekintéseA géntechnológia történeti áttekintése

„„Molecular pharming”Molecular pharming”

Gyógyszeralapanyagok előállítása genetikailag módosított Gyógyszeralapanyagok előállítása genetikailag módosított növényekkelnövényekkel

(emberi fehérjék, antitestek, vakcinák)(emberi fehérjék, antitestek, vakcinák)

Transzformáció: A transzgén bejuttatása a növénybeTranszformáció: A transzgén bejuttatása a növénybe

Transzgén bejuttatásaTranszgén bejuttatása Agrobacterium Agrobacterium tumefacienstumefaciens fertőzéssel fertőzéssel

Transzgén bejuttatása protoplasztokbaTranszgén bejuttatása protoplasztokba

Transzgén bejuttatása Transzgén bejuttatása génpuskávalgénpuskával

I. Transzgén bejuttatása Agrobacterium tumefaciens fertőzéssel

Az agrobaktériumok a kétszikü növényeket fertőzik a sebzési helyeken

A fertőzött növényeken tumorképződés

Vektorok

• Extrakromoszómális DNS, baktériumokra és egysejtű gombákra jellemző

• A jobb túlélőképességhez szükséges géneket tartalmazzák pl.: rezisztencia gének

• Képes önállóan osztódni, így átkerül az utódsejtbe

• Génsebészeti módszerekkel egyszerűen manipulálható

Agrobaktérium-fertőzés

Ti plazmid felépítése

Nicotiana tabacum (dohány)

• Gyorsan nő, kevés törődést igenyel

• Régóta használják a növénygenetikában

• Szöveteiből könnyen regenerálható új növény

• Genomja ismert

Transzformáció

Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat

Fertőzés agrobaktérium szuszpenzióval

II. Transzgén bejuttatása protoplasztokba

A növényi sejtek sejtfalát leemésztjük

A protoplaszt-szuszpenzióhoz adjuk a DNS-t

PEG (Polietilén-glikol) kezelés

Elektroporáció

Regeneráltatás és szelekció

III. Transzgén bejuttatása génpuskával

Néhány um átmérőjű wolfram vagy arany részecskére adszorbeált plazmid molekula

Génpuska nagy sebességgel lövi be a szövetekbe a plazmidot

A sejtfalon keresztüljutó részecskék egy része eltalálja a sejtmagot

Integrálódik a bevitt DNS a genomba

Antibiotikumot tartalmú regenerációs táptalaj

Transzformálás

Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat

Legújabb transzformációs rendszerek

Kloroplaszt transzformáció

Mitokondrium transzformáció

A gének expressziójának szabályzása

Külső szignal kapcsolja az expressziót

Az expresszió csak bizonyos szövetféleségekben indul el

Mesterséges kromoszóma

Penicillium chrysogenumPenicillium chrysogenum antifungális antifungális fehérje (PAF) termeltetése fehérje (PAF) termeltetése

transzgénikus dohány (transzgénikus dohány (Nicotiana Nicotiana tabacumtabacum) növényben) növényben

BevezetésBevezetés

• növény transzformálásnövény transzformálás

– harmadik generációs transzgénikus növényekharmadik generációs transzgénikus növények

– fehérje termeltetés növényekkel (nagy mennyiség, fehérje termeltetés növényekkel (nagy mennyiség, alacsony költség)alacsony költség)

• célkitűzés: célkitűzés:

– transzformációs technikák elsajátításatranszformációs technikák elsajátítása

– modellszervezet: dohánymodellszervezet: dohány

– modellfehérje: PAFmodellfehérje: PAF

Modell rendszerekModell rendszerek

• Dohány (Dohány (Nicotiana tabacumNicotiana tabacum))– transzfromációs rendszerektranszfromációs rendszerek– gyorsan növő, könnyen regenerálhatógyorsan növő, könnyen regenerálható

• PAF - PAF - Penicillium chrysogenumPenicillium chrysogenum antifungális fehérje antifungális fehérje – kis moltömegű, bázikus, ciszetinben gazdagkis moltömegű, bázikus, ciszetinben gazdag– rendellenes hifák, gátolt szaporodásrendellenes hifák, gátolt szaporodás

276 bp 96 aa Lokalizáció

Összeszerelődés

PAF

Pre Mature PAFPro

Transzfromálási technikákTranszfromálási technikák

• nukleáris transzformálásnukleáris transzformálás

– Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidTi plazmid

– T-DNS szakaszba transzgénT-DNS szakaszba transzgén

• kloroplaszt transzformáláskloroplaszt transzformálás

– homológ rekombinációhomológ rekombináció

– magas expressziós színtmagas expressziós színt

– nincs pollentranszmissziónincs pollentranszmisszió

Vad típusú plasztisz DNS

LTR

RTR

Szelekciós marker

LTR

RTR

transzgén

Transzformált plasztisz DNS

RTR

LTR

Szelekciós marker

transzgén

Nukleáris transzformálás I.Nukleáris transzformálás I.

• klónozó vektor szerkezeteklónozó vektor szerkezete

– jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciákjobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák

– kanamycin szelekciós marker kanamycin szelekciós marker

– PAF kazettaPAF kazetta

LB Kanamycin szelekciós marker

S35 RBPAF kazettaP2Tnos Tnos

Nukleáris transzformálás II.Nukleáris transzformálás II.

PAF

Mature PAF

TnosP2’ 38P

Tnos

PAF

Pre Mature PAFPro

TnosP2’

Pre-Pro-mature-PAF

Pre-Pro-mature-PAF+ozmotin

PAF

Pre Mature PAFPro

P2’ ozmotin

GE+Pre-Pro-mature-PAF

PAF

Pre Mature PAFPro

TnosP2’ GE

38P+Pre-Pro-mature-PAF

PAF

Pre Mature PAFPro

TnosP2’ 38P

Tnos

PAF

Mature PAF

P2’

mature-PAF

38P+mature-PAF

Nukleáris transzformálás I.Nukleáris transzformálás I.

• klónozó vektor szerkezeteklónozó vektor szerkezete– jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciákjobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák– kanamycin szelekciós markerkanamycin szelekciós marker – PAF kazettaPAF kazetta

• Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens transzformálása transzformálása• növények fertőzésenövények fertőzése• regenerálás kanamycin tartalmú szelekciós regenerálás kanamycin tartalmú szelekciós

táptalajokontáptalajokon• regenerált növények vizsgálata DNS, RNS regenerált növények vizsgálata DNS, RNS

szintenszinten

LB Kanamycin szelekciós marker

S35 RBPAF kazettaP2Tnos Tnos

1 kb –os standard

negatív kontroll

paf

pozitív kontroll

Kloroplaszt transzformálás I.Kloroplaszt transzformálás I.

PrrnPrrnaadA szelekciós kazetta

Mature PAFMature PAF trnCtrnC RTRRTRLTRLTR ProPro

• klónozó vektor szerkezeteklónozó vektor szerkezete– jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiókjobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók

– aadAaadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin

– promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia, transzgénpromóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia, transzgén

• transzformálás génpuskávaltranszformálás génpuskával

Kloroplaszt transzformálás II.Kloroplaszt transzformálás II.

transzformánsok szelektálása

spectinomycinstreptomycin

spectinomycin tartalmú regenerációs táptalaj

spectinomycin

Kloroplaszt transzformálás I.Kloroplaszt transzformálás I.

PrrnPrrnaadA szelekciós kazetta

Mature PAFMature PAF trnCtrnC RTRRTRLTRLTR ProPro

1.

2.

• klónozóklónozó vektor szerkezetevektor szerkezete

– jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiókjobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók

– aadAaadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin

– promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvenciapromóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia

• transzformálás génpuskávaltranszformálás génpuskával

• regenerálás antibiotikum tartalmú táptalajokonregenerálás antibiotikum tartalmú táptalajokon

• transzgén beépülésének vizsgálata DNS szintentranszgén beépülésének vizsgálata DNS szinten

pozitív kontrollok

paf

1 kb-os standard

negatív kontroll

ÖsszefoglalásÖsszefoglalás

• több vektorkonstrukció tervezése több vektorkonstrukció tervezése • nukleáris transzformálásnukleáris transzformálás• kloroplaszt transzformáláskloroplaszt transzformálás• transzformánsok bizonyítása DNS, RNS szintentranszformánsok bizonyítása DNS, RNS szinten

• tervek:tervek:– kloroplaszt transzformánsoknál a homoplazmikusság vizsgálata Sothern blot kloroplaszt transzformánsoknál a homoplazmikusság vizsgálata Sothern blot

technikávaltechnikával– termelődött PAF fehérje kimutatása Western blot technikávaltermelődött PAF fehérje kimutatása Western blot technikával– PAF fehérje tulajdonságainak megjelenése a növényben gombafertőzés hatására PAF fehérje tulajdonságainak megjelenése a növényben gombafertőzés hatására – más gazdaságilag fontos, illetve nem fehérje természetű anyag termeltetése más gazdaságilag fontos, illetve nem fehérje természetű anyag termeltetése

növényekkelnövényekkel– további növényen kidolgozni a transzfromációs technikákattovábbi növényen kidolgozni a transzfromációs technikákat

A GM növények fogadtatásaA GM növények fogadtatása

Zöld szervezetek (pl.: Greenpeace)Zöld szervezetek (pl.: Greenpeace)

Multinacionális cégekMultinacionális cégek

Mérlegelni kell!

http://www.greenpeace.org/india/news/gm-indian-food-greenpeace-flags-the-good-the-bad

A GM élelmiszerek egészségkárosításaA GM élelmiszerek egészségkárosítása

Csak féligazságokat hallunk!

Veszélyes megenni?

„Nincs bizonyíték, hogy nem károsak.”

„...egy génkezelt krumplifajta kóros elváltozásokat okoz az ezzel táplált patkányokon...”

A GM élelmiszerek egészségkárosításaA GM élelmiszerek egészségkárosítása

„2008-ban 25 országban ... 13,3 millió gazda foglalkozott genetikailag módosított növények termesztésével.”

„Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag módosított növények termesztésével.”

Csak féligazságokat hallunk!

Veszélyes megenni?

A GM élelmiszerek egészségkárosításaA GM élelmiszerek egészségkárosítása

Allegizálhat a transzgénről expresszálódott fehérjeAllegizálhat a transzgénről expresszálódott fehérje

A transzgén károsan befolyásolhatja a növény fiziológiai folyamataitA transzgén károsan befolyásolhatja a növény fiziológiai folyamatait

Antibiotikum rezisztenciát alakíthat kiAntibiotikum rezisztenciát alakíthat ki

A transzgén önmaga veszélytelen, ha az általa kódolt fehérje nem jelenik A transzgén önmaga veszélytelen, ha az általa kódolt fehérje nem jelenik meg az élelmiszerbenmeg az élelmiszerben

A hatékony védelem rovarírtó- és gyomirtó szerek nélkülA hatékony védelem rovarírtó- és gyomirtó szerek nélkül

Nagyobb terméshozam, egészségesebb, védettebb növényNagyobb terméshozam, egészségesebb, védettebb növény

Tények!

A GM élelmiszerek egészségkárosításaA GM élelmiszerek egészségkárosítása

Ne utasítsuk el tudatlanság vagy félelem miatt!Ne utasítsuk el tudatlanság vagy félelem miatt!

A hagyományos növénytermesztés, védelem gyakran károsabbA hagyományos növénytermesztés, védelem gyakran károsabb

Lehetnek GM élelmiszerek, de több kritérium betartásával:Lehetnek GM élelmiszerek, de több kritérium betartásával:

• A cégtulajdonosok vállaljanak felelősséget a termékeikértA cégtulajdonosok vállaljanak felelősséget a termékeikért

• Tudjuk meg mit és hogyan módosítottak (legalább szakmai körökben)Tudjuk meg mit és hogyan módosítottak (legalább szakmai körökben)

• Amit megeszünk ne akkumuláljon gyomirtót, nehézfémet...Amit megeszünk ne akkumuláljon gyomirtót, nehézfémet...

• Legyen vizsgálva az allergizáló hatása, és okoz-e toxicitástLegyen vizsgálva az allergizáló hatása, és okoz-e toxicitást

• Legyen tényleg olcsó, hogy segítsen az éhínség problémájánLegyen tényleg olcsó, hogy segítsen az éhínség problémáján

Konklúzió

A GM növények ökológiai hatásaA GM növények ökológiai hatása

Jelentősebb az ökológiai kockázat

„„A természeti környezetbe való kijutásával a génmódosított A természeti környezetbe való kijutásával a génmódosított élőlény beporzással, vagy a magok kihullása révén élőlény beporzással, vagy a magok kihullása révén ellenőrizhetetlenül kereszteződhet más, rokon fajtákkal, így ellenőrizhetetlenül kereszteződhet más, rokon fajtákkal, így “elszennyezve” azok genetikai állományát.”“elszennyezve” azok genetikai állományát.”

„„A ma termesztett génmódosított növények 99%-a A ma termesztett génmódosított növények 99%-a gyomirtószerekkel, illetve kártevőkkel szembeni ellenálló-képességet gyomirtószerekkel, illetve kártevőkkel szembeni ellenálló-képességet hordoz, amely tulajdonságok a fogyasztó számára semmilyen hordoz, amely tulajdonságok a fogyasztó számára semmilyen kézzelfogható előnnyel nem járnak.” kézzelfogható előnnyel nem járnak.”

A GM növények ökológiai hatásaA GM növények ökológiai hatása

Jelentősebb az ökológiai kockázat

„„Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése környezeti probléma, amelynek jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag módosított növények volna a genetikailag módosított növények termesztésével. ”termesztésével. ”

„„A spanyol és az ahhoz hasonló eredményt nyújtó francia és német A spanyol és az ahhoz hasonló eredményt nyújtó francia és német kísérletek alapján legfeljebb 20 m izolációs távolság szükséges a kísérletek alapján legfeljebb 20 m izolációs távolság szükséges a genetikailag módosított és hagyományos kukorica tábla között, a 0,9 genetikailag módosított és hagyományos kukorica tábla között, a 0,9 százalék feletti keveredés elkerüléséhez. A 0,9 % alatti véletlenszerű százalék feletti keveredés elkerüléséhez. A 0,9 % alatti véletlenszerű keveredés a biotermékek esetében is megengedett az Európai Uniós keveredés a biotermékek esetében is megengedett az Európai Uniós szabályozás alapján.”szabályozás alapján.”

A GM növények ökológiai hatásaA GM növények ökológiai hatása

Tények

Létezik a pollentranszmisszióLétezik a pollentranszmisszió

Olcsóbb az élelmiszerek előállításaOlcsóbb az élelmiszerek előállítása

Felfigyeltek a kutatók is a kockázati tényezőkreFelfigyeltek a kutatók is a kockázati tényezőkre

Gyakran GM növények végzik a környezeti károk felszámolását Gyakran GM növények végzik a környezeti károk felszámolását (nehézfém mentesítés)(nehézfém mentesítés)

A GM növények ökológiai hatásaA GM növények ökológiai hatása

Konklúzió

Új módszerek fejlesztése feloldhatja az ökológiai kockázatot Új módszerek fejlesztése feloldhatja az ökológiai kockázatot (kloroplaszt trasnszformáns, szabályozott expresszió)(kloroplaszt trasnszformáns, szabályozott expresszió)

Ne termesszék egymás közelében a transzgént tartalmazó növényt Ne termesszék egymás közelében a transzgént tartalmazó növényt és az azzal rokon vad típusú növénytés az azzal rokon vad típusú növényt

Ha biztonságos és olcsó egyben, akkor alkalmas a Ha biztonságos és olcsó egyben, akkor alkalmas a nagymennyiségű élelmiszer előállításranagymennyiségű élelmiszer előállításra

Alternatíva a zárt rendszerű nagyüzemi termelés (bioreaktor, Alternatíva a zárt rendszerű nagyüzemi termelés (bioreaktor, nagyüzemi üvegház)nagyüzemi üvegház)

A GM növények gyógyszer- és ipari alapanyag A GM növények gyógyszer- és ipari alapanyag előállításraelőállításra

Zárt rendszerben, megfelelő ipari technológiával hatékonyan Zárt rendszerben, megfelelő ipari technológiával hatékonyan termelhető és kivonható a kívánt alapanyagtermelhető és kivonható a kívánt alapanyag

Alkalmas ipari alapanyag előállítására, kiváltva költségesebb, Alkalmas ipari alapanyag előállítására, kiváltva költségesebb, környezetet károsító technológiákatkörnyezetet károsító technológiákat

Nagymennyiségű, biztonságos vakkcinák előállítására, hormonok Nagymennyiségű, biztonságos vakkcinák előállítására, hormonok és más drága enzimek előállítására használhatóés más drága enzimek előállítására használható

Előállíthatóak olyan fehérjék, melyek révén nem fehérje Előállíthatóak olyan fehérjék, melyek révén nem fehérje természetű alapanyagok létrehozhatóktermészetű alapanyagok létrehozhatók

A GM növények szigorú szabályozásaA GM növények szigorú szabályozása

EU komolyan veszi a kockázatokat, ezért biztonságos, de gyakran EU komolyan veszi a kockázatokat, ezért biztonságos, de gyakran nehézkes a GM növények termesztése, előállításanehézkes a GM növények termesztése, előállítása

EU színten szúrópróbaszerűen ellenőrizhetőek az egyes EU színten szúrópróbaszerűen ellenőrizhetőek az egyes laboratóriumok, cégeklaboratóriumok, cégek

Magyarországom a FVM foglalkozik a laboratóriumok Magyarországom a FVM foglalkozik a laboratóriumok akkreditálásábanakkreditálásában

Komoly engedélyeztetési eljárásKomoly engedélyeztetési eljárás

Szigorú hulladékmegsemmisítés és szállításSzigorú hulladékmegsemmisítés és szállítás

Elfogadjuk a GM növényeket?Elfogadjuk a GM növényeket?

??

Nehéz kérdés, de vajon kell dönteni?Nehéz kérdés, de vajon kell dönteni?

http://www.eurekastreet.com.au/article.aspx?aeid=8150

http://www.wired.com/techbiz/people/magazine/15-07/st_kia

Gondolkozzunk józanul!Gondolkozzunk józanul!