Molecular Size and Separability Features of Pea Cell Wall Polysaccharides

8/3/2019 Molecular Size and Separability Features of Pea Cell Wall Polysaccharides

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 9 2 ) 9 8 , 3 5 7 - 3 6 80 0 3 2 - 0 8 8 9 / 9 2 / 9 8 / 0 3 5 7 / 1 2 / $ 0 1 . 0 0 / 0 R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n S e p t e m b e r 1 1 , 1 9 9 0A c c e p t e d A u g u s t 1 5 , 1 9 9 1

M o l e c u l a r S i z e and S e p a r a b i l i t y F e a t u r e s o f PeaC e l l W a l l P o l y s a c c h a r i d e s 'I m p l i c a t i o n s f o r M o d e l s o f P r i m a r y W a l l S t r u c t u r e

L a w r e n c e D . T a l b o t t 2 and P e t e r M . R a y *D e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , S t a n f o r d U n i v e r s i t y , S t a n f o r d , C a l i f o r n i a 94305

ABSTRACTR e l a t i v e m o l e c u l a r s i z e d i s t r i b u t i o n s o f p e c t i c a n d h e m i c e l l u -l o s i c p o l y s a c c h a r i d e s o f p e a ( P i s u m s a t i v u m c v A l a s k a ) t h i r di n t e m o d e p r i m a r y w a l l s w e r e d e t e r m i n e d b y g e l f i l t r a t i o n c h r o -

m a t o g r a p h y . P e c t i c p o l y u r o n i d e s h a v e a p e a k m o l e c u l a r mass o fa b o u t 1 1 0 0 k i l o d a l t o n s , r e l a t i v e t o d e x t r a n s t a n d a r d s . T h i sp e a k may b e p a r t l y a n a g g r e g a t e o f s m a l l e r m o l e c u l a r u n i t s ,b e c a u s e d e m o n s t r a b l e a g g r e g a t i o n o c c u r r e d when s a m p l e s w e r ec o n c e n t r a t e d b y e v a p o r a t i o n . A b o u t 86% o f t h e n e u t r a l s u g a r s( m o s t l y a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e ) i n t h e p e c t i n c o f r a c t i o n a t e w i t hp o l y u r o n i d e i n g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y a n d d i e t h y l a m i n o -e t h y l - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y a n d a p p e a r t o b e a t t a c h e d c o -v a l e n t l y t o p o l y u r o n i d e c h a i n s , p r o b a b l y a s c o n s t i t u e n t s o f r h a m -n o g a l a c t u r o n a n s . H o w e v e r , a t l e a s t 60 % o f t h e w a l l ' s a r a b i n a n /g a l a c t a n i s n o t l i n k e d c o v a l e n t l y t o t h e b u l k o f i t s r h a m n o g a l a c -t u r o n a n , e i t h e r g l y c o s i d i c a l l y o r b y e s t e r l i n k s , b u t o c c u r s i n t h eh e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n , a c c o m p a n i e d b y n e g l i g i b l e u r o n i c a c i d ,a n d h a s a p e a k m o l e c u l a r mass o f a b o u t 1 0 0 0 k i l o d a l t o n s . X y l o g -l u c a n , t h e o t h e r p r i n c i p a l h e m i c e l l u l o s i c p o l y m e r , h a s a p e a km o l e c u l a r mass o f a b o u t 3 0 k i l o d a l t o n s ( w i t h a s e c o n d a r y , u s u a l l ym i n o r , p e a k o f a p p r o x i m a t e l y 3 0 0 k i l o d a l t o n s ) a n d i s m o s t l y n o tl i n k e d g l y c o s i d i c a l l y e i t h e r t o p e c t i c p o l y u r o n i d e s o r t o a r a b i n o -g a l a c t a n . T h e r e l a t i v e l y n a r r o w m o l e c u l a r mass d i s t r i b u t i o n s o ft h e s e p o l y m e r s s u g g e s t m e c h a n i s m s o f c o - o r p o s t s y n t h e t i cc o n t r o l o f h e m i c e l l u l o s e c h a i n l e n g t h b y t h e c e l l . A l t h o u g h t h em a c r o m o l e c u l a r f e a t u r e s o f t h e m e n t i o n e d p o l y m e r s i n d i v i d u a l l ya g r e e g e n e r a l l y w i t h t h o s e s h o w n i n t h e w i d e l y d i s s e m i n a t e ds y c a m o r e c e l l p r i m a r y w a l l m o d e l , t h e m a t r i x p o l y m e r s seem t ob e a s s o c i a t e d m o s t l y n o n c o v a l e n t l y r a t h e r t h a n i n t h e c o v a l e n t l yi n t e r l i n k e d m e s h w o r k p o s t u l a t e d b y t h a t m o d e l . X y l o g l u c a n a n da r a b i n a n / g a l a c t a n ma y f o r m t i g h t l y a n d m o r e l o o s e l y b o u n d l a y -e r s , r e s p e c t i v e l y , a r o u n d t h e c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l s , t h e o u t e r l a y e ri n t e r a c t i n g w i t h p e c t i c r h a m n o g a l a c t u r o n a n s t h a t o c c u p y i n t e r -s t i c e s b e t w e e n t h e h e m i c e l l u l o s e - c o a t e d m i c r o f i b r i l s .

T h e c e l l w a l l p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n p l a n t c e l l e n l a r g e m e n t .A w i d e r a n g e o f g r o w t h - r e g u l a t i n g a g e n t s , i n c l u d i n g b o t hh o r m o n e s a n d e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s , a p p a r e n t l y a c t b y m o d -i f y i n g t h e a b i l i t y o f t h e p r i m a r y w a l l t o e x t e n d i r r e v e r s i b l y .' T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l S c i e n c eF o u n d a t i o n a n d t h e M c K n i g h t F o u n d a t i o n .2 P r e s e n t a d d r e s s : L a b o r a t o r y o f B i o m e d i c a l a n d E n v i r o n m e n t a lS c i e n c e s , 9 0 0 V e t e r a n A v e . , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , L o s A n g e l e s ,CA 9 0 0 2 4 - 1 7 8 6 .

T h e s e m o d i f i c a t i o n s a r e t h o u g h t t o b e d u e t o a l t e r a t i o n s i nt h e n o n f i b r i l l a r , o r m a t r i x , p o l y m e r s o f t h e w a l l .L i n k a g e a n a l y s i s t e c h n i q u e s , a p p l i e d e s p e c i a l l y b y A l b e r -s h e i m ' s g r o u p ( 5 2 ) , h a v e y i e l d e d a g r e a t d e a l o f i n f o r m a t i o nc o n c e r n i n g t h e s t r u c t u r e o f t h e t y p e s o f p o l y s a c c h a r i d e c h a i n sf o u n d i n t h e p r i m a r y w a l l m a t r i x , w h i c h i n d i c o t s c o n s i s t sm a i n l y o f RG3 ( " p e c t i n " ) , XG ( " h e m i c e l l u l o s e " ) , a n d AG( c o m m o n l y r e g a r d e d a s a p e c t i c p o l y m e r ) . T h e s e s t r u c t u r a ld e t a i l s h a v e b e e n d e d u c e d m a i n l y b y a n a l y s i s o f e n z y m a t i c a l l yd e g r a d e d f r a g m e n t s o f t h e m a t r i x p o l y s a c c h a r i d e s .Much l e s s a t t e n t i o n h a s b e e n g i v e n t o w a l l p o l y s a c c h a r i d e sa s w h o l e m a c r o m o l e c u l e s . On t h e b a s i s o f c e r t a i n e v i d e n c es u g g e s t i n g t h a t XG c h a i n s a r e l i n k e d g l y c o s i d i c a l l y t o g a l a c t a no r AG c h a i n s , a n d t h a t t h e l a t t e r a r e s i m i l a r l y l i n k e d t o RGc h a i n s , A l b e r s h e i m ' s g r o u p ( 3 7 ) i n 1 9 7 3 p r o p o s e d a m o d e lf o r t h e s t r u c t u r e o f t h e c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l w a l l . T h i sm o d e l , w h i c h t h e y s o o n c o n s i d e r e d t o d e s c r i b e p r i m a r y w a l l so f a l l d i c o t s ( 2 , 4 , 8 0 ) , a t t r i b u t e d t h e w a l l ' s s t r u c t u r a l c o h e r -e n c e t o t h e m e n t i o n e d c o v a l e n t i n t e r l i n k i n g o f i t s m a t r i xp o l y m e r s , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e n o n c o v a l e n t b i n d i n g o fXG t o t h e w a l l ' s c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l s .A l b e r s h e i m ' s g r o u p s u b s e q u e n t l y m o d i f i e d t h e m o d e l w i t hr e s p e c t t o p o l y s a c c h a r i d e - p r o t e i n l i n k a g e s ( 3 ) a n d t h e d e g r e eo f XG-AG i n t e r l i n k i n g ( 1 4 ) . O t h e r a u t h o r s ( 3 2 , 5 3 , 6 1 , 6 6 )c o n c l u d e d t h a t t h e g l y c o s i d i c a l l y i n t e r l i n k e d s t r u c t u r e i s i n -c o r r e c t f o r c e r t a i n d i c o t p r i m a r y w a l l s , a n d some ( 1 0 , 5 3 )h a v e p r o p o s e d m o d e l s t h a t , i n s t e a d , a s c r i b e t h e w a l l ' s c o h e r -e n c e p r i m a r i l y t o n o n c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s b e t w e e n i t s p o l y -m e r s . N e v e r t h e l e s s , t h e c o n c e p t t h a t p r i m a r y w a l l c o h e r e n c ei s b a s e d o n a " c o v a l e n t l y c r o s s - l i n k e d m e s h w o r k o f m a t r i xm o l e c u l e s " ( 5 4 ) h a s l a s t i n g l y i n f l u e n c e d t h i n k i n g a b o u t w a l lg r o w t h , b y i m p l y i n g t h a t c o v a l e n t b o n d s h a v e t o b e b r o k e nf o r t h e w a l l t o e x p a n d i r r e v e r s i b l y ( f o r e x a m p l e , s e e r e f . 4 ) .T h i s a s s u m p t i o n c o n t i n u e s t o b e m a d e , e x p l i c i t l y o r i m p l i c -i t l y , i n much o f t h e c u r r e n t r e s e a r c h r e g a r d i n g t h e p h y s i o l o g yo f p l a n t c e l l g r o w t h . F u r t h e r m o r e , p e r h a p s b e c a u s e t h e s y c a -m o r e m o d e l w a s p o p u l a r i z e d ( 2 ) , a n u m b e r o f t e x t b o o ka u t h o r s h a v e p r e s e n t e d i t a s t h e s t r u c t u r e o f t h e p r i m a r y c e l lw a l l . T h u s , many s t u d e n t s a r e a p p a r e n t l y b e i n g t a u g h t i t a s a

3 A b b r e v i a t i o n s : R G , r h a m n o g a l a c t u r o n a n ; X G , x y l o g l u c a n ; A G ,a r a b i n o s e / g a l a c t o s e p o l y s a c c h a r i d e s ( a r a b i n o g a l a c t a n o r a r a b i n a n /g a l a c t a n ) ; H C , h e m i c e l l u l o s e ; G F C , g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ;M r , m o l e c u l a r m a s s r e l a t i v e t o d e x t r a n s t a n d a r d s ; H G , h o m o g a l a c -t u r o n a n .3 5 7


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P l a n t P h y s i o l . V o l . 9 8 , 1 9 9 2

f a c t , a n d many t e a c h e r s o f p l a n t p h y s i o l o g y d o n o t s e e m t ob e a w a r e t h a t i t s b a s i c c o n c e p t ma y n o t b e c o r r e c t .W h i l e e x p l o r i n g m a c r o m o l e c u l a r c h a n g e s i n p e a w a l l m a -t r i x p o l y s a c c h a r i d e s t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n a u x i n - i n d u c e dc e l l e n l a r g e m e n t ( 7 2 ) , w e o b t a i n e d m o l e c u l a r s i z e a n d s e p a r -a b i l i t y d a t a i n d i c a t i n g t h a t t h e s y c a m o r e w a l l m o d e l d o e s n o ta p p l y t o p e a , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e t h a t i t i s n o t v a l i df o r g r o w i n g d i c o t p r i m a r y w a l l s i n g e n e r a l . T h e s e o b s e r v a t i o n sa r e p r e s e n t e d h e r e , a l o n g w i t h a m o d e l f o r p e a p r i m a r y w a l lo r g a n i z a t i o n t h a t s e e m s c o n s i s t e n t w i t h t h e i n f o r m a t i o n a v a i l -a b l e f o r t h i s m a t e r i a l .

MATERIALS AND METHODSG r o w t h a n d P r e p a r a t i o n o f T i s s u e

S e e d s o f p e a , P i s u m s a t i v u m L . c v A l a s k a , w e r e p l a n t e d i nt r a y s o f m o i s t v e r m i c u l i t e a n d g r o w n 7 d i n t h e d a r k a t 2 5 Cw i t h o c c a s i o n a l b r i e f e x p o s u r e s t o r e d l i g h t . T h i r d i n t e r n o d es e g m e n t s 8 - m m - l o n g w e r e c u t , s t a r t i n g 3 mm b e l o w t h e t o po f t h e a p i c a l h o o k , u s i n g a d o u b l e - b l a d e d c u t t e r . B e f o r e w a l lm a t e r i a l w a s p r e p a r e d f r o m t h e m , t h e s e g m e n t s w e r e i n c u -b a t e d 2 h a t 3 5 C i n w a t e r - s a t u r a t e d a i r , s o t h e y w o u l d b ec o m p a r a b l e t o t h e a u x i n - d e p l e t e d s t a r t i n g m a t e r i a l u s e d f o ra u x i n a d d i t i o n e x p e r i m e n t s ( 7 2 ) .C e l l W a l l I s o l a t i o n

W a l l s w e r e i s o l a t e d a n d f r a c t i o n a t e d a c c o r d i n g t o t h em e t h o d o f N i s h i t a n i a n d M a s u d a ( 5 8 ) , s l i g h t l y m o d i f i e d .S e g m e n t s w e r e b o i l e d i n m e t h a n o l f o r 5 m i n , r e h y d r a t e d i n1 0 mm p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 0 , a n d t r e a t e d w i t h P r o n a s e -P( S i g m a , 0 . 2 m g / m L ) f o r 1 8 h a t 2 5 C . T h e w a l l s w e r e t h e nh o m o g e n i z e d w i t h a s m a l l v o l u m e o f w a t e r a t 5 C , e x t r a c t e dt h r e e t i m e s e a c h w i t h c o l d w a t e r , a c e t o n e , a n d m e t h a -n o l : c h l o r o f o r m ( 1 : 1 , v / v ) , a n d d r i e d u n d e r f i l t e r e d a i r a t r o o mt e m p e r a t u r e .C e l l W a l l F r a c t i o n a t i o n

T h e d r i e d c e l l w a l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n 3 t o 5 mL o f w a t e ra n d h e a t e d a t 7 0 C f o r 3 m i n t o d i s s o l v e s t a r c h ; 4 0 u n i t s o fp o r c i n e p a n c r e a t i c a m y l a s e ( S i g m a ) i n 1 0 mm p o t a s s i u mp h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 0 , w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a si n c u b a t e d f o r 2 h a t 2 5 C . P e c t i n w a s e x t r a c t e d b y f o u r 1 - ht r e a t m e n t s w i t h 2 0 mmammonium o x a l a t e - o x a l i c a c i d b u f f e r ,pH 4 . 0 , a t 7 0 C . S o t h a t a n y w a l l p o l y m e r s s o l u b i l i z e d b y t h ep r e v i o u s warm w a t e r t r e a t m e n t w o u l d b e r e c o v e r e d i n t h ep e c t i n f r a c t i o n , t h e a m y l a s e a n d ammonium o x a l a t e e x t r a c t sw e r e c o m b i n e d . T h e y w e r e c o n c e n t r a t e d t o a b o u t 5 mL b ys i m p l e ( n o t r o t a r y ) e v a p o r a t i o n i n a n E r l e n m e y e r f l a s k u n d e rr e d u c e d p r e s s u r e , w i t h o u t f r e e z i n g , s o a s t o a v o i d d r y i n g d o w na p p r e c i a b l e p o l y s a c c h a r i d e m a t e r i a l . T h e s a m p l e w a s d e s a l t e dw i t h a B i o -G e l P -2 c o l u m n ( B i o - R a d C o r p . , R i c h m o n d , C A ) ,a n y d e x t r i n s a n d o l i g o s a c c h a r i d e s d e r i v e d f r o m a m y l a s e a c -t i o n b e i n g r e c o v e r e d a l o n g w i t h t h e p o l y s a c c h a r i d e s .H e m i c e l l u l o s e s w e r e e x t r a c t e d b y t h r e e t r e a t m e n t s o f 2 4 he a c h i n 4 M KOH c o n t a i n i n g 2 6 mm N a B H 4 , a t 2 5 C . T h ee x t r a c t s w e r e c o m b i n e d a n d t i t r a t e d t o pH 7 . 0 w i t h H C 1 ,c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a s d e s c r i b e d a b o v e , a n dd e s a l t e d w i t h B i o - G e l P - 2 . T h e w a l l m a t e r i a l r e m a i n i n g a f t e ra l k a l i e x t r a c t i o n ( a - c e l l u l o s e ) w a s n o t s t u d i e d .

GFCG FC w a s p e r f o r m e d w i t h a P h a r m a c i a 2 . 5 - x 1 0 0 - c m Kc o l u m n o f S e p h a r o s e 4 B ( P h a r m a c i a L KB B i o t e c h n o l o g y ,P i s c a t a w a y , N J ) o r , i n l a t e r e x p e r i m e n t s , t h e c r o s s - l i n k e d C L -4 B v e r s i o n o f t h i s g e l , w h i c h h a s t h e s a m e s e p a r a t i o n p r o p e r -t i e s . D e s a l t e d w a l l e x t r a c t s w e r e l o a d e d o n t o t h e c o l u m n w i t h

a s a m p l e i n j e c t o r a n d w e r e e l u t e d w i t h g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r a ta b o u t 2 2 C . T h e c o l u m n w a s e q u i l i b r a t e d w i t h 1 0 mm s o d i u ma z i d e b e t w e e n u s e t o p r e v e n t m i c r o b i a l c o n t a m i n a t i o n .A s i n p r e v i o u s w o r k o n p l a n t c e l l w a l l m a t r i x p o l y s a c c h a -r i d e s , o u r S e p h a r o s e c o l u m n s w e r e c a l i b r a t e d u s i n g h e t e r o d -i s p e r s e d e x t r a n s t a n d a r d s o b t a i n e d f r o m P h a r m a c i a . P r e v i o u sw o r k e r s h a v e t a k e n t h e p o s i t i o n s o f t h e G FC e l u t i o n p e a k s o ft h e s e d e x t r a n s t o c o r r e s p o n d e i t h e r t o t h e i r m a n u f a c t u r e r ' sn o m i n a l m o l w t d e s i g n a t i o n s o r t o t h e i r w e i g h t - a v e r a g e m o lw t s , w h i c h a c c o r d i n g t o P h a r m a c i a a r e r e l a t i v e l y c l o s e t o t h e s en o m i n a l d e s i g n a t i o n s . H o w e v e r , t h e G F C p e a k o f a h e t e r o d -i s p e r s e p o l y m e r s h o u l d r e p r e s e n t t h e p e a k o f i t s m o l w td i s t r i b u t i o n r a t h e r t h a n i t s a v e r a g e m o l w t . A c c o r d i n g t o d a t as u p p l i e d b y P h a r m a c i a , t h e p e a k s o f t h e s e d e x t r a n m o l w td i s t r i b u t i o n s l i e a t m o l w t v a l u e s o f a b o u t 0 . 2 5 t o 0 . 5 t i m e st h e i r r e s p e c t i v e w e i g h t - a v e r a g e m o l w t s . T o c a l i b r a t e o u rc o l u m n , w e e q u a t e d t h e e l u t i o n v o l u m e o f t h e G FC p e a k o fe a c h d e x t r a n , w i t h t h e m o l e c u l a r m a s s v a l u e o f t h e p e a k i nt h e m o l e c u l a r m a s s d i s t r i b u t i o n p r o f i l e i n P h a r m a c i a ' s d a t af o r t h a t d e x t r a n . T h e s e p e a k m o l e c u l a r m a s s e s a r e r e l a t i v e l yc l o s e t o t h e n u m b e r - a v e r a g e m o l e c u l a r m a s s e s g i v e n f o r t h e s ed e x t r a n s b y P h a r m a c i a ( r a t h e r t h a n t h e i r w e i g h t - a v e r a g e m o lw t s , u s e d i n p r e v i o u s c a l i b r a t i o n s ) .F o r t h e 4 B a n d C L - 4 B c o l u m n s , a l o g - l i n e a r s e p a r a t i o n w a so b t a i n e d f r o m a b o u t 3 0 0 0 t o 3 0 k D , w i t h s o m e d e g r e e o fn o n l i n e a r s e p a r a t i o n d o w n t o a b o u t 2 k D . A l t h o u g h o u rc a l i b r a t i o n m e t h o d p r o d u c e s a m o r e v a l i d i d e a o f t h e s i z e o ff r a c t i o n a t e d p o l y m e r s , w a l l p o l y s a c c h a r i d e s ma y n o t n e c e s -s a r i l y h a v e t h e s a m e c o n f o r m a t i o n a s t h e d e x t r a n s t a n d a r d s ,s o a l l M r v a l u e s g i v e n i n t h i s p a p e r s h o u l d s t i l l b e r e g a r d e d a s" a p p a r e n t " v a l u e s .D E A E - C e l l u l o s e C h r o m a t o g r a p h y

T h e p e c t i c e x t r a c t w a s a p p l i e d t o a 1 2 - x 1 . 5 - c m C e l l e x -D E A E c o l u m n ( B i o - R a d ) . N e u t r a l a n d a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e sw e r e e l u t e d , r e s p e c t i v e l y , w i t h 1 0 0 mL o f 1 0 mM p o t a s s i u mp h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 5 , a n d 1 0 0 mL o f b u f f e r c o n t a i n i n g1 M N a C l .S u g a r A n a l y s i s

T o t a l c a r b o h y d r a t e w a s m e a s u r e d w i t h t h e p h e n o l - H 2 S O 4a s s a y ( 1 7 ) . B e c a u s e i t i s o n l y a b o u t 4 0 % a s s e n s i t i v e t o u r o n i ca c i d a s t o s u g a r s , i n v i e w o f t h e n e u t r a l s u g a r a n d u r o n i c a c i dc o m p o s i t i o n o f t h e p e c t i n f r a c t i o n ( T a b l e I I ) , t h e G FC p r o f i l eo b t a i n e d f o r p e c t i n w i t h t h i s a s s a y r e f l e c t s p r i n c i p a l l y t h ed i s t r i b u t i o n o f n e u t r a l s u g a r s . P o l y g a l a c t u r o n i c a c i d w a s m e a s -u r e d w i t h c a r b a z o l e a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f G a l a m b o s( 2 3 ) . XG w a s m e a s u r e d b y t h e i o d i n e a s s a y o f K o o i m a n ( 4 0 ) ,s o m e t i m e s s c a l e d t o h a l f t h e d e s c r i b e d v o l u m e f o r g r e a t e rs e n s i t i v i t y .To d e t e r m i n e m o n o s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o n , s a m p l e s w e r eh y d r o l y z e d w i t h 1 N H 2 S O 4 i n s e a l e d t u b e s a t 1 0 0 C f o r 6 h

3 5 8 TALBOTT AND RAY


3/12

PEA PRIMARY WALL STRUCTURE

a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f H a i s a n d M a c e k ( 2 6 ) a n d t h e nn e u t r a l i z e d w i t h B a C O 3 . S u g a r s w e r e s e p a r a t e d b y a s c e n d i n gTL C o n s i l i c a g e l 6 0 p l a t e s i m p r e g n a t e d w i t h 0 . 5 M N a H 2 P O 4u s i n g i s o p r o p a n o l : a c e t o n e : 0 . 2 M l a c t i c a c i d ( 6 0 : 3 0 : 1 0 , v / v / v )a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f K r e m e r ( 4 2 ) . S p o t s w e r e v i s u -a l i z e d b y s p r a y i n g w i t h a n i l i n e h y d r o g e n p h t h a l a t e . H P LCa n a l y s i s w a s p e r f o r m e d o n h y d r o l y s a t e s u s i n g a D i o n e x 4 0 0 0 ic h r o m a t o g r a p h y s y s t e m ( D i o n e x C o r p . , S u n n y v a l e , C A )e q u i p p e d w i t h e i t h e r a P A l ( T a b l e I I ) o r AS6A ( T a b l e I I I ) i o ne x c h a n g e c o l u m n a n d a p u l s e d a m p e r o m e t r i c d e t e c t o r .

RESULTST h e c o m p o s i t i o n o f p e a t h i r d i n t e r n o d e c e l l w a l l m a t r i xm a t e r i a l , s e p a r a t e d i n t o t r a d i t i o n a l p e c t i n a n d h e m i c e l l u l o s ef r a c t i o n s b y e x t r a c t i o n , r e s p e c t i v e l y , w i t h warm d i l u t e a m -monium o x a l a t e / o x a l i c a c i d ( p H 4 ) a n d 4 N KOH, i s s h o w ni n T a b l e s I a n d I I . T h e i n d i c a t e d c o m p o s i t i o n g e n e r a l l y r e s e m -b l e s t h a t p r e v i o u s l y g i v e n f o r p e a p r i m a r y w a l l s ( 1 6 , 2 4 ) ,e x c e p t f o r t h e l a c k o f d e t e c t a b l e m a n n o s e . T h e m i n o r a m o u n t

o f m a n n o s e p r e v i o u s l y r e p o r t e d m i g h t , i n o u r e x t r a c t i o np r o c e d u r e , h a v e b e e n r e t a i n e d m o s t l y i n t h e a - c e l l u l o s e f r a c -t i o n , a s i n s o m e e a r l i e r d a t a o n p e a c e l l w a l l s ( 2 7 , 4 2 ) . T h ep e c t i n f r a c t i o n , w h i c h m a k e s u p a b o u t 40% o f t h e w a l l ,c o n t a i n s a l m o s t a l l o f t h e w a l l ' s u r o n i c a c i d , p l u s s u b s t a n t i a lr h a m n o s e , i n d i c a t i n g t h a t R G i s a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t o ft h i s f r a c t i o n , a l o n g w i t h t h e t y p i c a l l y R G - a s s o c i a t e d g a l a c t o s ea n d a r a b i n o s e p o l y m e r s . T h e h e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n , w h i c hm a k e s u p a b o u t 3 0 % o f t h e w a l l , i n c o n t r a s t t o t h e p e c t i nc o n t a i n s s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f g l u c o s e a n d x y l o s e , i n a g r e e -m e n t w i t h p r e v i o u s r e s u l t s ( 3 0 ) i n d i c a t i n g t h a t m o s t o f t h ew a l l ' s XG o c c u r s i n t h i s f r a c t i o n . H o w e v e r , g a l a c t o s e a n da r a b i n o s e a r e t h e m o s t a b u n d a n t c o m p o n e n t s o f t h e H Cf r a c t i o n .

A s s h o w n i n T a b l e I I , w e a n a l y z e d w a l l m a t e r i a l t h a t h a db e e n p r e p a r e d e i t h e r w i t h o r w i t h o u t a h o t w a t e r t r e a t m e n tt o s o l u b i l i z e s t a r c h , s u c h a s w a s u s e d i n p r e v i o u s w o r k o nw a l l p o l y s a c c h a r i d e Mr ( 5 8 , 5 9 ) . T h i s s t e p p r o v e d t o h a v e n os i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e c o m p o s i t i o n o f t h e p e c t i c a n d H Cf r a c t i o n s .P e c t i c P o l y m e r sG FC o f t h e p e c t i c p o l y u r o n i d e s ( F i g . 1 ) g i v e s a r e l a t i v e l yn a r r o w M r d i s t r i b u t i o n c e n t e r e d a r o u n d 1 1 0 0 kD w i t h o u ta p p r e c i a b l e m a t e r i a l b e l o w a b o u t 5 0 0 k D . No s i g n i f i c a n ta m o u n t o f p o l y u r o n i d e a p p e a r s a t t h e c o l u m n ' s v o i d v o l u m e( 1 2 5 m L ) , i n d i c a t i n g t h e a b s e n c e o f v e r y l a r g e m o l e c u l e s o r

m o l e c u l a r a g g r e g a t e s .When t h e f r a c t i o n s f r o m a G FC s e p a r a t i o n s u c h a s t h a t i n

T a b l e I . G r o s s C o m p o s i t i o n o f P e a T h i r d I n t e r n o d e C e l l W a l l sW a l l m a t e r i a l made u p 1 1 . 1 % o f s e g m e n t d r y w e i g h t . F i g u r e f o rp e c t i n i n c l u d e s a n y s t a r c h c o n t a i n e d i n c e l l w a l l p r e p a r a t i o n .

F r a c t i o n %P e c t i n 4 1H e m i c e l l u l o s e 3 2C e l l u l o s e 2 7

F i g u r e 1 a r e p o o l e d , c o n c e n t r a t e d b y e v a p o r a t i o n t o t h eo r i g i n a l v o l u m e , a n d r e c h r o m a t og r ap h e d , a d i f f e r e n t p r o f i l ei s o b t a i n e d , s h i f t e d t o w a r d h i g h e r Mr v a l u e s a n d now i n c l u d -i n g a p p r e c i a b l e m a t e r i a l t h a t v o i d s t h e c o l u m n ( F i g . 2 ) . M o -l e c u l a r a g g r e g a t e s m u s t t h e r e f o r e f o r m d u r i n g c o n c e n t r a t i o no f t h e s o l u t i o n . B o i l i n g t h e p e c t i n s a m p l e b e f o r e r e c h r o m a -t o g r a p h y d i d n o t d i s s o c i a t e t h e s e a g g r e g a t e s o r r e s t o r e t h eo r i g i n a l M r d i s t r i b u t i o n .T h e M r d i s t r i b u t i o n o f t h e n e u t r a l s u g a r s c o n t a i n e d i n t h ep e c t i n f r a c t i o n c l o s e l y r e s e m b l e s t h a t o f t h e p o l y u r o n i d e s b u tp e a k s a t a s l i g h t l y l o w e r M r a n d d i s p l a y s a m i n o r t r a i l i n g p e a ka t a b o u t 4 0 0 k D , m a k i n g u p a b o u t 6% o f t h e t o t a l s u g a r , n o ta s s o c i a t e d w i t h u r o n i c a c i d ( F i g . 1 ) . T h e p e a k f r a c t i o n s o f t h ep o l y u r o n i d e p r o f i l e c o n t a i n s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f a r a b i n o s ea n d g a l a c t o s e , p l u s a s m a l l e r a m o u n t o f r h a m n o s e , a t r a c e o fx y l o s e , a n d n o g l u c o s e ( r e s u l t s f r o m T L C , n o t s h o w n ) . E x c e p tf o r t h e x y l o s e , t h i s c o m p o s i t i o n w o u l d b e e x p e c t e d f o r R Gp o l y m e r s , w h i c h b e a r s i d e c h a i n s c o m p o s e d o f a r a b i n o s e a n dg a l a c t o s e u n i t s , a t t a c h e d t o r h a m n o s e r e s i d u e s i n t h e p o l y u -r o n i d e b a c k b o n e ( 1 4 , 5 2 ) . T h e a b s e n c e o f d e t e c t a b l e g l u c o s ei n t h e p e a k f r a c t i o n s s u g g e s t s t h a t t h e g l u c o s e f o u n d i n t h et o t a l p e c t i n ( T a b l e I I ) c o m e s m a i n l y f r o m s t a r c h t h a t c o n t a m -i n a t e s t h e c e l l w a l l p r e p a r a t i o n , b e c a u s e i n t h e p r e p a r a t i o np r o c e d u r e a n y s t a r c h s h o u l d h a v e b e e n c o n v e r t e d t o s m a l lm o l e c u l a r p r o d u c t s . I f t h e x y l o s e f o u n d i n t h e p e c t i n f r a c t i o n( T a b l e I I ) h a d c o m e m a i n l y f r o m XG, a t l e a s t 3 0 % m o r eg l u c o s e t h a n x y l o s e s h o u l d h a v e o c c u r r e d i n t h e G FC p o l y m e rp e a k a n d w o u l d e a s i l y h a v e b e e n d e t e c t e d a l o n g w i t h t h ex y l o s e t h a t o c c u r r e d t h e r e . T h e r e f o r e , m o s t o f t h i s x y l o s ea p p a r e n t l y d o e s n o t come f r o m XG b u t p r o b a b l y f r o m x y l a n ,t h e p r e s e n c e o f w h i c h w a s i n d i c a t e d b y a l i n k a g e d e t e r m i n a -t i o n o n p e a c e l l w a l l s ( 2 4 ) .A b o u t 1 4 % o f t h e p e c t i n f r a c t i o n ' s n e u t r a l s u g a r c a n b es e p a r a t e d , u s i n g D E A E - c e l l u l o s e ( F i g . 3 ) , f r o m i t s p o l y u r o n i d ea s n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s , w h i c h d o n o t a d s o r b t o D E A Eg r o u p s . T h i s m a t e r i a l p r e s u m a b l y i n c l u d e s t h e m i n o r t r a i l i n g4 0 0 kD p e a k o f u r o n i c a c i d - f r e e p o l y s a c c h a r i d e i n t h e M rd i s t r i b u t i o n ( F i g . 1 ) , p l u s a d d i t i o n a l h i g h e r Mr n e u t r a l p o l y -s a c c h a r i d e w h i c h o v e r l a p s t h e p o l y u r o n i d e Mr d i s t r i b u t i o n .T h e r e m a i n i n g 8 6 % o f t h e p e c t i c f r a c t i o n ' s n e u t r a l s u g a r i sa p p a r e n t l y a s s o c i a t e d w i t h p o l y u r o n i d e , b e c a u s e i t e l u t e sa l o n g w i t h t h e l a t t e r w h e n t h e c o l u m n i s w a s h e d w i t h s a l ts o l u t i o n . T h i s s u p p o r t s t h e v i e w , n o t e d a b o v e , t h a t t h e p o l y u -r o n i d e Mr p e a k ( F i g . 1 ) i n c l u d e s R G b a c k b o n e s w i t h g a l a c t o s e -a n d a r a b i n o s e - c o n t a i n i n g s i d e c h a i n s a t t a c h e d t o t h e m .H e m i c e l l u l o s e s

I n c o n t r a s t t o t h e p e c t i c p o l y m e r Mr d i s t r i b u t i o n , G FCf r a c t i o n a t i o n o f HC g i v e s t w o m a j o r p e a k s ( F i g . 4 ) . T h e h i g hM r ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 0 k D ) p e a k m a k e s u p 6 0 t o 70% o f t h eH C f r a c t i o n ; t h e l o w e r Mr p e a k , m a k i n g u p t h e r e m a i n d e r , i sc e n t e r e d a t a b o u t 3 0 kD b u t e x t e n d s f r o m a b o u t 1 0 0 kDdown t o < 1 0 k D . T h e i o d i n e c o l o r r e a c t i o n f o r XG s h o w st h a t t h e l a t t e r p e a k c o r r e s p o n d s t o a p e a k o f X G , w h e r e a s t h eh i g h M r p e a k c o n t a i n s a l m o s t n o XG ( F i g . 4 ) .T h e h i g h Mr H C p e a k y i e l d s m a i n l y a r a b i n o s e a n d g a l a c -t o s e , m i n o r a m o u n t s o f x y l o s e , g l u c o s e , a n d r h a m n o s e , p l u sa t r a c e o f f u c o s e ( T a b l e I I I ) . T h i s p e a k a p p e a r s , t h e r e f o r e , t oc o n s i s t m a i n l y o f A G . B e c a u s e t h e x y l o s e t o f u c o s e m o l a r

3 5 9


4/12


T a b l e I I . M o n o s a c c h a r i d e C o m p o s i t i o n o f P e c t i n a n d H e m i c e l l u l o s e F r a c t i o n sF i g u r e s f o r i n d i v i d u a l c o m p o n e n t s a s p e r c e n t a g e o f t h e e n t i r e m a t r i x a r e t h e m e a ns o f t h e s t a n d a r d

a n d u n h e a t e d w a l l p r e p a r a t i o n s , t i m e s t h e m o l e f r a c t i o n o f t h e e n t i r e m a t r i x t h a t i s r e p r e s e n t e d ,r e s p e c t i v e l y , b y a l l t h e c o m p o n e n t s o f t h e p e c t i n o r H e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n , a s c a l c u l a t e d f r o m t h e d a t ai n T a b l e I a n d i n t h i s t a b l e . R h a m n o s e a n d a r a b i n o s e w e r e n o t s e p a r a t e d b y t h e P A l c o l u m n u s e d f o rt h e s e a s s a y s ; i n t h e f i g u r e s f o r p e r c e n t a g e o f e n t i r e m a t r i x , t o t a l r h a m n o s e p l u s a r a b i n o s e w a sa p p o r t i o n e d b e t w e e n t h e s e t w o s u g a r s b a s e d o n r e s u l t s f r o m T L C , b y w h i c h t h e y w e r e s e p a r a t e d .

P e c t i n H e m i c e l l u l o s eM o n o s a c c h a r i d e s W a l l p r e p a r a t i o n W a l l p r e p a r a t i o n% o f M a t r i x % o f M a t r i xS t a n d a r d U n h e a t e d a S t a n d ar d U n he at e d a

m o / %U r o n i c a c i d 4 5 . 2 4 6 . 0 2 4 . 9 1 . 3 1 . 2 0 . 5F u c o s e 1 . 0 1 . 2 0 . 6 5 . 1 4 . 8 2 . 3R h a m n o s e 3 3 . 3 3 2 . 2 J 3 . 6 t 3 6 . 2 3 6 . 8 ' 1 3 . 5A r a b i n o s e 1 1 4 . 2 1.G a l a c t o s e 1 5 . 8 1 5 . 3 8 . 5 4 0 . 9 4 0 . 3 1 8 . 4X y l o s e 1 . 8 2 . 1 1 . 1 7 . 5 6 . 6 3 . 2G l u c o s e 2 . 7 3 . 1 1 . 6 8 . 8 9 . 3 4 . 1

a C e l l w a l l s p r e p a r e d w i t h o u t h e a t i n g i n w a t e r ( s e e t e x t ) .

r a t i o i n p e a XG i s 6 ( r e f . 3 0 ; T a b l e I I I l e f t c o l u m n ) , t h e d a t ai n t h e r i g h t c o l u m n o f T a b l e I I I i n d i c a t e t h a t t h e s m a l l a m o u n to f x y l o s e i n t h e h i g h Mr p e a k i s m o s t l y n o t i n X G . I na g r e e m e n t , a p r e l i m i n a r y l i n k a g e d e t e r m i n a t i o n o n t h i s m a -t e r i a l b y m e t h y l a t i o n ( d a t a n o t g i v e n ) s h o w e d t h e o c c u r r e n c eo f 1 , 4 - l i n k e d x y l o s e , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f x y l a n , s m a l la m o u n t s o f w h i c h a r e k n o w n t o o c c u r i n d i c o t p r i m a r y w a l l s( 1 5 , 5 9 ) a n d w e r e i n d i c a t e d f o r p e a b y l i n k a g e a n a l y s i s ( 2 4 )a s m e n t i o n e d a b o v e .TL C ( n o t s h o w n ) i n d i c a t e d t h a t t h e m i n o r a m o u n t o fu r o n i c a c i d t h a t o c c u r s i n t h e HC f r a c t i o n ( T a b l e I I ) i s f o u n di n t h e h i g h Mr p e a k , o f w h i c h i t s h o u l d m a k e u p o n l y a b o u t2% ( f r o m t h e i n f o r m a t i o n g i v e n a b o v e a n d i n T a b l e I I ) . T h ea m o u n t o f r h a m n o s e i n t h i s p e a k a n d i n t h e HC a s a w h o l e

i s much t o o l a r g e , r e l a t i v e t o u r o n i c a c i d , t o b e e x p l a i n e d b yt h e p r e s e n c e o f t r a c e s o f t h e m a j o r RGs ( R G - I a n d R G - I I )w h o s e c o m p o s i t i o n h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d ( 5 0 ) . B e c a u s e s o m ea r a b i n o g a l a c t a n s c o n t a i n r h a m n o s e ( 1 4 ) , t h i s s u g a r c o u l d b ep a r t o f t h e m a j o r A G p o l y m e r ( s ) .T h e l o w e r M r , 1 2 - p o s i t i v e H C p e a k y i e l d s m a i n l y g l u c o s ea n d x y l o s e a n d s m a l l e r a m o u n t s o f g a l a c t o s e a n d f u c o s e( T a b l e I I I ) , w h i c h a r e t h e m a i n c o n s t i t u e n t s o f X G . A s m a l lamount o f a r a b i n o s e a l s o o c c u r s , a s f o u n d p r e v i o u s l y i n a p e aXG p r e p a r a t i o n ( 3 0 ) . T h i s a r a b i n o s e i s p r o b a b l y p a r t o f t h eXG m o l e c u l e , b e c a u s e t h i s s u g a r h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o

3 0 0 0 1 5 0 0Mr ( X l O O O )

9 0 0 5 0 0Mr ( X l O O O )

1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0E l u t i o n Volume ( m l ) 500

F i g u r e 1 . G FC p r o f i l e o f pe a p e c t i n . C l o s e d s y m b o l s , u r o n i c a c i d ;ope n s y m b o l s , t o t a l n e u t r a l s u g a r s ; a r r o w , v o i d v o l u m e o f c o l u m n .

0H - -

1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0E l u t i o n V o l u m e ( m l ) 2 2 0 2 4 0

F i g u r e 2 . C o m p a r i s o n o f i n i t i a l ( o p e n s y m b o l s ) a n d r e c h r o m a t o -g r a p h e d ( c l o s e d s y m b o l s ) G F C p o l y u r o n i d e p r o f i l e s f o r a p e c t i ne x t r a c t . A f t e r t h e i n i t i a l G F C , t h e u r o n i c a c i d - c o n t a i n i n g f r a c t i o n s w e r ep o o l e d , c o n c e n t r a t e d b y v a c u u m e v a p o r a t i o n , d i l u t e d , a nd r e a p p l i e dt o t h e c o l u m n a f t e r 2 4 h .

0H m



5/12

P EA P RI MAR Y WALL STRUCTURE

0H

0 5 0 1 0 0 1 5 0E l u t i o n V o l u m e ( m l )F i g u r e 3 . S e p a r a t i o n o f n e u t r a l f r o m a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e s i n t h ep e c t i n f r a c t i o n b y a d s o r p t i o n t o D E A E - c e l l u l o s e . S a m p l e ( i n w a t e r )w a s a p p l i e d t o c o l u m n w h i c h w a s w a s h e d w i t h w a t e r u p t o t h e p o i n ti n d i c a t e d b y t h e a r r o w , w h e n 1 M N a C I was a p p l i e d t o e l u t e a c i d i cp o l y s a c c h a r i d e s . S y m b o l s a s i n F i g u r e 1 .

b e a m i n o r t e r m i n a l s i d e g r o u p i n s e v e r a l o t h e r XGs ( 3 8 , 6 2 ,6 6 ) .G FC p r o f i l e s o f m o s t H C p r e p a r a t i o n s c o n t a i n a s e c o n d a r y ,u s u a l l y m i n o r , h i g h e r Mr XG p e a k a t a b o u t 3 0 0 kD ( F i g . 4 ) .A f t e r c e r t a i n t i s s u e p r e t r e a t m e n t s , t h i s XG p e a k i s much m o r ep r o m i n e n t a n d , i n s o m e c a s e s , c a n b e c o m e t h e p r i n c i p a l p e a k( 7 2 ) .When t h e X G - c o n t a i n i n g f r a c t i o n s f r o m a G FC p r o f i l e a r ep o o l e d , c o n c e n t r a t e d , a n d r e c h r o m a t o g r a p h e d , a p r o f i l e a l -m o s t i d e n t i c a l w i t h t h e i n i t i a l o n e i s o b t a i n e d ( d a t a n o ts h o w n ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t XG u n i t s n e i t h e r d i s s o c i a t e n o ra g g r e g a t e d u r i n g t h e s e m a n i p u l a t i o n s , i n c o n t r a s t t o t h e p e c t i cp o l y u r o n i d e s . T h a t n o s i g n i f i c a n t p r o p o r t i o n o f e i t h e r t h e

Mr ( X l O O O )3 0 0 0 8 0 0 2 0 0

c z0

H-

1 0 0

2 0

2 0 0 3 0 0 4 0 0E l u t i o n V o l u m e ( m l )

F i g u r e 4 . G F C p r o f i l e o f pe a h e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n . O p e n s y m b o l s ,t o t a l n e u t r a l s u g a r s ; c l o s e d s y m b o l s , XG ( 1 2 a s s a y ) .

T a b l e I l I l . M o n o s a c c h a r i d e C o m p o s i t i o n o f G F C - S e p a r a t e dH e m i c e l l u l o s e sS u g a r Low M , P e a k H i g h M , P e a k

m o l % m o l r a t i o m o / % m o l r a t i oF u c o s e 4 . 4 1 0 . 3 1A r a b i n o s e 1 . 3 0 . 2 5 3 4 . 5 9 6R h a m n o s e 0 0 7 . 6 2 1G a l a c t o s e 1 0 . 4 2 4 4 . 9 1 3 3X y l o s e 2 6 . 6 6 6 . 9 1 9G l u c o s e 5 2 . 9 1 1 3 . 9 1 1

X z p e c t i n o r t h e XG d i s t r i b u t i o n s s h i f t e d t o w a r d l o w e r Mr v a l u e s2 0 0 ( o r t o t h e i n c l u d e d v o l u m e a t a b o u t 5 0 0 mL) i n d i c a t e s t h a tn o s i g n i f i c a n t a u t o l y s i s o f t h e p o l y m e r s o c c u r r e d d u r i n g t h e s ep r o c e d u r e s .

D I S C U S S I O NT h e Mr d i s t r i b u t i o n s o f o u r p e a c e l l w a l l m a t r i x p o l y m e r sa r e s t r i k i n g l y n a r r o w e r t h a n many p r e v i o u s l y p u b l i s h e d d i s -t r i b u t i o n s f r o m o t h e r m a t e r i a l s , b o t h f o r p o l y u r o n i d e s ( 7 , 5 8 )a n d f o r AG a n d XG ( 2 9 , 5 8 , 5 9 ) , a l t h o u g h s o m e s i m i l a r l yn a r r o w e r d i s t r i b u t i o n s h a v e b e e n r e p o r t e d ( 4 6 , 5 7 , 7 7 ) . S o m eo f t h e s e v a r i a t i o n s ma y r e p r e s e n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n p l a n tm a t e r i a l s , b u t o t h e r s a r e p r o b a b l y d u e t o p r o c e d u r a l d i f f e r -

e n c e s a m o n g d i f f e r e n t i n v e s t i g a t i o n s . P r o c e d u r a l d i f f e r e n c e sm i g h t d e t e r m i n e , f o r e x a m p l e , t h e e x t e n t t o w h i c h a r t i f a c t u a ld e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s a n d / o r f o r m a t i o n o f m u l t i -c h a i n a g g r e g a t e s a f f e c t t h e G FC p r o f i l e s .O u r p r o c e d u r e i n v o l v e d p r e c a u t i o n s t o a v o i d a r t i f a c t u a ld e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s , i n c l u d i n g i n i t i a l l y b o i l i n g t h em a t e r i a l i n m e t h a n o l a n d t r e a t i n g i t w i t h p r o t e a s e t o i n a c t i v a t ea u t o l y t i c e n z y m e s ( 1 6 ) ; m a i n t a i n i n g a z i d e i n t h e G FC c o l u m nb e t w e e n r u n s , t o f o r e s t a l l m i c r o b i a l g r o w t h ; a n d o t h e r p o i n t st o b e d i s c u s s e d b e l o w . R e c h r o m a t o g r a p h y g a v e n o e v i d e n c et h a t p o l y m e r s i z e d e g r a d a t i o n w a s o c c u r r i n g d u r i n g o u r p o l -y s a c c h a r i d e e x t r a c t m a n i p u l a t i o n s a n d G F C p r o c e d u r e . S u c ht e s t s , a n d c e r t a i n o f t h e p r e c a u t i o n s a g a i n s t d e g r a d a t i o n t a k e nh e r e , a r e n o t m e n t i o n e d i n much o f t h e p r e v i o u s w o r k c i t e d ;t h e r e f o r e , s o m e o f t h o s e Mr p r o f i l e s c o u l d i n c l u d e a r t i f a c t s .S i z e F e a t u r e s o f P e c t i c P o l y s a c c h a r i d e s

O u r p e c t i n M r p r o f i l e s ( F i g s . 1 a n d 2 ) r e v e a l n o p o l y m e r si n t h e r a n g e s a r o u n d e i t h e r 1 0 0 kD o r 5 t o 1 0 k D , t h ea p p r o x i m a t e M r s t h a t h a v e b e e n e s t i m a t e d f o r R G - I a n d RG-I I , r e s p e c t i v e l y ( 5 0 , 5 1 ) . T h e s e p o l y m e r s , c o n s i s t i n g o f ag a l a c t o m o n i c a c i d ( R G - I I ) o r a l t e r n a t i n g r h a m n o s e / s a l a c t o -m o n i c a c i d ( R G - I ) b a c k b o n e d e c o r a t e d w i t h s i d e c h a i n s c o m -p o s e d p r i m a r i l y o f a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e , a r e t h e p r i n c i p a lt y p e s o f p e c t i c p o l y u r o n i d e s , o t h e r t h a n H G , t h a t h a v e b e e nr e c o g n i z e d ( 5 0 ) .R G - I I h a s b e e n r e p o r t e d t o o c c u r i n p e a c e l l w a l l s ( 1 3 ) i na m o u n t s e q u i v a l e n t t o a b o u t 8 . 5 % o f o u r p e c t i c f r a c t i o n . RG-I v e r y l i k e l y a l s o o c c u r s i n p e a , b e c a u s e i t i s w i d e s p r e a d i ns e e d p l a n t p r i m a r y w a l l s , i n a m o u n t s u s u a l l y a t l e a s t t w i c et h a t o f R G - I I ( 5 0 ) . T h e n e u t r a l s u g a r c o m p o s i t i o n o f o u rp e c t i c f r a c t i o n ( T a b l e I I ) i s v e r y s i m i l a r t o t h a t o f R G - I ( 5 0 ) ,a p a r t f r o m t h e o c c u r r e n c e o f s o m e x y l o s e a n d g l u c o s e ( e x p l a -

3 6 1


6/12


n a t i o n s f o r w h i c h w e r e s u g g e s t e d i n " R e s u l t s " ) . D E A E - c e l l u -l o s e a d s o r p t i o n i n d i c a t e s t h a t m o s t o f t h e p e c t i c n e u t r a l s u g a r sa r e f i r m l y a t t a c h e d ( p r o b a b l y c o v a l e n t l y b o u n d ) t o p o l y u r o n -i d e , a s t h e y a r e i n R G - I a n d R G - I I . H o w e v e r , t h e much h i g h e rp r o p o r t i o n o f u r o n i c a c i d i n t h e p e c t i n ( T a b l e I I ) t h a n i ne i t h e r R G - I o r R G - I I ( 5 0 ) , a n d t h e h i g h r a t i o o f u r o n i c a c i dt o r h a m n o s e ( c o m p a r e d t o t h e e x p e c t e d 1 : 1 r a t i o f o r R G - Ia n d 2 . 5 : 1 f o r R G - I I ) , p o i n t s t o HG a s a n i m p o r t a n t c o m p o -n e n t o f t h e p e c t i c p o l y u r o n i d e . F r o m t h e r h a m n o s e c o n t e n to f t h e p e c t i n f r a c t i o n , c o m p a r e d w i t h t h a t o f R G - I a n d RG-I I , i t c a n b e e s t i m a t e d t h a t HG m a k e s u p a b o u t 8 2 % o f t h et o t a l p e c t i c p o l y u r o n i d e , o r a b o u t 3 7 % o f t h e e n t i r e p e c t i nf r a c t i o n .T h e R G - I a n d R G - I I m o l e c u l e s t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d a n dc h a r a c t e r i z e d ( 5 0 ) a r e r e l e a s e d f r o m t h e c e l l w a l l b y d e g r a d i n gw i t h e n d o p o l y g a l a c t u r o n a s e , w h i c h h y d r o l y z e s HG. T h i s a n do t h e r e v i d e n c e ( f o r e x a m p l e , s e e r e f . 7 5 ) h a s r e p e a t e d l y b e e ni n t e r p r e t e d a s i n d i c a t i n g t h a t n a t i v e p e c t i c p o l y u r o n i d e s c o n -s i s t o f R G ( " h a i r y " ) b l o c k s s e p a r a t e d b y " s m o o t h " b l o c k s o fHG. T h e G FC p r o f i l e o f t h e p e a p e c t i c p o l y u r o n i d e s s u p p o r t st h i s i n t e r p r e t a t i o n , b e c a u s e t h e R G n e u t r a l s u g a r c o m p o n e n t sc o c h r o m a t o g r a p h w i t h t h e u r o n i c a c i d ( m o s t o f w h i c h i s i nHG a s n o t e d a b o v e ) a s a s i n g l e p e a k ( F i g . 1 ) . T h e p r o f i l es h o w s , m o r e o v e r , t h a t t h i s c o m p l e x p o l y m e r i s n o t i n d e f i n i t e l yl a r g e . C a l c u l a t i o n s ( n o t g i v e n ) f r o m t h e d a t a i n T a b l e I I a n dF i g u r e 3 i n d i c a t e t h a t , i f t h e m e a n s i z e s o f R G - I a n d R G - I Ib l o c k s i n p e a a r e s i m i l a r t o t h o s e o f s y c a m o r e , t h e a v e r a g ep e a p e c t i n m o l e c u l e o f a b o u t 1 1 0 0 kD c a n n o t c o n t a i n m o r et h a n a b o u t t w o s u c h R G - I b l o c k s a n d a b o u t 2 5 t o 4 0 o f t h e( m u c h s m a l l e r ) R G - I I b l o c k s .A q u e o u s s o l u t i o n s o f p e c t i c p o l y u r o n i d e s t e n d t o a s s o c i a t en o n c o v a l e n t l y i n t o m u l t i c h a i n a g g r e g a t e s ( 1 9 , 2 5 a n d r e f e r -e n c e s c i t e d t h e r e i n ) . O u r r e s u l t s ( F i g . 2 ) s h o w e d t h a t , w h e np e a p e c t i n s o l u t i o n s a r e c o n c e n t r a t e d b y e v a p o r a t i o n , s o m ea g g r e g a t i o n o c c u r s , l e a d i n g t o a m o d e s t u p s h i f t o f t h e m a i nM r p r o f i l e a n d f o r m a t i o n o f s o m e v e r y l a r g e m i c e l l e s w i t h a nMr o f a t l e a s t 3 0 0 0 k D . B e c a u s e o f p o s s i b l e a g g r e g a t i o n b e f o r et h e i n i t i a l G F C , t h e M r v a l u e s o b t a i n e d f o r p e c t i c p o l y m e r smay o v e r e s t i m a t e t h e s i z e o f t h e i r p r i m a r y s t r u c t u r e s ( g l y c o s -i d i c a l l y b o n d e d b a c k b o n e s ) . A g g r e g a t i o n m i g h t h a v e p r e -v e n t e d s e p a r a t e R G - I a n d R G - I I m o l e c u l e s f r o m b e i n g d e -t e c t e d , a l t h o u g h R G - I w a s r e p o r t e d t o s h o w n o t e n d e n c yt o w a r d a g g r e g a t i o n ( 5 1 ) . T h e p e c t i n Mr w o u l d a l s o e x c e e dt h a t o f t h e p o l y u r o n i d e c h a i n s i f t h e s e a r e i n t e r l i n k e d b y e s t e rc r o s s - l i n k s , a s h a s b e e n p r o p o s e d ( 2 1 ) . T h e G F C d a t a d o ,h o w e v e r , s e t a n u p p e r l i m i t o n p o l y u r o n i d e c h a i n s i z e , s o t h ea b o v e e s t i m a t e o f how many R G - I a n d R G - I I u n i t s may b ec o n t a i n e d i n t h e a v e r a g e p o l y u r o n i d e c h a i n r e p r e s e n t s m a x i -mu m v a l u e s .S i z e F e a t u r e s o f H e m i c e l l u l o s e s

T h e o x a l a t e - i n s o l u b l e , a l k a l i - s o l u b l e f r a c t i o n ( H C ) c o n t a i n sa p r e p o n d e r a n c e o f h i g h Mr A G , i n c l u d i n g a l m o s t h a l f t h ea r a b i n o s e a n d m o r e t h a n t w o - t h i r d s o f t h e g a l a c t o s e i n t h ee n t i r e w a l l m a t r i x . A G s , h o w e v e r , a r e c o n v e n t i o n a l l y r e g a r d e da s p e c t i c c o m p o n e n t s . I n s e v e r a l r e c e n t r e v i e w s o f p r i m a r yw a l l s , AGs a r e n o t e v e n m e n t i o n e d u n d e r t h e H C h e a d i n g .A l t h o u g h g a l a c t o s e a n d a r a b i n o s e w e r e f o u n d t o b e i m p o r t a n tH C c o n s t i t u e n t s i n e a r l i e r w o r k o n p r i m a r y w a l l s ( 7 , 3 5 , 4 7 ,

5 8 , 6 5 , 7 7 ) , t h e b r o a d G FC p r o f i l e s i n m o s t o f t h a t w o r k d i dn o t r e s o l v e AGs f r o m o t h e r H C c o m p o n e n t s , o b s c u r i n g t h e i rs i g n i f i c a n c e . T h e p e a H C Mr p r o f i l e ( F i g . 4 ) c l e a r l y s h o w s t h a td i s t i n c t A G a n d XG p o l y m e r s o c c u r i n t h e H C f r a c t i o n ; t h i sh a s b e e n s h o w n a l s o b y o t h e r m e t h o d s o f f r a c t i o n a t i o n ( 3 5 ,6 5 ) . T h i n k i n g a b o u t w a l l o r g a n i z a t i o n s h ou l d b e e x p a n d e d t oi n c l u d e AGs a s s i g n i f i c a n t HC c o m p o n e n t s o f p r i m a r y w a l l s .T h e p r e v i o u s b r o a d H C M r d i s t r i b u t i o n s n o t e d a b o v e s e e mt o h a v e r e s u l t e d a t l e a s t i n p a r t f r o m u s i n g a q u e o u s a l k a l i a sG FC e l u a n t , w h e r e a s w e u s e d w a t e r . When a z u k i b e a n H C ,w h i c h g a v e a b r o a d , u n r e s o l v e d p r o f i l e u s i n g a l k a l i ( 5 8 , 5 9 ) ,w a s c h r o m a t o g r a p h e d w i t h a d i l u t e pH 5 b u f f e r ( 5 7 ) , i t y i e l d e da d i s t r i b u t i o n v e r y s i m i l a r t o o u r s f o r p e a H C , i n w h i c h A Ga n d XG w e r e a l m o s t c o m pl e t e l y s e p a r a t e d a s r e l a t i v e l y s h a r pp e a k s . A s i m i l a r , b u t l e s s s h a r p l y s e p a r a t e d , Mr d i s t r i b u t i o nf o r s q u a s h h y p o c o t y l HC c o m p o n e n t s w a s o b t a i n e d b y HPLCu s i n g n e u t r a l p h o s p h a t e b u f f e r a s e l u a n t ( 7 7 ) . P r e v i o u s w o r k -e r s p r o b a b l y u s e d a l k a l i b e c a u s e o f c o n c e rn t h a t s o m e HCc o m p o n e n t s ( e s p e c i a l l y XG ) m i g h t e i t h e r a g g r e g a t e o r b i n dt o t h e G FC c o l u m n ' s p o l y s a c c h a r i d e g e l m a t r i x . H o w e v e r , w eo b t a i n e d >90% r e c o v e r y o f p e a H C b y G FC u n d e r t h ec o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n " M e t h o d s . " F u r t h e r m o r e , i t c a n b ec a l c u l a t e d f r o m t h e d a t a i n T a b l e I I I , a n d t h e q u a n t i t a t i v ef e a t u r e s o f t h e d i s t r i b u t i o n i n F i g u r e 4 , t h a t t h e m o n o s a c c h a -r i d e c o m p o s i t i o n o f t h e H C f r a c t i o n s r e c o v e r e d a f t e r G F C , i fp o o l e d t o g e t h e r , w a s v e r y s i m i l a r t o t h a t o f t h e s t a r t i n gm a t e r i a l ( T a b l e I I ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e g o o d r e c o v e r yo f a l l H C c o m p o n e n t s . We a l s o h a v e e v i d e n c e , t o b e p r e s e n t e de l s e w h e r e , t h a t u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s a l k a l i c a n a c t u a l l yc o n t r i b u t e t o a g g r e g a t i o n o f X G ; t h e r e f o r e , w e c o n s i d e r t h a tMr p r o f i l e s o f H C o b t a i n e d u s i n g a l k a l i ma y b e a t l e a s t p a r t l ya r t i f a c t u a l .I n c o n t r a s t t o t h e p e a k M r o f a b o u t 3 0 kD t h a t w e o b t a i n e df o r p e a XG ( F i g . 4 ) , H a y a s h i a n d M a c l a c h l a n ( 3 0 ) , b y G FCo f p e a XG w i t h a l k a l i , o b t a i n e d a b r o a d Mr d i s t r i b u t i o n t h a tp e a k e d a t a b o u t 3 0 0 k D . A l t h o u g h t h i s d i f f e r e n c e m i g h t b ed u e p a r t l y t o t h e m e d i u m u s e d , a s n o t e d a b o v e , i t a l s o s e e m sp o s s i b l e t h a t t h e i r m a t e r i a l m i g h t h a v e c o r r e s p o n d e d t o t h es e c o n d a r y , h i g h e r Mr XG p e a k t h a t o c c u r s a t a b o u t 3 0 0 kD( F i g . 4 ) a n d w h i c h c a n b e much m o r e p r o m i n e n t a f t e r c e r t a i nt i s s u e t r e a t m e n t s ( F i g s . 3 , 4 , a n d 6 i n r e f . 7 2 ) .B e c a u s e t h e XG a n d A G c o m p o n e n t s o f t h e p e a H Cf r a c t i o n c a n b e c l e a n l y s e p a r a t e d b y G L C u s i n g w a t e r , t h e ye v i d e n t l y d o n o t m u t u a l l y a g g r e g a t e i n d i l u t e s o l u t i o n . P e aXG a l s o g a v e n o i n d i c a t i o n o f s e l f - a g g r e g a t i n g d u r i n g c o n c e n -t r a t i o n p r o c e d u r e s t h a t e n c o u r a g e d p e c t i n s t o a g g r e g a t e .T h e r e f o r e , t h e M r d i s t r i b u t i o n s w e o b t a i n e d f o r t h e H C c o m -p o n e n t s a r e m o r e l i k e l y t o r e f l e c t t h e s e p o l y m e r s ' p r i m a r ys t r u c t u r e s , a l t h o u g h t h i s c a n n o t b e g u a r a n t e e d .W i t h t h e p r o v i s o j u s t m e n t i o n e d , o u r r e s u l t s s u g g e s t c o n -s i d e r a b l y m o r e c o n t r o l , b y p l a n t c e l l s , o f t h e c h a i n l e n g t h s o ft h e i r H C p o l y s a c c h a r i d e s t h a n h a s u s u a l l y b e e n s u p p o s e d ,b a s e d o n t h e b r o a d M r p r o f i l e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d . M a r x -F i g i n i a n d S c h u l t z ( 4 8 ) p r e v i o u s l y c o n c l u d e d t h a t t h e c e l l u l o s eo f c o t t o n s e c o n d a r y w a l l s p o s s e s s e s a r e l a t i v e l y u n i f o r m c h a i nl e n g t h b u t f o u n d t h i s n o t t o b e t r u e f o r c o t t o n p r i m a r y w a l l s ,w h i c h a r e m o r e a n a l o g o u s t o t h e p e a i n t e r n o d e c e l l w a l l ss t u d i e d h e r e .L i k e R G - I , XG c o n s i s t s o f many s h o r t s i d e c h a i n s a t t a c h e dt o a n e l o n g a t e d b a c k b o n e w h i c h may b e e x p e c t e d t o b e h a v e



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PEA PRIMARY WALL STRUCTURE

a p p r o x i m a t e l y a s a r a n d o m c o i l ( 9 ) a n d t o o c c u p y a b o u t a smuch v o l u m e a s a l i n e a r d e x t r a n o f e q u a l b a c k b o n e l e n g t h( c f . r e f . 5 1 ) . A t i t s p e a k Mr o f a b o u t 3 0 k D , t h e XG b a c k b o n et h u s a p p e a r s t o b e a bo u t 1 8 0 g l u c o s e r e s i d u e s l o n g , c o r r e -s p o n d i n g t o a n a c t u a l m o l e c u l a r m a s s o f a b o u t 5 0 kD w h e nt h e m a s s o f i t s s i d e c h a i n s ( f r o m t h e c o m p o s i t i o n i n t h e l e f tc o l u m n i n T a b l e I I I ) i s a d d e d .W h e t h e r t h e h e m i c e l l u l o s i c AG i s p r i n c i p a l l y a r a b i n o g a l a c -t a n o r d i s t i n c t a r a b i n a n a n d g a l a c t a n c a n n o t b e d e t e r m i n e dc o n c l u s i v e l y f r o m t h e p r e s e n t e v i d e n c e . T h e f a c t t h a t warmw a t e r a n d ammonium o x a l a t e d o n o t e x t r a c t t h e AG a n d t h er e p o r t e d l a c k o f 6 - a n d 3 , 6 - l i n k e d g a l a c t o s e r e s i d u e s i n t h ep e a c e l l w a l l ( 2 4 ) i n d i c a t e t h a t t h e A G i s n o t m a i n l y t y p e I Ia r a b i n o g a l a c t a n ( c f r e f . 5 0 ) . P e a c e l l w a l l s a l s o r e p o r t e d l y ( 2 4 )l a c k t h e g a l a c t o s e b r a n c h p o i n t s t h a t a r e c h a r a c t e r i s t i c o f t y p eI a r a b i n o g a l a c t a n ( 5 0 ) b u t c o n t a i n l a r g e a m o u n t s o f 4 - l i n k e dg a l a c t o s e a n d 5 - l i n k e d a r a b i n o s e ( 2 4 ) , w h i c h a r e m a j o r c o m -p o n e n t s o f t y p i c a l c e l l w a l l g a l a c t a n s a n d a r a b i n a n s , r e s p e c -t i v e l y . T h e r e f o r e , i t s e e m s l i k e l y t h a t t h e A G c o n s i s t s m a i n l yo f d i s t i n c t a r a b i n a n a n d g a l a c t a n c h a i n s . H o w e v e r , i t s s o l u -b i l i t y a n d m o l e c u l a r s i z e f e a t u r e s s e e m c o n t r a r y t o t h e i m p r e s -s i o n o f s i m p l e a r a b i n a n s a n d g a l a c t a n s a s r a t h e r s m a l l , s o l u b l ep o l y m e r s ( 1 4 , 7 9 ) . I f t h e A G w e r e a m i x t u r e o f i n d e p e n d e n ta r a b i n a n a n d g a l a c t a n m o l e c u l a r p o p u l a t i o n s , t h e i r r e s p e c t i v eMr d i s t r i b u t i o n s w o u l d b e u n l i k e l y t o c o i n c i d e t o g i v e t h eo b s e r v e d s i n g l e r a t h e r s h a r p G FC p e a k . T h e r e f o r e , t h e A Gp r o b a b l y c o n t a i n s i n t e r c o n n e c t e d g a l a c t a n a n d a r a b i n a nc h a i n s . B e c a u s e t h e s e i n t e r c o n n e c t i o n s m u s t b e a l k a l i s t a b l e ,t h e y a r e p r o b a b l y g l y c o s i d i c . T h e A G b a c k b o n e may c o n s i s to f s e p a r a t e b l o c k s o f g a l a c t a n a n d a r a b i n a n , s o m e w h a t a n a l -o g o u s t o t h e a l t e r n a t i n g HG a n d RG b l o c k s i n p e c t i n ( b u tw h i c h , u n l i k e t h o s e i n p e c t i n , c o n t a i n n o u r o n i c a c i d ) . R e a -s o n s w e r e g i v e n p r e v i o u s l y ( 4 ) f o r t h i n k i n g t h a t t h e A G o fd i c o t p r i m a r y w a l l s h a s t h i s t y p e o f s t r u c t u r e .A t y p i c a l h e m i c e l l u l o s i c A G c h a i n o f M r a bo u t 1 0 0 0 kDs h o u l d p o s s e s s a b a c k b o n e o f a b o u t 6 0 0 0 a r a b i n o s e a n d / o rg a l a c t o s e u n i t s . I t s a c t u a l Mr w i l l d e p e n d on t h e e x t e n t t ow h i c h i t b r a n c h e s , w h i c h s h o u l d , l i k e o t h e r s t r u c t u r a l f e a t u r e so f t h e A G , b e d e t e r m i n e d b y f u t u r e w o r k . B e c a u s e t h e a r a b i -n a n s a n d g a l a c t a n s t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d c o n s i s t o f o n l ya b o u t 3 0 t o 1 0 0 ( 7 9 ) ( o r w i t h g a l a c t a n s u p t o p e r h a p s 3 5 0[ 1 8 ] ) r e s i d u e s , many b l o c k s o f e a c h w o u l d h a v e t o o c c u r i n at y p i c a l A G m o l e c u l e .

P o s s i b l e C o v a l e n t I n t e r l i n k i n g I n v o l v i n g P e c t i c P o l y m e r sW a r m , m i l d l y a c i d i c ammonium o x a l a t e e x t r a c t i o n , u n d e rc o n d i t i o n s t h a t s h o u l d b r e a k n e i t h e r g l y c o s i d i c n o r e s t e r

b o n d s , r e m o v e s a l m o s t a l l t h e p e a p r i m a r y w a l l ' s p o l y u r o n i d e sw i t h t h e i r a s s o c i a t e d p r e d o m i n a n t l y A G s i d e c h a i n s , w h i l el e a v i n g i n p l a c e , a s a l r e a d y n o t e d , t h e m a j o r i t y o f t h e w a l l ' sAG a n d a l m o s t a l l i t s XG . I t t h u s a p p e a r s t h a t t h e b u l k o f t h ew a l l ' s n e u t r a l m a t r i x p o l y s a c c h a r i d e s a r e n o t c o v a l e n t l yl i n k e d , d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y , t o i t s p o l y u r o n i d e , e i t h e r g l y c o s -i d i c a l l y a s r e p r e s e n t e d i n t h e s y c a m o r e p r i m a r y w a l l m o d e l o rb y e s t e r l i n k a g e s ( 2 1 ) . A s i m i l a r c o n c l u s i o n was r e a c h e de a r l i e r , f o r l u p i n e h y p o c o t y l ( 5 3 ) , p o t a t o t u b e r ( 3 2 ) , a n dc u l t u r e d r o s e c e l l p r i m a r y w a l l s ( 1 2 ) , f r o m t h e r e s u l t s o fa n a l o g o u s e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h p a r -t i c u l a r p e c t i n m o l e c u l e s m i g h t b e c r o s s - l i n k e d b y e s t e r l i n k -

a g e s a s n o t e d a b o v e , t h e p e a p e c t i n Mr p r o f i l e c l e a r l y s h o w st h a t i t s m o l e c u l e s a r e n o t i n t e r l i n k e d e x t e n s i v e l y e n o u g h t of o r m a n e t w o r k .T h e s t r e n g t h o f t h e s e c o n c l u s i o n s d e p e n d s , o f c o u r s e , o nw h e t h e r we c a n r e l y o n t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e n o t b r e a k i n gc o v a l e n t b o n d s b y w h i c h m a t r i x p o l y s a c c h a r i d e s m i g h t b ei n t e r l i n k e d . T h e e s t e r l i n k a g e s p o s t u l a t e d t o c r o s s - l i n k p e c t i cp o l y m e r s ( 2 1 ) a r e k n o w n t o b e s t a b l e t o t h e c o n d i t i o n s o f o u ro x a l a t e e x t r a c t i o n s t e p ( 3 4 ) . C e r t a i n a u t h o r s ( 5 0 , 6 9 ) , h o w e v e r ,h a v e h e l d t h a t n o n e u t r a l a r a b i n o s e o r g a l a c t o s e p o l y s a c c h a -r i d e s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m p r i m a r y w a l l s b y a p r o c e d u r et h a t c o u l d n o t h a v e p r o d u c e d t h e m a r t i f a c t u a l l y b y s p l i t t i n gs i d e c h a i n s o f f o f RG m o l e c u l e s . J a r v i s e t a l . ( 3 2 ) r e g a r d e de x t r a c t i o n o f p e c t i n s w i t h o x a l a t e - c i t r a t e , pH 4 , a t 1 0 0 C a ss l i g h t l y d e g r a d a t i v e . T h e i r G F C e v i d e n c e f o r t h i s d i d n o te l i m i n a t e t h e a l t e r n a t i v e t h a t t h i s t r e a t m e n t c a u s e d s o m ed i s s o c i a t i o n o f l a r g e m o l e c u l a r a g g r e g a t e s r a t h e r t h a n d e g r a -d a t i o n . O u r pH 4 o x a l a t e e x t r a c t i o n a t 7 0 C w a s , i n a n y c a s e ,c o n s i d e r a b l y m i l d e r . M o r e o v e r , t h e r e a p p e a r s t o b e n o e v i -d e n c e t h a t a n y w a l l p o l y u r o n i d e s b e a r s i d e c h a i n s o f m o r et h a n a b o u t 1 5 t o 6 0 n e u t r a l s u g a r u n i t s ( 7 5 a n d r e f e r e n c e sc i t e d t h e r e i n ) , c h a i n s t h a t a r e much s m a l l e r t h a n t h e A G a n dXG m o l e c u l e s i n o u r H C f r a c t i o n .We r e c o v e r e d s u b s t a n t i a l p o l y m e r i c a r a b i n o s e a n d f u c o s ei n b o t h p e c t i c a n d H C f r a c t i o n s , d e t e c t e d n o s m a l l Mr a r a b i -n o s e - c o n t a i n i n g f r a g m e n t s i n t h e p e c t i n f r a c t i o n , a n d f o u n dv i r t u a l l y t h e s a m e n e u t r a l s u g a r c o n t e n t i n t h e 1 4 0 0 kDp o l y u r o n i d e p e a k a s i n t h e w h o l e p e c t i n f r a c t i o n . A l l t h i ss p e a k s a g a i n s t a p p r e c i a b l e h y d r o l y t i c d e g r a d a t i o n d u r i n g t h eo x a l a t e e x t r a c t i o n : t h e c o m m o n l y o c c u r r i n g l i n k a g e s i n v o l v -i n g a r a b i n o s e a n d f u c o s e a r e w e l l known t o b e much m o r el a b i l e t o h y d r o l y s i s t h a n a r e o t h e r g l y c o s i d i c b o n d s . S o m e o ft h e s m a l l a r a b i n o s e - c o n t a i n i n g s i d e c h a i n s o f R G - I a n d RG-I I w o u l d h a v e b e e n r e l e a s e d i f a p p r e c i a b l e h y d r o l y s i s w e r eo c c u r r i n g .T h e d e g r a d a t i v e a r t i f a c t e m p h a s i z e d i n t h e c o n c e r n s c i t e da b o v e , h o w e v e r , i s , 3 - e l i m i n a t i o n a t m e t h y l - e s t e r i f i e d g a l a c -t u r o n i c a c i d r e s i d u e s ( 6 ) , w h i c h c o u l d r e l e a s e n e u t r a l p o l y s a c -c h a r i d e s t h a t w e r e a t t a c h e d t o R G a t o r n e a r s u c h r e s i d u e s ., B - E l i m i n a t i o n o c c u r s p r i m a r i l y i n a l k a l i n e s o l u t i o n ( 5 6 ) o rw h e n p e c t i n i s h e a t e d a t n e a r - n e u t r a l pH ( 1 ) . I n o u r p r o c e d u r e ,t h e w a l l m a t e r i a l w a s h e a t e d b r i e f l y i n w a t e r a t 7 0 C t o h e l ps o l u b i l i z e s t a r c h ; c o u l d t h i s h a v e c a u s e d a p p r e c i a b l e , 8 - e l i m i -n a t i o n ? I f s i g n i f i c a n t c o v a l e n t l i n k a g e s b e t w e e n p e c t i n a n do x a l a t e - i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s w e r e b e i n g b r o k e n b y h e a t -i n g i n w a t e r , t h e n o m i t t i n g t h i s s t e p s h o u l d e i t h e r c a u s e s o m ep e c t i n t o b e r e t a i n e d i n t h e w a l l d u r i n g o x a l a t e e x t r a c t i o n o rc a u s e c o m p o n e n t s o f t h e H C f r a c t i o n t o b e p u l l e d o u t o f t h ew a l l , a l o n g w i t h p e c t i n , b y o x a l a t e e x t r a c t i o n . H o w e v e r , o m i t -t i n g t h e h e a t i n g i n w a t e r h a d no e f f e c t o n w a l l f r a c t i o nc o m p o s i t i o n ( T a b l e I I ) . I t a p p e a r s t h a t t h i s s t e p d i d n o t r e l e a s ea n y o x a l a t e - i n s o l u b l e c h a i n s f r o m a t t a c h m e n t s t o R G .T h e a u t h o r s c i t e d a b o v e c o n s i d e r , h o w e v e r , t h a t r e l e a s e o fn e u t r a l RG s i d e c h a i n s b y 1 - e l i m i n a t i o n m i g h t o c c u r d u r i n gh e a t i n g a t a c i d i c p H , a s i n o u r o x a l a t e e x t r a c t i o n s t e p . How-e v e r , p e c t i n d e g r a d a t i o n w a s r e p o r t e d u n d e t e c t a b l e a t pH 4 ,e v e n a t 1 0 0 C ( 1 ) . B e c a u s e t h e Q l o f o r 1 - e l i m i n a t i o n i s 3 . 5( 6 ) , t h e r a t e a t 7 0 C s h o u l d b e t r u l y n e g l i g i b l e . F u r t h e r m o r e ,e v e n e x t e n s i v e 1 3 - e l i m i n a t i v e d e g r a d a t i o n , w h e n d e l i b e r a t e l yc a r r i e d o u t , d o e s n o t r e l e a s e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s ( s u c h a s

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t h e A G a n d XG i n p e a H C ) f r o m p e c t i n b u t y i e l d s f r a g m e n t sc o n t a i n i n g b o t h n e u t r a l s u g a r s a n d s u b s t a n t i a l u r o n i c a c i d( f o r e x a m p l e s , s e e r e f s . 6 8 a n d 7 5 ) . I t a p p e a r s i m p o s s i b l e ,t h e r e f o r e , t h a t t h e s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f v i r t u a l l y u r o n i ca c i d - f r e e A G a n d XG p o l y m e r s i n t h e p e a HC f r a c t i o n c o u l dh a v e b e e n r e l e a s e d a r t i f a c t u a l l y f r o m p e c t i n b y , 8 - e l i m i n a t i o nd u r i n g o u r p r o c e d u r e . R e d g w e l l a n d S e l v e n d r a n ( 6 5 ) s i m i l a r l yc o n c l u d e d t h a t n e u t r a l g a l a c t a n i s o l a t e d f r o m a l k a l i - s o l u b l ef r a c t i o n s o f o n i o n p r i m a r y w a l l s m u s t b e a n a t i v e w a l lc o m p o n e n t .P o s s i b l e C o v a l e n t I n t e r l i n k i n g o f H e m i c e l l u l o s e s

A s n o t e d a b o v e , p e a h e m i c e l l u l o s i c AG ma y c o n s i s t o fg l y c o s i d i c a l l y i n t e r c o n n e c t e d b l o c k s o f a r a b i n a n a n d g a l a c t a n .H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t h e A G a n d t h e XG i n t h e p e a HCf r a c t i o n c a n b e a l m o s t c o m p l e t e l y s e p a r a t e d , b y G F C , a p p e a r st o s h o w t h a t m o s t o f t h e XG i s n o t g l y c o s i d i c a l l y l i n k e d t oA G , a s r e p r e s e n t e d i n t h e s y c a m o r e w a l l m o d e l . B e c a u s e t h ea l k a l i s t e p u s e d t o e x t r a c t H C w o u l d b r e a k a n y e s t e r b o n d s ,t h e r e s u l t s d o n o t e x c l u d e p o s s i b l e i n t e r l i n k i n g o f A G a n d / o rXG m o l e c u l e s b y s u c h b o n d s . E s t e r c r o s s - l i n k s h a v e b e e ns u g g e s t e d t o e x p l a i n w h y s o m e m a t r i x c o m p o n e n t s r e q u i r ea l k a l i t o b e c o m e s o l u b i l i z e d ( 2 1 , 6 5 ) , a l t h o u g h t h e r e s t i l l s e e m st o b e n o d i r e c t e v i d e n c e f o r e s t e r c r o s s - l i n k s b e t w e e n n e u t r a lH C p o l y m e r s . G l y c o s i d i c b o n d s ( e x c e p t i n e s t e r i f i e d p o l y u -r o n i d e s ) , o n t h e o t h e r h a n d , a r e c o n s i d e r e d a l k a l i s t a b l e . A l k a l id e g r a d a t i o n p r o c e e d i n g f r o m a r e d u c i n g e n d ( 7 8 ) m i g h t s e p -a r a t e g l y c o s i d i c a l l y i n t e r c o n n e c t e d p o l y s a c c h a r i d e s b y p a r -t i a l l y d e g r a d i n g o n e o r b o t h o f t h e m . H o w e v e r , b o r o h y d r i d er e d u c t i o n o f t h e r e d u c i n g e n d , a s d o n e i n o u r a l k a l i e x t r a c t i o ns t e p , p r e v e n t s a l k a l i d e g r a d a t i o n ( 4 4 ) . M o r e o v e r , a B [ 3 H ] 4 -l a b e l i n g e x p e r i m e n t b y H a y a s h i a n d M a c l a c h l a n ( 3 0 ) s h o w e dt h a t s i g n i f i c a n t n e w r e d u c i n g t e r m i n i d o n o t a p p e a r o n p e aXG c h a i n s d u r i n g a n a l k a l i e x t r a c t i o n c o m p a r a b l e t o o u r s .T h e r e f o r e , i t s e e m s e x c l u d e d t h a t t h e XG-AG c o u p l i n g s h o w ni n t h e s y c a m o r e w a l l m o d e l w a s m i s s e d b e c a u s e o f a l k a l id e g r a d a t i o n d u r i n g o u r p r o c e d u r e .We c a n e s t i m a t e t h e maximum p o s s i b l e p r o p o r t i o n o f p e aw a l l XG t h a t m i g h t b e l i n k e d g l y c o s i d i c a l l y t o A G f r o m o u rG F C a n d H P LC d a t a . T h e XG p e a k o f t h e HC p r o f i l e c o n t a i n s1 1 t i m e s a s much f u c o s e a s t h e A G p e a k . I f a l l t h e l a t t e rf u c o s e i s i n X G , a n d t h e f u c o s e c o n t e n t o f t h i s XG i s t h es a m e a s t h a t o f t h e XG p e a k , t h e n a b ou t 8% o f t h e t o t a l XGc o c h r o m a t o g r a p h s w i t h t h e A G p e a k a n d m i g h t b e l i n k e d t oA G . T h e 1 2 a s s a y r e s u l t s s i m i l a r l y i n d i c a t e t h a t a b o u t 8% o ft h e t o t a l XG o c c u r s a t t h e AG p e a k . H a y a s h i a n d M a c l a c h l a n( 3 0 ) s t a t e d ( w i t h o u t g i v i n g d a t a ) t h a t 4% KOH e x t r a c t s f r o mp e a c e l l w a l l s a l l n o n c e l l u l o s i c p o l y s a c c h a r i d e s e x c e p t X G ,l e a v i n g 9 0 % o f t h e XG i n p l a c e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e df o r mung b e a n c e l l w a l l s ( 3 5 , 3 6 ) . T h e y i m p l y , i n a g r e e m e n tw i t h t h e f o r e g o i n g , t h a t m o s t o f t h e XG i s n o t g l y c o s i d i c a l l yl i n k e d t o o t h e r m a t r i x p o l y m e r s .B y s u m m i n g t h e a p p a r e n t XG c o n t e n t o f t h e v a r i o u s GFC-s e p a r a t e d s y c a m o r e c e l l w a l l s u b f r a c t i o n s t h a t w e r e c i t e d b yK e e g s t r a e t a l . ( 3 7 ) a s t h e b a s i s f o r t h e s y c a m o r e w a l l m o d e l ,a n d c o m p a r i n g t h i s w i t h t h e t o t a l XG c o n t e n t r e p o r t e d f o rt h i s m a t e r i a l ( 7 3 ) , o n e c a n e s t i m a t e t h a t a maximum o f a b o u t1 0 % o f t h e s y c a m o r e w a l l ' s XG c o c h r o m a t o g r a p h e d w i t hp e c t i c c o m p o n e n t s a n d m i g h t h a v e b e e n l i n k e d t o t h e m . T h e

A l b e rs h e i m g r o u p ( 1 4 ) l a t e r s t a t e d t h a t t h e y w e r e n o t a b l e t oi s o l a t e m o r e s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f XG a t t a c h e d t o o t h e rw a l l p o l y s a c c h a r i d e s , a n d t h e y c h r o m a t o g r a p h i c a l l y s e p a r a t e dv i r t u a l l y a l l o f t h e XG f r o m t h e A G a n d R G i n s y c a m o r ee x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ( 7 1 ) , w h i c h c l o s e l y r e s e m b l e t h ew a l l m a t r i x p o l y m e r s o f t h e s e c e l l s . O u r r e s u l t s w i th p e ap r i m a r y w a l l s t h u s a c t u a l l y a g r e e r a t h e r c l o s e l y w i t h t h o s e f o rs y c a m o r e c e l l s , e v e n t h o u g h a t o t a l l y d i f f e r e n t i n t e r p r e t a t i o nw a s o r i g i n a l l y m a d e o f t h e l a t t e r .F r o m p o t a t o t u b e r a n d s c a r l e t r u n n e r b e a n f r u i t c e l l w a l l s ,S e l v e n d r a n e t a l . ( 6 1 , 6 6 ) i s o l a t e d XGs t h a t w e r e f r e e o f A Ga n d R G a n d c o n c l u d e d t h a t t h e s y c a m o r e w a l l m o d e l c a n n o ta p p l y t o t h o s e t i s s u e s . J a r v i s e t a l . ( 3 2 ) c o n c l u d e d t h a t XGc o v a l e n t l y l i n k e d t o p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s m a k e s u p


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P EA P RI MA RY WALL STRUCTURE

}~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ---..i c r o f i b r i l. . h e m i c e l l u l o s e s h e a t h.....i n t e r s t i t i a l pecticAV~~~~~~~~~~~Jphase

...cellulosic g l u c a n. . . . . . . .x y l o g l u c a n

.......a r a b i n a n / g a l a c t a n4.= - - - s - (free p o l y m e r )

...... a r a b i n a n / g a l a c t a nsidech a i n o f p e c t i n

.pectic p o l y u r o n i d ebackbone

. . . . . . . . . g lycoproteinW 1 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ( e x t e n s i n )

--=v-f--cttJF i g u r e 5 . S c h e m a t i c p i c t u r e o f s u g g e s t e d p o l y m e r o r g a n i z a t i o n i n pe a p r i m a r y w a l l s , d e p i c t e d i n t h e p l a n e o f t h e c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l s . T h e XGa n d AG l a y e r s f o r m a h e m i c e l l u l o s i c s h e a t h ( " c o r t e x " [ 6 3 ] ) a r o u n d e a c h m i c r o f i b r i l , n o n c r y s t a l l i n e p o r t i o n s o f w h i c h c o n t a i n i n t e r c a l a t e d XGc h a i n s . I n t e r s t i c e s b e t w e e n t h e H C - c o a t e d m i c r o f i b r i l s a r e o c c u p i e d b y p e c t i n . W h e r e m i c r o f i b r i l s a p p r o a c h o n e a n o t h e r m o r e c l o s e l y , t h e i r HCs h e a t h s m a y o v e r l a p , a n d s om e XG c h a i n s m a y e x t e n d f r o m o n e m i c r o f i b r i l t o a n o t h e r , a s h a s b e e n v i s u a l i z e d ( 2 2 , 2 8 ) . T h e d i f f e r e n t l a b e l e dp o l y m e r t y p e s a r e d e p i c t e d i n a p p r o x i m a t e l y t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s i n w h i c h t h e y occur i n pe a c e l l w a l l s , a c c o r d i n g t o t h e r e s u l t s i n t h i s papera n d d a t a i n t h e l i t e r a t u r e . Smooth p o r t i o n s o f p o l y u r o n i d e b a c k b o n e s d e n o t e H G ; s i d e c h a i n - b e a r i n g p o r t i o n s ar e RG b l o c k s , t h e l o n g o n e sr e pr e s en t i n g l e n g th y r u n s o f s u b s t i t u t e d g a l a c t u r o n o s y l - r h a m n o s e l i k e t h e R G - I i s o l a t e d f r o m syc a more c e l l w a l l s ( 5 1 ) . E x c e p t f o r e x t e n s i n , m i n o rc o m p o n e n t s ( e . g . m annan, x y l a n ) a r e n o t s h o w n .

t o b i n d t o t h e s u r f a c e o f t h e c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l s a n d t oi n t e r c a l a t e t o s o m e e x t e n t b e t w e e n c e l l u l o s e c h a i n s i n n o n -c r y s t a l l i n e p o r t i o n s o f t h e m i c r o f i b r i l s ( a s p r o p o s e d t o e x p l a i nt h e t i g h t n e s s o f t h e X G / c e l l u l o s e a s s o c i a t i o n [ 2 8 ] ) , l e a v i n gu n b o u n d l o o p s a n d e n d s o f t h e XG c h a i n s p r o j e c t i n g i n t o t h em a t r i x . B e c a u s e a l m o s t a l l t h e p o l y u r o n i d e ( w i t h i t s n e u t r a ls u g a r - c o n t a i n i n g s i d e c h a i n s ) c a n b e r e m o v e d f r o m t h e w a l l ,b y m i l d s o l v e n t s t h a t d i s r u p t i o n i c a s s o c i a t i o n s b e t w e e n p o -l y u r o n i d e s , w i t h o u t r e l e a s i n g much o f t h e h e m i c e l l u l o s i c AGo r X G , we c o n s i d e r t h a t t h e p e c t i c a n d h e m i c e l l u l o s i c c o m -p o n e n t s o f t h e m a t r i x m u s t c o m p o s e n e a r l y s e p a r a t e p h a s e sw i t h i n t h e i n t e r m i c r o f i b r i l l a r s p a c e s a n d t h a t t h e A G , l i k e t h eX G , i s a s s o c i a t e d w i t h t h e m i c r o f i b r i l s . B e c a u s e t h e AG c a nb e r e m o v e d b y 4% KOH w i t h o u t d i s s o l v i n g much XG ( 3 0 ,3 5 ) , we v i s u a l i z e t h e AG a s c o n s t i t u t i n g a s e c o n d m a t r i x l a y e r

a r o u n d t h e m i c r o f i b r i l s , o u t s i d e t h e XG c o a t , a l a y e r i n w h i c ht h e f r e e p o r t i o n s o f t h e XG c h a i n s a r e e m b e d d e d a n d w i t hw h i c h t h e y i n t e r a c t b y w e a k i n t e r m o l e c u l a r f o r c e s , b y e n t a n -g l e m e n t a n d p o s s i b l y a l s o b y e s t e r l i n k a g e s i f t h e y o c c u r . T h ep e c t i n we v i s u a l i z e a s f o r m i n g a g e l t h a t o c c u p i e s t h e i n t e r -s t i c e s b e t w e e n t h e H C - c o a t e d m i c r o f i b r i l s . A t t h e b o u n d a r yb e t w e e n t h e p e c t i n p h a s e a n d t h e AG c o a t o f t h e a d j a c e n tm i c r o f i b r i l s , p e c t i n a n d AG w o u l d m u t u a l l y i n t e r d i g i t a t e t osome e x t e n t . S o m e o f t h e s i d e c h a i n s o f t h e p e c t i c R G b l o c k sw o u l d p r o j e c t i n t o , a n d ( b e c a u s e o f t h e i r s i m i l a r m a j o r s u g a rc o n s t i t u e n t s ) w o u l d i n t e r a c t w i t h , t h e AG l a y e r . F o l l o w i n gi n d i c a t i o n s i n t h e l i t e r a t u r e ( 2 7 , 6 3 a n d r e f e r e n c e s c i t e dt h e r e i n ) , we r e p r e s e n t t h e m a t r i x p o l y m e r c h a i n s a s r u n n i n gm o r e o r l e s s p a r a l l e l t o n e a r b y m i c r o f i b r i l s r a t h e r t h a nr a n d o m l y .

3 6 5


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T h e k i n d o f o r g a n i z a t i o n s h o w n i n F i g u r e 5 m i g h t r e a s o n -a b l y b e e x p e c t e d t o a r i s e b y s e l f - a s s e m b l y a s new m a t r i xp o l y m e r s a r e r e l e a s e d i n t o t h e w a l l b y e x o c y t o s i s . New XGw o u l d b i n d t o , a n d b e c o m e e n t a n g l e d w i t h , t h e c h a i n s o fg r o w i n g c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l s . Ne w p e c t i n s w o u l d e n c o u n t e ra h i g h e r C a 2 " c o n c e n t r a t i o n i n t h e w a l l t h a n i n t r a c e l l u l a r l y ,w h i c h w o u l d t e n d t o m a k e t h e m g e l ( 3 1 ) i n t h e s p a c e s b e t w e e nt h e m i c r o f i b r i l s . T h i s w o u l d t e n d t o s e g r e g a t e t h e AG a n dm i n o r w a l l p o l y m e r s i n t o a l a y e r b e t w e e n t h e p e c t i n p h a s ea n d t h e XG c o a t o f t h e m i c r o f i b r i l s . B e c a u s e e x t e n s i n ( w h i c hm a k e s u p o n l y a b o u t 2% o f t h e p e a c e l l w a l l [ 3 9 ] ) t e n d s t oi n t e r a c t i o n i c a l l y w i t h p o l y u r o n i d e s ( 1 1 ) , a n d i t s a r a b i n o s y ls i d e c h a i n s p r o b a b l y t e n d t o i n t e r a c t w i t h A G , we t h i n k t h a te x t e n s i n w o u l d c o n c e n t r a t e a t t h e b o u n d a r y b e t w e e n p e c t i na n d A G .T h e p i c t u r e i n F i g u r e 5 r e s e m b l e s t h e c o n c e p t o f b e a np r i m a r y w a l l s t r u c t u r e s u g g e s t e d b y T a y l o r e t a l . ( 7 4 ) b a s e do n p r o t o n NMR, a c c o r d i n g t o w h i c h m i c r o f i l b r i l s a r e e n v e l -o p e d b y a t i g h t l y b o u n d , r i g i d "HC I I " l a y e r , s u r r o u n d e d b ya l e s s t i g h t l y b o u n d b u t s t i l l r i g i d "HC I " l a y e r , a n d i n t u r nb y a l o o s e r p e c t i n p h a s e . T h a t t h e r i g i d i t y o f t h e m o r e t i g h t l yb o u n d l a y e r s i s a p p a r e n t l y r e d u c e d b y r e m o v i n g l e s s t i g h t l yb o u n d o n e s ( 7 4 ) w o u l d b e e x p l a i n e d , i n F i g u r e 5 , b y t h ei n t e r d i g i t a t i o n b e tw e e n c o m p o n e n t s o f t h e l a y e r s a l o n g t h e i rb o u n d a r i e s . T h e p i c t u r e c a n a l s o b e r e l a t e d t o r e s u l t s f r o md i f f e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r i m e t r y ( 4 5 ) i n d i c a t i n g t h a t t h e r m a ll o o s e n i n g o f t h e p r i m a r y w a l l ' s m a t r i x c a n b e l a r g e l y s u p -p r e s s e d b y C a 2 + . T h i s s u g g e s t s t h a t i n t h e n a t i v e w a l l t h ep e c t i n m o l e c u l e s a r e l a r g e l y a s s o c i a t e d w i t h o n e a n o t h e r ( a si n F i g . 5 ) , s o a d d e d C a 2 + c a n c r e a t e a b u n d a n t i o n i c c r o s s - l i n k sb e t w e e n t h e m t h a t g r e a t l y r i g i d i f y t h e s t r u c t u r e . T h i s p r o b a b l yc o u l d n o t t a k e p l a c e i f t h e p o l y u r o n i d e c h a i n s w e r e l a r g e l yi n t e r s p e r s e d b e t w e e n o t h e r , n o n i o n i c w a l l p o l y m e r s . F u r t h e rs u p p o r t i n g t h i s f e a t u r e o f F i g u r e 5 , e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o fs u c c e s s i v e l y e x t r a c t e d p r i m a r y w a l l s s u g g e s t t h a t p e c t i n s f o r ma " n e t w o r k " ( f i b r o i d p h a s e , n o t a c o v a l e n t n e t w o r k ) t h a t i ss e p a r a t e f r o m , b u t c o e x t e n s i v e w i t h , t h e H C - c e l l u l o s e p h a s eo r n e t w o r k ( 4 9 ) .R e g a r d i n g t h e n a t u r e o f t h e w a l l l o o s e n i n g t h a t i s r e q u i r e df o r c e l l g r o w t h t o o c c u r , t h e p r e s e n t r e s u l t s a n d t h e p i c t u r e i nF i g u r e 5 i m p l y t h a t b r e a k a g e o f c o v a l e n t b o n d s w i t h i n t h ew a l l s t r u c t u r e i s n o t n e c e s s a r i l y o b l i g a t o r y a n d s h o u l d n o ts i m p l y b e a s s u m e d ( i n d e f a u l t o f e v i d e n c e ) t o b e o c c u r r i n g ,a s h a s b e e n d o n e many t i m e s i n t h e p l a n t g r o w t h l i t e r a t u r e .C h a n g e s t h a t a f f e c t n o n c o v a l e n t b o n d i n g f o r c e s b e t w e e n w a l lp o l y m e r s , o r b o n d e x c h a n g e b e t w e e n p r e v i o u s l y d e p o s i t e da n d n e w l y i n t r o d u c e d p o l y m e r s , c a n i n p r i n c i p l e c a u s e w a l ll o o s e n i n g a n d g r o w t h . H o w e v e r , b r e a k a g e o f b o n d s w i t h i np o l y m e r b a c k b o n e s o r t o t h e i r s i d e c h a i n s c o u l d a l s o w e a k e n ,h e n c e l o o s e n , t h e w a l l e v e n t h o u g h t h e p o l y m e r s d o n o t f o r ma c o v a l e n t l y c o u p l e d n e t w o r k . T h e s u g g e s t e d s t r u c t u r e t h u sa l l o w s f o r a l t e r n a t i v e , p o s s i b l y e v e n m u l t i p l e , m e c h a n i s m s f o rw a l l l o o s e n i n g a n d c e l l g r o w t h . B i o l o g i c a l l y , t h i s s e e m s m o r ep l a u s i b l e t h a n m o d e l s t h a t d e p e n d o n a s i n g l e t y p e o f b o n do r m a t r i x c o m p o n e n t , s u c h a s XG ( 2 2 , 2 8 ) o r e x t e n s i n ( 4 3 ) ,f o r c o h e r e n c e b e t w e e n m i c r o f i b r i l s a n d t h u s f o r a p o s s i b l em e c h a n i s m o f w a l l l o o s e n i n g . E v i d e n c e t h a t p o l y s a c c h a r i d eb a c k b o n e b r e a k a g e o c c u r s i n c o n j u n c t i o n w i t h h o r m o n a ls t i m u l a t i o n o f c e l l g r o w t h i n p e a i s p r e s e n t e d i n t h e c o m p a n -i o n p a p e r ( 7 2 ) .

ACKNOWLEDGMENTST h e a u t h o r s t h a n k D r s . J o h n L a b a v i t c h a n d L . C a r l G r e v e f o ra d v i c e , D i o n e x C o r p . f o r s o m e o f t h e HPLC a n a l y s e s , a n d D r . K . S .D h u g g a f o r h e l p w i t h c o m p u t e r d r a w i n g .

LITERATURE C I T E D1 . A l b e r s h e i m P ( 1 9 5 9 ) I n s t a b i l i t y o f p e c t i n i n n e u t r a l s o l u t i o n s .B i o c h e m B i o p h y s R e s Commun 1 : 2 5 3 - 2 5 62 . A l b e r s h e i m P ( 1 9 7 5 ) T h e w a l l s o f g r o w i n g p l a n t c e l l s . S c i Am2 3 2 ( A p r i l ) : 8 0 - 9 53 . A l b e r s h e i m P ( 1 9 7 8 ) C o n c e r n i n g t h e s t r u c t u r e a n d b i o s y n t h e s i so f t h e p r i m a r y c e l l w a l l s o f p l a n t s . I n t R e v B i o c h e m 1 6 :1 2 7 - 1 5 04 . A l b e r s h e i m P , M c N e i l M, L a b a v i t c h JM ( 1 9 7 7 ) T h e m o l e c u l a rs t r u c t u r e o f t h e p r i m a r y c e l l w a l l a n d e l o n g a t i o n g r o w t h . I nPE P i l e t , e d , P l a n t G r o w t h R e g u l a t i o n . S p r i n g e r - V e r l a g , NewY o r k , p p 1 - 1 25 . A l b e r s h e i m P , M u h l e t h a l e r K , F r e y - W y s s l i n g A ( 1 9 6 0 ) S t a i n e dp e c t i n a s s e e n i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e . J B i o p h y s B i o c h e mC y t o l 8 : 5 0 1 - 50 66 . A l b e r s h e i m P , Neukom H , D u e l H ( 1 9 6 0 ) S p l i t t i n g o f p e c t i nc h a i n m o l e c u l e s i n n e u t r a l s o l u t i o n s . A r c h B i o c h e m B i o p h y s

9 0 : 4 6 - 5 17 . A s a m i z u T , N a k a y a m a N , N i s h i A ( 1 9 8 4 ) P e c t i c p o l y s a c c h a r i d e si n c a r r o t c e l l s g r o w i n g i n s u s p e n s i o n c u l t u r e . P l a n t a 1 6 0 :4 6 9 - 4 7 38 . B a k e r C J , A i s t J R , B a t e m a n DF ( 1 9 8 0 ) U l t r a s t r u c t u r a l a n db i o c h e m i c a l e f f e c t s o f e n d o p e c t a t e l y a s e o n c e l l w a l l s f r o m c e l ls u s p e n s i o n c u l t u r e s o f b e a n a n d r i c e . C a n J B o t 5 8 : 8 6 7 - 8 8 09 . B u r t o n B A , B r a n t DA ( 1 9 8 3 ) C o m p a r a t i v e f l e x i b i l i t y , e x t e n s i o n ,a n d c o n f o r m a t i o n o f s o m e s i m p l e p o l y s a c c h a r i d e c h a i n s . B i o -p o l y m e r s 2 2 : 1 7 6 9 - 1 7 9 21 0 . C a r p i t a NC ( 1 9 8 7 ) T h e b i o c h e m i s t r y o f " g r o w i n g " c e l l w a l l s . I nDJ C o s g r o v e , DP K n i e v e l , e d s , T h e P h y s i o l o g y o f C e l l E x p a n -s i o n d u r i n g G r o w t h . A m e r i c a n S o c i e t y o f P l a n t P h y s i o l o g i s t s ,R o c k v i l l e MD, p p 2 8 - 4 51 1 . C a s s a b G I , V a r n e r JE ( 1 9 8 8 ) C e l l w a l l p r o t e i n s . Annu R e v P l a n tP h y s i o l P l a n t M o l B i o l 3 9 : 3 2 1 - 3 5 31 2 . C h a m b a t G , B a r n o u d F , J o s e l e a u JP ( 1 9 8 4 ) S t r u c t u r e o f t h ep r i m a r y c e l l w a l l s o f s u s p e n s i o n - c u l t u r e d R o s a g l a u c a c e l l s . I .P o l y s a c c h a r i d e s a s s o c i a t e d w i t h c e l l u l o s e . P l a n t P h y s i o l 7 4 :6 8 7 - 6 9 31 3 . D a r v i l l A G , M c N e i l M, A l b e r s h e i m P ( 1 9 7 8 ) S t r u c t u r e o f p l a n tc e l l w a l l s . V I I I . A new p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e . P l a n t P h y s i o l 6 2 :4 1 8 - 4 2 21 4 . D a r v i l l A , M c N e i l M, A l b e r s h e i m P , D e l m e r D ( 1 9 8 0 ) T h ep r i m a r y c e l l w a l l s o f f l o w e r i n g p l a n t s . I n NE T o l b e r t , e d , T h eB i o c h e m i s t r y o f P l a n t s , V o l 1 . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , p p9 2 - 1 6 21 5 . D a r v i l l J E , M c N e i l M, D a r v i l l A G , A l b e r s h e i m P ( 1 9 8 0 ) S t r u c -t u r e o f p l a n t c e l l w a l l s . X I . G l u c u r o n o a r a b i n o x y l a n , a s e c o n dh e m i c e l l u l o s e i n t h e p r i m a r y w a l l s o f s u s p e n s i o n - c u l t u r e d s y -c a m o r e c e l l s . P l a n t P h y s i o l 6 6 : 1 1 3 5 - 1 1 3 91 6 . D o p i c o B , L a b r a d o r E , N i c o l a s G ( 1 9 8 6 ) C h a r a c t e r i z a t i o n a n dl o c a l i z a t i o n o f t h e c e l l w a l l a u t o l y s i s s u b s t r a t e i n P i s u m s a t i v u me p i c o t y l s . P l a n t S c i 4 4 : 1 5 5 - 1 6 1

1 7 . D u b o i s M, G i l l e s K A , H a m i l t o n J K , R e b e r s P A , S m i t h F ( 1 9 5 6 )C o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f s u g a r s a n d r e l a t e ds u b s t a n c e s . A n a l Chem 2 8 : 3 5 0 - 3 5 61 8 . E d a S , K a t o K ( 1 9 7 8 ) G a l a c t a n i s o l a t e d f r o m t h e m i d r i b o f t h el e a v e s o f N i c o t i a n a t a b a c u m . A g r i c B i o l Chem 4 2 : 2 2 5 3 - 2 2 5 71 9 . F i s h m a n ML, G r o s s K C , G i l l e s p i e D T , S o n d e y SM ( 1 9 8 9 )M a c r o m o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f t o m a t o f r u i t p e c t i n . A r c hB i o c h e m B i o p h y s 2 7 4 : 1 7 9 - 1 9 12 0 . F i s h m a n ML, P f e f f e r P E , B a r f o r d R A , D o n e r LW ( 1 9 8 4 ) S t u d i e so f p e c t i n s o l u t i o n p r o p e r t i e s b y h i g h - p e r f o r m a n c e s i z e e x c l u -s i o n c h r o m a t o g r a p h y . J A g r i c F o o d Chem 3 2 : 3 7 2 - 3 7 82 1 . F r y SC ( 1 9 8 6 ) C r o s s - l i n k i n g o f m a t r i x p o l y m e r s i n t h e g r o w i n gc e l l w a l l s o f a n g i o s p e r m s . Annu R e v P l a n t P h y s i o l 3 7 :1 6 5 - 1 8 6



11/12

P EA P RI MA RY W AL L S TR UC TU RE

2 2 . F r y SC ( 1 9 8 9 ) C e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d a u x i n - s t i m u l a t e dg r o w t h : a p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p . P h y s i o l P l a n t 7 5 : 5 3 2 - 5 3 62 3 . G a l a m b o s JT ( 1 9 6 7 ) T h e r e a c t i o n o f c a rb a z o le w i t h c a r b o h y -d r a t e s . A n a l B i o c h e m 1 9 : 1 1 9 - 1 3 22 4 . G i l k e s N R , H a l l MA ( 1 9 7 7 ) T h e h o r m o n a l c o n t r o l o f c e l l w a l lt u r n o v e r i n P i s u m s a t i v u m L . Ne w P h y t o l 7 8 : 1 - 1 52 5 . G o l d b e r g R , M o r v a n C , d u P e n h o a t CH , Michon V ( 1 9 8 9 ) S t r u c -t u r e a n d p r o p e r t i e s o f a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e s f r o m m u n g b e a nh y p o c o t y l s . P l a n t C e l l P h y s i o l 3 0 : 1 6 3 - 1 7 32 6 . H a i s I M , Macek K ( 1 9 6 3 ) P a p e r C h r o m a t o g r a p h y . AcademicP r e s s , New Y o r k , p 2 9 52 7 . H a y a s h i R , M o r i k a w a H , N a k a j i m a N , I c h i k a w a Y , S e n d a M( 1 9 8 0 ) O r i e n t e d s t r u c t u r e o f p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s i n p e ae p i d e r m a l c e l l w a l l s . P l a n t C e l l P h y s i o l 2 1 : 999-10052 8 . H a y a s h i T ( 1 9

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