BioOne sees sustainable scholarly publishing as an inherently collaborative enterprise connecting authors,nonprofit publishers, academic institutions, research libraries, and research funders in the common goal ofmaximizing access to critical research.

Molecular Characterization and Genetic Differentiationof Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera:Noctuidae) in Maize, Rice, and Cotton Fields of Colombiawith AFLPAuthor(s): Mariela Isabel Lobo-Hernández y Clara Inés Saldamando-BenjumeaSource: Southwestern Entomologist, 37(2):193-207. 2012.Published By: Society of Southwestern EntomologistsDOI: http://dx.doi.org/10.3958/059.037.0213URL: http://www.bioone.org/doi/full/10.3958/059.037.0213

BioOne (www.bioone.org) is a nonprofit, online aggregation of core researchin the biological, ecological, and environmental sciences. BioOne providesa sustainable online platform for over 170 journals and books published bynonprofit societies, associations, museums, institutions, and presses.

Your use of this PDF, the BioOne Web site, and all posted and associatedcontent indicates your acceptance of BioOne’s Terms of Use, available atwww.bioone.org/page/terms_of_use.

Usage of BioOne content is strictly limited to personal, educational, and non-commercial use. Commercial inquiries or rights and permissions requests shouldbe directed to the individual publisher as copyright holder.

193

VOL. 37, NO. 2 SOUTHWESTERN ENTOMOLOGIST JUN. 2012

Caracterización Molecular y Diferenciación Genética de Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae) en Cultivos de Maíz, Arroz, yAlgodonero de Colombia con el uso de AFLP

Molecular Characterization and Genetic Differentiation of Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae) in Maize, Rice, and Cotton Fields of Colombia with AFLP

Mariela Isabel Lobo-Hernández1 y Clara Inés Saldamando-Benjumea2

Resumen. Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae) es una

. Dada la existencia de estos biotipos este estudio se enfocó en realizar una caracterización molecular de la especie con marcadores AFLP (Polimorfismo en la Longitud del Fragmento Amplificado), a partir de larvas colectadas en tres departamentos: Córdoba (Norte), Meta (Oriente) y Valle del Cauca (Occidente) en cultivos de maíz, algodonero y arroz, para ampliar la información preliminar obtenida para esta especie. En este trabajo se encontraron 101 loci en 45 muestras larvales, las cuales fueron amplificadas con tres combinaciones decebadores de AFLP. Los AFLP fueron útiles para determinar que las poblaciones de S. frugiperda de Colombia presentan una alta variabilidad genética, pero no permitieron discriminar los dos biotipos de este insecto como otros autores reportan. Un análisis de varianza molecular (AMOVA) realizado con los datos en los departamentos mencionados mostró que no existe diferenciación genética entre sus poblaciones ( PT = 0.041, p = 0.14), y además el número de migrantes es de Nem = 5.8. El dendrograma UPGMA obtenido con las distancias de Dice, también mostró que no existe una asociación de los individuos ni por locación geográfica ni por cultivo, lo cual concuerda con los resultados previos en la misma especie obtenidos para Colombia con una secuenciación del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa I (COI).

Abstract. Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae) is a moth . This study was

focused on carrying out a molecular characterization of the species with Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) using larvae collected in the departments of Córdoba (North), Meta (East), and Valle del Cauca (West) in corn, cotton, and rice fields, to improve the information of the species obtained in 2008. In this work, 134 DNA extractions were made from each larva head and 45 samples were amplified with three combinations of AFLP primers that produced 101 loci. The________________________1Unidad de Biotecnología Vegetal. Corporación para Investigaciones Biológicas CIB. Universidad Nacional de Colombia-UNALMED-CIB. Carrera 72 A No 78 B 141, Medellín, Colombia. miloboh@unal.edu.co2Escuela de Biociencias, Universidad Nacional de Colombia Calle 59A No 63-20 Bloque 11-208, Medellín, Colombia. cisaldam@unal.edu.co

194

AFLP were useful to determine that populations of S. frugiperda of Colombia have a high genetic variability, but they do not differentiate the strains as other authors reported. The analysis of molecular variance (AMOVA) showed that populations of S. frugiperda from the three departments were not genetically differentiated. The UPGMA dendrogram obtained also showed that there is no a genetic differentiation of the genotyped individuals based on the geographical location or the crop sampled. Our results coincide with a previous report obtained with the same species of Colombia based on a sequence of the mitochondrial gene cytochrome oxidase I (COI).

Introducción

Spodoptera frugiperda (J. E Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) es una polilla cuya larva ocasiona grandes pérdidas económicas en una gran variedad de cultivos en el Hemisferio Occidental (López-Edwards et al. 1999, Nagoshi y Meagher 2004,Prowell et al. 2004). Esto se explica debido al carácter polífago del insecto puesto que ha sido encontrado en más de 80 especies de plantas pertenecientes a 23 familias diferentes (Pashley 1988, Machado et al. 2008). Sus poblaciones se encuentran principalmente en cultivos de maíz (Zea mays L.), arroz (Oryza sativaL.), algodonero (Gossypium hirsutum L.), sorgo (Sorghum vulgare L.), pastos, y otras gramíneas en el centro y oriente de Norte América y Sur América (Luginbill1928, Sparks 1979, Pashley 1986). Este insecto, también ha sido reconocido por representar un excelente ejemplo de especiación simpátrica, dado que ha evolucionado en son idénticos morfológicamente, pero difieren en una gran variedad de marcadores bioquímicos y moleculares (Prowell et al. 2004). Estos dos biotipos fueron reconocidos por primera vez por Pashley en 1986, con el uso de los marcadores bioquímicos de esterasas ya que ella observó que las esterasas B, C, y D fueron encontradas exclusivamente en el biotipo de maíz y las E y F en el biotipo de arroz. Otros marcadores tales como una PCR RFLP (Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción Amplificados) del gen de la citocromo oxidasa I (COI) con la enzima de restricción MspI (Levy et al. 2002, Nagoshi y Meagher 2004), al igual que una PCR del gen nuclear FR ( for Rice ) (Lu et al. 1994) también han sido utilizados como marcadores diagnóstico para el reconocimiento de estos biotipos en Estados Unidos por Nagoshi y Meagher (2004) y en Colombia por Vélez-Arango et al. (2008).

En 1999 McMichael y Prowell, produjeron uno de los primeros trabajos relacionados con el uso de los marcadores moleculares AFLP (Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos Amplificados) para la identificación de los biotipos de S. frugiperda con el uso de cinco combinaciones de cebadores. Evaluaron 10 loci de AFLP en 74 larvas y 37 para cada cultivo provenientes de maíz y pasto de bermuda de Baton Rouge, Luisiana y con ellos concluyeron que los AFLP representan excelentes marcadores diagnóstico para el reconocimiento de los biotipos de esta polilla originarios de poblaciones naturales. Posterior a este estudio, Busato et al.(2004) realizaron uno de los primeros trabajos sobre la estructura genético-poblacional de S. frugiperda en Sur América, en la región de Rio Grande del Sur, Brasil. Estos autores genotipificaron 40 larvas provenientes de tres poblaciones de cultivos de maíz y arroz, con el uso de cinco combinaciones de cebadores de AFLP, diferentes a los cebadores estandarizados por McMichael y Prowell (1999), ydemostraron que esta polilla presenta una gran diferenciación genética entre sus

195

poblaciones, lo cual explican debido a la existencia de los biotipos de maíz y arroz en esta región de Brasil.

Estudios posteriores con estos mismos marcadores con poblaciones de S. frugiperda de Estados Unidos y Argentina colectadas en maíz (Zea mays), árbol de limón (Citrus limon), árbol de princesa (Paulownia tomentosa), y pastos de bermuda (Cynodon dactylon) también han comprobado una diferenciación genética en el insecto (Martinelli et al. 2007, Clark et al. 2007), sin embargo en ninguno de éstos se tuvo en cuenta la presencia de los biotipos previo a la realización de un estudio de estructura poblacional.

En Colombia, la presencia de los biotipos de S. frugiperda también ha sido confirmada en el departamento de Tolima con el uso de una PCR RFLP del gen de la citocromo oxidasa I (COI) con la enzima de restricción MspI y una PCR del gen nuclear FR en 253 larvas colectadas en maíz, sorgo, algodonero y arroz por Vélez-Arango et al. (2008). Estos autores encontraron que las larvas del biotipo de maíz se encontraron principalmente en maíz, algodonero y sorgo mientras que las del biotipo de arroz se encontraron más frecuentemente en arroz y en muy bajas proporciones en maíz. Más adelante, estos dos marcadores fueron utilizados por Saldamando y Vélez-Arango (2010) para evidenciar una diferenciación genética entre las poblaciones colectadas en maíz, algodonero y sorgo respecto a las poblaciones colectadas en arroz con el uso de un análisis de varianza molecular (AMOVA) (Peakall y Smouse 2006). Adicionalmente, ellos estimaron el flujo genético (Nem) entre los biotipos con el uso del estimador indirecto FST =1/1+4Nem (Wright 1978), encontrando un flujo reducido entre ambos biotipos. Otro trabajo adicional realizado en Colombia se basó en la secuenciación de un fragmento de 568 pares de bases del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa I en 102 individuos de poblaciones de S. frugiperda colectadas en maíz, algodonero,arroz y sorgo de los departamentos de Antioquia, Córdoba, Meta, Tolima y Valle del Cauca (Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea 2011). En este estudio también se realizó un AMOVA, el cual demostró que no existe una estructura poblacional entre los departamentos de Colombia mencionados, pero que sí existe una gran diferenciación genética entre las poblaciones de S. frugiperda de Colombia y Estados Unidos. Adicionalmente, Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea (2011) encontraron que el biotipo de maíz presenta una mayor capacidad de dispersión en Colombia respecto al biotipo de arroz, dado que el haplotipo más comúnmente encontrado en sus muestras se colectó en maíz, algodonero y sorgo, cultivos en los que Vélez-Arango et al. (2008) identificaron el biotipo de maíz.

Debido a que el trabajo realizado en Colombia por Vélez Arango et al. (2008) solo se concentró en el departamento del Tolima (centro) y a su vez dado que el trabajo realizado por Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea (2011) se basóen el análisis de un gen mitocondrial de herencia materna (Freeland 2005), elpropósito de este estudio fue complementar los resultados obtenidos por estos autores con el uso de tres cebadores de los marcadores AFLP que han sido previamente estandarizados en la especie por McMichael y Prowell (1999). Los marcadores AFLP usados en este estudio fueron amplificados en 45 larvas colectadas en los departamentos de Córdoba, Meta, Tolima y Valle del Cauca para determinar si: a) estos marcadores pueden ser utilizados como marcadores diagnóstico para identificar los biotipos de esta polilla y b) si éstos reflejan una gran variabilidad genética entre las poblaciones de S. frugiperda de Colombia generando estructuración.

196

Materiales y Métodos

Área de Estudio y Colección de Muestras. Los muestreos de S. frugiperda se realizaron en fincas con cultivos de rotación: algodonero, maíz, yarroz en los departamentos de Córdoba, Meta, Tolima y Valle del Cauca en las que se colectaron al azar larvas desde los estadios 3 a 5 (Fig. 1). Estos muestreos se llevaron a cabo durante 2008 y 2009.

Fig. 1. Mapa de Colombia con los departamentos de Córdoba, Meta, Tolima y Valle del Cauca. Muestras de S. frugiperda de Córdoba, Meta, y Valle del Cauca fueron analizadas en este estudio. Fig. 1. Colombia map with the departments of Córdoba, Meta, Tolima, and Valle del Cauca. S. frugiperda samples of Córdoba, Meta and Valle del Cauca were analyzed in this work.

197

Las larvas se colocaron en tubos de plástico de 2.5 ml (rotulados por finca y micro-región de colección) con etanol al 70% y posteriormente se enviaron la Unidad de Biotecnología Vegetal UNALMED-CIB (Corporación para Investigaciones Biológicas) de Medellín, donde se almacenaron en seco en una nevera a -70ºC, para su posterior genotipificación.

La extracción de ADN genómico total en S. frugiperda se realizó con el método Kit de extracción DNeasyBlood and Tissue de Qiagen® (Qiagen, US),siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones. Para esto, se empleó la cabeza de cada espécimen, dada la exigencia de la calidad del ADN que requieren los marcadores AFLP. Para el protocolo de extracción se maceró la cabeza (±24 mg) de cada una de las larvas en 180 l de Buffer ATL y se depositó en un tubo de plástico de 1.5 ml. A este tubo posteriormente se le agregaron 20 lde RNAsa A (20 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante 1 hora, luego se le agregaron20 l de proteinasa K y cada tubo fue mezclado por medio de un vórtex y se incubó a 55ºC agitando cada media hora durante 3 horas. Posteriormente cada tubo se agitó durante 15 segundos. A cada muestra se le adicionaron 200 l del buffer ALy después la muestra fue mezclada por medio de un vórtex, y fue llevada a incubación a 70ºC por 10 minutos. Todos los tubos fueron centrifugados a 12.000rpm durante 15 minutos y a continuación cada sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo, al cual se le agregaron 200 l de etanol (100%). De nuevo el contenido fue mezclado por medio de un vórtex y su sobrenadante se pasó a la columna del kit Qiagen® (Dneasy mini spin Colum) de 2 ml. Esta columna fue centrifugada a 8.000 rpm durante un minuto, se descartó el agua y la columna fue colocada sobre otro tubo de 2 ml. Posteriormente se le agregaron 500 l de Buffer AW1, se centrifugó a 8.000 rpm durante un minuto, se descartó el sobrenadante y la columna fue colocada en otro tubo de 2 ml. A esta columna se le agregaron 500

l del buffer AW2 y se centrifugó a 14.000 rpm durante tres minutos. Se descartó el tubo con agua y la columna nuevamente fue colocada en un nuevo tubo de plástico de 1.5 ml. En este tubo se realizaron dos eluciones de 100 l de buffer AE, directamente en la membrana de la columna. Este tubo se dejó reposar por 1 mina temperatura ambiente y luego se centrifugó a 8.000 rpm/1 min, repitiéndolo dos veces. Las muestras fueron concentradas por medio de un Speed Vac (Savant, CA). En un principio la extracción del ADN fue realizada con el método CTAB (Sambrook y Russell 2001) en 174 larvas de S. frugiperda. Sin embargo, este método no fue útil para obtener una buena calidad de ADN. Posteriormente 137 muestras larvales fueron utilizadas como nuevo material genético para extraerle su ADN con el Kit de Qiagen. Estas últimas muestras fueron utilizadas para la estandarización de los marcadores AFLP dado que la buena calidad del ADN obtenido en ellas permitió la digestión con las enzimas de restricción EcoRI y MseI. La cantidad y calidad del ADN extraído se evaluó para cada una de las muestras en geles de agarosa (0.8%) teñidos con bromuro de etidio. La calidad de su ADN se verificó en un transiluminador de luz ultravioleta y después se cuantificó su concentración con ayuda del ADN (Promega, Colombia) con diluciones de 200, 100, 50, y 25 ng/μl. Las concentraciones de cada muestra fueron determinadas con la finalidad de obtener 50 ng/μl de ADN genómico para realizar una posterior digestión con las enzimas de restricción EcoRI y MseI.

Entre 250 y 300 ng de ADN genómico fueron digeridos utilizando dos unidades de cada enzima comercial EcoRI y MseI (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA) en un volumen de reacción de 12.5(New England BioLabs) que permite el 100% de actividad para ambas enzimas,

198

100 ug/ml de BSA (Bovine Serum Albumin, New England BioLabs), en un volumen final de 12.5 ul. Las reacciones se incubaron a 37oC por 3 h y 30 min, seguido de un paso de inactivación de las enzimas a 70oC por 15 min. El ligamiento de los adaptadores sintéticos a los fragmentos de restricción se llevó a cabo durante 2 h a 20o olución que contenía: T4 DNA ligasa y 12adaptadores. Al finalizar la incubación se realizó una dilución 1:5. La amplificación de los fragmentos de restricción se llevó a cabo en dos pasos: una primera preamplificación con cebadores que incluían una base selectiva y una segunda amplificación del preamplificado mediante cebadores con 3 bases selectivas (Vos et al. 1995).

Para realizar la preamplificación se utilizaron cebadores complementarios a la secuencia del adaptador incluyendo un nucleótido selectivo, 5 l de ADN ligado y diluido en buffer, se amplificaron en 23 l de un volumen de reacción que contenía 20 l de una mezcla de cebador preamp (Pre-amp cebador mix, Invitrogen), 2.5 lde buffer de PCR 10X, 0.5 l de Taqpolimerasa (Fermentas UAB, Canadá). El ADN molde se amplificó según el protocolo PCR de Vos et al. (1995) siguiendo una desnaturalización inicial de 30 s a 94oC, seguido de un alineamiento de oligos a 56oC por 1 min y una extensión de 1 min a 72oC por 20 ciclos. Finalmente, se realizó una dilución 1:10. El ADN preamplificado a partir de cebadores EcoRI y MseI se usó como molde para las amplificaciones con cebadores MseI -CNN (N representa cualquiera de las 4 bases posibles). Para realizar las amplificaciones selectivas, se sintetizaron los oligos en Gentech (Colombia) conteniendo una secuencia base, una secuencia específica para cada enzima y una extensión selectiva de nucleótidos.

Para permitir la detección de los fragmentos amplificados, los cebadores EcoRI-CNN no radiactivos fueron diluidos teniendo en cuenta 18 μl del cebador EcoRI en 32 μl de agua destilada. Del producto de ADN preamplificado diluido 1:10 se usaron 5 l como molde para la amplificación selectiva en 20 l de un volumen de reacción que contenía 1 pmol\μl de cebador EcoRI, 5 pmol\μl de cebador MseI;0.2 mM de dNTPs, buffer de PCR 10x (Kit AFLP, Invitrogen) y 1 U de Taqpolimerasa (Fermentas UAB). El ADN molde se amplificó según el protocolo de PCR de Vos et al. (1995) seguido de un ciclo de denaturación a 94oC por 30 s, alineamiento por 30 s a 65oC, y una extensión a 72oC por 60 s y realizando 12 ciclos más seguido de una disminución -0.7oC por ciclo.

Posteriormente, a 20 l de cada muestra de ADN amplificada se le adicionaron 5 l de buffer de carga 2X (95% de formamida, 20mM de EDTA (0.5M pH. 8.0), 0.05% de azul de bromofenol, y 0.05% de Xilencianol). Finalmente, 5 lde cada muestra fueron colocadas en geles de poliacrilamida (poliacrilamida 6%, 7.5 M de Urea y 1X de TBE) y todas las muestras fueron corridas en cámaras de electroforesis vertical BioRad a 120 W por 2.5 min. Los geles se tiñeron con nitrato de plata siguiendo el protocolo descrito por Creste et al. (2001), siguiendo un paso inicial de fijación con una solución de ácido acético al 10%, seguido de un lavado con agua, teñido con una solución de nitrato de plata al 1.5% y formaldehído. Estos geles se revelaron con una solución conteniendo carbonato de sodio. Finalmente, los geles de poliacrilamida fueron escaneados para visualizar el patrón de bandas electroforéticas producidas por las combinaciones de cebadores utilizadas en este trabajo.

Análisis de Datos. Los fragmentos de AFLP amplificados fueron identificados en geles escaneados de poliacrilamida en un rango entre 200 pb y

199

650 pb, donde la presencia de cada locus se tomó como (1) y ausencia (0). Estos datos fueron utilizados para crear una matriz binaria y realizar sus respectivos análisis genéticos. Los cálculos de la frecuencias de los alelos de los loci de AFLP se realizaron con el programa Genalex 6.41 (Peakall y Smouse 2006) y se basaron en la relación entre dos alelos p y q: q = (1-p2)0.5 esto debido a que la frecuencia del alelo recesivo es la base principal para el análisis de un marcador dominante, por lo cual la frecuencia de los genotipos se basa en la ausencia de las bandas, lo que representa el homocigoto recesivo q2 (Hartl y Clark 1997). El tamaño de cada uno de los fragmentos de AFLP fue estimado utilizando un marcador de peso molecular de 50 pb (NEB). La matriz binaria de presencia/ausencia se utilizó para la construcción de una matriz de distancias genéticas de Dice (DDice = 1- Sij) (Dice 1945) con el uso del paquete estadístico Past 1.34 (Hammer et al. 2001). Estas distancias genéticas fueron escogidas ya que son ideales para trabajar marcadores moleculares dominantes dado que promedian los valores de similitud por par de individuos mediante la siguiente ecuación: Sij= 2a / (2a+b+c); donde, Sij= similitud entre los individuos i y j; a= número de loci compartidos por i y j; b= número de loci presentes en i pero ausentes en j, y c= número de loci presentes en j pero ausentes en i (Rivera-Jiménez et al. 2009).

Las distancias de Dice fueron utilizadas para obtener dendrogramas con el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, Método No Ponderado de Apareamiento por Grupos con Media Aritmética) (Sneath y Sokal 1973). La estimación de este algoritmo y la producción del dendrograma UPGMA se obtuvieron con el programa Mega 4.0. (Tamura et al. 2007). Posteriormente, un análisis de varianza molecular (AMOVA) fue estimado con el programa GenAlEx 6.4.1 (Peakall y Smouse 2006) realizando 99,999 permutaciones para evaluar lavariación genética existente entre individuos pertenecientes a los cultivos de maíz y arroz de los departamentos de Córdoba, Meta y Valle del Cauca. Además, un análisis de distancias pareadas de PT también fue realizado para los tres departamentos de Colombia, para identificar cuáles son las poblaciones de S. frugiperda más similares entre sí. Las distancias pareadas fueron obtenidas con el programa GenAlEx 6.4.1 y un árbol de Neighbor Joining (NJ) obtenido con el programa Mega 4 fue utilizado para producir dendrogramas con estas distancias.

Resultados

De las 134 muestras a las que se les extrajo ADN, 45 de ellas fueron utilizadas para realizar la caracterización molecular de S. frugiperda (Tabla 1),puesto que este número de muestra es suficiente para realizar un análisis de diferenciación genética de poblaciones con marcadores moleculares como los AFLP (Busato et al. 2004). Dos de las 45 muestras provinieron de una colonia de S. frugiperda mantenida en condiciones de laboratorio desde 2009 a partir de lacual se encogieron larvas que fueron genotipificadas con los marcadores estandarizados por Vélez-Arango et al. (2008) para la identificación de los biotipos de maíz y arroz.

La caracterización en S. frugiperda realizada en este trabajo, se basó en el uso de tres pares de cebadores de AFLP (ECGA/MAGG, ECGC/MAAG, ECGC/MACA) estandarizados previamente por McMichael y Prowell (1999) (Tabla 2). Estos cebadores fueron escogidos puesto que estos autores demostraron que eran los cebadores más confiables para identificar los biotipos de este insecto .En nuestro estudio estos cebadores dieron origen de 33 a 34 loci polimórficos,

200

Tabla 1. Departamentos de Colombia Muestreados y Número de Larvas de Spodoptera frugiperda Analizadas en Cada CultivoTable 1. Sampled Departments of Colombia and Number of Spodoptera frugiperdaLarvae Analyzed per Crop

Número Departamento Cultivo10 Córdoba Algodonero

1 Córdoba Arroz4 Córdoba Ma1 Valle del Cauca Arroz4 Valle del Cauca Algodonero

10 Meta11 Meta Arroz

2 Tolima (Colonia) Biotipo arroz2 Tolima (Colonia)

Tabla 2. Cebadores de Polimorfismo en la Longitud del Fragmento Amplificado(AFLP) estandarizados en Spodoptera frugiperda (ver McMichael y Prowell 1999) Table 2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Primers Standardized in Spodoptera frugiperda (see McMichael and Prowell 1999)

Nombre del ce bador -ECGA GACTGCGTACCAATTCCGAECGC GACTGCGTACCAATTCCGCMAGG GATGAGTCCTGAGTAAAGGMAAG GATGAGTCCTGAGTAAAAGMACA GATGAGTCCTGAGTAAACA

generando un total de 101 loci que fueron detectados entre un rango de tamaño de 200 a 650 pares de bases. Esta escogencia se basó en la reproducibilidad de los perfiles electroforéticos obtenidos en las 45 muestras y en el éxito de amplificación en todos los individuos. Con estos marcadores la combinación de cebadores (3) ECGC/MACA de AFLP en S. frugiperda produjo el mayor número de loci, seguida de la combinación (2) ECGC/MAAG y la combinación (1) ECGA/MAGG, ya que el número de loci correspondiente para cada una de ellas fue de 34, 34, y 33 respectivamente. Ninguna de las combinaciones de cebadores produjo bandas electroforéticas o genotipos con frecuencias superiores al 40% por individuo, significando que estos marcadores presentan una alta variabilidad genética por lo que dicha variabilidad no permitió diferenciar loci diagnósticos para la identificación de los biotipos de S. frugiperda.

El número y frecuencia de las bandas de AFLP (loci) encontradas en las larvas genotipificadas de S. frugiperda de los departamentos de Córdoba, Meta y Valle del Cauca se muestra en la Tabla 3. Se puede observar que el departamento del Meta presenta un mayor número de loci, seguido de Córdoba y Valle del Cauca, debido a que el número de bandas identificadas para cada localidad fueron de 86, 82, y 49 respectivamente. Por otro lado, los valores de heterocigosidades calculadas (He) fueron superiores para el departamento de Meta (0.183), seguido de Córdoba (0.167) y Valle del Cauca (0.154), lo cual significa que Meta presenta la

201

Tabla 3. Patrón de Loci Encontrados con los Marcadores AFLP en los Departamentos de Córdoba, Meta, y Valle del Cauca (HE = heterocigosidad, SE = Error Estándar, UHE = Estimador Insesgado de Heterocigosidad) en Muestras de Spodoptera frugiperda de ColombiaTable 3. Pattern of Loci found in Spodoptera frugiperda with AFLP from the Departments of Córdoba, Meta, and Valle del Cauca, Colombia (HE =Heterozygosity, SE = Standard Error, UHE = Unbiased Estimator of Heterozygosity)

Población Córdoba Meta Valle CaucaNo. bandas 5% 82 86 49No. Bandas privadas 8 9 3Promedio He 0.167 0.183 0.154SE He 0.013 0.012 0.018Promedio de UHe 0.175 0.188 0.185SE UHe 0.013 0.013 0.022

mayor heterocigosidad (variabilidad genética) en S. frugiperda para los 101 loci deAFLP evaluados.

En general, los resultados obtenidos con las distancias del índice de Dice y el algoritmo UPGMA no muestran una discriminación de los individuos genotipificados ni por cultivo ni por localidad (Fig. 2).

El Análisis de Varianza Molecular (AMOVA), mostró que para los departamentos de Córdoba, Meta, y Valle del Cauca no se presentó diferenciación genética entre las poblaciones de S. frugiperda, debido a que el valor de PT fue de 0.041 (P = 0.1401) (Tabla 4). El porcentaje de variación dentro de las poblaciones fue mayor (96%) que la variación encontrada entre las poblaciones (4%).

PT pareados para los departamentos de Córdoba, Meta, yValle del Cauca se muestran en la figura 3 en la cual se puede observar que las poblaciones de S. frugiperda que presentan una mayor similitud genética son

PT PT =0.036). Las poblaciones que tuvieron una mayor diferenciación genética son Meta

PT = 0.078) (Fig. 3). Debido a que no se encontró diferenciación genética significativa entre estos departamentos, no se realizó un test de Mantel para evaluar aislamiento por distancia, ya que las poblaciones de S. frugiperda evaluadas en este estudio no se encuentran estructuradas.

Tabla 4. Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) para las Poblaciones de Spodoptera frugiperda colectadas en los Departamentos de Córdoba, Meta, y Valle del Cauca, ColombiaTable 4. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) for Spodoptera frugiperdaPopulations collected at the Departments of Córdoba, Meta, and Valle del Cauca in ColombiaFuente de variación gl SSD MSD E(MSD) % Estadístico Valor Prob.Entre pob. 2 41.341 20.670 0.632 4 PT 0.041 0.140Dentro pob. 30 444.417 14.814 14.814 96Total 32 485.758 15.445 100

202

Fig. 2. Dendrograma basado en la distancia genética de Dice y el algoritmo UPGMA para las 3 combinaciones de cebadores (C1: ECGA/MAGG, C2: ECGC/MAAG, C3: ECGC/MACA) de AFLP. CCo: Córdoba-algodonero, CC: Córdoba-maíz, CR: Córdoba-arroz, MR: Meta-arroz, MC: Meta-maíz, VCo: Valle del Cauca-algodonero y VR: Valle del Cauca-arroz. Arroz, Maíz, Algodonero.Fig. 2. Dendrogram obtained with Dice genetic distances and UPGMA algorithm for 3 combinations of primers (C1: ECGA/MAGG, C2: ECGC/MAAG, C3: ECGC/MACA) de AFLP. CCo: Córdoba, Cotton, CC: Córdoba-corn, CR: Córdoba-rice, MR: Meta-rice, MC: Meta-corn, VCo: Valle del Cauca-cotton and VR: Valle del Cauca-rice. Rice, Corn, Cotton.

203

PT pareados obtenidos en Spodoptera frugiperda para los departamentos de Córdoba (C), Meta (M), y Valle del Cauca de Colombia.Fig. 3. NJ dendrogram obtained for paired PT values in Spodoptera frugiperda for the departments of Córdoba (C), Meta (M), and Valle del Cauca of Colombia.

Discusión

Los resultados más relevantes de este trabajo indican un alto nivel de polimorfismo de los marcadores AFLP, ya que el uso de solo tres combinaciones de cebadores de este marcador produjo un total de 101 loci polimórficos. Estos locipermitieron estimar la heterocigosidad dentro de las poblaciones de S. frugiperda ya su vez determinar su grado de similitud genética. Adicionalmente, la diversidad genotípica y la evaluación de la estructura genética de esta especie ha sido demostrada en diversos estudios con este insecto por autores como McMichael y Prowell (1999), Busato et al. (2004), Clark et al. (2007), y Martinelli et al. (2007), los cuales demuestran la validez y la vigencia de esta técnica molecular.

Este es el primer estudio de caracterización molecular de S. frugiperdautilizando AFLP en Colombia y claramente ha comprobado que la variabilidad genética de la especie es muy alta. Aunque el número de muestras evaluadas (n = 45) en este estudio fue bajo, se encontró un gran número de loci (101). Este alto número de loci permitió realizar un análisis de diferenciación de genética poblacional de las poblaciones de S. frugiperda en Colombia, de la misma manera que Busato et al (2004) lo realizaron con 40 muestras larvales de este insectoprovenientes de cultivos de maíz y arroz colectadas en tres regiones geográficamente separadas de Brasil.

Los marcadores AFLP evaluados en este trabajo no lograron diferenciar los biotipos de S. frugiperda en los departamentos de Córdoba, Meta, y Valle del Cauca, de Colombia, a pesar de que las combinaciones de cebadores escogidas se basaron en un trabajo de McMichael y Prowell (1999) en el que se recomienda el uso estos marcadores para identificar los biotipos de maíz y arroz. Por ello, al no lograr identificar los biotipos, los resultados obtenidos no permitieron dilucidar si el comportamiento migratorio de estos biotipos difiere en esta especie. Sin embargo, un estudio previo basado en la secuenciación del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa I (COI) realizado por Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea (2011) en Colombia, demostró que el biotipo de maíz tiene mayor capacidad de migración que el biotipo de arroz en este país. En este trabajo se analizaron 102 muestras larvales colectadas en cultivos de maíz, arroz y algodonero (Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea 2011) y con él se corroboró resultados similares obtenidos

204

por Nagoshi y Meagher (2004) en esta polilla en Estados Unidos, ya que estos autores también encontraron que el biotipo con mayor capacidad de dispersión es el biotipo de maíz, puesto que éste tiende a moverse más que el biotipo de arroz hacia el sur de Estados Unidos, particularmente hacia Florida en época de lluvias.

Diferentes marcadores moleculares pueden ser utilizados para realizar estudios en genética de poblaciones y estudios sobre la variabilidad genética de una población, y en el caso de S. frugiperda marcadores como la PCR RFLP del gen de la citocromo oxidasa I (COI), al igual que la PCR del gen nuclear FR (For rice) utilizados por Nagoshi y Meagher (2004) en Estados Unidos y Vélez Arango et al. (2008) en Colombia, son ideales para la identificación de los biotipos de S. frugiperda. No obstante, los marcadores AFLP no presentan esta misma característica, por lo que son importantes para realizar análisis en genética de poblaciones y variación genética (Vos et al. 1995), pero en este caso no son ideales para la identificación de los biotipos de este insecto.

De acuerdo con Peakall y Smouse (2006), el PT es una medida análoga al estadístico FST descrito por Wright (1978), por lo cual se puede concluir que no hay diferenciación o estructuración genética entre las poblaciones de S. frugiperda de Colombia. Estos últimos resultados sugieren que el flujo genético de esta polilla en Córdoba, Meta, y Valle del Cauca es posible entre estas localidades dado los bajos valores estimados de PT. Según Wright (1978) FST = 1/1 + 4Nem (siendo Nem = al número de migrantes (m) y x el tamaño efectivo de la población (Ne)), una estimación de Nem podría ser equivalente al flujo genético entre poblaciones. El valor de Nem estimado para S. frugiperda con AFLP fue de Nem = 5.84 migrantes, este resultado indica que alrededor de 5 migrantes son necesarios para homogenizar las poblaciones de S. frugiperda en la naturaleza (Hartl y Clark 1997). El flujo genético es causado por fenómenos de migración y apareamiento de los individuos migrantes de una población originaria con individuos de la población colonizada (Hartl y Clark 1997), lo que en este contexto significaría que las poblaciones de S. frugiperda migran fácilmente en Colombia y se aparean entre si. Esto es posible debido a que este insecto es polífago, por lo cual no solamente utiliza como plantas hospederas a los cultivos de maíz, arroz, y algodonero, sino otras especies de plantas.

Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al realizar estudios de genética de poblaciones, es el nivel de separación geográfica de las poblaciones analizadas. Por ejemplo, los estudios realizados en S. frugiperda por Clark et al. (2007) en Estados Unidos, Argentina, y Brasil y por Busato et al. (2004) en Brasil con marcadores AFLP, mostraron que este insecto presenta una gran diferenciación genética entre sus poblaciones, por lo que representaron un buen ejemplo de aislamiento por distancia (Wright 1978), ya que en estos dos estudios se colectaron muestras de S. frugiperda separadas por un gran distanciamiento geográfico. Clark et al. (2007) genotipificaron muestras del insecto provenientes de cultivos de maíz,árbol de limón, árbol de princesa y pastos de bermuda mientras que Busato et al. (2004) analizaron muestras provenientes de cultivos de maíz y arroz. En el trabajo de Clark et al. (2007), no se analizaron las muestras de S. frugiperda teniendo en cuenta la existencia de los biotipos de S. frugiperda a pesar de que las muestras de maíz pudieron representar al biotipo de maíz y las muestras de pastos de bermuda al biotipo de arroz. De manera contraria, Busato et al. (2004) explicaron que ladiferenciación genética encontrada en S. frugiperda fue dada por la gran separación geográfica de las poblaciones evaluadas y a su vez dada por la existencia de sus biotipos asociados a cultivos de maíz y a cultivos de arroz.

205

El diseño experimental para evaluar el efecto de la existencia de los biotipos de S. frugiperda en la diferenciación genética de la especie, debe basarse en colectas del insecto realizadas en cultivos de maíz y arroz, en particular, para determinar si hay estructuración genética debido a la asociación de este insecto con estos dos cultivos. En el presente trabajo se analizaron muestras provenientes de maíz, arroz y algodonero, ya que Vélez-Arango et al. (2008) encontraron que el biotipo de maíz es abundante en maíz, algodonero y sorgo mientras que el biotipo de arroz es abundante en arroz y por ello se esperaría una diferenciación genética entre las poblaciones de S. frugiperda provenientes de maíz, algodonero y sorgo, respecto a las poblaciones provenientes de arroz, como lo encontrado en el departamento del Tolima (Colombia) por Saldamando y Vélez-Arango (2010) con el uso de los marcadores de PCR RFLP y PCR de la región FR. Un trabajo en el que no se tuvo en cuenta la existencia de los biotipos de esta polilla es el de Martinelli et al. (2006) en poblaciones de Brasil colectadas en cultivos de maíz y algodonero.Estos autores, encontraron una baja diferenciación genética entre las poblaciones de esta polilla y este resultado puede deberse al hecho de que ellos analizaron poblaciones pertenecientes al mismo biotipo, ya que el biotipo de maíz se encuentra tanto en maíz como en algodonero, como lo demostraron Vélez-Arango et al (2008) en poblaciones colombianas de esta especie.

Es importante de nuevo mencionar aquí, el trabajo realizado por Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea (2011) en Colombia, ya que estos autores incluyeron más individuos en su análisis (n = 102) que en el presente estudio (n = 45) y además también incluyeron más regiones colombianas en las que S. frugiperda es considerada plaga (departamentos de Antioquia, Córdoba, Meta, Tolima, y Valle del Cauca). Ellos encontraron que los haplotipos de S. frugiperdagenotipificados con el gen COI de la mitocondria mostraron tener una gran diferenciación genética entre las poblaciones de Estados Unidos y las de Colombiapuesto que obtuvieron valores de FST significativos (FST = 0.76, P 0.001). No obstante, Salinas-Hernández y Saldamando-Benjumea (2011) encontraron una gran similitud genética de poblaciones de S. frugiperda entre los sitios analizados, por lo que este trabajo corrobora los resultados de estos autores, dado que los AFLP no mostraron diferenciación genética significativa del insecto entre los departamentos de Córdoba, Meta, y Valle del Cauca evaluados y por lo tanto, el manejo integrado que se realice con el insecto puede ser el mismo en todas estas regiones colombianas. Sin embargo, es importante diferenciar el manejo integrado en los cultivos de maíz y arroz, puesto que estudios sobre la susceptibilidad de losbiotipos de S. frugiperda de Colombia hacia dos insecticidas (metomil y lambdacialotrina) han demostrado que el biotipo de arroz es más tolerante a los insecticidas sintéticos (Ríos-Díez y Saldamando-Benjumea 2011), mientras que el biotipo de maíz a dos endotoxinas del Bacillus thurigensis (Cry1Ac y Cry1Ab) (Ríos-Diez y Saldamando-Benjumea , sin publicar).

Agradecimientos

Los autores agradecen a Flor Edith Acevedo por sus conocimientos y asesorías en la técnica AFLP, al Ministerio de Medio Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial por la otorgación del permiso de colecta y acceso genético no 4120E1-44703 (24 Abril 2008) y a COLCIENCIAS por la financiación del proyecto no 1118-452-550 21042 al investigador principal Clara Inés Saldamando Benjumea.

206

Referencias Citadas

Busato, G. R., A. D. Gruztmacher, A. C. De Oliveira, E. A. Vieira, P. A. Zimmer, M. M. Kopp, J. De Bandeira, and T. R. Magalahes. 2004. Análise da estrutura e diversidade molecular de poblaçoes de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera, Noctuidae) associadas às culturas de milho e arroz no Rio Grande do Sul. Neotrop. Entomol 33: 709-716.

Clark, P. L., J. Molina-Ochoa, S. Martinelli, S. R. Skoda, D. I. Isenhour, D. J. Lee, J. T. Krumm, and J. E. Foster. 2007. Population variation of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, in western hemisphere. J. Insect. Sci. 7:article 5.

Creste, S., A. Tulman-Neto, and A. Figueira. 2001. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrilamide sequencing gels by silver staining. Plant Mol. Biol. 19: 299-306.

Dice, L. R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology 26: 297-302.

Freeland, J. 2005. Molecular Ecology. John Wiley and Sons, West Sussex, UK.Giolo, F. P., A. D. Grutzmacher, M. S. García, and G. R. Busato. 2002.

Parâmetros biológicos de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) oriundas de diferentes localidades e hospedeiros. Rev. Bras. Agroc. 8: 219-224.

Hammer, O. D., A. T. Harper, and P. D. Ryan. 2001. PAST: Palaeontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontol.Elect. 4: 1-9.

Hartl, D. L., and A. G. Clark. 1997. Principles of Population Genetics. Editorial Sinnauer Associates Publishers, Sunderland, MA.

Levy, C. H., A. García-Maruniak, and J. Maruniak. 2002. Strain identification of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) insects and cell line: PCR-RFLP of cytocrome oxidase c subunit I gene. Fla. Entomol. 85: 186-190.

López-Edwards, M., J. L. Hernández-Mendoza, A. Pescador-Rubio, J. Molina-Ochoa, R. Lezma-Gutierrez, J. J. Hamm, and B. R. Wiseman. 1999. Biological differences between five populations of fall armyworm (Lepidoptera: Noctuidae) collected from maize in Mexico. Fla Entomol. 82: 254-262.

Lu, Y. J., G. D. Kochert, D. J. Isenhourand, and M. J. Adang. 1994. Molecular characterization of a strain-specific repeated DNA sequence in the fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Insect Mol. Biol. 3: 123-130.

Luginbill, P. 1928. The fall armyworm. U.S. Dep. Agric. Tech. Bull. 34: 1-91.Machado, V., M. Wender, V. D. Baldissiera, J. V. Oliveira, L. M. Fiuza, and R. N.

Nagoshi. 2008. Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) molecular characterization of host strains in southern Brazil. Ann. Entomol. Soc. Am. 101: 619-626.

Martinelli, S., R. B. Montrazi, M. I. Zucchi, M. C. Silva-Filho, and C. Omoto. 2006. Molecular variability of Spodoptera frugiperda populations associated to maize and to cotton in Brazil. J. Econ. Entomol. 99: 519-526.

Martinelli, S., P. L. Clark, M. I. Zucchi, M. C. Silva-Filho, J. E. Foster, and C. Omoto. 2007. Genetic structure and molecular variability of Spodoptera frugiperda(Lepidoptera: Noctuidae) collected in maize and cotton fields in Brazil. Bull. Entomol. Res. 97: 225-231.

207

McMichael, M., and D. P. Prowell. 1999. Differences in amplified fragment-length polymorphism in fall armyworm (Lepidoptera: Noctuidae) host strains. Ann. Entomol. Soc. Am. 92: 175-181.

Nagoshi, R. D., and R. L. Meagher. 2004. Behavior and distribution of the two fall armyworm host strains in Florida. Fla. Entomol. 87: 440-448.

Pashley, D. P. 1986. Host-associated genetic differentiation in fall armyworm (Lepidoptera: Noctuidae): a sibling species complex? Ann. Entomol. Soc. Am. 79: 898-904.

Pashley, D. P. 1988. Current status of fall armyworm host strains. Fla. Entomol. 71: 227-234.

Peakall, R., and P. E. Smouse. 2006. GENALEX 6.4.1. Genetic analysis in excel. Population genetic software for teaching and research. Mol. Ecol. Notes 6: 288-295.

Prowell, D. P., M. McMichael, and J. F. Silvain. 2004. Multilocus genetic analysis of host use, introgression and speciation in host strains of fall armyworm (Lepidoptera: Noctuidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 97: 1034-1044.

Rios-Díez, J. D., and C. I. Saldamando-Benjumea. 2011. Susceptibility of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) strains from Central Colombia to two insecticides, methomyl and lambda-cyhalothrin: a study of the genetic basis of resistance. J. Econ. Entomol. 104: 1698-1705.

Rivera-Jiménez, H. J., I. E. Suárez-Padrón, and J. D. Palacio-Mejía. 2009. Análisis de la diversidad genética de `caña flecha´ Gyneriums agittatum Aubl. utilizando la técnica de AFLP. Agricultura Técnica en México [en línea] 35.

Salinas-Hernández, H., and C. I. Saldamando-Benjumea. 2011. Haplotypeidentification within Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) corn and rice strains from Colombia. Neotrop. Entomol. 40: 421-430.

Saldamando, C. I., and A. M. Vélez-Arango. 2010. Host plant association and genetic differentiation of corn and rice strains of Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae) in Colombia. Neotrop. Entomol 39: 921-929.

Sambrook, J., and D. W. Russell. 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 2: 101-105.

Sneath, P. H., and R. R. Sokal. 1973. Numerical Taxonomy. Editorial Freeman, San Francisco, CA.

Sparks, A. N. 1979. A review of the biology of the fall armyworm. Fla. Entomol. 62: 82-87.

Tamura, K., J. Dudley, M. Neiand, and S. Kumar. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24: 1596-1599.

Vélez-Arango, A. M., R. E. Arango, D. Villanueva, E. Aguilera, y C. I. Saldamando. 2008. Identificación de biotipos de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) mediante marcadores mitocondriales y nucleares. Rev. Colomb. Entomol. 34: 145-150.

Vos, P., R. Hogers, M. Bleecker, M. Reijans, T. V. De Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiperand, and M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Res. 23: 4407-4414.

Wright, S. 1978. Evolution and the Genetics of Populations, Vol. IV. Chicago University Press, Chicago, IL.

208