Module_Biochemistry (Ind).pdf

BUKU PANDUAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

LABORATORIUM DASAR PROSES KIMIA DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK 2013

1

VISION AND MISSION

DEPARTMENT OF CHEMICAL ENGINEERING

VISION

“To become a world class Chemical Engineering Department as center of

excellence for education and research in chemical engineering”

MISSION

The Department seeks to provide the best quality of undergraduate and

postgraduate education. The Department will provide a broad-based education

and design experience, enabling students to address chemical engineering

problems. Furthermore, the Department will provide students with fundamental

elements to develop in the profession in response to rapidly chaning technology

and societal needs and expectations, and, will also develop important soft skills

such as problem solving, communication, and group skills.

2

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah Swt, karena dengan rahmat dan

hidayahNya kami dapat menyelesaikan penyusunan buku petunjuk praktikum Biokimia ini.

Praktikum Biokimia merupakan salah satu mata kuliah dasar yang diberikan

departemen Teknik Kimia FTUI pada semester genap. Buku petunjuk praktikum Biokimia

ini dibuat dengan maksud membantu mahasiswa agar lebih mudah mendalami materi

praktikum yang akan dilaksanakan.

Kemudian pada kesempatan ini kami ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang

sebesar - besarnya kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan buku ini.

Kami menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kami dengan

senang hati menerima kritik dan saran yang membangun.

Akhimya kami mengharapkan semoga buku ini dapat memberikan manfaat bagi para

pembacanya.

Depok, 31 Januari 2013

Editor,

Kenny Lischer

Desy Qoiriyani

Muhammad Firdaus S

Tim Penyusun :

1. Dr. Muhammad Sahlan, S.Si, M.Eng. 2. Ir. Rita Arbianti, M.Si. 3. Kenny Lischer, S.T.

4. Muhammad Firdaus S., S.T. 5. Desy Qoriyani

3

DAFTAR ISI

VISION AND MISSION ......................................................................................................... 1

KATA PENGANTAR .............................................................................................................. 2

DAFTAR ISI............................................................................................................................. 3

TATA TERTIB PRAKTIKUM .............................................................................................. 4

ASPEK KESELAMATAN ...................................................................................................... 5

SUSUNAN PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ................................... 8

REAKSI-REAKSI PADA HIDROKARBON ......................................................................... 10

ANALISIS POLISAKARIDA ALAMI ................................................................................... 20

EKSTRAKSI MINYAK DAN IDENTIFIKASI LIPID DAN ASAM LEMAK..................... 26

EKSTRAKSI DNA DARI KACANG HIJAU ........................................................................ 32

EKSTRAKSI DAN KUANTIFIKASI PROTEIN DARI SUMBER MAKANAN ................. 38

PERHITUNGAN MIKROSKOPIS ......................................................................................... 49

KLOROFIL DAN KAROTENOID ......................................................................................... 53

TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI ............................................... 58

4

TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Semua praktikan wajib mengenakan jas lab yang berwarna putih selama

melaksanakan praktikum.

2. Semua praktikan wajib hadir 10 menit sebelum tes awal dimulai, dan menandatangani

daftar hadir.

3. Semua praktikan wajib menyerahkan berkas Laporan Pendahuluan dan Jurnal

Praktikum kepada asisten sebelum praktikum dimulai. Berkas tersebut dapat diminta

lagi kepada asisten setelah mengikuti tes awal.

4. Semua praktikan wajib mengikuti tes awal sebelum percobaan dilakukan sampai

asisten yang bertanggungjawab menilai bahwa yang bersangkutan pantas dan mampu

melaksanakan modul percobaan yang telah ditentukan. Apabila praktikan tidak

mengikuti tes awal, percobaan dinyatakan GUGUR. Tes awal berlangsung 10-20

menit.

5. Semua praktikan wajib mencatat semua hasil pengamatan dari percobaan yang

dilakukan di dalam Jurnal Praktikum. Pada akhir percobaan semua hasil pengamatan

harus diketahui dan ditandatangani oleh asisten.

6. Laporan Praktikum harus diserahkan kepada asisten satu minggu setelah praktikum.

Keterlambatan penyerahan akan dikenai sanksi yaitu tidak boleh mengikuti praktikum

pada hari penyerahan Laporan Praktikum.

7. Laporan praktikum yang belum memenuhi persyaratan harus diperbaiki, dan

diserahkan kepada asisten yang bersangkutan paling lambat satu minggu setelah

dinyatakan perlu perbaikan.

8. Peminjaman alat-alat praktikum harus seijin petugas laboratorium dan dikembalikan

kepada petugas dalam keadaan yang sama.

9. Sebelum meninggalkan laboratorium, praktikan harus membersihkan meja kerja dan

alat-alat praktikum serta mengatur kembali letak bahan dan alat praktikum.

10. Penggunaan alat-alat dan pemakaian bahan kimia harus hati-hati, tidak boleh sampai

ada bahan kimia yang tercecer atau tumpah.

11. Kerusakan alat atau bahan yang terbuang yang terjadi karena kesalaha kerja dan atau

kelalaian praktikan, wajib diganti oleh praktikan dengan alat/bahan yang sama.

12. Bersikap sopan pada petugas laboratorium dan asisten.

13. Ketidakhadiran praktikan pada waktu yang telah dijadwalkan mendapatkan sanksi

dinyatakan GUGUR, kecuali ada alasan kuat seperti musibah/kemalangan yang tidak

terhindarkan.

14. Ketidakhadiran karena sakit, percobaannya dapat dilakukan di luar jadwal praktikum

dengan persetujuan asisten, setelah mendapat ijin dari Dosen Kordinator Praktikum.

Dispensasi penjadwalan ulang karena sakit hanya diperbolehkan satu kali selama

periode praktikum.

15. Ketentuan lulus praktikum:

− Telah mengikuti tes awal dan menyerahkan Laporan Pendahuluan dan Jurnal

sebelum praktikum dimulai.

− Telah melaksanakan semua percobaan pada semester yang sama dan dinyatakan

lulus oleh asisten.

− Menyerahkan laporan praktikum untuk semua percobaan yang telah dilaksanakan

dan dinilai oleh asisten.

− Lulus ujian akhir praktikum.

5

ASPEK KESELAMATAN

Untuk memperoleh hasil percobaan yang benar maka haruslah diketahui lebih dulu

cara-cara pokok dalam penggunaan alat-alat laboratorium.

I. Pemanasan

Kebanyakan dari proses pemanasan dalam laboratorium dilakukan dengan

menggunakan alat pembakar gas, meski demikian untuk beberapa hal dipakai peralatan oven.

Pembakaran atau bunsen seperti tergambar di bawah ini pada umumnya memiliki sebuah

katup pengatur gas dan pengatur udara.

Untuk menyalakan bunsen, dilakukan tahap sebagai berikut :

- Katup udara dalam keadaan tertutup dan katup gas terbuka.

- Nyalakan dengan korek api, pada tahap ini akan dihasilkan nyala berwarna merah

yang tak terlalu panas.

- Untuk mendapatkan nyala yang baik dan temperatur pembakaran yang lebih tinggi,

katup udara dibuka perlahan-lahan hingga didapat nyala biru.

- Setelah selesai digunakan, matikan bunsen dengan cara menutup katup aliran gas.

- Jika bunsen digunakan untuk memanaskan zat dalam tabung reaksi/beaker gelas, tata

caranya dapat dilihat dalam gambar di bawah ini :

6

Perhatikan mulut tabung jangan mengarah ke wajah atau kearah orang lain !

II. Penyaringan

Penyaringan bertujuan untuk memisahkan suatu cairan dari bahan padat dengan cara

melewatkan cairan pada bahan penyaring, misalnya kertas saring. Tata cara penyaringan

adalah sebagai berikut :

- Lipat kertas saring seperti gambar di bawah ini :

(a) (b) (c)

Cara melipat kertas saring

Penyaringan

(d)

- Pasanglah di atas corong, lalu basahi kertas saring tersebut dengan air suling dan

hindari adanya rongga udara dibalik kertas saring.

- Perhatikan posisi tepi kertas saring harus 1/2 sampai 1 sentimeter dari tepi atas corong

dan jumlah endapan 2/3 dari ketinggian kertas saring (maksimum).

- Pasang corong pada penyangga dan taruhlah wadah penampung di bawahnya.

Pemanasan dan pendidihan larutan

dalam sebuah tabung reaksi

Pemanasan gelas beker pada standar

dengan bunsen pembakar.

7

- Tuanglah cairan melalui batang pengaduk dengan hati-hati.

- Bilaslah beberapa kali dengan air suling hingga benar-benar bersih.

III. Pembacaan skala

Pada alat-alat pengukur volume cairan tertera tanda garis-garis melingkar yang

menunjukkan batas tinggi cairan pada volume tertentu. Sebagai batas pembacaan adalah

bagian permukaan lengkung cairan, kecuali untuk cairan yang berwarna pekat/gelap, dibaca

pada bagian atas permukaan lengkung cairan. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar

di bawah ini:

IV. Pencucian alat

Alat-alat yang digunakan dalam laboratorium kimia harus dalam keadaan bersih. Alat

yang bersih dapat diketahui bila permukaannya dibasahi maka akan terdapat suatu lapisan

cairan yang merata. Adanya lemak atau debu akan menyebabkan lapisan tersebut tidak

merata.

Pencucian/pembersihan alat dilakukan dengan cara pencucinya dengan ditergen dan bila

perlu digosok dengan sikat dan akhimya dibilas dengan air suling. Untuk mencuci alat-alat

yang sangat kotor digunakan larutan Kalium dikromat dalam asam sulfat. Cara membuat

larutan tersebut dapat ditanyakan pada asisten.

8

SUSUNAN PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

1. PENULISAN LAPORAN PENDAHULUAN DAN JURNAL

1. PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM

A. KULIT LUAR

9

B. ISI

10

MODUL 1

REAKSI-REAKSI PADA HIDROKARBON

I. Tujuan Percobaan

- Menguji kelarutan dan flammability hidrokarbon

- Mengetahui sifat-sifat kimia dan reaksi-reaksi pada hidrokarbon

II. Teori

Banyaknya jenis senyawa organik tidak terlepas dari kemampuan atom karbon

untuk mengikat satu sama lain dan jumlah unsur-unsur yang mampu membentuk

ikatan dengan gugus karbon yang sudah ada. Untuk menyederhanakan masalah ini,

maka disepakati bahwa senyawa hidrokarbon adalah senyawa dengan ikatan hidrogen

dan karbon saja.

Hidrokarbon memiliki jumlah ikatan yang sangat banyak, tetapi dapat

dikelompokkan sesuai dengan ciri khas strukturnya. Dimana struktur-struktur ini juga

disesuaikan dengan kereaktifan kimia secara umum. Sehingga tiap kelompok dapat

dikelompokkan dari struktur maupun kereaktifannya. Pada percobaan ini, praktikan

akan mengujicobakan kereaktifan kimia dari hidrokarbon jenuh, tidak jenuh dan

aromatik.

Stuktur Hidrokarbon

Hidrokarbon dikatakan jenuh apabila jumlah hidrogen yang terikat pada

karbonnya sudah maksimal. Hal ini terjadi bila atom karbon terikat satu sama lain

dengan ikatan tunggal atau yang dikenal sebagai ikatan sigma (). Etana merupakan

contoh hidrokarbon jenuh berdasarkan kriteria ini.

H C

H

C

H

H

H

H

Gambar 2.1 Struktur hidrokarbon, Etana

Hidrokarbon tak jenuh memiliki jumlah hidrogen yang terikat lebih sedikit

daripada jumlah maksimal yang mampu diikatnya. Senyawa jenis dipastikan memiliki

ikatan rangkap sehingga jumlah total ikatan kovalen pada tiap atom karbon sebanyak

empat. Contoh senyawa jenis ini adalah etilen dan asetilen

11

C C

H

H

H

H

Ethylene

C CH H

Acethylene

Gambar 2.2 Struktur Etilen dan Asetilen

Ikatan karbon rangkap pada etilen terdiri dari sebuah ikatan seperti yang

terdapat pada hidrokarbon jenuh dan sebuah ikatan jenis pi (). Keduanya bersama-

sama membentuk ikatan rangkap. Sedangkan acetilen memiliki ikatan rangkap tiga

yang terdiri dari satu ikatan dan dua ikatan .

Hidrokarbon aromatik memiliki ikatan yang unik antara karbonnya yang susah

untuk dideskripsikan. Pada benzene, salah satu jenis hidrokarbon aromatik, semua

ikatan karbon-karbonnya (6 ikatan) identik. Dua contoh jenis ikatan benzene, a dan b,

memiliki ikatan tunggal dan double yang bervariasi.

(a) (b) (c)

Gambar 2.3 Struktur benzena

Akantetapi, keduanya mewakili jenis molekul yang berbeda. Strutur c, yang

menggunakan lingkaran dalam heksagon, dapat lebih diterima. Lingkaran ini

mewakili enam elektron yang terdistribusi secara merata pada ikatan aromatik di

keenam atom karbonnya. Ikatan yang diwakili oleh sisi-sisi hexagonal adalah ikatan

. Struktur c dapat digunakan untuk mewakili semua jenis ikatan karbon-karbon

dalam benzen secara benar.

Kereaktifan Hidrokarbon

Ikatan pada hidrokarbon jenuh (alkana) sangat stabil sehingga sangat tidak

reaktif. Pada temperatur tinggi, hidrokarbon jenuh bereaksi dengan oksigen

(pembakaran). Pada reaksi tersebut, ikatan karbon-karbon diputus dan produknya

adalah karbondioksida dan air. Jika pembakarannya tidak efisien, maka yang

terbentuk adalah karbon monoksida atau bahkan karbon tunggal (soot). Tetapi secara

umum hidrokarbon jenuh terbakar dengan lebih efisien daripada jenis hidrokarbon

lainnya.

Ikatan karbon-hidrogen dari alkana dapat digantikan oleh halogen. Persamaan

reaksi yang umum dengan bromin adalah sebagai berikut :

12

R H + Br2 R Br + HBrheat

Perhatikan bahwa HBr adalah produk dari reaksi tersebut. Untuk bereaksi dengan

halogen diperlukan heat ataupun energi yang ringan.

Ikatan pada hidrokarbon tak jenuh (alkena dan alkuna) bersifat reaktif dan

mempermudah terjadinya reaksi tambahan. Pada reaksi ini, sebuah molekul seperti

bromin membentuk dua ikatan tunggal karbon-bromin yang setara dengan energi

ikatan . Etilen bereaksi dengan bromin membentuk 1,2-dibromoetana.

C C

H

H

H

H

C C

H

Br

H

Br

H

H

Br2

(colorless) (red-brown) (colorless)

+

Reaksi tersebut dapat terjadi pada suhu ruang. Sebagai hasilnya, karakteristik

warna merah kecoklatan pada bromin menghilang. Perlu diperhatikan juga bahwa

tidak terbentuk HBr seperti pada reaksi substitusi hidrokarbon jenuh pada reaksi ini.

Acetilen yang memiliki dua ikatan juga mengalami reaksi lanjutan :

C CH HBr C

H

C

Br

H

Br

Br

+ 2Br

(colorless) (red-brown)(colorless)

Ikatan juga merupakan pusat serangan oleh oxidizing agents. Sebagai contoh,

larutan potasium permanganat yang netral bereaksi dengan alkena dan akuna sehingga

menghasilkan dialkohol. Secara visual, reaksi ini diikuti dengan hilangnya warna

ungu dari potasium permanganat dan terbentuknya warna coklat sebagai wujud dari

manganese dioxide. Percobaan untuk menguji reaksi tak jenuh disebut test Baeyer.

HC CHR R C

OH

C

H

OH

R

H

+ 2 KMnO4 + 4 H2O + 2MnO2 (s) + 2 KOH3 R 3

(purple) (brown)

(2.1)

(2.2)

(2.3)

(2.4)

13

Jaringan dari senyawa aromatik dipertahankan selama reaksi. Bahkan grup

yang sudah jenuh yang terikat pada cincin benzene bisa diserang oleh axidizing agents

dengan energy yang sangat besar. Produk yang selalu dihasilkan ketika alkyl group

tunggal terikat pada cincin benzene adalah asam benzoid.

CH2CH2CH3 CO2H

+ 2 CO2 + 3 H2O

Benzoic Acid

oxidazing

agent

Atom hidrogen dari benzene bisa disubstitusikan oleh bromin. Akantetapi,

diperlukan katalis Fe. Perhatikan bahwa reaksi berikut ini adalah reaksi substitusi dan

HBr terbentuk.

Br

+ Br2+ HBr

Fe

III. Prosedur

III.1 Alat

Tabung reaksi 10x 75 mm

Tabung reaksi 16 x 150 mm

Acetylene generator

Pipet tetes

Kaca arloji

Rak tabung reaksi

III.2 Bahan

Heptana

1-oktana

toluene

xylena

1-butanol

karbon tetraklorida

1% bromin dalam karbon tetraklorida

paku payung

1% larutan potasium permanganat

sample hidrokarbon yang tidak diketahui

kalsium karbida

kertas lakmus biru

(2.5)

(2.6)

14

III.3 Prosedur Percobaan

Perhatikan bahwa limbah organik harus dibuang ke tempat yang tersedia.

Catatan :

1. Lakukan semua percobaan di bawah ini.

2. Percobaan A sampai D menggunakan tiga hidrokarbon yakni, heptana,

1-oktana dan toluena. Gunakan tabung reaksi yang bersih dan kering

untuk semua reaksi. Struktur ketiga hidrokarbon tersebut adalah :

CH3(CH2)5CH3 CH2=CH(CH2)5CH3

Heptane 1-OctaneToluene

CH3

Gambar 4.1 Struktur hidrokarbon dalam percobaan

3. Kebanyakan alkana mengandung pengotor alkena. Untuk

membersihkannya, alkana dicampur dengan H2SO4 dengan

perbandingan alkana : H2SO4 = 3:1. Terbentuk lapisan, dimana lapisan

bawah yang lebih gelap (H2SO4) dipisahkan. Lapisan alkana yang

tersisa diperlakukan ulang dengan H2SO4 hingga tidak terbentuk lagi

lapisan yang lebih gelap. Setelah itu, alkana dicuci dengan air. (Hati-

hati dengan larutan H2SO4, dikerjakan hanya oleh orang yang sudah

berpengalaman)

A. Kelarutan Hidrokarbon.

1. Kocoklah secara perlahan 0.5 ml heptana dengan 5ml pelarut air dalam

tabung reaksi 16x150 mm untuk menguji kelarutannya. Catatlah hasil

pengamatan Anda.

2. Ulangi langkah 1dengan sampel 1-Oktana dan toluena, masing-masing

dengan takaran yang sama.

3. Ganti pelarut dengan 1-butanol dan ligroin (campuran alkana), ulangi

langkah 1 dan 2 di atas dengan takaran yang sama.

B. Flammability Hidrokarbon

Hati-hati : hidrokarbon sangat mudah terbakar, dan uapnya sangat ekplosif

di udara. Berhati-hatilah dengan apinya. Jangan menambah kuantitas dari

hidrokarbon selain daripada yang sudah ditentukan.

1. Teteskan 3 tetes dari salah satu jenis sampel hidrokarbon pada kaca

gelas, dengan menggunakan korek, nyalakanlah hidrokarbon tersebut.

2. Amati type dan warna nyalanya, karbon yang terdapat dalam nyala

tersebut dan jumlah residu yang tertinggal.

3. Ulangi langkah di atas untuk kedua sampel hidrokarbon lainnya.

4. Catat hasil pengamatan Anda.

15

C. Perilaku Bromin dalam Karbon Tetraklorida.

1. Masukkan 1ml bromin dalam karbon tetraklorida dalam tabung reaksi

kecil.

2. Tambahkan 10-20 tetes dari sampel hidrokarbon, perhatikan perubahan

warnanya.

3. Bila tidak terjadi perubahan warna setelah tetes ke-20, tambahkan iron

tack, dan biarkan selama 5 menit.

4. Bila masih tidak terdapat perubahan warna, panaskan larutan tersebut

dalam water bath panas selama 15-20 menit.

5. Untuk mengetes terdapatnya kandungan hidrogen bromid, letakkan

kertas lakmus biru lembab di mulut tabung reaksi.

6. Ulangi percobaan dengan kedua sampel hidrokarbon lainnya.

7. Catatlah hasil pengamatan Anda.

D. Reaksi dengan Potassium Permanganat

1. Tempatkan 1ml sampel hidrokarbon dalam tabung reaksi kecil.

2. Tambahkan 3 tetes dari larutan 1% potasium permanganat.

3. Kocok tabung reaksi tersebut, perhatikan semua perubahan yang

terjadi. Berapa waktu yang dibutuhkan sebelum perubahan terjadi?

4. Ulangi dengan sampel hidrokarbon lainnya.

5. Catat hasil pengamatan Anda.

E. Pengelompokkan Zat

1. Dapatkan sampel hidrokarbon yang tidak diketahui dari asisten

praktikum Anda.

2. Lakukan tes untuk menggelompokkann sampel-sampel tersebut

menjadi hidrokarbon saturated, unsaturated dan aromatik.

F. Preparasi dan Sifat-Sifat Kimia dari Acetylene.

1. Perhatikan alat percobaan acetylene yang terdiri dari sebuah botol

kering 250 ml dengan dua buah karet stopper, sebuah saluran dropping,

tubing kaca dan karet yang sesuai. (Lihat Gambar).

2. Beberapa potongan kalsium karbid (CaC2) dimasukkan dalam botol

kering tersebut.

3. Penambahan air yang berhati-hati dan sedikit demi sedikit akan

menghasilkan gas acetylene.

4. Untuk mengeringkan tabung reaksi 16x150mm yang mengandung 10

tetes dari larutan 1% bromin dalam karbon tetraklorida, tambahkan

sekitas 3ml karbon tetraklorida. Alirkan acetylene ke larutan tersebut.

Perhatikan perubahan yang terjadi.

5. Untuk tabung reaksi 16x150 mm yang mengandung 3 tetes dari larutan

1% potasium permanganat, tambahkan sekitar 3ml air. Alirkan

acetylene ke larutan tersebut hingga warna permanganatnya

menghilang. Jika reaksinya lamban, kocok dan teruskan dengan aliran

acetylene. Ulangi hingga terjadi penghilangan warna. Perhatikan

Perubahan yang terjadi.

16


IV. Potensi Bahaya

No. Alat Potensi Bahaya

1 Tabung Reaksi Pecah/meledak

2 Acetylene Generator Bocor/meledak

3 Pipet Tetes Pecah

4 Kaca Arloji Pecah/meledak

5 Rak Tabung Reaksi Patah

No. Bahan Potensi Bahaya

1 Heptana Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.

Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau

memasuki saluran pernapasan.

Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak

jangka panjang.

Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.

Mudah terbakar.

2 1-oktana Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.



Mudah terbakar jika terkena panas atau api.

3 Toluena Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

4 Xylena Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

5 1-butanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

6 Karbon Tetraklorida Iritasi bila terkena mata dan kulit

Bahaya bila tertelan dan terhirup

7 Bromin Oksidator yang kuat.

Mudah terbakar.

Korosif.

17

Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit.

Dapat menyebabkan iritasi sistem pencernaan bila

tertelan.

Dapat menyebabkan iritasi sistem pernapasan bila

terhirup.

Dapat menyebabkan gangguan saraf, jantung, hati, dan

ginjal.

8 Paku payung Tertusuk.

9 Potasium permanganat Oksidator yang kuat.

Mudah terbakar.

Korosif.


Dapat menyebabkan iritasi sistem pencernaan bila

tertelan.

Dapat menyebabkan iritasi sistem pernapasan bila

terhirup.

11 Kalsium Karbida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.



Dapat menyebabkan kebakaran jika terpapar oksigen

atau panas.

V. Pertanyaan

Berikan produk hasil dari reaksi berikut ini :

a . CH3CH2CH3 + O2heat

b.

CH3

CH3

heat

KMnO4

c.

CH2CH3

heat

KMnO4

d.

C C

H3C

H3C

CH3

CH3

Br2

CCl4

e.

CH3C CCH2CH3Br2

CCl4

18

f.

CH3CH2CH2CH=CH2

KMnO4

g.

CH3

CH3

Br2

Fe

h.

CaC2 + H2O

VI. Format Laporan dan Pengumpulan

A. Kelarutan Hidrokarbon

No. Data yang diambil Hasil Pengamatan

1 0,5 ml heptana + 5 ml air

2 0,5 ml 1-oktana + 5 ml air

3 0,5 ml toluena + 5 ml air

4 0,5 ml heptana + 5 ml ligroin

5 0,5 ml 1-oktana + 5 ml ligroin

6 0,5 ml toluena + 5 ml ligroin

7 0,5 ml heptana + 5 ml 1-butanol

8 0,5 ml 1-oktana + 5 ml 1-butanol

9 0,5 ml toluena + 5 ml 1-butanol

B. Flammability Hidrokarbon

No. Data yang diambil Hasil Pengamatan

1 3 tetes heptana + api

2 3 tetes 1-oktana + api

3 3 tetes toluena + api

C. Perilaku Bromin dalam Karbon Tetraklorida

No. Data yang diambil Hasil

Pengamatan

1 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-20

tetes heptana


tetes 1-oktana


tetes toluena

D. Reaksi dengan Potassium Permanganat

19


Pengamatan

Waktu

Reaksi

1 1 ml heptana + 3 tetes larutan 1% potassium

permanganat

2 1 ml 1-oktana+ 3 tetes larutan 1% potassium

permanganat

3 1 ml toluena + 3 tetes larutan 1% potassium

permanganat

E. Pengelompokkan Zat


Pengamatan

Waktu

Reaksi

1 3 tetes hidrokarbon + api -

2 0,5 ml hidrokarbon + 5 ml 1-butanol -

3 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida +

10-20 tetes hidrokarbon -

4 1 ml hidrokarbon + 3 tetes larutan 1%

potassium permanganat

F. Preparasi dan Sifat-sifat Kimia dari Acetylene.


Pengamatan

1 (10 tetes larutan 1% bromin dalam tetraklorida + 3 ml

karbon tetraklorida) + gas acetylene

2 (3 tetes larutan 1% potassium permanganat + 3 ml air)

+ gas acetylene

VII. Daftar Pustaka

Tim Penyusun, 2006. Buku Panduan Praktikum Kimia Organik. Departemen

Teknik Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia. Depok.

Fessenden, Ralph J., and Fassenden, Joans S., 1982, Organic Chemistry, 2nd

ed.,

Williard Grant Press/PWS Publisher, Masachusetts, USA.

20

MODUL 2

ANALISIS POLISAKARIDA ALAMI

I. Tujuan Percobaan

- Mengkarakterisasi gula: monosakarida dan polisakarida

- Menganalisis polisakarida alami

II. Teori

Monosakarida

Secara umum, ciri-ciri dari monosakarida adalah sebagai berikut:

- Sebuah molekul yang terdiri dari C, H, dan O dengan rasio 1:2:1 [CH2O)n].

- Sebagian besar monosakarida pada protoplasma adalah berupa 3-karbon gula

(triosa), 5-karbon gula (pentosa), atau 6-karbon gula (heksosa)

- Gula yang merupakan monosakarida juga dikarakterisasi oleh apapun yang

mengandung aldehid (aldosa) atau grup keton (ketosa)

Sebagian besar monosakarida dikenal sebagai heksosa, karena terdiri atas 6-

rantai atau cincin karbon. Atom-atom hidrogen dan oksigen terikat pada rantai

atau cincin ini secara terpisah atau sebagai gugus hidroksil (OH). Ada tiga jenis

heksosa yang penting dalam ilmu gizi, yaitu glukosid, fruktosa, dan galaktosa.

Ketiga macam monosakarida ini mengandung jenis dan jumlah atom yang sama,

yaitu 6 atom karbon, 12 atom hidrogen, dan 6 atom oksigen. Perbedaannya hanya

terletak pada cara penyusunan atom-atom hidrogen dan oksigen di sekitar atom-

atom karbon. Perbedaan dalam susunan atom inilah yang menyebabkan perbedaan

dalam tingkat kemanisan, daya larut, dan sifat lain ketiga monosakarida tersebut.

Monosakarida yang terdapat di alam pada umumnya terdapat dalam bentuk isomer

dekstro (D). Struktur kimianya dapat berupa struktur terbuka atau struktur cincin.

Jenis heksosa lain yang kurang penting dalam ilmu gizi adalah manosa.

Monosakarida yang mempunyai lima atom karbon disebut pentosa, seperti ribosa

dan arabinosa.

Polisakarida

Secara umum, ciri-ciri dari polisakarida adalah sebagai berikut:

- Banyak jenis berbeda dari polisakarida yang diketahui. Dan pati, glikogen,

serta selulosa adalah jenis polisakarida yang penting dalam sistem kehidupan.

- Ketiga jenis polisakarida tersebut terbuat dari subunit glukosa yang tergabung

akibat adanya perpindahan air (kondensasi) untuk membentuk ikatan

glikosida.

- Ketiga jenis polisakarida tersebut berbedadalam hal struktur dan juga sifat-

sifat kimianya.

-

Adapun sifat-sifat dari ketiga jenis polisakarida yang penting dalam sistem

kehidupan tersebut, dilampirkan pada Tabel 2.1, sebagai berikut:

21

Tabel 2.1 Perbedaan jenis polisakarida

Jenis Glikogen Pati Selulosa

Dihasilkan oleh Sel hewan Sel tumbuhan Sel tumbuhan

Fungsi Polisakarida penyimpan yang mungkin

terdeposit pada granula yang cukup

besar di dalam sel.

Polisakarida

struktural yang

meliputi sel

dinding tumbuhan

Jenis ikatan

glikosida

Ikatan alpha-glikosida (glikogen lebih

bercabang dibandingkan dengan pati)

Ikatan beta-

glikosida (tidak

mudah terpecah di

alam, selulosa

bersifat sangat

kuat dan

merupakan zat

yang tahan lama.

Polisakarida merupakan polimer molekul-molekul monosakarida yang berupa

rantai lurus dan bercabang. Polisakarida dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim

tertentu dan diantaranya dihasilkan oligosakarida. Pada bahan makanan ada dua

macam polisakarida yaitu polisakarida yang berfungsi sebagai penguat tekstur

(struktural) seperti selulosa, hemiselulosa, pektin dan lignin atau yang disebut

serat, dan polisakarida sumber energi seperti pati, dekstrin, glikogen dan fruktan

(Winarno, 1997).

Hidrolisis

Pemecahan ikatan glikosida melibatkan penambahan air dinamakan proses

hidrolisis. Peristiwa ini dapat dilakukan dengan memanaskan polisakarida dalam

air dan/atau asam kuat. Enzim mengkatalisis reaksi hidrolitik yang sama dalam

larutan normal tanpa kondisi ekstrim.

Kontrol dalam Percobaan

Sebuah kontrol positif atau negatif dalam prosedur percobaan dibuat dalam

rangka untuk memastikan bahwa hasil percobaan diperoleh bukan karena:

- Kesalahan sistematik

- Kesalahan eksperimental

Dalam kontrol positif, sebuah efektor positif meliputi variasi uji, termasuk di

dalamnya. Sedangkan pada kontrol negatif, variasi uji tidak termasuk didalamnya

dan diharapkan hasil bersifat negatif.

III. Prosedur

III.1 Alat

Tabung reaksi

Rak Tabung Reaksi

Tusukan gigi (1 pack)

Pipet pasteur

Boiling water bath

22

III.2 Bahan

Saliva

1M glukosa

0,5% pati

Larutan Benedict

6M HCl

5M NaOH

Na2CO3


Bagian I

1. Ambil saliva pada beaker yang telah disediakan.

2. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label A, B, C, dan D,

3. Isi keempat tabung reaksi tersebut dengan komposisi masing-masing tabung

adalah sebagai berikut:

- Tabung A: 15 ml H2O + 30 tetes saliva

- Tabung B: 30 tetes saliva + 15 ml pati

- Tabung C: 15 ml H2O + 30 tetes pati

- Tabung D: 15 ml pati + amilase

4. Inkubasi keempat tabung tersebut pada suhu 37oC dalam jangka waktu 1 jam.

5. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict (setelah 1 jam).

6. Panaskan selama 5 menit pada boiling water bath.

7. Observasi dan catat perubahan warna yang terjadi.

Bagian II

1. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label E, F, G, dan H.

2. Isi keempat tabung dengan komposisi masing-masing tabung adalah sebagai

berikut:

- Tabung E: 15 ml H2O

- Tabung F: 15 ml larutan pati

- Tabung G: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian yang

cukup kecil + 15 ml H2O

- Tabung H: 15 ml larutan glukosa

3. Panaskan keempat tabung tersebut dalam boiling water bath selama 15 menit

dan kemudian biarkan dingin

4. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict pada semua tabung

5. Catat warnanya

6. Panaskan dalam boiling water bath selama 5 menit

7. Catat warnanya

Bagian III

1. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label I, J, K, dan L.

2. Isi keempat tabung reaksi dengan komposisi sebagai berikut:

- Tabung I: 15 ml H2O + 10 ml 5N HCl

- Tabung J: 15 ml larutan pati + 10 ml 5N HCl (*)

- Tabung K: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian kecil +

10 ml 5N HCl

- Tabung L: 15 ml larutan glukosa + 10 ml 5N HCl

3. Panaskan dalam boiling water bath selama 15 menit dan kemudian dinginkan

23

4. Tambahkan Na2CO3 secara bertahap, sampai pembentukan gelembung

berhenti

5. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict

6. Panaskan dalam boiling water bath selama 5 menit

7. Catat warnanya

(* ) PERHATIAN! Praktikan seharusnya selalu menambahkan asam ke

dalam air, bukan air ke dalam asam.

(**) PERHATIAN! Letakkan mulut tabung cukup jauh dari praktikan

(***) PERHATIAN! Jangan tambahkan NaOH terlalu banyak, karena reaksi

terjadi sangat cepat.

IV. Potensi Bahaya



2 Rak Tabung Reaksi Patah

3 Tusukan Gigi Tertusuk

4 Pipet Pasteur Pecah

5 Boiling Water Bath Meledak/Terpapar tubuh


1 Saliva Dapat menularkan penyakit.

2 Larutan benedict Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.



3 Asam Klorida (HCl) Sangat korosif dan toksik.

Dapat menyebabkan iritasi bila terkontak dengan mata

atau terhirup.

4 Natrium Hidroksida

(NaOH)

Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

5 Natrium Karbonat

(Na2CO3)





jangka panjang.


V. Pertanyaan

1. Untuk masing-masing bagian dalam percobaan, tentukan dan terangkan,

manakah yang merupakan tabung kontrol negatif, tabung kontrol positif, dan

tabung uji!

2. Apakah kandungan dari larutan Benedict? Reaksi apakah yang terjadi di

dalamnya?

24

3. Mengapa tabung reaksi perlu untuk dipanaskan setelah penambahan larutan

Benedict? Jelaskan!

4. Mengapa glukosa disebut juga reducing sugar/ gula pengurang?

5. Untuk bagian I, apa yang dapat anda simpulkan terkait saliva? Apa yang anda

harapkan untuk menjadi hasil, jika anda menggunakan tusukan gigi dan juga

larutan pati dalam percobaan?

6. Tuliskan reaksi yang merupakan hasil dari pembentukan gelembung ketika

Na2CO3 ditambahkan dalam percobaan. Mengapa reaksi ini dibutuhkan?

Jelaskan!

7. Gambarkan struktur dari:

a. Glukosa

b. Ikatan glikosida pada pati dan Selulosa

c. Reaksi hidrolisis


Bagian I


Pengamatan

Perubahan

Warna

1 Tabung A: 15 ml H2O + 30 tetes saliva

2 Tabung B: 30 tetes saliva + 15 ml pati

3 Tabung C: 15 ml H2O + 30 tetes pati

4 Tabung D: 15 ml pati + amilase

Bagian II

No. Data yang diambil

Perubahan

warna

setelah

ditambahkan

larutan

benedict

Perubahan

warna

setelah

dipanaskan

1 Tabung E: 15 ml H2O

2 Tabung F: 15 ml larutan pati

3

Tabung G: 1 tusukan gigi yang telah

dipecah menjadi bagian-bagian yang

cukup kecil + 15 ml H2O

4 Tabung H: 15 ml larutan glukosa

Bagian III

No. Data yang diambil

Perubahan

Warna

1 Tabung I: 15 ml H2O + 10 ml 5N HCl

2 Tabung J: 15 ml larutan pati + 10 ml 5N HCl

3 Tabung K: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi

bagian-bagian kecil + 10 ml 5N HCl

4 Tabung L: 15 ml larutan glukosa + 10 ml 5N HCl

VII. Daftar Pustaka

25

Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem.,2008. Cell

Biology Lab Manual. Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici

University, Istanbul.

Winarno, F.G., 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Cet. ke-8. P. T. Gramedia Pustaka

Utama, Jakarta.

26

MODUL 3

EKSTRAKSI MINYAK DAN IDENTIFIKASI LIPID DAN ASAM LEMAK

I. Tujuan Percobaan

- Melakukan ekstraksi lipid dan melakukan analisa kelarutan dan kejenuhan lemak

- Menentukan jumlah asam lemak bebas yang terkandung dalam minyak goreng

II. Pendahuluan

Trigliserida, salah satu jenis lipida, adalah ester dari gliserol alkohol dan asam

karboksilat rantai panjang.

H2C O C R

O

HC O C

O

R'

H2C O C

O

R''

Trigliserida mengandung asam dengan 8 sampai 12 karbon atom dan terdiri

dari campuran beberapa jenis asam yang berbeda. Jika sebagian besar asam tersebut

tidak jenuh, maka gliserida tersebut berupa cairan dan diklasifikasikan sebagai

minyak. Gliserida yang mengandung asam jenuh yang lebih banyak memiliki titik

leleh yang lebih tinggi dan diklasifikasikan sebagai lemak.

Hidrolisis lemak atau minyak dengan basa untuk menghasilkan gliserol dan

garam dari asamnya dikenal sebagai proses saponifikasi. Sabun adalah garam-garam

dari asam karboksilat berantai panjang. Garam sodium dan potasium larut dalam air,

sedangkan garam dari magnesium, kalsium, dan besi tidak terlarut dalam air.

H2C O C R

O

HC O C

O

R'

H2C O C

O

R''

+ 3 NaOH

CH2OH

CHOH

CH2OH

+

RCO2Na

R'CO2Na

R''CO2Na

Deterjen adalah garam dari aryl sulfonates atau alkyl sulfates.

27

Ar SO3-Na

+

Sodium aryl sulfonate

R OSO3-Na

+

Sodium alkyl sulfate

Karena garam kalsium dari aryl sulfonate dan alyl sulfate terlarut dalam air,

deterjen bisa digunakan dalam air keras, sedangkan sabun akan membentuk

presipitant tidak terlarut.

Setiap tahunnya, orang Amerika menggunakan jutaan kilogram deterjen untuk

mencuci pakaian dan perlatan lainnya. Hampir setiap gram dari deterjen tersebut

mengalir ke danau maupun sungai. Kebanyakan produk laundry mengandung

phospate yang apabila sudah berada dalam perairan, akan menyuburkan pertumbuhan

algae. Phosphate bertindak sebagai pupuk bagi alga dalam bentuk seperti ketika

phosphate menyuburkan tanaman atau rumput di kebun. Alga mengonsumsi oksigen

yang terlarut dalam air dalam jumlah banyak. Konsentrasi dari oksigen terlarut yang

berkurang menyulitkan ikan-ikan atau hewan air lain, sehingga menganggu

keseimbangan ekosistem.

Pada percobaan ini, deterjen komersial diujicobakan untuk mengetahui

keberadaan kandungan phosphate di dalamnya. Dasar dari percobaan ini adalah reaksi

kimia antara anion phosphate anion molybdate dalam larutan asam.

12Mo7O246-

+ 7 PO43-

+ 72 H+ 7 PMo12O40

3- + 36 H2O (3.1)

Larutan ammonium molybdate, (NH4)6Mo7O24, ditambahkan pada sampel

terdahulu yang bersifat asam. Jika sampel tersebut mengandung anion phospate,

presipitat ammonium phosphomolybdate (NH4)3PMo12O40 yang terpisah dengan baik

dan berwarna kuning terang akan terbentuk.

Pada percobaan ini, praktikan diminta untuk membawa sendiri sedikit sampel

dari deterjen cair ataupun bubuk. Pastikan sudah mengecek labelnya untuk

menentukan bahwa apakah produk tersebut mengandung phospate. Ujicoba dilakukan

tukaran dengan praktikan yang lain untuk mengetahui kandungan phospate.

III. Prosedur

III.1 Alat

Tabung reaksi 16x150 mm

Tabung reaksi 10x75 mm

Peraltan refluks

Pipet tetes

Glass stirring rod

Gelas Beaker

III.2 Bahan

Minyak biji kapas

Heksana

Karbon tetraklorida

Larutan 5% bromin dalam karbon tetraklorida

28

etanol 95%

Larutan NaOH

Larutan HCl konsentrasi tinggi

Kalsium klorida 0.1M

Magnesium klorida 0.1M

Besi (III) klorida 0.1M

Larutan ammonium molybdate 0.2 M

Asam nitrat 6M

Kertas lakmus atau kertas penguji pH

Minyak mineral.


Ekstraksi Minyak

Menentukan Kelarutan Minyak

1. Masukkan masing-masing 0.5ml (sekitar 10 tetes) minyak biji kapas ke

empat buah tabung reaksi 16x150 mm.

2. Tambahkan 1ml air ke tabung pertama, 1ml etanol ke tabung kedua, 1ml

heksana ke tabung ketiga dan 1ml karbon tetraklorida ke tabung keempat.

3. Kocoklah tabung-tabung reaksi tersebut, catatlah kelarutan dari masing-

masing larutan dalam tabung reaksi.

4. Tambahkan maing-masing 5 ml pelarut tambahan

5. Kocoklah dengan kencang masing-masing tabung, amatilah apakah

minyaknya terlarut sekarang.


Identifikasi Lipid

Menentukan Ketakjenuhan Trigliserida

1. Gunakanlah 2ml dari larutan antara karbon tetraklorida dan minyak biji kapas

yang dipraktekkan dalam percobaan A untuk percobaan ini.

2. Tambahkan tetes demi tetes larutan bromin 5% dalam karbon tetraklorida.

3. Hitunglah jumlah tetesan yang diperlukan untuk menghasilkan efek warna

bromin terhadap larutan tersebut.

4. Larutkan 0.1 g crisco ke dalam 1ml karbon tetraklorida.

5. Ulangi langkah 2 dan 3.


Identifikasi Asam Lemak

Menentukan Jumlah Asam Lemak

1. Buat larutan KOH dalam etanol 0.1 N dalam labu 100 mL. Titrasi dengan

larutan HCl 0,1 N.

2. Buat campuran benzena dan etanol dengan perbandingan 1:1 dalam

erlenmeyer, kemudian masukan erlenmeyer ini ke dalam air panas sambil

digoyang-goyang, sampai campuran menjadi homogen.

3. Titrasi larutan (benzena + etanol) dengan KOH 0,1 N hingga larutan berubah

warna dari bening jadi ungu.

4. Sementara itu, timbanglah 1 g minyak goreng dalam erlenmeyer.

5. Campurkan larutan hasil titrasi dengan minyak goreng, kemudian teruskan

titrasi sampai terbentuk warna merah.

29

6. Catat volume titran yang ditambahkan.

Maka dapat dihitung nilai asam (acid value) dari minyak goreng dengan:

W

N * T * (56.11) KOH BMASAM NILAI (3.2)

dengan:

T = volume titran KOH yang ditambahkan pada titrasi CPO

N = normalitas KOH

W = berat sampel CPO yang dititrasi

IV. Potensi Bahaya



2 Peralatan refluks Pecah/meledak

3 Pipet Tetes Pecah

4 Glass stirring rod Pecah

5 Gelas Beaker Pecah


1 Minyak biji kapas Dapat tertelan.

2 Heksana Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

3 Karbon tertraklorida Iritasi bila terkena mata dan kulit

Bahaya bila tertelan dan terhirup

4 NaOH Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

5 HCl Sangat korosif dan toksik.

Dapat menyebabkan iritasi bila terkontak dengan mata

atau terhirup.

6 Kalsium klorida Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila

terhirup.

Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan

ringan bila tertelan.

30

Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan.

Dapat menyebabkan abrasi mekanis atau luka bakar pada

mata dari panas iritasi hidrolisis dan klorida.

7 Magnesium klorida Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila

terhirup.




Dapat menyebabkan iritasi pada mata.

8 Besi (III) klorida Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan

yang mudah terbakar.

Dapat mengakibatkan luka bakar.

Dapat menyebabkan efek merugikan jangka panjang

dalam lingkungan air.

Sangat beracun untuk organisme air.

9 Larutan amonium

molybdate

Oksidator kuat.

Dapat menyebabkan mata dan kulit terbakar.

Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan


Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila

terhirup.



10 Asam nitrat Bersifat korosif.

Dapat menyebabkan mata dan kulit terbakar.

Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan


Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila

terhirup.



11 Minyak mineral Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila

terhirup.



V. Pertanyaan

1. Dari semua pelarut yang dicobakan, manakah pelarut paling bagus untuk

menghilangkan noda minyak atau lemak dari pakaian ?

2. Berapa gramkah bromin yang diperlukan untuk bereaksi secara sempurna dengan

1mol trigliserida yang mengandung hanya asam oleic?


Ekstraksi Minyak

No. Data yang diambil Kelarutan

1 0,5 ml minyak biji kapas + air

2 0,5 ml minyak biji kapas + etanol

3 0,5 ml minyak biji kapas + heksana

31

4 0,5 ml minyak biji kapas + karbon tetraklorida

Identifikasi Lipid


Pengamatan

Jumlah

Tetesan

5% bromin

dalam

karbon

tetraklorida

1

2 ml larutan karbon tetraklorida + karbon

tetraklorida (hasil dari percobaan A) + 5%

bromin dalam karbon tetraklorida

2

0,1 g crisco dalam 1 ml karbon

tetraklorida + 5% bromin dalam karbon

tetraklorida

Identifikasi Asam Lemak

No. Data yang diambil Volume

titran

1 Larutan KOH dalam etanol 0,1 N

2 Campuran benzena dan etanol

3 Campuran larutan 1 dan 2 + 1 g minyak goreng

VII. Daftar Pustaka

Modul Praktikum Kimia Organik Departemen Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia

2006.

Fessenden, Ralph J., and Fassenden, Joans S., 1982, Organic Chemistry, 2nd

ed., Williard

Grant Press/PWS Publisher, Masachusetts, USA.

32

MODUL 4

EKSTRAKSI DNA DARI KACANG HIJAU

I. Tujuan Percobaan

- Mengisolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) dari kacang hijau (bovine spleen)

II. Teori

DNA (Deoxyribo Nuceic Acid)

DNA adalah akronim dari Deoxyribo Nucleic Acid yang bila diterjemahkan

kedalam bahasa Indonesia berarti Asam Deoksiribo Nukleat. DNA merupakan

senyawa kimia yang terdapat di dalam inti sel yang sangat berperan pada proses

sintesis protein untuk pembentukan enzim, dan protein lain.

Pada tahun 1953, Francis H.C Crick dan James D. Watson, berdasarkan analisis

foto difraksi sinar X, menggambarkan struktur DNA sebagai tangga tali terpilin dan

disebut “Double Helix” (heliks ganda). Ibu tangganya terdiri atas rentetan rantai

gugus gula deoksiribosa dan gugus fosfat, sedangkan anak tangganya terdiri atas basa

nitrogen, yaitu Purin terdiri atas Adenin(A) dan Guanin (G); serta Pirimidin terdiri

atas Sitosin (S) dan Timin (T).

Basa-basa nitrogen yang menyusun anak tangga tersebut dihubungkan oleh ikatan

hidrogen yang sifat ikatannya lemah. Setiap anak tangga terdiri atas pasangan basa

nitrogen yang khas, yaitu Adenin (A) dengan Timin (T), Sitosin (S) dengan Guanin

(G). Atas penemuan mereka mengenai struktur model DNA tersebut, pada 1962,

Crick dan Watson menerima hadiah Nobel. Crick dan Watson menyimpulkan bahwa

tatanan nukleotida merupakan perangkat kode instruksi pembangunan seluruh

organisme.

Fungsi DNA

DNA berfungsi menyampaikan informasi genetika dari induk ke generasi

berikutnya dan mengatur perkembangan metabolisme tubuh. Dengan demikian, dapat

dikatakan bahwa DNA adalah gen itu sendiri. DNA dapat juga mengawasi aktivitas-

aktivitas sel dengan memerintahkan pembentukan semua macam protein (enzim) di

dalam sel. DNA berada di dalam inti sel dan pada umumnya pembentukan protein

terjadi pada ribosom, yaitu pada sitoplasma. Sehingga, informasi yang ada pada DNA

harus diterjemahkan dahulu oleh suatu senyawa tertentu dan dibawa oleh senyawa

tersebut dari inti ke sitoplasma. DNA akan membentuk senyawa lain dalam

menyampaikan informasi genetik yang akan memerintahkan sintesis protein.

Senyawasenyawa yang dibentuk oleh DNA, yaitu RNA duta, RNA transfer, dan RNA

ribosom.

Ektraksi DNA

Ekstraksi DNA adalah sebuah prosedur rutin yang dilakukan untuk mendapatkan dan

mengumpulkan DNA untuk molekuler subsekuen atau analisis forensik.

33

DNA diekstraksi dari sel-sel yang ada pada manusia untuk berbagai alasan. Dengan

sampel murni berupa DNA, anda dapa menguji bayi yang baru lahir untuk penyakit

genetik, menganalisis pembuktian forensik, atau mempelajari gen yang terlibat dala

kanker. Secara garis besar, tahapan untuk ekstraksi DNA adalah sebagai berikut:

1. Buka sel dengan cara dipecah/ cacah untuk menampakkan DNA

2. Hilangkan lemak membran dengan penambahan deterjen

3. Presipitasi DNA dengan alkohol. Adapun jenis alkohol yang digunakan adalah

etanol atau isopropanol (70-95%). Karena DNA tidak terlarut pada alkohol jenis

tersebut, DNA akan teragregasi secara bersama-sama, denga pemberian pellet saat

proses sentrifugasi. Tahapan ini juga berguna untuk menghilangkan garam yang

larut dalam alkohol (alcohol-soluble salt).

III. Prosedur

III.1 Alat

Blender

Saringan

Tabung reaksi

Rak tabung reaksi

Batang lidi/ kayu

Gelas beaker

Wadah

UV Spektroskopi

III.2 Bahan

Kacang hijau

Garam/ NaCl

Air dingin

Deterjen cair

Enzim (Dapat berupa pelunak daging (meat tenderizer), jus nanas, atau

larutan pembersih lensa kontak)

Alkohol 70-95% (Etanol atau Isopropanol)

DNA Standar


Secara garis besar, tahapan untuk ekstraksi DNA adalah sebagai berikut:

1. Buka sel dengan cara dipecah/ cacah untuk menampakkan DNA

2. Hilangkan lemak membran dengan penambahan deterjen

3. Presipitasi DNA dengan alkohol. Adapun jenis alkohol yang digunakan adalah

etanol atau isopropanol (70-95%). Karena DNA tidak terlarut pada alkohol

jenis tersebut, DNA akan teragregasi secara bersama-sama, denga pemberian

pellet saat proses sentrifugasi. Tahapan ini juga berguna untuk menghilangkan

garam yang larut dalam alkohol (alcohol-soluble salt).

Adapun proses detail untuk percoban ini adalah sebagai berikut:

1. Siapkan alat dan bahan yang telah ditentukan sebelumnya

2. Masukkan ½ cup kacang hijau (100 ml) dalam blender

34

3. Masukkan sejumput garam (kurang dari 1/8 sendok teh, kurang dari 1 ml)

dalam blender

4. Masukkan air dingin sebanyak 2 (dua) kali lebih banyak dari jumlah kacang

hijau yang sebelumnya sudah dimasukkan dalam blender (kira-kira 1 cup, 200

ml)

5. Blender kesemuanya dengan kecepatan tinggi selama 15 detik

Gambar 4.1 Ilustrasi proses blending

(Sumber: http://learn.genetics.utah.edu, 2008)

6. Blender memisahkan sel dari kacang hijau dari beberapa komponen di

dalamnya, sehingga setelah selesai di-blender, praktikan akan mendapatkan

sel kacang hijau dalam bentuk menyerupai soup.

7. Tuangkan soup sel kacang hijau hasil blender tersebut melalui saringan ke

dalam wadah yang lain, seperti gambar berikut ini.

Gambar 4.2 Ilustrasi proses penyaringan


8. Tambahkan sekitar 2 (dua) sendok makan deterjen cair (kira-kira) 30 ml ke

dalam soup sel kacang hijau hasil saringan.

9. Aduk sehingga membentuk sebuah campuran

10. Biarkan campuran tersebut selama 5-10 menit

11. Tuang campuran ke dalam tabung reaksi, masing-masing sekitar 1/3 volume

maksimal tabung reaksi

12. Tambahkan sedikit enzim (enzim yang digunakan dapat berasal dari pelunak

daging (meat tenderizer), jus nanas, atau larutan pembersih lensa kontak)

pada masing-masing tabung reaksi

13. Aduk perlahan (Hati-hati! Jika anda mengaduk terlalu kencang/ keras, secara

otomatis anda akan merusak DNA dalam campuran tersebut)

14. Miringkan tabung reaksi tersebut dan secara perlahan-lahan tuangkan alkohol

ke dalam tabung reaksi, seperti gambar berikut ini.

35

Gambar 4.3 Ilustrasi proses penambahan alkohol


15. Tuangkan alkohol (70-95%) kesamping, sehingga membentuk lapisan di atas

campuran kacang hijau

16. Tuang hingga didapati jumlah lapisan alkohol yang sama dalam tabung

dengan campuran kacang hijau

17. Kemudian amati bahwa DNA akan naik ke lapisan alkohol dari lapisan

campuran kacang hijau

18. Gunakan lidi/ batang kayu tipis untuk mendapatkan DNA yang naik ke

lapisan alkohol, seperti gambar di bawah ini

Gambar 4.4 Ilustrasi proses pengambilan ekstrak DNA


19. Jika anda ingin menyimpan dan meneliti DNA tersebut, anda dapat

memindahkannya ke dalam wadah berukuran kecil yang berisi alkohol.

20. Analisis DNA menggunakan kurva standar dari DNA standar.

IV. Potensi Bahaya


1 Blender Meledak/terbakar

2 Tabung reaksi Meledak/pecah

3 Rak tabung reaksi Patah

4 Batang lidi/kayu Tertusuk

36


6 UV Spektroskopi Meledak/terbakar


1 Kacang hijau Dapat tertelan/tersedak.

2 Garam/NaCl Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila

terhirup.




Dapat menyebabkan iritasi bila terkena mata.

3 Deterjen cair Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


4 Alkohol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

V. Pertanyaan

1. Mengapa kacang hijau digunakan dalam percobaan ini? Apakah kacang hijau

merupakan sumber DNA terbaik? Jelaskan alasan anda!

2. Apakah fungsi dan tujuan penambahan garam dan deterjen pada percobaan

ini?

3. Mengapa air dingin lebih baik dibandingkan dengan air hangat dalam

mengekstraksi DNA? Jelaskan!

4. Bagaimanakah sel dinding dari sel tumbuhan dapat dicacah/ pecah?

5. Jenis enzim apakah yang ditemukan di dalam pelunak daging/ jus nanas/

larutan pembersih lensa kontak?

6. Apakah yang dapat anda lakukan untuk meningkatkan hasil DNA dalam

percobaan ini?

7. Mengapa DNA menggumpal secara bersama-sama? Jelaskan!

8. Bagaimana anda dapat mengkonfirmasi bahwa gumpalan putih berserabut

yang menempel pada lidi/ batang kayu tersebut adalah DNA?

9. Apakah mungkin bahwa gumpalan putih berserabut tersebut adalah campuran

DNA dan RNA?

10. Berapa lama daya tahan DNA? Akankah kuantitas DNA menurun dan

menghilang? Jelaskan!

11. Dapatkah anda mengekstrak DNA manusia menggunakan prosedur percobaan

ini?

12. Dapatkah anda menggunakan mikroskop untuk melihat DNA yang anda

ekstrak dalam percobaan ini?


37

No. Data yang diambil Absorbansi

1 DNA Standar

2 DNA kacang hijau

VII. Daftar Pustaka

Genetic Science Learning Center Team, 2008. How to Extract DNA from Anything

Living

(http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/DNA_Extraction.pdf).

Genetic Science Learning Center, Utah.

K. Murray, Robert, dkk. 2003. Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC,

Jakarta.

Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem.,2008. Cell

Biology Lab Manual. Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici

University, Istanbul.

38

MODUL 5

EKSTRAKSI DAN KUANTIFIKASI PROTEIN DARI SUMBER MAKANAN

I. Tujuan:

Menentukan konsentrasi protein dari suatu sample yang tidak diketahui

II. Teori

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang

merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama

lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen,

nitrogen dan kadang sulfur serta fosfor. Protein merupakan salah satu bio-makromolekul

yang penting perananya dalam makhluk hidup. Setiap sel dalam tubuh kita mengandung

protein, termasuk kulit, tulang, otot, kuku, rambut, air liur, darah, hormon, dan enzim.

Fungsi dari protein itu sendiri secara garis besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok

besar, yaitu sebagai bahan struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat

molekular. Beberapa protein struktural, fibrous protein, berfungsi sebagai pelindung,

sebagai contoh a dan b-keratin yang terdapat pada kulit, rambut, dan kuku. Sedangkan

protein struktural lain ada juga yang berfungsi sebagai perekat, seperti kolagen. Protein

dapat memerankan fungsi sebagai bahan struktural karena seperti halnya polimer lain,

protein memiliki rantai yang panjang dan juga dapat mengalami cross-linking dan lain-

lain. Selain itu protein juga dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia

dalam sistem makhluk hidup. Makromolekul ini mengendalikan jalur dan waktu

metabolisme yang kompleks untuk menjaga kelangsungan hidup suatu organisma. Suatu

sistem metabolisme akan terganggu apabila biokatalis yang berperan di dalamnya

mengalami kerusakan.

1. Tahap utama sintesis protein

Tahap 1 : Aktivasi asam amino

Tahap ini terjadi di sitosol, bukan pada ribosom. Masing- masing dari 20 asam

amino diikat secara kovalen dengan suatu RNA pemindah spesifik dengan

memanfaatkan energi ATP. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim pengaktif yang

memerlukan Mg2+

sebagai kofaktor yang masing- masing spesifik bagi satu asam

amino dan bagi tRNA-nya.

39

Tahap 2 : Inisiasi Rantai Polipeptida

RNA pembawa pesan yang membawa sandi bagi polipeptida yang akan

dibentuk diikat oleh subunit ribosom yang berukuran lebih kecil, diikuti oleh inisiasi

asam amino yang diikat oleh tRNA-nya membentuk suatu kompleks inisiasi. tRNA

asam amino penginisiasi ini berpasangan dengan triplet nukleutida spesfik atau kodon

pada mRNA yang menyandi permulaan rantai polipeptida. Dalam proses ini

memerlukan guanosin trifosfat (GTP), dilangsungkan oleh tiga protein sitosol spesifik

yang dinamakan faktor inisiasi.

Tahap 3 : Pemanjangan

Rantai polipeptida diperpanjang oleh pengikatan kovalen unit asam amino

berturut-turut, masing-masing diangkut menuju ribosom dan diletakkan ke tempatnya

secara benar oleh tRNA masing-masing, yang berpasangan dengan kodonnya pada

molekul RNA pembawa pesan. Pemanjangan digiatkan oleh protein sitosol yang

dinamakan faktor pemanjangan. Energi yang diperlukan untuk mengikat setiap

aminoasil t-RNA yang datang dan untuk pergerakan ribosom disepanjang RNA

pembawa pesan satu kodon diperoleh dari hidrolisis dua molekul GTP bagi setiap

residu yang ditambahkan ke polipeptida yang sedang tumbuh. Terdapat 3 faktor

penunjang yaitu Tu, Ts, dan G.

Tahap 4 : Terminasi dan pembebasan

Terminasi polipeptida didisyaratkan oleh satu diantara tiga triplet terminasi

(UAA, UAG, dan UGA) dimana triplet tersebut tidak menyandi asam amino

manapun. Sekali ribosom mencapai kodon terminasi, ada tiga faktor pengakhir

(terminasi) atau faktor pembebas, yaitu protein R1, R2, dan S, yang kemudian turut

menyebabkan (1) penguraian hidrolitik polipeptida dari ujung tRNA terakhir dan

melepaskannya dalam bebtuk bebas, (2) pelepasan tRNA terakhir yang sekarang

kosong dari tempat P, dan (3) dissosiasi ribosom 70S menjadi subunit 30S dan 50S

nya siap untuk memulai rantai polipeptida yang baru.

Tahap 5 : pelipatan dan pengolahan

Untuk memperoleh bentuk aktifnya secara biologis, polipeptida harus

mengalami pelipatan menjadi konfirmasi tiga dimensi yang benar. Sebelum dan

sesudah pelipatan, polipeptida baru dapat mengalami pengolahan oleh kerja enzimatik

untuk melepaskan asam amino penginisiasi, dan mengikat gugus fosfat, metil,

karboksil atau gugus lain pada residu asam amino tertentu, atau untuk mengikat gugus

40

oligosakarida atau gugus prostetik. Perubahan yang terjadi tersebut dinamakan

modifikasi pasca translasi, dimana pengolahannya bergantung pada proteinnya.

2. Struktur protein

Suatu asam amino-α terdiri atas:

1. Atom C α. Disebut α karena bersebelahan

dengan gugus karboksil (asam).

2. Atom H yang terikat pada atom C α.

3. Gugus karboksil yang terikat pada atom C α.

4. Gugus amino yang terikat pada atom C α.

5. Gugus R yang juga terikat pada atom C α.

Ada 4 tingkat struktur protein yaitu struktur primer, struktur sekunder, struktur

tersier dan struktur kuartener.

a. Struktur primer

Struktur primer adalah urutan asam-asam

amino yang membentuk rantai polipeptida.

Struktur primer protein bisa ditentukan dengan

beberapa metode: (1) hidrolisis protein dengan

asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian

komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid analyzer, (2)

analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3)

kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan

massa molekular dengan spektrometri massa.

b. Struktur sekunder

Struktur sekunder protein bersifat reguler, pola lipatan berulang dari rangka

protein. Pada struktur sekunder, protein sudah mengalami interaksi intermolekul,

melalui rantai samping asam amino. Analisa defraksi sinar-X merupakan cara

yang baik untuk mempelajari struktur sekunder protein serabut.

Kekuatan yang menstabilkan struktur protein

Beberapa interaksi nonkovalen yang

secara individual lemah, namun secara numerik cukup kuat menstabilkan

41

konformasi protein. Kekuatan ini mencakup iktan hidrogen, interaksi hidrofobik,

interaksi elektrostatik dan kekuatan van der Walls.

1. Ikatan hidrogen

Residu dengan gugus polar R umumnya terdapat pada permukaan protein

globuler, dimana residu tersebut membentuk ikatan hidrogen terutama dengan

molekul air. Di bagian lain, residu aminoasil pada tulang punggung membentuk

ikatan hidrogen antara satu dgn yang lain.

2. Interaksi hidrofobik

Interaksi ini meliputi gugus nonpolar R pada residu aminoasil yang dalam

protein globular thipikal berada dalam bagian interior protein. Pembentukan

interaksi ini digerakkan secara entropis. Keseluruhan bentuk yang sferis kasar

mengurangi daerah permukaan. Konsentrasi residu nonpolar dalam bagian interor

protein menirinkan jumlah residu permukaan dan memaksimalkan peluang bagi

lapisan tipis molekul air permukaaan untuk membentuk ikatan hidrogen antara

satu dengan yang lainnya yaitu suatu proses yang berkaitan dengan peningkatan

entropi. Berkebalikan, lingkungan nonpolar membran biologik lebih memberikan

peluang bagi residu permukaaan yang hidrofobik yang gugus nonpolar R nya

berpartisipasi dalam interaksi hidrofobik dengan rantai samping akil ester asil

lemak pada lapisan ganda membran.

3. Interaksi elektrostatik

Interaksi elektrostatik atau ikatan garam dibentuk antar gugus yang muatannya

berlawanan seperti gugus terminal amino dan karboksil pada peptida dan gugus R

bermuatan pada residu polar aminoasil. Gugus polar spesifik yang melakukan

fungsi biologis yang esensial dapat terletak dalam celah yang menembus bagian

interior protein. Karena residu polar dapat pula berpartisipasi dalam interaksi

ionik, maka keberadaan garam seperti KCL dapat menurunkan secara bermakna

interaksi ionik antar residu permukaan.

4. Interaksi van der Walls

Kekuatan van der Wall bersifat sangat lemah serta bekerja hanya pada jarak

yang amat pendek mencakup komponen yang menarik dan yang menolak.

Kekuatan yang menarik (attractive force) meliputi interaksi antar sifat bipoler

yang terbentuk oleh fluktuasi monomer distribusi elektron pada atom didekatnya.

Kekuatan yang menolak (repulsive pulse) turut berperan ketika dua buah atom

datang begitu dekat sehingga orbit elektronnya saling tumpang tindih. Jarak

42

dimana kekuatan yang menarik bekerja maksimal dan kekuatan yang menolak

minimal disebut jarak kontak van der Walls.

Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi oleh ikatan hidrogen antar

rantai samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan

hidrogennya. Dua pola terbanyak adalah alpha helix dan beta sheet . b-sheet itu

sendiri ada yang paralel dan juga ada yang anti-paralel, bergantung pada orientasi

kedua rantai polipeptida yang membentuk struktur sekunder tersebut. Struktur

sekunder bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi circular dichroism

(CD) dan Fourier Transform Infra Red (FTIR). Spektrum CD dari puntiran-alfa

menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta

menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi dari komposisi

struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada spektrum

FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I

dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa

diestimasi dari spektrum inframerah.

c. Struktur tersier

Struktur tersier terbentuk karena terjadinya perlipatan (folding) rantai α-helix,

konformasi β, maupun gulungan rambang suatu polipeptida, membentuk globular,

yang struktur tiga dimensiny lebih rumit daripada protein tersebut. Interaksi intra

molekuler seperti ikatan hidrogen, ikatan ion, van der Waals, hidropobik turut

menentukan orientasi struktur 3 dimensi dari protein. Beberapa protein telah dapat

ditentukan struktur tersiernya, misalnya hemoglobin, mioglobin, lisozim,

ribonulease dan kimo tripsinogen. Sebagai contoh, struktur tersier enzim sering

padat, berbentuk globuler.

43

Struktur tersier dari protein enzim triosa fosfat isomerase (TPI)

d. Struktur kuartener

Beberapa protein tersusun atas lebih dari satu rantai polipeptida. Struktur

kuartener menggambarkan subunit-subunit yang berbeda dipak bersama-sama

membentuk struktur protein. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara

fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer,

trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener. Kemantapan struktur

kuartener suatu protein oligomer disebabkan oleh interaksi dan ikatan non-

kovalen yang lemah antara masing-masing sub bagiannya. Kemampuan untuk

berhimpun diri daripada beberapa sub bagian ini merupakan ciri struktur

kuartener suatu protein oligomer. Sebagian besar protein oligomer mengalami

disidiasi pada pH tinggi atau rendah, juga bila ditempatkan dalam larutan urea

atau garam berkonsentrasi tinggi. Dalam proses denaturasi ini, protein oligomer

mengalami dua proses bertingkat, yaitu :

1. Disosiasirantai polipeptida yang satu dengan yang lainnya

2. Merenggangnya satuan rantai polipeptida

Struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin. Sebagai

contoh adalah molekul hemoglobin manusia yang tersusun atas 4 subunit, yang

akan berdisosiasi pada proses pengenceran. Masing-masing sub bagian terdiri atas

dua rantai polipeptida, α dan β.

44

Struktur hemoglobin yang merupakan struktur kuartener protein

3. Percobaan berdasarkan reaksi warna:

a. Percobaan kadar-N

Kapur natron, yaitu campuran NaOH dan Ca(OH)2 dalam tabung reaksi dengan

larutan protein dipanaskan. Keluarlah Amoniak dan Amina.Lakmus merah yang

dibasahi menjadi biru.

b. Reaksi Xantoprotein

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein.

Setelah dicampur terjadi pengendapan putih yang dapat berubah menjadikuning

apabila dipanaskan.. reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti Benzen yang terdapata

pada molekul protein. Jadi, reaksi ini positif untuk protein, fenilalanin dan triptofan.

Kulit kita bila kena asam nitrat berwarna kuning, itu juga karena terjadi reaksi

xantoprotein ini.

c. Reaksi Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat,

apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan

putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini

positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus

hidroksifenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan

reaksi positif.

45

d. Reaksi Biuret

Beberapa reaksi uji terhadap protein, tes biuret merupakan salah satu cara untuk

mengidentifikasi adanya protein, dalam larutan basa biuret memberikan warna violet

dengan CuSO4 karena akan terbentuk kompleks Cu2+

dengan gugus CO dan gugus

NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Pengendapan dengan logam diketahui

bahwa protein mempunyai daya untuk menawarkan racun. Salting out, apabila

terdapat garam-garam anorganik alam presentase tinggi dalam larutan protein, maka

kelarutan protein akan berkurang, sehingga mengakibatkan pengendapan.

Pengendapan dengan alkohol, penambahan pelarut organik seperti aseton atau alkohol

akan menurunkan kelarutan protein pada kedudukan dan distribusi dari gugus hidrofil

polar dan hidrofob polar di dalam molekul hingga menghasilkan protein yang dipol

(Tim Dosen Kimia, 2011).

Pengembangan dari metode biuret adalah metode lowry. Metode lowry

merupakan teknik uji biokimia untuk mengetahui kadar total protein di dalam suatu

larutan. Total konsentrasi protein diperlihatkan melalui proporsi perubahan warna

larutan sampel dibandingkan dengan konsentrasi protein, yang dapat dihitung dengan

menggunakan teknik colorimetric. Nama Lowry sendiri diambil dari nama seorang

biochemist bernama Oliver H. Lowry yang mengembangkan reagen pada tahun 1940.

Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan

terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan

tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu,

kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate),

menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik

(rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif

yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung

pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry

adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel

protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL.

Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.

Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode

Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol,

Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam

urat, guanin, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat

diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk

46

menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan

oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau

melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Lowry et al., 1951).

Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak

dapat mengukur molekul peptida panjang (Alexander dan Griffiths, 1992). Prinsip

kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin,

triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan

fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga

dapat menyerap cahaya (Lowry et al., 1951).

III. Prosedur

III.1 Alat

Spektrofotometer

Gelas beaker

Tabung reaksi

Pipet

Mikropipet

III.2 Bahan

Tahu

Tempe

Susu

Na2CO3

N NaOH

NaK Tartrate

H2O

CuSO4.5 H2O

Folin-Phenol 2 N


1. Siapkan bahan-bahan berikut:

A. 2% Na2CO3 dalam 0.1 N NaOH

B. 1% NaK Tartrate dalam H2O

C. 0.5% CuSO4.5 H2O dalam H2O

D. 48 mL of A, 1 mL of B, 1 mL C

E. Phenol Reagent : 1 bagian Folin-Phenol [2 N] : 1 bagian air BSA

Standard - 1 mg/ mL

2. Siapkan sampel (tempe, tahu, susu) dengan 4 konsentrasi berbeda

3. Tambahkan 2 mL larutan D pada setiap tabung

4. Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang.

5. Tambahkan 0.2 mL larutan phenol reagent pada setiap tabung.

47

6. Vortex (melakukan pencampuran dengan bantuan vibrator) segera setiap

tabung tersebut dengan segera.

7. Inkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang.

8. Tentukan absorbansi setiap sample menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 600 nm.

9. Plot absorbansi vs mg protein sampel untuk mendapatkan kurva kalibrasi

standar.

10. Ambil sample dengan konsentrasi yang yang tidak diketahui dari asisten

praktikum.

11. Ukur absorbansi sampel tersebut.

12. Tentukan konsentrasinya

IV. Potensi Bahaya


1 Spektrofotometer Meledak/terbakar


3 Tabung reaksi Meledak/pecah

4 Pipet dan mikropipet Meledak/pecah


1 Natrium karbonat

(Na2CO3)





jangka panjang.


2 Natrium Hidroksida

(NaOH)





jangka panjang.


Mudah terbakar.

3 NaK Tartrate Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




5 CuSO4.5 H2O Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




6 Folin-Phenol Dapat menyebabkan gangguan fatal pada kulit jika

terpapar.



Dapat menyebabkan iritasi fatal pada mata dan kulit.

V. Pertanyaan

1. Jelaskan Prinsip kerja dari metode Lowry dalam menentukan konsentrasi protein

48

2. Jelaskan mengenai keketerbatasan metode Lowry ini



1 Tempe

2 Tahu

3 Susu

4 Sampel dengan konsentrasi yang tidak

diketahui

VII. Daftar Pustaka

Modul Praktikum Kimia Organik Departemen Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia

2006.

Budi, Setya. 2008. Struktur dan Fungsi Protein. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Universitas Sebelas Maret: Surakarta.

49

MODUL 6

PERHITUNGAN MIKROSKOPIS

I. Tujuan Percobaan

Untuk menghitung spesimen dengan menggunakan mikroskop

II. Teori

Bagian-bagian dari mikroskop cahaya

Tipe Mikroskop Cahaya

Mikroskop cahaya menggunakan cahaya tampak untuk melihat spesimen. Cahaya

tersebut akan melewati dua lensa yang akan memperbesar gambar . Sementara itu,

lensa yang ketiga berada ditempat untuk melakukan pengamatan yang dekat

dengan mata pengamatan untuk mendapatkan gambar sesungguhnya. Batas dari

mikroskop ini berhubungan dengan resolusi, iluminasi, dan keterangan. Resolusi

dapat ditingkatkan menggunakan lensa imersi, pencahayaan dan keterangan dapat

ditingkatkan dengan memodifikasi area gelap, fase terang, dan interferensi terang.

Hal-hal yang mempengaruhi kualitas mikroskop adalah sebagai berikut

Perbesaran, derajat kebesaran dari gambar dibandingkan dengan ukuran

aslinya. Perbesaran dilakukan oleh dua lensa yaitu lensa okular (8 atau 10x)

dan lensa objektif (4, 10, 100x). Total dari perbesaran adalah hasil perkalian

perbesaran kedua lensa.

Resolusi, adalah perhitungan untuk kejelasan gambar

Kemampuan untuk lihat mendetail, gambar yang diberikan dari mikroskop

dapat melihat objek secara detail.

Keterangan, adalah kemampuan untuk melihat kedetailan dari spesimen

terhadap latar belakang.

Perbesaran maksimum didapatkan dari mikroskop cahaya adalah sebesar 400 kali.

Dengan kata lain, ukuran yang dapat dilihat minimal adalah sebesar 0,2 µm. Batas

ini adalah hasil dari difraksi oleh objek saat observasi yang disebabkan oleh

interferensi cahaya oleh gambar.

Perhitungan Mikroskopis

Ukuran linear dari spesimen yang diobservasi di mikroskop diekspresikan dalam

µm bukan dari total perbesaran. Ukuran aktual dari objek yang dilihat dibawah

50

mikroskop dapat di estimasi berdasarkan fakta bahwa penglihatan mikroskop dan

kombinasi lensa memiliki diameter konstan. Alat untuk pengukurannya disebut

dengan hemocytometer seperti yang terdapat pada gambar dibawah ini,

Hemocytometer dibawah mikroskop cahaya

Alat ini digunakan untuk menghitung jumlah spesimen (sel/bakteri). Metode ini

banyak digunakan dalam suatu riset. Aplikasi hemocytometer biasa ditemukan

untuk menghitung jumlah sel darah. Dalam percoban akan dilakukan untuk

menghitung jumlah spesimen yang digunakan.

Contoh perhitungan,

Diameter yang digunakan pada x10 lensa objektif = 2 mm

Diameter dari media yang digunakan, x40 lensa objektif = 2x10/40 mm = 0,5 mm

III. Prosedur

III.1 Alat

Mikroskop cahaya

Hemocytometer

Slide mikroskop

Coverslip

Pipet

III.2 Bahan

Rambut

Dedaunan

Safranin stain

Methylene blue

Etanol

Isopropanol (to clean objective lenses)


51

Perhitungan diameter rambut

1. Menghitung diamter media dengan hemocytometer. Gunakan lensa objektif

perbesaran 10x dan 40x. Gunakan hemocytometer berdiameter 0,05 mm.

Bandingkan nilai yang didapatkan keduanya. Apakah ada perbedaan?

2. Bersihkan slide gelas kaca mikroskop dengan etanol

3. Ambil sehelai rambut (potong kecil) dan diletakkan pada slide)

4. Berikan air sehingga menutupi rambut

5. Observasi sampel dengan menggunakan lensa objektif 40x. Untuk

mengestimasi ketebalan dari sampel, luruskan rambut yang menjadi spesimen.

Hitung diameter dari rambut.

Observasi sel daun

Daun muda digunakan untuk mempelajari struktur sel karena sel ini hanya teridir

dari beberapa layer.

1. Ambil sedikit bagian dari daun muda, teteskan air hingga menutupi spesimen

2. Lakukan pengamatan dengan perbesaran 40x

3. Tambahan tetesan dari safranin stain untuk membuat dinding sel lebih terlihat.

Tambahkan stain (1 tetes) untuk menutupi jaringan dari sampel yang tertutupi

Observasi sel epitel

1. Gesekan pipi dengan menggukanan tusuk gigi

2. Teteskan methylene blue pada slide hingga menutupi sel epitel

3. Lakukan pengamatan dengan perbesaran 40x

4. Gambarkan tipe sel yang didapatkan

IV. Potensi Bahaya


1 Mikroskop cahaya Meledak/terbakar

2 Hemocytometer Pecah/patah

3 Slide mikroskop Meledak/terbakar

4 Pipet Meledak/pecah


1 Safranin stain




Dapat menyebabkan iritasi pada mata, hati, dan ginjal.

Mudah terbakar dalam bentuk cair dan uap.

2 Methylene blue Dapat menyebabkan gangguan pada kulit dan mata jika

terpapar.



Mudah terbakar.

3 Etanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

52

5 Isopropanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

V. Pertanyaan

1. Apa perbedaan dari mikroskop dengan area terang dan gelap? Apa tipe

mikroskop yang baik digunakan untuk melihat sampel?

2. Apa bagian sel yang dipengaruhi oleh safranin dan methylene blue?

3. Berapa diameter dari daun dan sel epitel?


Perhitungan Diameter Rambut

No. Data yang diambil Diameter

1 Rambut pada perbesaran lensa objektif 10 x

2 Rambut pada perbesaran lensa objektif 40 x

Observasi Sel Daun

Gambar atau hasil pengamatan

Observasi Sel Epitel

Gambar sel epitel yang didapatkan

VII. Daftar Pustaka

Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem. Cell

Biology Lab Manual. 2008. Departement of Molecular Biology and Genetics:

Bogazici University.

53

MODUL 7

KLOROFIL DAN KAROTENOID

I. Tujuan Percobaan

- Mengekstraksi klorofil dan karotenoid dari dedaunan

- Menentukan kandungan klorofil dan karotenoid

II. Teori

Sumber energi yang paling utama dari semua sumber kehidupan di alam ini

adalah matahari. Energi yang terdapat dalam sinar matahari yang memasuki biosfer

dimanfaatkan oleh sebuah proses yang dinamakan fotosintesis, yang biasanya terjadi

pada tumbuh-tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri. Fotosintesis dapat juga

dikatakan sebagai proses physico-chemical, dimana organisme yang melakukan

fotosintesis menggunakan energi cahaya untuk mensintesis senyawa-senyawa organik.

Proses fotosintesis tergantung pada sebuah set molekul protein kompleks yang berlokasi

di dalam dan sekitar sebuah membran yang sangat terorganisir. Melalui serangkaian

reaksi transfer energi, mesin fotosintetik tersebut mengubah energi cahaya menjadi

sebuah bentuk stabil yang dapat bertahan selama ratusan juta tahun.

Pada tumbuh-tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri, proses fotosintesis

menghasilkan suatu pelepasan oksigen molekular dan penghilangan karbon dioksida dari

atmosfer, yang akan digunakan untuk mensitesa karbohidrat (fotosintesis oksigenik).

Sedangkan ada beberapa jenis bakteri yang menggunakan energi cahaya untuk membuat

senyawa organik tetapi tidak menghasilkan oksigen (fotosintesis anoksigenik).

Fotosintesis menyediakan energi dan mengurangi karbondioksida yang diperlukan untuk

kelangsungan semua kehidupan di muka bumi ini, juga oksigen molekular yang sangat

diperlukan untuk kehidupan organisme yang mengkonsumsi oksigen, termasuk manusia.

Juga bahan-bahan bakar yang dibakar untuk menyediakan energi bagi aktivitas

kehidupan manusia dihasilkan oleh organisme-organisme fotosintetik pada zaman

dahulu. Meskipun fotosintesis terjadi di dalam sel atau organela yang sesungguhnya

hanya berukuran beberapa mikron, tetapi proses ini dapat berdampak pada lapisan

atmosfer bumi dan iklim.

Pada tumbuhan-tumbuhan proses fotosintesis terjadi didalam kloroplast, dimana

organela-organela ditemukan di dalam sel. Kloroplast menyediakan energi dan karbon

tereduksi yang diperlukan untuk pertumbuhan tumbuhan dan perkembangannya,

sementara itu tumbuhan menyediakan CO2, air, nitrogen, senyawa organik, dan mineral-

mineral yang penting yang diperlukan kloroplast untuk biogenesis. Kebanyakan

kloroplast berada dalam sel daun yang spesial, dimana biasanya mengandung 50 atau

lebih kloroplast tiap sel.

Fotosintesis digerakkan terutama oleh cahaya tampak (panjang gelombang dari

400 sampai 700 nm) yang terabsorb oleh molekul pigmen (terutama klorofil a dan b, dan

karotenoid).

54

Gambar 2.1 Struktur kimia Klorofil a

Struktur kimia dari molekul klorofil a dapat dilihat pada Gambar 4.1 Pada klorofil

b, CH3 pada cincin II digantikan oleh grup CHO. Tumbuhan akan kelihatan hijau

dikarenakan klorofil yang dimilikinya. Cahaya yang dikumpulkan oleh 200 – 300

molekul pigmen akan yang diikat oleh protein kompleks berada di dalam membran

fotosintetik.

Masing-masing klorofil ini memiliki kelebihan pada daya absorpsi terhadap

panjang gelombang tertentu seperti ditunjukkan pada Gambar 4.2.

Gambar 2.2. Daya absorpsi klorofil a dan b terhadap energi cahaya

Reaksi fotosintesis secara umum dibagi menjadi dua tahap, yaitu reaksi terang

dan reaksi gelap. Pada reaksi terang terjadi reaksi transfer elektron dan proton,

sedangkan pada reaksi gelap terjadi reaksi biosintesa karbohidrat dari CO2. Reaksi terang

menghasilkan sintesis ATP dan NADPH untuk membentuk senyawa organik pada reaksi

gelap.

55

Pada reaksi terang molekul air (H2O) terurai menjadi molekul oksigen (O2) dan

proton (H+). Dalam reaksi tersebut dihasilkan energi dalam bentuk ATP dan NADP

+.

Kemudian, H+

yang dihasilkan dalam reaksi penguraian air tersebut ditangkap oleh

NADP+

sehingga terbentuk NADPH. Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut:

12 H2O + ATP + 24 NADP+ 6 O2 + ATP + 24 NADPH

Reaksi terang tersebut terjadi di dalam grana. Sedangkan reaksi gelap yang

dikemukakan oleh Blackman terjadi pada stroma. Dalam reaksi gelap, ATP dan NADPH

yang terbentuk pada reaksi terang digunakan untuk pembentukan glukosa dari karbon

dioksida.

Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut :

6 CO2 + 18ATP + 12NADPH (CH2O)6 + 6 H2O

Jika kedua reaksi tersebut digabungkan, akan didapat persamaan reaksi umum

fotosintesis sebagai berikut :

6 CO2 + 12 H2O + energi cahaya C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2

Jadi reaksi gelap hanya berlangsung jika tersedia energi kimia dan proton (H+)

yang dihasilkan oleh reaksi terang. Tanpa didahului reaksi terang, reaksi gelap tak akan

berlangsung.

III. Prosedur

III.1 Alat

Sentrifuge

Tabung sentrifuge

Labu Erlenmeyer

Vortexer

Kuvet kaca

Spektrofotometer

Botol aquades

Oven pengering

III.2 Bahan

Daun-daunan dari tumbuhan hijau

Aquades

Larutan aseton 80%


Persiapan Dedaunan

1. Ambil dedaunan dari pepohonan yang ada disekitar tempat tinggal Anda.

2. Keringkan dedaunan pada aliran udara panas 50oC (1-2 jam)

3. Tumbuk dengan mortar dedaunan kering tersebut hingga halus

4. Timbang berat sejumlah (sekitar 10 gram) bubuk dedaunan kering.

(2.1)

(2.2)

(2.3)

56

Pencucian Dedaunan

1. Larutkan dalam air suling secukupnya

2. Bagi sampel menjadi beberapa bagian sama rata untuk ditempatkan dalam tabung

sentrifuge.

3. Sentrifuge larutan tersebut dengan putaran 3300 g (6200 rpm) selama 10 menit

4. Pisahkan padatan bubuk dedaunan kering dari pelarutnya

Ekstraksi Dedaunan

1. Masukkan padatan bubuk dedaunan kering ke dalam tabung erlenmeyer lalu

larutkan dengan sejumlah volume larutan aseton 80% (rasio larutan aseton 80%

dengan sampel biasanya 1:1 atau 1:2)

2. Aduk secara merata dengan vorteks selama 30 detik (dilakukan tidak terus

menerus, tetapi setiap 5 detik)

3. Diamkan hingga 5 menit

4. Bagi sampel menjadi beberapa bagian sama rata untuk ditempatkan dalam tabung

sentrifuge.

5. Sentrifuge larutan yang terjadi (3300 g/10 menit)

6. Ambil supernatan dari hasil sentrifuge larutan di atas. Supernatan merupakan

larutan bagian atas di dalam tabung sentrifuge setelah sampel melalui proses

sentrifuge.

Pengukuran Chlorophyl a

1. Masukkan kuvet kaca yang berisi sampel ke dalam spektrofotometer.

2. Masukkan juga kuvet kaca yang berisi larutan aseton 80% sebagai pembanding

dalam waktu yang hampir bersamaan dengan masuknya kuvet yang berisi sampel

ke dalam spektrofotometer.

3. Ukur absorbansi supernatan tersebut pada panjang gelombang 663 nm

4. Hitung konsentrasi chlorophyll a dalam supernatant dengan rumusan berikut:

CChl a = (A663nm) / 0.8204

5. Hitung jumlah khloropil a dalam padatan dengan rumusan berikut:

Chl a = CChl a x (Vaseton 80%)

6. Hitung kandungan chlorophyl a dalam deaunan kering dengan rumusan berikut:

Chl a content = Chl a / M bubuk dedaunan kering

Pengukuran Carotenoid

1. Ukur absorbansi supernatan tersebut pada panjang gelombang 460 nm

2. Hitung konsentrasi Carotenoid dalam supernatant dengan rumusan berikut:

CCar = (A460nm) / 2.0

3. Hitung jumlah Carotenoid dalam padatan dengan rumusan berikut:

Car = CCar x (Vaseton 80%)

4. Hitung kandungan Carotenoid dalam deaunan kering dengan rumusan berikut:

Car Content = Car / M bubuk dedaunan kering

(4.1)

(4.2)

(4.3)

(4.4)

(4.5)

(4.6)

57

IV. Potensi Bahaya


1 Sentrifuge Meledak/terbakar

2 Labu Erlenmeyer Pecah/patah

3 Vortexer Meledak/terbakar

4 Kuvet kaca Pecah

5 Spektrofotometer Meledak/terbakar

6 Oven pengering Meledak/terbakar


1 Aseton




Dapat menyebabkan iritasi pada mata.

Dapat menyebabkan gangguan pada sistem saraf.

Sangat mudah terbakar dalam bentuk cair dan uap.

V. Pertanyaan

1. Pada panjang gelombang berapa klorofil diukur? Dimana letak klorofil di dalam sel?

2. Apakah kaitan antara klorofil a dengan proses fotosintesis?

3. Gambarkan struktur kimia dari klorofil b!

4. Apakah yang dimaksud dengan karotenoid? Apa fungsi karoten dalam kaitannya

dengan kesehatan mata?



1 Larutan aseton 80% (λ = 663 nm)

2 Supernatan daun (λ = 663 nm)

3 Supernatan daun (λ = 460 nm)

VII. Daftar Pustaka

Tim Penyusun, 2006. Buku Panduan Praktikum Kimia Organik. Departemen Teknik Gas dan

Petrokimia Universitas Indonesia. Depok.

58

MODUL 8

TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI

I. Tujuan

- Mempraktikkan teknik aseptik dan pembuatan biakan murni

II. Teori

Pemanfaatan mikroba dalam bioteknologi umumnya bergantung pada biakan

murni yang terdiri dari spesies tunggal, dan pemeliharaan kemurniannya. Sebagian besar

aplikasi bioteknologi modern melibatkan penggunaan biakan murni. Metoda yang paling

praktis dan bermanfaat untuk mendapatkan biakan murni adalah metoda “streak plate”,

dimana campuran biakan di sebar atau dioleskan pada permukaan medium sedemikan

rupa sehingga sel-sel tunggal menjadi terpisah satu sama lainnya. Masing-masing sel

tunggal akan tumbuh menjadi suatu koloni yang merupakan biakan murni, oleh karena

sel-sel yang tumbuh dalam koloni tersebut adalah keturunan dari sel tunggal.

Teknik aseptik diperlukan dalam bekerja dengan suatu biakan mikroba murni dan

untuk menjaga/memelihara kesterilan suatu media atau larutan. Dengan teknik aseptic,

ahli-ahli bioteknologi dapat mencegah kontaminasi biakan atau larutan oleh mikroba

yang tidak diinginkan. Banyak cawan petri dan plate kultur jaringan yang digunakan

untuk menumbuh-biakan mikroorganisme terbuat dari bahan yang telah disterilkan oleh

produsennya, pengisian peralatan-peralatan ini dengan media steril membutuhkan teknik

aseptic. Teknik aseptic yang benar juga melindungi peneliti di bidang bioteknologi dari

kontaminasi biakan-biakan yang berpotensi pathogen. Termasuk dalam teknik aseptic

adalah menghindari kontak antara biakan murni, media steril, dan permukaan steril

peralatan bejana dengan mikroorganisme kontaminan. Untuk mencapai tujuan ini :

1. Tempat kerja harus dibersihkan dengan larutan antiseptic untuk mengurangi jumlah

kontaminan potensial

2. Peralatan disterilkan sebagai contoh batang ose disterilkan melalui pemanasan

dengan pembakar Bunsen sebelum dan setelah transfer biakan

3. Pekerjaan dilakukan secara cepat dan efisien untuk mengurangi waktu kontak

dimana kontaminasi pada biakan atau pekerja laboratorium dapat terjadi

Langkah-langkah yang biasa dilakukan dalam transfer biakan dari satu

bejana/tabung ke bejana lain adalah sebagai berikut:

1. Menempelkan jarum ose ke api

2. Membuka dan menempelkan mulut tabung biakan ke api

3. Menggunakan jarum ose, sejumlah biakan diambil dan dipindahkan ke media segar

4. Menempelkan mulut tabung biakan kea pi dan tabung ditutup kembali

5. Menempelkan kembali jarum ose ke api

Teknik yang sama digunakan untuk inokulasi ke dalam cawan petri dan plate mikroskop,

kecuali bahwa tutup cawan dan plate tidak dibakar.

Pemahaman dan pengetahuan yang menyeluruh mengenai teknik aseptic dan prosedur

pemindahan biakan merupakan persyaratan awal untuk bekerja dengan kultur

mikrobiologi. Kita akan menghemat banyak waktu dan tenaga serta menghindari

kesalahan hasil jika aturan-aturan umum dicermati ketika bekerja dengan biakan.

1. Sterilkan selalu jarum inokulasi ose dengan pembakaran sebelum menggunakannya

dan memasukkannya ke bahan biakan.

59

2. Bekerja selalu dekat dengan api, bila perlu bibir tabung (bahan gelas) ditempelkan

pada api sebelum memasukkan jarum ose. Langkah ini akan merusakkan sel-sel

kontaminan yang mungkin tersimpan pada bibir tabung saat transfer biakan

sebelumnya atau oleh hal lain.

3. Menjaga semua bahan biakan agar tertutup dengan baik. Jangan meletakkan penutup

tabung atau cawan petri di atas meja, karena hal ini akan memungkinkan

kontaminasi pada biakan. Ketika mentransfer koloni dari cawan petri, gunakan tutup

cawan sebagai pelindung dengan sedikit mengangkatnya sehingga jarum ose dapat

dimasukkan, tetapi permukaan media masih terlindung dari kontaminan-kontaminan

yang mungkin jatuh ke atasnya.

4. Jangan membiarkan penutup tabung atau cawan petri menyentuh apapun kecuali

wadah biakannya masing-masing. Hal ini akan mencegah kontaminasi terhadap

penutup dan biakan.

5. Gunakan cara yang tepat pada saat membuka dan memasang penutup.

III. Prosedur

III.1 Alat

Batang inokulasi (jarum ose)

Cawan petri

Tabung reaksi tertutup 18x150 mm

Laminar flow

Lampu spirtus

Inkubator pengocok (shaker)

Inkubator (oven) 37oC

Rak tabung reaksi

III.2 Bahan

2x5 mL media LB cair (Luria-Bertani: 10 g/L bacto-tryptone; 5 g/L yeast-

extract; 10 g/L NaCl)

5x10 mL LB-agar (tambahkan 15 g/L bacto-agar ke dalam LB cair)

Sampel: 5 mL biakan murni E. Coli dalam LB cair

Alkohol

Kertas tissue


Catatan Pemimpin Praktikum

Sehari sebelum percobaan, 5 mL LB cair diinokulasi dengan kultur E.

Coli. Inkubasi disertai pengocokan E. coli pada 37oC, 150 rpm.

Seluruh pekerjaan di bawah ini dilakukan di dalam kamar steril (laminar

flow). Ingat!! Bersihkan dan sterilkan ruang laminar sebelum dan setelah bekerja

di dalamnya.

A. Transfer Biakan

Hari ke satu

1. Pegang batang inokulasi (ose) antara ibu jari dan jari telunjuk, tempelkan bagian

kawat ose pada api lampu spirtus, bakar seluruh kawat hingga merah dan berpijar.

60

Biarkan kawat dingin selama 5-10 detik sebelum diteruskan ke langkah

berikutnya. Jangan kibaskan ose di udara.

2. Gunakan tangan anda yang bebas, ambil tabung yang mengandung biakan E. coli

dan perlahan-lahan kocok biakan untuk meratakan biakan. Buka tutup tabung dan

tempatkan pada jari kelingking yang bebas dari tangan yang memegang jarum ose

steril, kemudian bibir tabung dibakar pada pembakar spirtus.

3. Pegang tabung biakan dengan posisi miring, masukan ose steril dan pindahkan

sedikit biakan dari tabung ke kawat ose. Usahakan jarum ose tidak menyentuh

dinding tabung atau sisi bibir tabung selama proses pemindahan.

4. Bakar bibir tabung, dan dengan hati-hati ditutup kembali. Kemudian kembalikan

tabung biakan E. coli ke rak tabung reaksi.

5. Ambil tabung reaksi baru yang mengandung 5 mL LB cair steril. Buka dan

pindahkan tutup tabung dengan cara yang sama seperti tahap sebelumya dan

mulut tabung dibakar.

6. Masukkan jarum ose yang menganduk inokulum hidup ke dalam tabung yang

mengandung LB cair steril dan goncangkan kawat ose sehingga mikroorganisme

berpindah ke dalam medium. Keluarkan jarum ose dari dalam tabung.

7. Selanjutnya mulut tabung dibakar, ditutup kembali, dan diletakkan pada rak

tabung reaksi.

8. Kawat ose dibakar kembali untuk disimpan.

9. Berikan label pada tabung baru yang telah diinokulasi, dan tempatkan pada

inkubator pengocok, pada 37oC dengan pengocokan 150 rpm selama 1 malam.

Hari ke dua

1. Setelah inkubasi satu malam, keluarkan tabung dari inkubator.

2. Amati tabung dan gambarkan kondisinya.

B. Streak Plate

Hari ke satu

1. Berikan label pada media LB dengan informasi nama, tanggal, nama media, dan

nama sumber biakan yang akan digunakan.

2. Gunakan LB di atas untuk:

a. Menumbuhkan biakan E. coli dengan kedua metoda streak (kuadran dan

kontinyu) masing-masing pada satu plate LB agar.

b. Satu dari masing-masing plate agar akan digunakan sebagai kontrol.

Berikan label pada masing-masing cawan petri.

Metode Quadrant Streak

a. Gambar kuadran pada bagian bawah luar cawan petri agar.

b. Bakar batang inokulasi (kawat ose) dan biarkan dingin sebelum

bersentuhan dengan biakan. Ose yang panas akan membunuh

mikroorganisme dan menghasilkan aerosol ketika bersentuhan dengan

agar dingin. Ikuti prosedur pada percobaan bagian A (Transfer Biakan,

tahap 1 s/d 4) untuk memindahkan biakan dari media cair ke kawat ose.

c. Ambil plate agar, dan angkat sedikit tutup cawannya. Biarkan kawat ose

menyentuh permukaan agar, kemudian kawat digeser perlahan (dioleskan)

diseluruh permukaan agar dalam satu kuadran melalui gerakan streaing

continue (tidak terputus). Hindari penusukan kawat ose kedalam agar.

Gunakan pantulan cahaya untuk melihat dimana anda melakukan

streaking dan inokulasi pada agar. Area ini akan terlihat sebagai goresan-

61

goresan redup. Hal ini akan membantu dalam menempatkan inokulasi

lebih baik.

d. Bakar jarum ose kemudian biarkan dingin, dan lakukan streak silang dari

area sebelumnya (kuadran 1) ke kuadran kedua. Selalu sterilkan ose

setelah inokulasi setiap kuadran pada cawan, hal ini akan membuhun sel-

sel yang menempel pada jarum ose dan mencegah kontaminasi pada

inokulasi berikutnya.

e. Ulangi prosedur yang sama untuk setiap kuadran berikutnya, hingga

semua quadrant pada cawan terinokulasi

f. Bakar jarum ose setelah selesai

Metode Streak Continue

a. Ambil sedikit biakan inokulum pada kawat ose dengan cara yang sama

seperti percobaan bagian A (Transfer Biakan, tahap 1-4).

b. Sebarkan (oleskan melalui gerakan tunggal yang kontinyu (tidak terputus),

terus menerus dan dengan arah bolak-balik diseluruh permukaan agar

pada setengah area cawan.

c. Tanpa pembakaran dan tanpa mengeluarkan kawat ose, putar cawan 90o

dan lanjutkan prosedur streaking dengan cara yang sama seperti di atas

pada setengah area cawan berikutnya.

3. Siapkan inokulasi kontrol (Metode quadran streak) dimana plate agar digores

dengan hanya menggunakan kawat ose steril tanpa biakan. Cawan ini akan

menjadi indikator yang baik untuk teknik aseptik, karena apapun seharusnya tidak

tumbuh pada cawan ini.

4. Balikkan cawan untuk menghindari kondensasi air dari kultur bakteri yang telah

disebarkan di permukaan agar, letakkan cawan pada inkubator 37oC untuk

diinkubasi selama 24-28 jam.

Gambar quadrant streak dan continuous streak

Hari ke dua

1. Setelah inkubasi selama 24-28 jam, cawan dikeluarkan inkubator.

2. Amati cawan, amati dimana anda menemukan koloni yang terisolasi dengan baik

(koloni tunggal).

IV. Potensi Bahaya


1 Batang inokulasi Tertusuk

2 Cawan petri Pecah/patah

3 Tabung reaksi Pecah/patah

4 Laminar flow Meledak/terbakar

5 Lampu spirtus Meledak/terbakar/tumpah

6 Inkubator pengocok Meledak/terbakar/konselet

7 Inkubator (oven) Meledak/terbakar/konselet

8 Rak tabung reaksi Patah


62

1 E. Coli Terpapar pada tubuh praktikan.

Kontaminasi laboratorium.

2 Alkohol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.




jangka panjang.


Mudah terbakar.

V. Format Laporan dan Pengumpulan

Transfer Biakan

Buatlah gambaran kondisi tabung yang mengandung LB cair steril + inokulum hidup E.

coli setelah diimkubasi 1 malam.

Gambar quadrant streak dan continuous streak

Buatlah gambaran kondisi cawan yang mengandung LB cair steril + inokulum

hidup E. coli setelah diimkubasi 1 malam untuk metode quadrant streak.

Buatlah gambaran kondisi tabung yang mengandung LB cair steril + inokulum

hidup E. coli setelah diimkubasi 1 malam untuk metode continous streak.

VI. Daftar Pustaka

Azhar, M. 1996. Kloning dan Penentuan Urutan Nukleotida Mutan sal4-13,

Saccharomces cereviseae. Tesis Program Master. Jurusan Kimia. Program

Pascasarjana Institut Teknologi Bandung.

Becker, J.M., Caldwell, G.A., and Zachgo, E. A., 1996. Biotechnology: A

Laboratory Course. 2nd

ed.USA: Academic Press.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. A

Laboratory Manual. 2nd

edition. Vol. 1-3. USA : Cold Spring Harbor

Laboratory.

Documents

Module_Biochemistry (Ind).pdf