Department de Chemotherapie de VAcademie Roumaine, Bucarest

Modifications biochimiques indultes au Po/j«/«i (P. x euramericana(Dode) Guinier CV. Robusta R^) par Dothichiza populea

Sacc. et Br,

Par

IoANA TANASE et VICTORIA MOCANU

Avec 3 figures

L'un des problemes importants concernant la culture des peupliers enEurope, ainsi qu'en Roumanie est represente par Tobtention de nioyens efficacespermettant d'obtenir des clones resistantes aux agents pathogenes (SEKAWIN1964).

L'attaque du champignon Dothichiza populea constitiie I'une des causesprincipales de maladie des differentes clones du genre Populm (BUTIN 1960,1964, LoESCHCKE 1961, BRAUN 1962. BRENDEL 1965).

Par le fait que la maladie determine dans la plupart des cas, la mort de lapiante, Dothichiza populea Sacc. et Br. constitue un danger .serieux pour lescultures des peupliers. L'attaque manifeste une predilection pour les plantesjeunes.

Compte tenu que la rentabilite economique du peuplier, dans certainesconditions climatique de notre pays, ne peut rivaliser avec aucune autre piante,on ressent la necessite de l'institution de mesures correspondantes pour la pre-vention des infections et en vue de rehausser le niveau de resistance des diffe-rentes espcees de peupliers contre l'attaque avec Dothichiza populea Sacc, et Br.

Mais, pour l'institution des conditions efflcientes de lutte eontre la maladie,il faut en premier lieu connaitre les effets biochimiques induits par le champignonsur la piante hote a tous les niveaux de cycles mctaboHques impliques dans saphysio-pathologie; cette attitude offrira une base seientlfique pour l'institutiondes mesures efficientes de lutte et de prevention contre cette maladie, ainsi quele decclement de I'affection au niveau moleculaire avant la modification desstructures morphologiques.

Dans ce but, nous nous sommes propose de poursuivre la mesure danslaquelle l'ecorce de peuplier affectee par Dothichiza populea presente un dese-quilibre au niveau de quelques constituants biochimiques essentiels pour le

260 TANASE et MOCANU

developpement de la piante, tels les glucides libres, les chlorophylles, les acidesgras non-satures, les acides amines Hbres et lies, TARN et I'ADN, c'est-a-direles composants qui appartiennent aux quatre groupes metaboliques importants:les glucides, les lipides, les protides et les chlorophylles.

Materiel et Methodes

Les plantes d'experience ont ^te representees par la clone P. X euramericana(Dode) Guinier CV. Robusta R^. Cette clone a ete obtenue de la pepinierecentrale de Hirsova (Region de la Dobroudja), le 26 novembre 1966.

Les plantes experimentales ont ete groupees en trois lots, diaque lot 6taniconstitue de plants agc's de deux ans.

Le lot I a ete considerc* comme lot temoin; les lots II et III etaient formes dcplants affect^s par Dothichiza populea et se trouvant dans la premiere phase del'attaque, lorsque la maladie se manifeste sous la forme de taches (lot II) et dansune phase plus avancee, caracterisee par t'apparition de pycnides (lot III).

Pour la preparation des extraits et des hydrolysats necessaires a la deter-mination des glucides hbres extractibles dans I'alcool, ainsi que des autres con-stituants mentionnes, nous avons utilise de l'ecorce prelevee des tiges des plantsages de deux ans. Pour diaque lot d'exp^riences on a pes^ 100 g d'ecoree, qui a eteensuite sediee au chaud (90 C) j'usqu'au poJds constant; le materiel sedie estbroye dans un triturateur jusqu'a I'obtention d'une poudre fine. La poudrcobtenue a ^te passee au crible, en selectionnant les particules dont la dimensionne depassait pas 60 microns.

La determination des acides nucl^iques a ete effectuee sur 0,4 g de poudred'ecoree, hydrolysee avec de l'acide trichloracetique 5 % pendant 30 minutes, endecolorant ensuite avec du carho depuratum.

Le dosage de I'ADN a etc obtenu par la reaction avee P. nitrophenylhydra-zine pour le desoxyribose et celle de I'ARN par la reaction a I'orcinol pour laribose, d'apres la methode de WEBB et LEVY (1955).

Les recherches chromatographiques destinees a la separation des glucides ontete effectuees en utiHsant des extraits alcooliques de 24 heures, obtenus de 0,4 gde poudre d'ecoree. La separation des glueides libres a ete effectuee par chro-matographie descendante sur papier dans le systeme de solvants constitue debutanol-acide acetique-eau (150 : 30 : 70).

La revelation des composants glucidiques sur le chromatogramme a eteex^cutee h. l'aide d'une solution alcoolique d'aniline-diphenylamine-acide ortho-phosphorique et par sediage rapide a 60—65 C pendant sept minutes, selon latedinique decrite par HAIS et MACEK (1960). L'evaluation quantitative a etceffectuee en mesurant l'aire de ehaque composant glucidique et en rapportant aune courbe etalon diromatographiee dans des conditions identiques.

L'extraction des acides amines libres a ete faite a partir d'un gramme depoudre d'ecoree additionnee de 10 ml d'acetone chlorhydrique (100 ml d'acetone+ 1 ml de HCI cone). Duree de I'extraetion: 24 heures. Aprcs filtration, l'extraitest evapore a sec et le residu repris dans 1 ml d'eau; ensuite on a separe et analyse

Modifications biodiimiques induites au Populus par DothiAiza populea 261

au point de vue quantitatif les acides amines libres en utilisant la methodechromatographique sur papier Whatman No. 1 en developpement descendantet radiaire, d'apres la tedinique decrite dans un travail anterieur (TANASE 1967).La mise en Ubert des aminoacides des structures proteiques et peptidiques a ^teeffectuee apres une hydrolyse en milieu acide avec du HCl 5 N (0,1 g de poudrependant quatre heures a 90 C). L'hydrolysat a ete ramene a un volume final de10 ml, ensuite filtre et evapor^ i sec sur un bain d'eau; le residu obtenu est reprisdans 1 ml d'eau. Pour ['analyse quantitative de certains acides amines, tels I'argi-nine, I'histidine et la serine qui presentent le phenomcne d'hyper- et d'hypo-chromicite a la reaction de la ninhydrine, on a utilise la m( thode de SATAKE etLUCK (1958). NEWMAN et TURNBULL (1960) et FRISELL et MACKENZIE (1958)apres decoloration prcalable de l'hydrolysat avec du carbo depuratum pendant30 minutes \ la temperature de la chambre.

La separation des chlorophylles et des acides gras non-satures a ete faite pardiromatographie radiaire sur des papiers impregnes avec de I'oleum paraf-fini (5 %• dans du benzene) avec extraction prealable au chloroforme-ethanolet au chloroforme-methanol (2 : 1) (FAURE 1963). Le developpement des chro-niatogrammes pour la separation des dilorophylles a ete execute dans le systemeacide acetique-acide formique-eau.

Resultats

L'analyse des acides nucleiques, des glucides libres, des dilorophylles, desacides gras non-satures, ainsi que celle des acides amines libres et lies dans lesstructures peptidiques inf^rieures et superieures de l'ecorce de peuplier saine etattaquee par le diamplgnon Dothichiza populea a conduit aux resultats quisuivent: La methode chromatographique d'equilibre sur papier a permis la miseen evidence dans les extraits alcooliques d'ecoree de peuplier, de plusieurs com-poses glucidiques dont la cellobiose, la glucosamine, le rhamnose, le glucose et lefructose (tabl. 1). Au niveau des composants mentionnes on observe l'apparitionde modifications importantes, lorsque l'ecorce de peuplier est infectee avecDothichiza populea Sacc. et Br.

Ainsi, on constate une reduction considerable de la teneur de ces com-posants, avec disparition quasi-totale dans la phase avancee d'attaque (fig. la).

Tableau 1Valeurs des glucides Hbres extractibles dans I'alcool dc peuplier (clone Ris)

infectee avec Dothichiza populea (g '/i)

Composant 11 III

Cellobiose 0,3 ± 0,01 - —Glucosamine 0,5 ± 0,02 0,1 ± 0,06 —Rhamnose 1,3 ± 0,06 0,4 ± 0,01 0,t ± 0,03Glucose 0,7 ± 0,03 0,2 ± 0,05 tracesFructose 0,4 ± 0,01 0,1 ± 0,01 traces

262 TANASE et MocANU

Fig. 1, Chromatogramme des glucides (a), des acides gras non-satures (b) et des dilorophylles(c) de l'ecorce de peuplier (Ri,.) infective avec Dothichiza populea. I. = Ecorce de peupliersaine-t^moin; II = Ecorce de peuplier dans la premiere phase d'altaque avec Dothichizapopulea; III = £corce de peuplier dans la secondc phase d'actaque avec Dothichiza populea.1 = cellobiose, 2 = glucosamine, 3 = ?, 4 = rhamnose, 5 = glucose, 6 = fructose,

a = l'acide Unoienique, b = l'acide linoleique, c = l'acide oleique

Le comportement chromatographique des chlorophylles extraites de l'ecorcede peuplier malade differe du comportement normal (fig. lc).

On a isole dans Tecorce de peuplier saine trois acides gras non-satures:l'acide oleique, l'acide linoleique et l'acide Unoienique; par contre, dans l'ecorcede peuplier infectee dans les conditions techniques donnees, on ne retrouve plusque Tacide oleique avec comportement diromatographique differant du com-portement normal (fig. lb).

L'acide ribonucleique (ARN) et l'acide desoxyribonuclcique (ADN) pre-sentent une hausse marquee dans l'ecorce de peuplier infectee se trouvant dansla premiere phase d'attaque, pour diminuer ensuite au-dessous des valeurs nor-males, c'est-a-dire au moment ou l'attaque est caracterisee par l'apparition depycnides (fig. 3).

Les conditions experimentales d^crites nous ont de meme permis de mettreen evidence dans les extraites ac^toniques, ainsi que dans les hydrolysats acidesd'ecorce de peuplier, 17 acides amines, qui sont souvent trouves dans la structuredes proteines vegetales (tabl. 2).

Modifications biodiimiques induites au Populus par Doihichiza populea 263

Dans l'ecorce infectee lecontenu de la plupart des acidesamines libres et li s diminue demoitie (fig. 2).

Discussion

Le fait que les acides nuclei-ques — aussi bien l'ARN quel'ADN — augmentent en mesureconsiderable dans la premierephase d'attaque avec le champi-gnon Dothichiza populea Sacc. etBr. pour diminuer ensuite au-dessous des valeurs normales, nouspermet de presumer que les possi-bilites de defense de la piante hotepar l'intensification des processusmetaboliques, s'averent insuffi-santes pour lui permettre le main-tien d'un equilibre biociiimiquenormal.

Le comportement diromato-graphique different de l'acideoleique et la dlsparition des acideslinoleique et linolenique de recor-ce de peuplier attaquee par Dothi-chiza populea Sacc. et Br. presumel'existence des modifications struc-turales importantes induites parle diampignon au niveau de cescomposants.

De meme, robservation quedans l'ecorce de P. X eurameri-cana (Dode) Guinier CV. RobustaRi8 affectee par Dothichiza popu-lea Sacc. et Br. le fond aminelibre est modifi^, c'est-a-direqu'on constate une diminutionmarquee par rapport aux valeursnormales, suggere l'existence d'unblocage des systemes fermentatifs,impliqucs dans la synthese et ladegradation des proteines; ceciserait le resultat de I'^laboration

Fig. 2. Chromatogramme des acides amines libreset lies de l'ecorce de peuplier (Ris). A = deve-loppement radiaire, Ij, Hi, IIIi = acides amineslibres. B = developpement descendant, I , II^III., = acides amines lies. Ordre des acides ami-nes: A. 1 — ac. aspartique; 2 — ac. glutamique;3 — serine; 4 — alpha-alanine; 5 — lcucinc; 6 —cystinc; 7 — ?. B. 1 — lysine; 2 — arginine;3 — histidine; 4 — serine; 5 — glycocolle; 6 —ac. glutamique + ac. aspartique; 7 — alpha-alanine; 8 — tyrosine; 9 — mithionine; 10 —

valine; 11 — phenylalanine; 12 — leucine

264 TANASE t-t MOCANU

de certaines substances toxiques actives d'inhl-bition de I'actlvite proteasique, substances quiapparaissent en meme temps que la specialisa-tion biologique du diampignon et avec la crea-tion des systcmes fermentatifs d'adaptationpendant son developpement sur la plante hote.

Nos donnees conflrment les redierdies deBRENDEL (1965) effectuees sur l'ecorce de clonesdifferentes, qui a mis en evidence la presence de17 acides amines extractibles dans des solutions

aqueuses.

ConclusionsFig. 3. Modification de l'ARN etde I'ADN de l'ecorce de pcuplicr(Rie) infectee avec Dothichiza po-

pulea

1. Les redierches effectuees permettent deconclure que le champignon Dothichiza popu-lea Sacc. et Br. produit, dans I'ecorce du P. X

Tab le au 2Valeurs des acides amines libres et lies dc l'ecorce de peuplier

infecte avec Dothichiza populea mg% g produit

Acide amine

Cyst^ineGlutamincHistidineTryptophaneCystineThreonineArginineOrnithineLysineGlycocoUeShrineProllneTyrosineM^thionineValinePh^nylalanincIsol^ucineL^ucineAlanineAc. glutamiqucAc. aspartique

Acides amines totaux

I

—

40 ± 6—

130±2f14O±13220±10

—300 ±21180±15370 ±36

—140±14120±10400 ±20200 ±135 7 ± n

500 ±14400 ± 20600 ±17130± 9

II

—18*) ± 2

—

80 0 ± 363=0 ± -•'

no'0± 7—

170*)± 8

92^0 ± 6210*) ± 1 4

—82*) ± 466*) ± 5

220=0 ± 1 3

100=0 ± 630=0 ± 1.^

240=0 ±21 .

III

_

—21=-0±

—75*) ±58*) ±

00=0 ±—

80*) ±86*) ±

100*)±—

76=0 ±59=0 ±

M0*)±87*) ±21=i-)±

3

468

757

69

10100,9

.00*)±11251=0±13 230=0±22330=0 ±18 300*) ± 2 466=0 ± 1 0 60*) ± 5,8

Ac

I

_

?28 ±5

—7 ±1,4

19±332±7

—41 ±514±224±211 ±0,76 ±0,2

14 ±0,332 ±414±27±],1

62 ± 5,869 ±6,744 ±527 ±3

ides

30

61014

20

6U

4

amines llbres

11

±4—

±0,3*)±0,l'0 ± 2—*) ± 0,6

5*) ±0,1*) ± 0,2—

±0,16,4*) ± 0,2

136

30402517

*) ± 0,4=O±o,i—=0±l,6*)±2=0±3

±1.1

III

12 *)±1,I—

4,8 ± 0,28 =0±0>'9,6=0 ±0,8

16 *)±0,44,6*) ±0,36,7*) ±0,1

—2,7' ) ± 0.24,4»)±0,l9 *)±0,54 *)±1

24 *)±1,430 *)±319 *)±514 ±2

*) T > 2,5 P < 0,01. I = t^moin; II = ^corce infectee avec Dothichiza populea —premier stade d'attaque; III = ecorce infectee avec Dolhithiza popnlea — stade plus avan-cee d'attaque.

Modifications biochimiques induites au Populus par Dothichiza populea 265

euramericana (Dode) Guinier CV. Robusta Rm, un dereglement de l'equilibrebiodiimique normal au niveau des trois cycles metaboliques importants de lapiante hote, c'est-a-dire le metabolisme glucidique, lipidique et protidique, ainsiqu'au niveau des chlorophylles.

2. Le desequilibre biodiimique induit par Dothichiza populea Sacc. et Br.diez la piante hote, conduira inevitablement a la mort de la piante, au cas ouI'on n'instituera pas des mesures adequates pour son rc'tablissement; ceci pourraits'obtenir par I'action de certains biostimulateurs, capables d'intervenir dans lesprocessus d'oxydo-reduction cellulaire et done de venir en aide au retablissementdes groupements enzymatiques actifs, probablement bloques par les toxineselaborees par le champignon.

3. On ressent la necessite de trouver des tests biodiimiques destines audecelement precoce de la maladie, avant que celle-ci n'atteigne les niveauxmacroscopiques.

4. De mcme il est necessaire de creer des clones resistantes contre Dothichizapopulea, capable de permettre une specialisation physiologique efficiente de luttecontre l'agent pathogcne.

L'attaque avec le diampignon Dothichiza populea, constitue une des causesprincipales de maladie des differentes clones du genre Populus. Pour l'institutiondes mesures efficientes de lutte et de prevention contre l'agent pathogcne il faut,en premier lieu, connaitre les effets biodiimiques induits par le diampignon surla piante hote. Par sa specialisation biologique sur la clone R,,i, !e diampignonDothichiza populea Sacc. et Br. produit un dereglement de Tequilibre biodiimi-que au niveau du metabolisme glucidique, lipidique, protidique et des diloro-phylles.

Zusammenfassung

Der Befall durch den Pilz Dothichiza populea Sacc. et Br. ist einer derhauptsadilidien Grunde zur Erkrankung der verschiedenen Klone der GattungPopulus.

Der Pilz Dothichiza populea Sacc. et Br. ergibt in der Rinde des P. X eura-mericana (Dode) Guinier CV. Robusta Ri,i eine Stbrung des normalen biochemi-sdien Gleidigewichtes im Niveau der drei wichtigsten metabolischen Zyklen, indem Stoffwedisel der Glucide, der Lipide und der Proteide, sowohl wie imChlorophyllspiegel.

Summary

The infection by the Dothichiza populea fungus constitutes one of theprincipal causes of disease for the different clones of the Populus genus. Forefficient measures of fight and prevention against the pathogenous agent, it isfirst necessary to know the biodiemical effects provoked by the fungus on the

I

Phytopath. Z., fld. 63, Heft3 J9

266 T. NASE et MocANU, Modifications biodiimiques induites par Populus

host plant. By its biological specialization on the R,fl, the Dothichiza populeaSacc. and Br. fungus determines disorders in the biochemical equilibrium of theglucidic, Hpiidic, protidic metabolism, as well as at the level of the chlorophylls.

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