Embed Size (px)
Citation preview
Université Paris VI - UPMC
MASTER SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Mention BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE
1ère
année de Master
2011-2012
Mise au point du diagnostic prénatal de la thrombopénie
fœtale allo-immune
Aurélie DENIS
Responsable du laboratoire : Dr Cécile KAPLAN
Maître de stage : Emilie LE TORIELLEC
Laboratoire d’Immunologie Plaquettaire
Institut National de la Transfusion Sanguine
6 rue Alexandre Cabanel
75739 Paris cedex 15
Université Paris VI - UPMC
MASTER SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Mention BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE
1ère
année de Master
2011-2012
Mise au point du diagnostic prénatal de la thrombopénie
fœtale allo-immune
Aurélie DENIS
Responsable du laboratoire : Dr Cécile KAPLAN
Maître de stage : Emilie LE TORIELLEC
Laboratoire d’Immunologie Plaquettaire
Institut National de la Transfusion Sanguine
6 rue Alexandre Cabanel
75739 Paris cedex 15
Je remercie, tout d’abord, le Docteur Cécile KAPLAN-GOUET responsable du
laboratoire d’Immunologie plaquettaire de m’avoir accueillie au sein de son équipe.
Je tiens à remercier particulièrement Madame Emilie LE TORIELLEC, mon maître de
stage, ingénieur de recherche, pour avoir encadré mon travail, et pour la confiance qu’elle m’a
accordée tout au long de ce stage.
Je remercie également Monsieur Gérald BERTRAND, ingénieur de recherche, pour
tous ses conseils et ses explications, et pour son extrême gentillesse.
Merci à Monsieur Vincent JALLU, ingénieur de recherche, pour sa bonne humeur et
d’avoir partagé son bureau avec moi.
Je remercie également toute l’équipe du laboratoire : Corinne MARTAGEIX, Jeannine
QUESNE, Frédéric BIANCHI, Christophe CHENET, Cécile CASALE, Thomas
BERANGER, Sébastien PHILIPPE, Nicolas GIULIANI, Virginie DUFOUR et la secrétaire
Théréza MARIE pour leur disponibilité et leur sympathie.
Toutes ces personnes ont contribué, par leur disponibilité et leur bonne humeur, à rendre mon
stage enrichissant et motivant.
REMERCIEMENTS
Les thrombopénies fœtales et néonatales alloimmunes sont les plus fréquentes des
thrombopénies isolées sévères du fœtus et du nouveau-né avec une incidence estimée à un cas
pour 800 à 1000 naissances et sont à l’origine d’accidents hémorragiques graves. Elles
résultent de l’immunisation maternelle vis-à-vis des antigènes plaquettaires du système HPA
(Human Platelet Alloantigen) présents chez le fœtus et absents chez la mère. Les plus
fréquents, dans la population caucasienne, sont HPA-1a, -3a et -5b. Le diagnostic prénatal
(DPN) des thrombopénies fœtales est réalisé à l’heure actuelle à partir d’amniocentèse, un
geste invasif pouvant être à l’origine de fausses couches spontanées. Le DPN non invasif est
donc un enjeu majeur du laboratoire d’immunologie plaquettaire. Une méthode de génotypage
sur l’ADN fœtal présent dans le sang maternel a déjà été développée pour HPA-1 en
combinant deux techniques : la PCR-SSP et la PCR-HRM afin de permettre un diagnostic non
invasif plus sûr et à un terme précoce de la grossesse.
L’objectif de ce travail de recherche était d’une part d’augmenter la cohorte de
patientes pour lesquelles un génotypage plaquettaire HPA-1 fœtal était nécessaire, afin de
valider la méthode. D’autre part, il s’agissait de mettre au point un protocole pour le
diagnostic prénatal des systèmes HPA-3 et HPA-5.
Pour HPA-1, l’incompatibilité ou la compatibilité avec le fœtus pour neuf patientes a
pu être observée dans les deux techniques, augmentant ainsi la cohorte à 58 patientes. Le DPN
pour HPA-3 a pu être mis au point, à l’exception de l’allèle « b » en PCR-SSP. La majorité
des femmes impliquées dans une immunisation HPA-3 étant de génotype « bb », la recherche
de l’allèle « a », présent sur l’ADN fœtal, permettra de diagnostiquer pour la majorité des cas
une incompatibilité dans ce système. Pour HPA-5, la PCR-SSP a donné de bons résultats. De
plus, le programme utilisé est le même que pour le système HPA-1, permettant un génotypage
en même temps et donc un gain de temps sur le rendu des résultats et la prise en charge des
patientes.
La suite de ce projet consiste à valider la méthode de DPN pour les systèmes HPA-3 et
-5 en effectuant ces techniques sur une centaine de patientes afin d’évaluer la reproductibilité
de la méthode. A terme, il ne sera plus nécessaire d’effectuer des amniocentèses pour le
diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale ou néonatale allo-immune, un simple
prélèvement de sang maternel suffira au diagnostic. De tels progrès seront un atout
considérable pour la prise en charge thérapeutique dans le domaine de la périnatalité, élément
essentiel de la santé publique.
RESUME
ABREVIATIONS
INTRODUCTION…….……………………………………………………………………...1
I) Présentation………………………………………………………………………….1
1) L’INTS………………………………………………………………………1
2) Le laboratoire d’immunologie plaquettaire…………………………………1
II) Les plaquettes……………………………………………………………………….1
1) Structure……………………………………………………………………..1
2) Fonction……………………………………………………………………..2
III) Thrombopénie fœtales ou néonatale allo-immune…………………………………2
1) Aspects cliniques……………………………………………………………2
2) Cause………………………………………………………………………3
3) Antigènes plaquettaires impliqués…………………………………………..3
4) Diagnostic…………………………………………………………………...4
a) Cytométrie en flux…………………………………………………4
b) MAIPA………………………………………………………………4
c) Typage plaquettaire………………………………………………….5
5) Prise en charge post-natale…………………………………………………..5
6) Prise en charge des grossesses à risque.……………………………………5
OBJECTIF DU PROGRAMME DE RECHERCHE……………………………………...6
MATERIELS ET METHODES……………………………………………………………7
I) Matériels……………………………………………………………………………7
II) Méthodes……………………………………………………………………7
1) Extraction ADN…………………………………………………………...7
2) Quantification……………………………………………………………..7
3) PCR-SPP…………………………………………………………………….7
4) PCR-HRM……………………………………...……………………………9
RESULTATS……………………………...…………………………………………………10
I) Validation de la méthode de DPN sur HPA-1……………………………………...10
II) Mise au point du DPN sur HPA-3…………………………………………………14
III) Mise au point du DPN sur HPA-5………………………………………………..17
DISCUSSION………………………………...……………………………………………19
TABLE DES MATIERES
ADN Acide Désoxyribo Nucléique ARN Acide Ribo Nucléique Ct Threshold Cycle DMSO Diméthylsulfoxide DNases DésoxyriboNucléases DPN Diagnostic PréNatal EDTA Ethylène Diamine Tétra-Acétate Fc Fragment constant FNAIT Foetal and Neonatal Allo-Immune Thrombopenia GP Glycoprotéine GIP Groupement d’Intérêt Public HIC Hémorragie Intracrânienne HLA Human Leucocyte Antigen HPA Human Platelet Antigen HRM High Resolution Melting IgG Immunoglobulines G INTS Institut National de la Transfusion Sanguine MAIPA Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens MgCl2 Chlorure de Magnésium MHNN Maladie Hémolytique du Nouveau-Né PCR Polymerase Chain Reaction PRP Plasma Riche en Plaquettes RNases RiboNucléases SSP Single Specific Primer VIH Virus de l’Immunodéficience Humain
ABREVIATIONS
I) Présentation
1) L’INTS
L’Institut National de la Transfusion Sanguine (INTS) est un Groupement d’Intérêt Public
(GIP). Il se rattache à la veille et la sécurité sanitaire. Ses activités sont dévolues à l'analyse, à
la maîtrise et à la prévention des risques transfusionnels ainsi qu'à l'évolution de la transfusion
sanguine et de la médecine transfusionnelle en France et dans le contexte européen.
L’INTS regroupe un centre national de référence pour les groupes sanguins, un centre
national de référence pour la surveillance des hépatites B et C et du VIH, un laboratoire du
polymorphisme génétique et un laboratoire d’immunologie plaquettaire.
2) Le laboratoire d’immunologie plaquettaire
Ce dernier est un laboratoire multidisciplinaire regroupant des compétences en immunologie,
hématologie, biochimie et biologie moléculaire. Il possède deux activités principales :
laboratoire d’analyses médicales et laboratoire de recherche fondamentale.
Des prélèvements de patients thrombopéniques, provenant de tous les hôpitaux français et de
grands laboratoires privés (Biomnis, Cerba) sont reçus. Plusieurs techniques sont utilisées
pour la recherche d’une cause immunologique à la pathologie : la détection des
immunoglobulines (IgG) fixées à la surface des plaquettes par cytométrie en flux, la détection
des anticorps anti glycoprotéines plaquettaires, libres dans le sérum ou fixés sur les plaquettes,
par la technique MAIPA (Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens) et le
typage plaquettaire : phénotypage par méthodes sérologiques et génotypage par biologie
moléculaire.
II) Les plaquettes
1) Structure
Les plaquettes sanguines, également appelées thrombocytes, sont les plus petits éléments
figurés du sang. Ce sont des particules anucléées, discoïdes, mesurant de 2 à 3 µm de
INTRODUCTION
diamètre et prenant naissance dans la moelle osseuse. Elles sont produites par fragmentation
de précurseurs : les mégacaryocytes. Dans le sang, elles sont au nombre de 150000 à 400000
par mm3 et leur durée de vie est d’environ 8 à 10 jours. Elles sont ensuite éliminées par les
macrophages dans la rate1. La membrane plasmique des plaquettes est composée de
nombreuses glycoprotéines (GP) et de phospholipides. Ces GP, appartenant à la famille des
intégrines, sont présentes sous forme de complexes multimoléculaires GPIIb/IIIa, GPIa/IIa et
GPIb/IX. Elles portent des déterminants antigéniques, appelés HPA (Human Platelet
Antigen), responsables d’allo-immunisation lors de transfusions ou de grossesses2.
2) Fonction
Leur rôle majeur intervient lors de l’hémostase primaire : elles permettent le maintien de
l’intégrité du système vasculaire et constituent la première ligne de défense contre les
hémorragies grâce à leurs propriétés d’adhésion, de sécrétion, d’agrégation et leur activité
pro-coagulante. La GPIa/IIa interagit avec le collagène, et la GPIb/IX avec le facteur
vonWillebrand lié au sous-endothélium, ce qui permet la formation d’une mono couche de
plaquettes sur la lésion afin de l’obstruer, et l’activation des plaquettes se fait ensuite en
quelques secondes. La GPIIb/IIIa se lie enfin au fibrinogène plasmatique afin de former un
caillot réversible appelé thrombus2.
III) Thrombopénie fœtales ou néonatale allo-immune
L’allo-immunisation plaquettaire materno-fœtale, qui touche un cas sur 1000 naissances, est à
l’origine de thrombopénies fœtales ou néonatales allo-immune (FNAIT : Fœtal and Neonatal
Allo-Immune Thrombocytopenia), ayant pour conséquence une diminution de plaquettes.
Cette affection est considérée comme l’équivalent plaquettaire de la Maladie Hémolytique du
Nouveau-Né (MHNN) avec cependant la possibilité que le premier enfant soit atteint3.
1) Aspects cliniques
Pour un nouveau-né, le diagnostic de FNAIT est suspecté lorsqu’il présente des pétéchies ou
un purpura généralisé à la naissance ou dans les heures suivantes, sans signe clinique d’une
infection ou de malformations. Les enfants avec une thrombopénie modérée sont
asymptomatiques et le diagnostic peut être méconnu. Chez le fœtus, la thrombopénie peut être
suspectée à l’échographie fœtale. Dans 20 à 30% des cas, l’enfant présente une hémorragie
intracrânienne (HIC) in utéro ou lors de l’accouchement pouvant conduire dans 10 à 15 % des
cas au décès4.
2) Causes
La FNAIT résulte d’une incompatibilité materno-fœtale pour un ou plusieurs antigènes
plaquettaires fœtaux hérités du père et absents chez la mère. Au cours de la grossesse, lors
d’une incompatibilité entre les allo-antigènes plaquettaires de la mère et du fœtus, la mère
peut s’immuniser, synthétisant des anticorps d’isotype IgG vis-à-vis des allo-antigènes du
fœtus considérés comme étrangers. Le transfert transplacentaire des anticorps maternels IgG a
lieu dès 14 semaines de gestation, et les antigènes plaquettaires étant exprimés fortement dès
16 à 18 semaines de gestation, les plaquettes fœtales recouvertes d’anticorps vont pouvoir être
détruites tôt dans la vie fœtale par le système réticulo histiocytaire5.
3) Antigènes plaquettaires impliqués
A ce jour, 28 allo-antigènes plaquettaires ont été décrits. La majorité d’entre eux est située sur
le complexe GPIIb/IIIa. On compte six systèmes bi-alléliques (HPA-1 à -5, et -15) (table1).
Antigène Glycoprotéine Nucléotide modifié Acide aminé modifié Référence
HPA-1 GPIIIa 176 T>C L33P Newman et al.6
HPA-2 GPIb 482 C>T T145M Kuijpers et al.7
HPA-3 GPIIb 2621 T>G I843S Lyman et al.8
HPA-4 GPIIIa 506 G>A R143Q Wang et al.9
HPA-5 GPIa 1600 G>A E505K Santoso et al.10
HPA-15 CD109 2108 C>A S703Y Schuh et al.11
Table 1 : Allo-antigènes plaquettaires fréquents.
L’allèle le plus fréquent est désigné par la lettre «a», l’allèle le moins fréquent par la lettre
«b». La différence entre les deux allèles est liée, dans la majorité des cas, à la substitution
d’un seul nucléotide (l’antigène HPA-14w est une exception, le polymorphisme correspond à
une délétion de trois nucléotides)12
.
La fréquence des allo-antigènes plaquettaires varie selon la population. Chez les caucasiens,
l’antigène HPA-1a est le plus souvent impliqué et le plus sévère dans les thrombopénies
néonatales allo-immune suivi de HPA-5b et HPA-3a ; chez les Asiatiques il s’agit de
l’antigène HPA-4b13
.
4) Diagnostic
L’enfant étant à risque hémorragique pendant toute la phase de thrombopénie sévère, il
importe de faire rapidement le diagnostic de thrombopénie néonatale allo-immune afin de
mettre en œuvre le traitement adapté. Le diagnostic est établi lorsque les allo-anticorps
maternels sont identifiés correspondant à l’incompatibilité antigénique plaquettaire entre la
mère et l’enfant. Il importe donc d’effectuer la recherche et l’identification de l’alloanticorps
maternel et d’effectuer le typage plaquettaire de la famille14
.
a) Cytométrie en flux
La cytométrie en flux permet l’identification des immunoglobulines associées aux plaquettes.
Cependant, cette technique ne permet pas de déterminer si les anticorps sont fixés aux
glycoprotéines ou au récepteur Fc des plaquettes.
Cette technique, considérée comme un test de dépistage, ne permet pas d’affirmer le caractère
immunologique de la thrombopénie. En effet, les anticorps fixés aux plaquettes peuvent être
dirigés contre le système HLA, les groupes sanguins ABO, ou les systèmes HPA15
.
b) MAIPA
A la différence de la cytométrie en flux, les méthodes d’immunocapture antigénique
permettent de caractériser ces anticorps.
La détection des anticorps est réalisée par la technique de MAIPA (Monoclonal Antibody
Immobilization of Platelet Antigens). Cette méthode immuno-enzymatique demeure la
méthode de référence pour la détection et l’identification des auto- ou allo-anticorps anti-GP
plaquettaires. Elle est basée sur l’immobilisation sur plaque des glycoprotéines plaquettaires
sensibilisées par des anticorps monoclonaux murins. Seuls les anticorps ayant une spécificité
pour les glycoprotéines, qu’ils soient sériques ou fixés aux plaquettes, sont détectés16
.
c) Typage plaquettaire
Le typage plaquettaire est réalisé par phénotypage grâce à des antisérums humains de
référence contenant des anticorps anti-HPA1a, anti-HPA-3a, ou anti-HPA-5b. Cependant la
connaissance des bases moléculaires des alloantigènes plaquettaires ainsi que le manque de
réactifs sérologiques pour effectuer le phénotypage, ont conduit à la réalisation du génotypage
plaquettaire. Le génotypage plaquettaire est effectué par une technique de PCR multiplexe
qui associe l’utilisation de billes fluorescentes et de puces à ADN (HPA BeadChip, BioArray
Solutions). Pour le diagnostic prénatal sur liquide amniotique, le génotypage sur BioArray est
associé à une technique de PCR SSP (Single Specific Primer - Polymerase Chain Reaction) 17
.
5) Prise en charge post-natale
En cas d’hémorragie ou de numération plaquettaire inférieure à 30000/mm3
pendant les 24
premières heures de vie, la transfusion de plaquettes maternelles lavées et irradiées est le
traitement de choix. A défaut, le nouveau-né peut-être transfusé par des plaquettes de
donneurs HPA-1bb (l’incompatibilité HPA-1a étant la plus fréquente) ou en cas d’urgence,
par des plaquettes standards associées à l’administration d’immunoglobulines polyvalentes18,
19.
6) Prise en charge des grossesses à risque
Lors d’une grossesse suivante, pour tout fœtus incompatible, le risque de récurrence est élevé
avec une aggravation de l’atteinte.
Lorsque l’incompatibilité entre les parents n’est pas obligatoire (père hétérozygote pour un
antigène plaquettaire), le laboratoire réalise un diagnostic prénatal par génotypage du fœtus.
La prise en charge thérapeutique maternelle repose sur une injection hebdomadaire
d’immunoglobulines polyvalentes (1g/kg) de 16 à 20 semaines d’aménorrhée jusqu’au terme
de la grossesse avec l’éventuelle adjonction de corticoïdes à partir de 30 semaines.
L’accouchement est réalisé par césarienne20
.
Le diagnostic prénatal (DPN) non invasif des thrombopénies fœtales est un enjeu majeur du
laboratoire d’immunologie plaquettaire. Le DPN est réalisé à l’heure actuelle à partir
d’amniocentèse. Ce geste invasif peut être à l’origine de fausses couches spontanées.
Une méthode de génotypage sur l’ADN fœtal présent dans le sang maternel a été développée,
dans le laboratoire, pour HPA-121
. La combinaison de deux techniques de génotypage
plaquettaire fœtal : PCR-SSP et PCR-HRM (High Resolution Melting - Polymerase Chain
Reaction) à partir de l’ADN fœtal circulant dans le sang maternel permet un diagnostic non
invasif plus sûr et à un terme précoce de la grossesse.
Deux autres systèmes sont régulièrement impliqués dans les thrombopénies fœtales et
néonatales : HPA-3 et HPA-5. Cependant il n’existe pas, à ce jour, de diagnostic prénatal non
invasif pour ces systèmes.
L’objectif de ce travail de recherche est d’une part d’augmenter la cohorte de patientes pour
lesquelles un génotypage plaquettaire fœtal pour HPA-1 est nécessaire, afin de valider la
méthode. Pour cela une PCR-SSP et une PCR-HRM seront effectuées selon le protocole déjà
développé.
D’autre part, il s’agit de mettre au point un protocole pour le diagnostic prénatal des systèmes
HPA-3 et HPA-5. En effet, le protocole pour HPA-1 ne peut être totalement applicable pour
ces deux systèmes en raison d’une région à amplifier riche en GC pour HPA-3 (formation de
structure secondaire diminuant l’accès aux amorces) et d’un amplicon plus long pour HPA-5.
OBJECTIF DU PROGRAMME DE RECHERCHE
I) Matériels
Les prélèvements recueillis au laboratoire proviennent de patients thrombopéniques, ou de
familles sujettes aux thrombopénies fœtales et néonatales (un consentement pour l’étude
génétique est recueilli). Pour les femmes enceintes, pour lesquelles une thrombopénie
néonatale avait été diagnostiquée pour un précédent enfant, le génotypage plaquettaire fœtal à
partir du sang maternel (sérum/plasma) est effectué dès la 10ème
semaine de grossesse Le
sérum est préparé à partir de 5mL de sang, prélevé sur tube sec et centrifugé 10 min à 2200g.
Le plasma est, quant à lui, préparé à partir de 5mL de sang, prélevé sur tube EDTA (Ethylène
Diamine Tétra-Acétate), centrifugé 4 min à 850g à 20°C. Le surnageant, correspondant au
plasma riche en plaquettes (PRP), est récupéré puis centrifugé 10min à 2200g à 20°C. Le
surnageant recueilli correspond alors au plasma.
II) Méthodes
1) Extraction ADN
L’ADN circulant est extrait à partir de 1mL de sang maternel par le kit QIAmp Circulating
Nucleic Acid (Qiagen), permettant l’extraction d’ADN circulant à partir de grands volumes (1
à 5mL) de plasma ou de sérum. La méthodologie, décrite dans le guide du kit, a été suivie
sauf pour l’élution qui a été réalisée dans 65µL d’eau.
2) Quantification
Il s’agit de déterminer la concentration d’ADN extrait à partir de sérum ou plasma par la
technique précédente. Pour cela, la quantification d’ADN est réalisée par le fluorimètre Qubit
(Invitrogen) à l’aide d’un agent fluorescent et intercalant de l’ADN, en suivant les
recommandations du fournisseur.
3) PCR-SSP
La PCR-SSP en temps réel est basée sur la détection d’un signal fluorescent (SYBR Green)
permettant de mesurer en continu la quantité d’ADN synthétisée au cours de la phase
exponentielle. Le Sybr Green ne fluoresce que lorsqu’il est lié à l’ADN double brin. La
quantification de la fluorescence du Sybr Green est à associer à la courbe de fusion
MATERIELS ET METHODES
correspondante afin de vérifier la spécificité des produits amplifiés. En effet, chaque amplicon
spécifique a une température de fusion qui lui est propre. La PCR est effectuée à l’aide du
Rotor Gene 2QPlex HRM de Qiagen et repose sur l’utilisation de deux couples d’amorces.
Chaque couple est composé d’une amorce commune et d’une amorce spécifique de l’allèle à
amplifier (table 2). Ainsi, deux amplifications sont réalisées pour chaque antigène plaquettaire
HPA-Xa et HPA-Xb (figure 2).
Nom de l’amorce Séquence
HPA-1a sens 5’-ACTTACAGGCCCTGCCTCT-3’
HPA-1b sens 5’-ACTTACAGGCCCTGCCTCC-3’
HPA-1 anti sens 5’-AGCCCTTGTCGCTGAGG-3’
HPA-3a sens 5’-GGGGGAGGGGCTGGGGA-3’
HPA-3b sens 5’-GGGGGAGGGGCTGGGGC-3’
HPA-3 anti sens 5’-GGCCCTGGGACTGTGAAT-3’
HPA-5a sens 5’-AGTCTACCTGTTTACTATCAAAG-3’
HPA-5b sens 5’-AGTCTACCTGTTTACTATCAAAA-3’
HPA-5 anti sens 5’-CTCTCATGGAAAATGGCAGTAC-3’
Table 2 : Séquence des amorces utilisées en PCR-SSP pour l’étude de HPA-1, -3 et -5.
Figure 2 : Principe de la PCR SSP appliquée au génotypage plaquettaire.
Deux mix sont préparés pour l’ensemble des échantillons, contenant l’amorce commune et
soit l’amorce HPA-Xa soit l’amorce HPA-Xb, et sans ADN. 15µL de ce mix sont distribués
dans chaque tube puis 10µL de chaque échantillon d’ADN, préalablement ajusté à 1ng/µL,
sont ajoutés (table 3).
Concentration
initiale Concentration/quantité
finale
Real Master Mix Syber Rox (5 Prime) 2,5 X 1X
MgCl2 25 mM 2 mM
Primer c 20 µM 0.5 µM
Primer 1a/1b 20 µM 0.5 µM
ADN - 10 ng
Table 3 : Préparation du mix SSP pour la système HPA-1, pour un échantillon.
Homozygote HPA-Xaa
Homozygote HPA-Xbb
Hétérozygote HPA-Xab
Amorce antisens commune
Amorce sens allèle b spécifique
Amorce sens allèle a spécifique
Allèle a
Allèle a
Allèle b
Allèle b
Polymorphisme HPA
Un programme de deux heures est utilisé pour le système HPA-1 : 2min à 95°C, (30sec à
95°C, diminution de 0,4°C à chaque cycle de 68 à 58°C, 30sec à 68°C ) x 25 cycles, (30sec à
95°C, 30sec à 54°C, 30sec à 68°C) x 25 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95°C avec un pas
de 1°C/sec
4) PCR-HRM
La PCR-HRM en temps réel est basée sur l’intégration à de l’ADN amplifié par PCR d’un
fluorochrome intercalant (Eva Green) permettant de mesurer en continu la quantité d’ADN
synthétisée au cours de la phase exponentielle. L’Eva Green ne fluoresce que lorsqu’il est lié
à l’ADN double brin et est plus saturant que le Sybr Green. La PCR est effectuée à l’aide du
Rotor Gene de Qiagen et repose sur l’utilisation d’un seul couple d’amorce qui encadre la
région d’ADN correspondant au polymorphisme de HPA-X (table 4).
Nom de l’amorce Séquence
HPA-1 sens 5’-CTCCTGTCTTACAGGCCC-3’
HPA-1 anti sens 5’-CACAGCGAGGTGAGCC-3’
HPA-3 sens 5’GCCTGACCACTCCTTTGC-3’
HPA-3 anti sens 5’GTCTGCGATCCCGCTTGT-3’
HPA-5 sens 5’-GAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTA-3’
HPA-5 anti sens 5’-GCAAATTAAACTATTAGTTTATTTTTTTTTTTTTACCT-3’
Table 4 : Séquence des amorces utilisées en PCR-HRM pour HPA-1, -3 et -5.
Un mix commun pour tous les échantillons est préparé sans ADN. 15µL de ce mix sont
distribués dans chaque tube puis 10µL de chaque échantillon d’ADN à 1ng/µL sont ajoutés
(table 5).
Concentration
initiale Concentration/quantité
finale
HRM Master Mix (Qiagen)
2X 1 X
Primer 10µM 0,7 µM
ADN - 10 ng
Table 5 : Préparation du mix HRM pour le système HPA-1, pour un échantillon.
Un programme de trois heures est utilisé pour le système HPA-1: 5min à 95°C, (10sec à 95°C,
30sec à 60°C) x 50 cycles, 30sec à 95°C, 30sec à 60°C, cycle de HRM : augmentation de la
température de 70 à 90°C avec un pas de 0.05°C/sec, et une courbe de fusion entre ces mêmes
températures est également réalisée (pas de 1°C/sec).
I) Validation de la méthode de DPN sur HPA-1
La validation de la méthode de DPN sur HPA-1 a pour but d’évaluer sa reproductibilité, sa
fiabilité et sa sensibilité. Afin d’augmenter la cohorte de patientes pour lesquelles un
génotypage plaquettaire HPA-1 fœtal est nécessaire, une PCR-SSP et une PCR-HRM sont
effectuées selon un protocole déjà développé. Ces deux méthodes doivent être réalisées pour
un DPN complet.
1) PCR-SSP
La PCR-SSP est effectuée sur des échantillons contrôles HPA-1aa, 1bb, sur les échantillons
de patientes et sur un contrôle négatif (l’eau). Les courbes d’amplification et de fusion sont
obtenues pour chaque allèle « a » et « b ».
Figure 3 : PCR-SSP sur les échantillons contrôles HPA-1aa (rouge), HPA-1bb (bleu),
l’échantillon patient 643350 (vert). A et B représentent respectivement les courbes
d’amplification et de fusion pour l’allèle « a ». C et D représentent respectivement les courbes
d’amplification et de fusion pour l’allèle « b ».
Une droite seuil est tracée à la moitié de la phase exponentielle de cette courbe correspondant
à la moitié de la fluorescence finale. L’intersection entre la droite et la courbe en phase
exponentielle correspond au cycle seuil Ct (Threshold Cycle).
Cycle
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Norm
. F
luoro
.
-0,510
-1,010
-1,510
-2,010
-2,510
-3,010
Threshold
ºC
75 80 85 90 95
dF/d
T
7
6
5
4
3
2
1
0
Cycle
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Norm
. F
luoro.
-0,510
-1,010
-1,510
-2,010
-2,510
-3,010
Threshold
ºC
75 80 85 90 95
dF/d
T
7
6
5
4
3
2
1
0
A
RESULTATS
B
C D
Tout d’abord, le contrôle négatif doit être vérifié. Pour l’allèle « a », l’eau sort entre 33 et 37
cycles et pour l’allèle « b », elle sort à 26 cycles, mais aucun pic spécifique pour ces deux
allèles n’est observé (non représenté).
Des critères d’analyse ont été définis au préalable. Les duplicats de chaque échantillon
(contrôles et allèle correspondant au génotype de la mère) doivent sortir entre 23 et 31 cycles
et avoir un écart de sortie de cycle de moins de 0,3. Les courbes de fusion obtenues, pour être
spécifiques de l’amplicon recherché, doivent posséder un pic à 90,5 ±0,5°C. Les échantillons
testés correspondent bien à ces critères.
Le contrôle HPA-1aa sort à 23 cycles pour l’allèle « a » et l’écart type de sortie de cycle est
inférieur à 0,3 (figure 3A). Un pic à 90,5°C est observé sur la courbe de fusion, il s’agit donc
d’une amplification spécifique de l’allèle « a » (figure 3B). Pour l’allèle « b », le contrôle 1aa
sort à 32 cycles, l’écart type est inférieur à 0,3 (figure 3C) mais aucun pic à 90,5°C n’est
observé. Il n’y a donc pas d’amplification spécifique de l’allèle « b » (figure 3D).
Le contrôle HPA-1bb sort à 25 cycles pour l’allèle « b » et l’écart type est inférieur à 0,3
(figure 3C). Sur la courbe de fusion, un pic à 90,5°C est observé, il s’agit d’une amplification
spécifique de l’allèle « b » (figure 3D). Pour l’allèle « a », le contrôle 1bb sort à 27 cycles,
l’écart type de sortie de cycle est supérieure à 0,3 (figure 3A), mais sur la courbe de fusion, un
pic de faible intensité à 90,5°C est observé (figure 3B). Il y a donc, étonnamment, une
amplification spécifique de l’allèle « a ».
Les deux contrôles doivent montrer que la PCR a bien marché et doivent montrer la
spécificité des amorces : pour le contrôle aa, amplification de l’allèle « a » et pas
d’amplification pour l’allèle « b » ; pour le contrôle bb, amplification de l’allèle « b » et pas
d’amplification pour l’allèle « a ». Or on retrouve une amplification de l’allèle « a » dans le
contrôle bb. Ceci est du probablement au fait que le prélèvement provenait d’une femme qui
venait d’accoucher d’un bébé incompatible. L’ADN fœtal n’a pas complètement disparu, et
est en faible quantité, d’où un écart type de sortie de cycle entre les duplicats supérieur à 0,3.
Ceci met donc en avant la difficulté d’avoir un «réel» contrôle.
Pour l’allèle « b » la patiente sort à 28 cycles et l’écart type de sortie de cycle est inférieur à
0,3 (figure 3C). Sur la courbe de fusion, un pic à 90,5°C est observé, il y donc une
amplification spécifique de l’allèle « b » (figure 3D). Pour l’allèle « a », la patiente sort à 28
cycles et l’écart type de sortie de cycle est supérieur à 0,3 (figure 3A). Les duplicats ne sont
pas bons mais sur la courbe de fusion, un pic à 90,5°C est observé pour un des duplicats
(figure 3B). L’écart type de sortie de cycle peut être supérieur à 0,3, même si ce n’est pas
l’idéal, car il s’agit d’évènements rares. Pour pallier cet effet, la PCR peut être recommencée
avec une quantité d’ADN plus importante. Il y aurait donc de l’allèle « a » provenant du fœtus
puisque la mère est connue pour être de génotype 1bb. La patiente est de génotype 1bb,
comme le confirment les résultats mais il existe de l’allèle « a » en petite quantité dans
l’échantillon. Il semble donc y avoir une incompatibilité entre la mère et le fœtus.
Des résultats similaires ont été obtenus pour sept autres patientes. Les résultats sont à
confronter avec ceux de PCR-HRM pour pouvoir conclure à une incompatibilité ou non.
2) PCR-HRM
La PCR-HRM est effectuée sur les échantillons de plasmas ou de sérums de patientes, avec
les contrôles HPA-1aa et 1bb appropriés extraits à partir de plasma ou de sérum en fonction
de la nature des échantillons patients à analyser. Les courbes HRM normalisée et
différentielle par rapport au contrôle HPA-1bb sont obtenues, car les patientes étudiées sont
de génotype 1bb. Si la mère est de génotype 1aa, la courbe HRM différentielle se fait par
rapport au contrôle 1aa.
Figure 4 : PCR-HRM sur les échantillons contrôles HPA-1aa (rouge), HPA-1bb (bleu),
l’échantillon plasma patient 643350 (vert) et l’ échantillon sérum patient 643940 (turquoise).
A et B correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM
différentielle par rapport au contrôle HPA-1bb, pour les échantillons de sérum. C et D
correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM différentielle
par rapport au contrôle HPA-1bb, pour les échantillons de plasma.
deg.
74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
Norm
alis
ed F
luore
scence
100
80
60
40
20
deg.
74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
Norm
alised m
inus B
BS
0
-5
-10
-15
deg.
74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
Norm
alis
ed F
luore
scence
100
80
60
40
20
deg.
74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
Norm
alised m
inus B
B
0
-5
-10
C D
A B
Des critères d’analyse ont été préalablement définis. Les duplicats de chaque échantillon
doivent sortir avant 30 cycles, et la différence de sortie de cycle entre les contrôles et les
patients doit être inférieure à 3. Les courbes de fusion obtenues, pour que l’amplicon soit
spécifique, doivent posséder un pic entre 81 et 82,5°C.
Les échantillons de sérum sortent avant 30 cycles et la différence de sortie de cycle entre les
contrôles et l’échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de fusion, un pic à 81°C est
observé pour le contrôle 1aa et à 81,7°C pour le contrôle 1bb et la patiente. Dans un tableau
de résultat, le logiciel détermine le génotype des échantillons en fonction des contrôles
prédéterminés et calcule un pourcentage de confiance à accorder à ce génotypage. Un seuil de
confiance a été établit à 95%. En dessous de ce seuil, l’échantillon est noté «variation», il est
alors ni 1aa ni 1bb homozygote, mais il existe un «contaminant». Il est possible de voir sur le
graphique si l’échantillon est plus proche du contrôle 1aa ou 1bb et donc de déterminer la
nature du contaminant, 1b ou 1a sachant le génotype des parents. L’échantillon sérum patient
643940 est noté HPA-1bb avec un pourcentage de confiance supérieur à 95%. Il possède le
même profil que le contrôle 1bb et ces résultats sont également observés sur les graphiques
normalisés et différentiels (figures 4A et 4B). La mère étant de génotype 1bb, il semble
exister une compatibilité entre la mère et son fœtus.
Les échantillons de plasma, quant à eux, sortent bien avant 30 cycles et la différence de sortie
de cycle entre les contrôles et l’échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de
fusion, un pic à 81°C est observé pour le contrôle 1aa et à 81,7°C pour le contrôle 1bb et la
patiente. Dans le tableau de résultats, l’échantillon plasma patient 643350 est noté «variation»
avec un seuil de confiance définit à 95%. En effet, son profil est différent de celui des
contrôles et ces résultats sont également observés sur les graphiques normalisés et
différentiels (figure 4C et 4D). La courbe du patient coupe la courbe du contrôle 1bb. La mère
étant de génotype 1bb, il existe donc un allèle a dans l’échantillon. Il semble donc qu’il y ait
une incompatibilité entre la mère et son fœtus.
Des résultats similaires ont été obtenus pour les sept autres patientes.
3) Résultats des DPN
Pour toutes les patientes testées, les résultats des PCR-SSP et HRM sont concordants entre
eux et avec les résultats attendus, permettant de conclure une incompatibilité avec leur fœtus
dans le système plaquettaire HPA-1 sauf pour la patiente 643940 qui présente une
compatibilité.
II) Mise au point du DPN sur HPA-3
1) PCR-SSP
Pour la mise au point de la PCR-SSP pour le système HPA-3, l’utilisation des amorces : sens
HPA-3a (5’ACTGGGGGCTGCCCAT-3’), sens HPA-3b (5’ACTGGGGGCTGCCCAG-3’)
et antisens (5’GTCTGCGATCCCGCTTGT-3’) n’a pas permis d’obtenir des résultats
satisfaisants. L’ajout d’additifs tels que du MgCl2, du glycérol, du formamide et du DMSO,
seuls ou combinés, et à des doses croissantes, a été testé sans aucun succès. Une concentration
en amorces de 1µM a donné les meilleurs résultats. Nous avons également testé plusieurs
conditions dans le programme de PCR en faisant varier la température d’hybridation, le
nombre de cycles ou le temps de dénaturation.
Pour finir, un mix contenant les amorces (décrites dans la table 2) à 1µM et sans additifs, une
quantité d’ADN de 10ng, un volume final de réaction de 25µL et le programme de PCR
suivant : 2min à 95°C, (15sec à 95°C, diminution de 0,4°C/cycle de 68 à 66°C, 30sec à 72°C)
x 5 cycles, (15sec à 95°C, 30sec à 61°C, 30sec à 72°C) x 30 cycles, courbe de fusion entre 70
et 95°C avec un pas de 1°C/sec, ont permis l’obtention d’une amplification spécifique de
l’allèle « a » pour les échantillons de génotype aa et ab. Les différentes conditions testées
n’ont pas permis l’amplification spécifique de l’allèle « b ».
Les courbes d’amplification et de fusion sont obtenues pour chaque allèle « a » et « b ».
Figure 5 : PCR-SSP sur les échantillons contrôles HPA-3aa (rouge), 3bb (bleu), 3ab (violet).
A et B représentent les courbes d’amplification et de fusion de l’allèle « a », C et D les
courbes d’amplification et de fusion de l’allèle « b ».
Cycle
5 10 15 20 25 30 35
Norm
. F
luoro
.
-1,010
-1,510
-2,010
-2,510
-3,010
Threshold
ºC
75 80 85 90 95
dF/d
T
2,25
2,00
1,75
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
Cycle
5 10 15 20 25 30 35
Norm
. F
luoro
.
-1,010
-1,510
-2,010
-2,510
-3,010
Threshold
ºC
75 80 85 90 95
dF/d
T
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
A B
C D
Tout d’abord, le contrôle négatif doit être vérifié. Pour l’allèle « a », l’eau ne sort pas et pour
l’allèle « b », elle sort à 30 cycles mais aucun pic spécifique pour les deux allèles n’est
observé. Il ne s’agit donc pas d’une amplificaction spécifique (non représenté). Pour la mise
au point, les tests ont été effectués en simplicat pour économiser le volume des échantillons
du fait du manque de prélèvement. Ainsi, l’ écart type de sortie de cycle ne peut être calculé.
Les critères d’analyse sont les mêmes que ceux définis pour HPA-1.
Le contrôle HPA-3aa sort à 24 cycles pour l’allèle « a » (figure 5A). Un pic à 91°C est
observé sur la courbe de fusion, il s’agit donc d’une amplification spécifique de l’allèle « a »
(figure 5B). Pour l’allèle « b », le contrôle 3aa sort avant 30 cycles (figure 5C) mais aucun pic
à 90°C n’est observé. Il n’y a donc pas d’amplification spécifique de l’allèle « b » (figure 5D).
Le contrôle HPA-3bb sort avant 30 cycles pour l’allèle « b » (figure 5C). Sur la courbe de
fusion, un pic à 90°C est observé, il s’agit d’une amplification spécifique de l’allèle « b »
(figure 5D). Pour l’allèle « a », le contrôle 3bb sort à 35 cycles (figure 5A) mais sur la courbe
de fusion, aucun pic à 91°C n’est observé (figure 5B). Il n’y a donc pas d’amplification
spécifique de l’allèle « a ».
Le contrôle HPA-3ab sort à 30 cycles pour l’allèle « a » (figure 5A). Sur la courbe de fusion,
un pic à 91°C est observé (figure 5B). Il y a donc une amplification spécifique de l’allèle
« a ». Pour l’allèle « b », le contrôle 3ab sort avant 30 cycles (figure 5C). Sur la courbe de
fusion, un pic à 90°C est observé mais il est de très faible intensité (figure 5D). Il est donc
difficile de conclure sur l’allèle « b » pour ce contrôle.
Pour l’allèle « a », les contrôles aa, bb et ab montrent que la PCR a bien marché et montrent la
spécificité des amorces : pour les contrôle aa et ab, amplification de l’allèle a, pour le contrôle
bb, pas d’amplification. Cependant, les résultats pour l’amorce « b » ne sont pas encore au
point étant donné que le pic du contrôle ab n’est pas assez franc.
2) PCR-HRM
Pour la PCR-HRM, une PCR en gradient de température a permis de déterminer la meilleure
température d’hybridation. Nous avons testés les amorces décrites dans l’article de Liew et
al22
et de nouvelles amorces (table 4), à des concentrations différentes et avec ajout d’additifs
tels que du MgCl2, du glycérol ou du formamide. Les meilleurs résultats ont été trouvés en
utilisant un mix de PCR avec les nouvelles amorces à 1µM et sans additifs, et le programme
suivant : 5min à 95°C, 20sec à 95°C et 30sec à 61°C pendant 60 cycles, suivi d’un cycle de
HRM (augmentation de la température de 80 à 95°C avec un pas de 0.05°C/sec).
La PCR-HRM est effectuée sur les échantillons de plasmas ou de sérums de patientes, avec
les contrôles HPA-3aa et 3bb appropriés extraits à partir de plasma ou de sérum en fonction
de la nature des échantillons patients à analyser. Les courbes HRM normalisées et
différentielles par rapport au contrôle HPA-3bb (pour les mères HPA-3bb) et au contrôle
HPA-3aa (pour les mères HPA-3aa) sont obtenues.
Figure 6 : PCR-HRM sur les échantillons contrôles HPA-3aa (rouge), HPA-3bb (bleu),
l’échantillon sérum patient 645976 (marron) et l’échantillon plasma patient 644753 (vert). A
et B correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM
différentielle par rapport au contrôle HPA-3bb, pour les échantillons de sérum. C et D
correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM différentielle
par rapport au contrôle HPA-3bb, pour les échantillons de plasma.
Les échantillons de sérum sortent entre 34 et 37 cycles et la différence de sortie de cycle entre
les contrôles et l’échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de fusion, un pic entre
88 et 89°C est observé en fonction des échantillons. Dans le tableau de résultat, l’échantillon
sérum patient 645976 est noté «variation». En effet, il ne possède pas le même profil que les
contrôles et la courbe coupe celle du contrôle 3bb. Ces résultats sont également observés sur
les graphiques normalisés et différentiels (figure 6A et 6B). La mère étant de génotype 3bb, il
semble exister une incompatibilité entre la mère et son fœtus.
Les échantillons de plasma, quant à eux, sortent entre 33 et 36 cycles et la différence de sortie
de cycle entre les contrôles et l’échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de
fusion, un pic entre 88 et 89°C est observé en fonction des échantillons. Comme pour HPA-1,
il existe un tableau de résultats avec un seuil de confiance définit à 95%. L’échantillon plasma
patient 644753 est noté HPA-3aa pour un des duplicats avec un pourcentage de confiance
supérieur à 95%. En effet, il possède le même profil que le contrôle 3aa et ces résultats sont
également observés sur les graphiques normalisés et différentiels (figure 6C et 6D).
deg.
83 84 85 86 87 88 89 90 91
Norm
alis
ed F
luore
scence
100
80
60
40
20
deg.
83 84 85 86 87 88 89 90 91
Norm
alis
ed m
inus B
BS
0
-5
-10
-15
-20
-25
deg.
83 84 85 86 87 88 89 90 91
Norm
alis
ed F
luore
scence
100
80
60
40
20
deg.
83 84 85 86 87 88 89 90 91
Norm
alis
ed m
inus A
AP
L
5
0
-5
A B
C D
Cependant, il existe un écart entre les duplicats (∆Ct = 0.44), en effet l’autre duplicat indique
une incompatibilité. La mère est de génotype 3aa mais il est impossible de conclure à une
incompatibilité ou non, la PCR devrait être refaite.
La PCR-HRM a également été réalisée sur quatre autres patientes pour lesquelles
l’incompatibilité ou la compatibilité étaient connues. Des profils communs aux patientes
compatibles d’une part, et aux patientes incompatibles avec leur fœtus d’autre part, ont été
trouvés.
III) Mise au point du DPN sur HPA-5
La PCR-HRM ayant déjà été mise au point auparavant, seule la PCR-SSP a été faite dans ce
projet. Comme pour le système HPA-3, nous avons testés des concentrations croissantes
d’amorces et d’additifs tels que le MgCl2, le glycérol, le formamide ou le DMSO. Plusieurs
programmes ont été testés : 2min à 95°C, (30sec à 95°C, 30sec à 61°C, 30sec à 72°C) x 50
cycles, courbe de fusion entre 60 et 95°C avec un pas de 1°C/sec ; ou 2min à 95°C, (30sec à
95°C, Diminution de 0,4°C/cycle de 68 à 58°C, 30sec à 68°C) x 25 cycles, (30sec à 95°C,
30sec à 54°C, 30sec à 68°C) x 25 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95°C avec un pas de
1°C/sec. Pour chaque programme, différentes températures d’hybridation ont été testées.
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un mix contenant les amorces (table 2) à 0,5µM et
du MgCl2 à 3,5mM et avec le programme suivant : 2min à 95°C, (30sec à 95°C, diminution
de 0,4°C/cycle de 68 à 58°C, 30sec à 68°C) x 25 cycles, (30sec à 95°C, 30sec à 54°C, 30sec à
68°C) x 25 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95°C avec un pas de 1°C/sec.
La PCR est effectuée sur des échantillons contrôles HPA-5aa, bb et ab en utilisant une
quantité d’ADN de 10ng. Le volume final de réaction est de 30µL. Les courbes
d’amplification et de fusion sont obtenues pour chaque allèle « a » et « b » (figure 7).
Tout d’abord, le contrôle négatif doit être vérifié et ne pas présenté d’amplification spécifique.
Pour l’allèle a, l’eau sort à 39 cycles et pour l’allèle « b », elle sort à 41 cycles, mais aucun pic
spécifique sur la courbe de fusion n’est observé pour les deux allèles.
Le contrôle HPA-5aa sort à 31 cycles pour l’allèle « a » et l’écart type de sortie de cycle est
inférieur à 0,3 (figure 7A). Un pic à 79°C est observé sur la courbe de fusion, il s’agit donc
d’une amplification spécifique de l’allèle « a » (figure 7B). Pour l’allèle « b », le contrôle 1aa
sort à 41 cycles, l’écart type est inférieur à 0,3 (figure 7C) mais le pic observé est inférieur à
79°C. Il n’y a donc pas d’amplification spécifique de l’allèle « b » (figure 7D).
Le contrôle HPA-5bb sort à 35 cycles pour l’allèle « b » et l’écart type est de 0.66 (figure 7C).
Les duplicats ne sont pas bons, cependant sur la courbe de fusion, un pic à 79°C est observé.
Il s’agit donc d’une amplification spécifique de l’allèle « b » (figure 7D). Les duplicats
donnant les mêmes résultats, et du fait du faible volume du contrôle, la PCR n’a pas été
refaite. Pour l’allèle « a », le contrôle 1bb sort à 41 cycles et l’écart type de sortie de cycle est
inférieur à 0,3 (figure 7A), mais aucun pic à 79°C n’est observé sur la courbe de fusion
(figure 7B, pic à 75°C). L’amplification n’est donc pas spécifique.
Le contrôle HPA-5ab sort à 33 cycles pour l’allèle « a » et à 35cycles pour l’allèle « b » avec
un écart type de sortie de cycle inférieur à 0,3 (figure 7A et 7C). Sur les courbes de fusion, un
pic à 79°C est observé pour les deux allèles (figure 7B et 7D). Il y a donc une amplification
spécifique de l’allèle « a » et de l’allèle « b ».
Figure 7 : PCR-SSP sur les échantillons contrôles HPA-5aa (rouge), 5bb (bleu), 5ab (violet) et
l’eau. A et B représentent les courbes d’amplification et de fusion de l’allèle a, C et D les
courbes d’amplification et de fusion de l’allèle b.
Les trois contrôles montrent que la PCR a bien marché et montrent la spécificité des amorces :
pour le contrôle aa, amplification de l’allèle « a » et pas d’amplification pour l’allèle « b » ;
pour le contrôle bb, amplification de l’allèle « b » et pas d’amplification pour l’allèle « a » ;
pour le contrôle ab, amplification des deux allèles.
Cycle
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Norm
. F
luoro.
-0,510
-1,010
-1,510
-2,010
-2,510
-3,010
Threshold
ºC
75 80 85 90 95
dF
/dT
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Cycle
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Norm
. F
luoro.
-0,510
-1,010
-1,510
-2,010
-2,510
-3,010
Threshold
ºC
75 80 85 90 95
dF
/dT
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
A B
C D
Les thrombopénies fœtales ou néonatales alloimmunes sont les plus fréquentes des
thrombopénies isolées sévères du fœtus et du nouveau-né. Au cours des grossesses
successives, l’atteinte fœtale est de plus en plus sévère. Le diagnostic biologique doit pouvoir
bénéficier des techniques les plus sensibles, fiables et reproductibles afin de mettre en place
un traitement adapté pour l’enfant atteint, et proposer une prise en charge adaptée des
grossesses ultérieures. Le DPN des thrombopénies fœtales est réalisé à l’heure actuelle à
partir d’amniocentèse. Ce geste invasif peut être à l’origine de fausses couches spontanées. Le
DPN non invasif est donc un enjeu majeur du laboratoire d’immunologie plaquettaire.
Une méthode de génotypage sur l’ADN fœtal présent dans le sang maternel a déjà été
développée pour HPA-1 en combinant deux techniques : la PCR-SSP et la PCR-HRM afin de
permettre un diagnostic non invasif plus sûr et à un terme précoce de la grossesse (dès 15
semaines d’aménorrhée). La technique par les sondes Taqman, étant plus coûteuse et ayant
donné des résultats non spécifiques pour l’allèle « a » recherché, n’a pas été retenue. Afin de
valider la méthode et sa reproductibilité, le DPN doit être réalisé sur un certain nombre de
patientes (entre 30 et 100). Pour l’instant, ce nombre est de 49 mais nous souhaitons
l’augmenter. Pour cela, nous avons réalisé les deux techniques de PCR sur neuf patientes
HPA-1bb présentant une incompatibilité ou une compatibilité connue avec leur fœtus. Pour
les neuf, l’incompatibilité ou compatibilité a pu être observée dans les deux techniques,
augmentant ainsi la cohorte à 58 patientes. En 2011, Scheffer et al. avaient développé une
méthode de génotypage fœtal HPA-1a non invasive par PCR en temps réel. Les résultats
faussement négatifs causés par l’amplification non spécifique de l’ADN maternel avaient été
exclus par digestion enzymatique de l’ADN grâce à Msp1. Cette digestion permettait de
détruire l’allèle « b », la majorité des mères étant HPA-1bb, et de n’amplifier que l’allèle « a »
s’il était présent chez le fœtus23
. La méthode que nous utilisons, grâce à deux techniques
fiables, est moins sujette aux amplifications non spécifiques et aux digestions incomplètes qui
pourraient se produire avec l’utilisation d’enzymes de restriction. De plus, la technique est
applicable aussi bien aux immunisations HPA-1a que HPA-1b.
Deux autres systèmes sont régulièrement impliqués dans les thrombopénies fœtales et
néonatales : HPA-3 et HPA-5. Cependant il n’existe pas, à ce jour, de DPN non invasif pour
ces systèmes. Le protocole pour HPA-1 ne peut être applicable directement pour ces deux
systèmes en raison d’une région à amplifier riche en GC pour HPA-3 (formation de structure
secondaire diminuant l’accès aux amorces) et d’un amplicon plus long pour HPA-5. Il est
DISCUSSION
donc nécessaire d’adapter le protocole pour ces systèmes. Le DPN pour HPA-3 en PCR-SSP a
pu être mis au point pour l’allèle « a » mais les différentes conditions utilisées n’ont pas
permis l’amplification spécifique de l’allèle « b ». La recherche de l’allèle « a », présent sur
l’ADN fœtal, permettrait de diagnostiquer une incompatibilité entre la mère et son fœtus pour
la majorité des cas d’incompatibilité dans ce système étant donné que la majorité des femmes
impliquées dans une immunisation HPA-3 sont de génotype « bb ». La PCR-HRM a été
réalisée sur six patientes pour lesquelles l’incompatibilité ou la compatibilité étaient connues.
Des profils communs aux patientes compatibles d’une part, et aux patientes incompatibles
avec leur fœtus d’autre part, ont été trouvés. Il serait cependant nécessaire d’effectuer cette
technique sur d’autres échantillons dont l’incompatibilité est connue afin d’augmenter la
cohorte et de vérifier ces profils. Pour HPA-5, la PCR-HRM a déjà été mise au point. Nous
nous sommes donc concentrés sur la PCR-SSP. Cette technique a donné de bons résultats
avec une bonne spécificité des amorces pour chaque allèle et un pic à 79°C retrouvé sur les
courbes de fusion pour chaque amplification spécifique. En revanche, de manière surprenante,
les résultats obtenus avec un volume final de réaction de 30µL ne sont pas retrouvés dans
25µL, alors que la quantité d’ADN et la concentration des différents réactifs du mix sont
restées les mêmes. Il serait donc préférable d’effectuer une nouvelle PCR afin de recontrôler
cette information. De plus, il est intéressant de noter que le programme utilisé pour le système
HPA-5 est le même que pour le système HPA-1. Ainsi, le génotypage de ces deux systèmes
pourra se faire en même temps : dans des tubes séparés, puisque la composition du mix est
différente, mais lors du même programme de PCR. Ce regroupement permettra de gagner du
temps sur le rendu des résultats et permettre une prise en charge encore plus rapide des
incompatibilités.
La suite de ce projet consiste à valider la méthode de DPN pour les systèmes HPA-3 et
-5 en effectuant ces techniques sur une centaine de patientes afin d’évaluer la reproductibilité
de la méthode. Le seul problème est le manque de prélèvements arrivant au laboratoire pour la
recherche d’incompatibilité dans ces systèmes. Cependant, la mise au point de ces techniques
s’ajoute à celles de HPA-1 et à la PCR-HRM déjà effectuée pour HPA-5 et constitue ainsi les
méthodes de génotypage plaquettaire non invasif des trois systèmes pour lesquels les
immunisations sont les plus fréquentes chez les caucasiens. A terme, il ne sera plus nécessaire
d’effectuer d’amniocentèse pour le diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale ou
néonatale allo-immune, un simple prélèvement de sang maternel suffira au diagnostic. De tels
progrès seront un atout considérable pour la prise en charge thérapeutique dans le domaine de
la périnatalité, élément essentiel de la santé publique.
1. Ozier Y, Mignon A, Rosencher N. Les indications des produits sanguins labiles et la
physiologie de la transfusion en chirurgie. TCB, vol 12, ISSUE 2, June 2006 (Revue).
2. Bernard J, Levy JP, Varet B, Chauvel JP, Drain JD, Sultan Y. Les plaquettes sanguines et
leur pathologie quantitative. Abrèges hématologie 1976, 9ème
édition. P:187-201. (Ouvrage).
3. Kaplan C, Morel-Kopp MC, Verdy E, Pron B, Tchernia G, et al. Thrombopénies fœtales et
néonatales immunes. La presse médicale, 31 octobre 1992,21,n°36:1717-1724.
4. Davoren A, Curtis BR, Aster RH, McFarland JG. Human platelet antigen-specific
alloantibodies implicated in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia.
Transfusion. 2004;44:1220-25.
5. Gruel Y, Boizard B, Daffos F, et al. Determination of platelet antigens and glycoproteins in
the human fetus. Blood 1986;68:488-492.
6. Newman PJ, Derbes RS, Aster RH. The human platelet alloantigens, P1A1 and P1A2, are
associated with a leucine33
/proline33
amino acid polymorphism in membrane glycoprotein
IIIa, and are distinguishable by DNA typing. J Clin Invest 1989;83:1778-1781.
7. Kuijpers RWAM, Faber NM, Cuypers HThM, OUwehand WH, von dem Borne AEGKr.
NH2-terminal globular domain of human platelet glycoprotein Ib has a
methionine145
/threonine145
amino acid polymorphism, which is associated with the HPA-2
alloantigens. J Clin Invest 1992;89:231-384.
8. Lyman S, Aster RH, Visentin GP, Newman PJ. Polymorphism of human platelet membrane
glycoprotein IIb associated with the Baka/Bak
b alloantigen system. Blood 1990;75:2343-2348
9. Wang L, Juji T, Shibata Y, Kuwata S, Tokunaga K. Sequence variation of human platelet
membrane glycoprotein IIIa associated with the Yuka/Yuk
b alloantigen system. Proc Japan
Acad 1991;67:102-106.
10. Santoso S, Kalb R, Walka M et al. The human platelet alloantigens Bra and Br
b are
associated with a single amino acid polymorphism on glycoprotein Ia. J Clin Invest
1993;92:2427-2432.
11. Schuh AC, Watkins NA, Nguyen Q et al. Atyrosine703serine polymorphism of CD109
defines the Gov platelet alloantigens. Blood 2002;99:1692-198.
12. Bussel JB, Primiani A. Fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia : progress and
ongoing debates. Blood. Rev. 2008;22:33-52.
13. Tchernia G, Kaplan C, Tertian G. Thrombopénie neonatal immune Archif Pediat
1991;48:355-361.
14. Kaplan C. Incompatibilités sanguines plaquettaires materno-foetales. EMC édition 2006.
BIBLIOGRAPHIE
15. Nguyen P, Hézard N, Daliphard S. Explorations de la fonction plaquettaire par cytométrie
en flux. Hématologie 2003;9:367-378.
16. Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mueller-Eckhardt C. Monoclonal antibody-specific
immobilization of platelet antigens (MAIPA) : a new tool for the identification of platelet-
reactive antibodies. Blood 1987;70:1722-1726.
17. McFarland JG, Aster RH, Bussel JB, Gianopoulos JG, Derbes PJ. Prenatal diagnostic of
neonatal alloimmune thrombocytopenia using allele-specific oligonucleotide probes. Blood
1991;78:2276-2282.
18. Allen D, Verjee S, Rees S, et al. Platelet transfusion in neonatal alloimmune
thrombocytopenia. Blood 2007;109:388-389.
19. Arjan B, te Pas et al. Postnatal mnagement of fetal and neonatal alloimmune
thrombocytopenia : the role of matched platelet transfusion and IVIG. Eur J Pediatr
2007;166:1057-1063.
20. Hensen RJ, Balthasar JP. Effects of intraveinous fetal transfusion of immunoglobulin on
platelet count and antiplatelet antibody disposition in a rat model of immune
thrombocytopenia. Blood 2002;100:2087-2093.
21. Le Toriellec E, Chenet C, Kaplan C. Safe fetal platelet genotyping : new developments.
Submitted to transfusion.
22. Liew M, Nelson L,
Margraf R, Mitchell S, Erali M, Mao R, Lyon E, Wittwer
C.
Genotyping of Human Platelet Antigens 1 to 6 and 15 by High-Resolution Amplicon Melting
and Conventional Hybridization Probes. J Mol Diagn. 2006 February; 8(1): 97–104.
23. Scheffer PG, Soussan A, Verhagen OJHM, Page-Christiaens GCML, Oepkes D, Haas M,
Van der Schoot CE. Noninvasive fetal genotyping of human platelet antige-1a. International
Journal of Obstetrics & Gynaecology. 2011;118:1392–1395.
