Embed Size (px)
Citation preview
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
VIVALDO GOMES DA COSTA
ACURÁCIA DIAGNÓSTICA DE DOIS KITS COMERCIAIS ELISA PARA
CAPTURA DO ANTÍGENO NS1 NO DIAGNÓSTICO PRECOCE DO VÍRUS
DENGUE: UMA META-ANÁLISE
Jataí-GO
2015
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás
(UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o do-cumento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou down-load, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): VIVALDO GOMES DA COSTA E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não
Vínculo empregatício do autor Agência de fomento: Fundação de Amparo à Pesqui-
sa do Estado de Goiás Sigla: FAPEG
País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: Acurácia diagnóstica de dois kits comerciais ELISA para captura do antígeno
NS1 no diagnóstico precoce do vírus dengue: uma meta-análise Palavras-chave: Meta-análise, Dengue, Antígeno NS1, ELISA, Acurácia diagnóstica Título em outra língua: A meta-Analysis of the diagnostic accuracy of two commercial
NS1 antigen ELISA tests for early dengue virus detection Palavras-chave em outra língua: Meta-analysis, Dengue, NS1 antigen, ELISA, Diag-
nostic accuracy Área de concentração: Novos Materiais e Metodologias Aplicadas à Saúde Data defesa: (dd/mm/aaaa) 12/01/2015 Programa de Pós-Graduação: CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE Orientador (a): Marcos Lázaro Moreli E-mail: [email protected] Co-orientador (a):*
E-mail: *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o en-vio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os ar-quivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
________________________________________ Data: 02/02/2015 Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
ACURÁCIA DIAGNÓSTICA DE DOIS KITS COMERCIAIS ELISA PARA
CAPTURA DO ANTÍGENO NS1 NO DIAGNÓSTICO PRECOCE DO VÍRUS
DENGUE: UMA META-ANÁLISE
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde para Obtenção do Título de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde. Área de Concentração: Novos Materiais e Metodologias Aplicadas à Saúde
Opção: Métodos de Diagnóstico e Tratamento de Doenças. Orientado: Vivaldo Gomes da Costa
Orientador: Prof. Dr. Marcos Lázaro Moreli
Jataí-GO
2015
VIVALDO GOMES DA COSTA
ACURÁCIA DIAGNÓSTICA DE DOIS KITS COMERCIAIS ELISA PARA CAPTURA DO ANTÍGENO NS1 NO DIAGNÓSTICO PRECOCE DO VÍRUS DENGUE: UMA
META-ANÁLISE
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Ciências Aplicadas à Saúde, Universidade Federal de Goiás, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde.
Aprovada em: 12 de Janeiro de 2015
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr. Marcos Lázaro Moreli (Orientador) UFG
______________________________________________ Prof. Dr. Wagner Gouvêa dos Santos (Membro Interno)
UFG
______________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Luzía França (Membro Externo)
UFMT
DEDICATÓRIA
A todos da minha família, em especial aos
meus pais (Vivaldo G. da Silva e Valdetina
S. da Costa Silva).
Ao meu irmão (Carlos G. da Costa),
E a minha sobrinha (Stefane M. Gomes).
VI
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcos Lázaro Moreli, pela parceria e confiança em meu
trabalho.
Aos professores da pós-graduação, particularmente aos professores Dr. Cleber Douglas L.
Ramos, Dr. Gildiberto Mendonça de Oliveira, Dra Mônica Santiago Barbosa e Dra Rosângela
Maria Rodrigues por terem participado da minha qualificação de mestrado.
Aos professores Dr. Wagner Gouvêa dos Santos e Dr Eduardo Luzía França meu muito
obrigado, por integrarem a comissão julgadora da minha dissertação de mestrado. Também
agradeço pelas valiosas considerações, voltadas para a melhoria deste trabalho.
Agradeço a Profa. Dra Angela Ferreira Lopes de Teive e Argolo e a Profa. Dra Ludimila Paula
Vaz Cardoso pela prontidão e concordância em ser integrantes da banca examinadora.
A secretária da pós-graduação, Márcia PD de Rezende pela disposição e prontidão em ajudar a
resolver os pedidos.
Aos colegas do curso do mestrado, Acácia GF Leal, Aline M Montel, Allana S Pereira, Dayane
KS Pereira, Dayane Moraes, Elton FS Lima, Fausto G Costa, Hélio RM Filho, Jonas F Scopel,
Lizandra CBS Silvério e Rosane GV Machado, pela convivência e por toda a cooperação.
Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisas do Estado de Goiás (FAPEG) pelo auxílio
financeiro, concedido mediante a bolsa de mestrado número 201310267000308, referente ao
Edital 003/2013.
E a Deus, por tudo.
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfologia do DENV, representada de forma esquemática .............................. 5
Figura 2. Genoma viral dos Flavivírus. ............................................................................. 6
Figura 3. Partícula do DENV, mostrando de forma esquematizada as proteínas prM, E e NS1
........................................................................................................................................... 8
Figura 4. Imagem esquemática representando o ciclo de replicação dos Flavivírus ......... 9
Figura 5. Mapas mostrando a distribuição espacial dos sorotipos do DENV no período de
1943 a 2013. .................................................................................................................... 12
Figura 6. Representação esquemática do período de incubação, perfil sorológico e métodos de
diagnóstico do DENV. ..................................................................................................... 16
Figura 7. Fluxograma das etapas a ser seguidas no processo de meta-análise. ............... 33
Figura 8. Fluxograma das etapas realizadas durante a meta-análise ............................... 33
Figura 9. Ferramenta QUADAS mostrando a avaliação da qualidade dos estudos. ....... 37
Figura 10. Gráfico HSROC mostrando a acurácia diagnóstica dos estudos incluídos. ... 38
Figura 11. Forest plot para a sensibilidade do kit da Platelia™ na DF e FHD. .............. 40
Figura 12. Nomograma de Fagan usado para demonstrar a probabilidade pós-teste. ..... 41
VIII
ABREVIATURAS E SIGLAS
Arbovírus Arthropod-borne virus
DC Depois de Cristo
DENV Dengue vírus
DOR Razão de chance do diagnóstico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FHD Febre hemorrágica da dengue
HSROC Hierarchical summary receiver operating characteristic
LR+ Razão de verossimilhança positivo
LR- Razão de verossimilhança negativo
NS1 Nonstructural protein 1
OD Densidade óptica
ORF Open reading frame
PRISMA Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-
analysis
PRNT Teste de neutralização por redução em placa
QUADAS Quality assessment of diagnostic accuracy studies
RNA Ácido ribonucléico
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro
RT-PCR Transcrição reversa seguida pela Reação em Cadeia da
Polimerase
SCD Síndrome do choque da dengue
ViPR Virus pathogen resource
VPP Valor preditivo positivo
VPN Valor preditivo negativo
WHO World Health Organization
IX
RESUMO
Introdução: O diagnóstico das infecções pelo dengue vírus (DENV) continua um desafio,
principalmente devido a ocorrência de reações cruzadas entre os testes sorológicos e devido aos
tradicionais métodos para captura de IgM constituírem marcadores tardio da infecção. Todavia,
o antígeno NS1 é um marcador precoce. Nesse contexto vários estudos tem avaliado a
performance dos testes para a captura do NS1, porém os resultados dos estudos individuais
podem ser limitados, por causa do restrito tamanho amostral dos pacientes recrutados. Portanto,
nosso objetivo foi realizar uma meta-análise da acurácia diagnóstica de dois ensaios comerciais
ELISA NS1 (Panbio® e Platelia™).
Métodos e Resultados: Os estudos de interesse foram extraídos das bases de dados PubMed,
Embase e Google Acadêmico, com definidos critérios de inclusão e exclusão. Um total de 30
estudos, perfazendo 12.105 pacientes recrutados, foram incluídos na análise estatística. A
estimativa global da sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança positiva e negativa,
razão de chance diagnóstica foram: 66% (95% intervalo de confiança (CI) 61-71), 99% (95%
CI 96-100), 98 (95% CI 20-464), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 289 (95% CI 59-1412),
respectivamente para o kit da Panbio®. Enquanto para o kit da Platelia™, os resultados obtidos
foram, respectivamente: 74% (95% CI 63-82), 99% (95% CI 97-100), 175 (95% CI 28-1099),
0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 663 (95% CI 98-4478). A menor performance dos testes ocorreram nas
infecções secundárias e na detecção do DENV4. Quanto às formas clínicas da dengue, a
sensibilidade do Platelia™ foi de 69% (95% CI 43-86) e 60% (95% CI 48-70), para a febre da
dengue e febre hemorrágica, respetivamente. A sensibilidade de ambos os testes foram
discretamente menores para as amostras provenientes da Ásia e Oceania.
Conclusão: As amostras de DENV1 forneceram maior sensibilidade para ambos os testes.
Observamos que os fatores influenciando negativamente os testes, tais como o tipo de infecção
e o sorotipo viral necessitam de maiores investigações no intuito de melhor aperfeiçoamento da
acurácia diagnóstica.
X
ABSTRACT
Background: The diagnosis of dengue virus (DENV) infection still remains a challenge, due
to cross-reactivity between serological tests and to traditional methods that capture IgM,
which is a late marker of infection. However, NS1 antigen is an early marker. Accordingly,
several studies have evaluated the performance of tests that utilize NS1 capture, but the results
of individual studies may be limited due to the restricted sample size of the patients recruited.
Therefore, our objective was to perform a meta-analysis of the diagnostic accuracy of two
commercial NS1 ELISAs (Panbio® and Platelia™).
Methods and Results: Studies of interest were found in PubMed, Embase and Google Scholar
databases using defined inclusion/exclusion criteria. A total of 30 studies containing 12.105
total enrolled patients were included. The overall estimated sensitivity, specificity, positive
and negative likelihood ratios, diagnostic odds ratio were as follows: 66% (95% confidence
interval (CI) 61-71), 99% (95% CI 96 -100), 98 (95% CI 20-464) 0.3 (95% CI 0.2-0.4) and
289 (95% CI 59-1412), respectively, for Panbio®, and 74% (95% CI 63-82 ), 99% (95% CI
97-100), 175 (95% CI 28-1099), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) and 663 (95% CI 98-4478),
respectively, for Platelia™. The lowest sensitivity values were for secondary infections (57%
[95% CI 47-67] and 66% [95% CI 53-77] for Panbio® and Platelia™, respectively) and for
the detection of DENV4. Regarding clinical manifestations, the sensitivity of Platelia™ was
69% (95% CI 43-86) and 60% (95% CI 48-70) for fever and dengue hemorrhagic fever,
respectively. In addition, the sensitivity of both tests was slightly lower for samples from
Southeast Asia and Oceania.
Conclusion: DENV1 samples gave higher sensitivity results for both tests. We observed that
factors negatively influencing the tests, such as the type of infection and viral serotype,
require further investigation to optimize the diagnostic accuracy.
XI
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
1.1. Dengue: um breve histórico ................................................................................... 3
1.2. Propriedades do DENV ......................................................................................... 5
1.3. Dados epidemiológicos ........................................................................................ 10
1.3.1. A dengue no Brasil ....................................................................................... 12
1.4. Quadro clínico ...................................................................................................... 13
1.5. Diagnóstico do DENV ......................................................................................... 14
1.5.1. Métodos de identificação sorológico ........................................................... 15
1.5.2. Isolamento viral. ........................................................................................... 17
1.5.3. Detecção do material genético ..................................................................... 18
1.5.4. Diagnóstico da NS1 do dengue .................................................................... 19
1.6. Patogênese da infecção viral ................................................................................ 20
1.7. Profilaxia e tratamento ......................................................................................... 21
1.8. Meta-análise: considerações ................................................................................ 23
1.9. Acurácia diagnóstica ............................................................................................ 24
2. JUSTIFICATIVA ...................................................................................................... 26
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos Geral .................................................................................................... 27
3.2. Objetivos Específicos .......................................................................................... 27
4. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 28
4.1. Estratégia de pesquisa .......................................................................................... 28
4.2. Seleção dos estudos ............................................................................................. 28
4.3. Extração dos dados .............................................................................................. 29
4.4. Avaliação da qualidade dos estudos .................................................................... 29
XII
4.5. Análise estatítica .................................................................................................. 29
4.6. Análise in silico ................................................................................................... 30
5. RESULTADOS .......................................................................................................... 31
5.1. Acurácia global dos kits comerciais da Panbio® e Platelia™ ............................. 36
5.2. Acurácia dos ensaios quanto ao sorotipo viral e a classificação da infecção ..... 37
5.3. Acurácia dos ensaios quanto às manifestações clínicas da dengue .................... 39
5.4. DOR e probabilidade pós-teste ........................................................................... 39
6. DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................... 41
7. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 47
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 48
ANEXO ........................................................................................................................... 63
1
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas os espectros de doenças reemergentes no mundo têm aumentado
significativamente. Nesse contexto, inclui-se o dengue vírus (DENV), o qual é o agente
etiológico de uma doença febril indiferenciada que anualmente acomete ~390 milhões de
pessoas. Por conseguinte, a cada ano a dengue ocasiona cerca de meio milhão de casos graves
que resultam entre 25 a 50 mil óbitos (Bhatt et al. 2013). Ademais, o DENV está presente na
maioria dos países tropicais e subtropicais, fato este que representa um risco iminente de
infecção viral para três bilhões de pessoas (Guzman & Istúriz, 2010; WHO 2014). Portanto,
devido à gravidade da dengue, e por não possuir um tratamento antiviral, ou vacina eficaz, e
pelos altos custos financeiros voltados para o combate da doença, a mesma constitui um
grande problema de saúde pública para a maioria dos países (Lopes et al. 2006; Shepard et al.
2013; Da Costa et al. 2014).
O DENV possui material genético constituído por RNA de fita simples e sentido
positivo, pertencendo ao gênero Flavivírus. Este vírus é comumente conhecido como o mais
importante arbovírus (Arthropod-borne virus), visto que é transmitido ao homem por
mosquitos (Aedes sp) hematófagos. Arbovírus é um grupo ecológico complexo, podendo ser
transmitidos também pela picada de carrapatos. À vista disso, quando os vetores artrópodes se
adaptaram ao ambiente urbano, os mesmos provocaram diversas epidemias de febre amarela e
dengue. Além do mais, arbovírus circulantes em regiões distantes tem sido introduzido em
novas regiões, devido ao tráfego intenso de pessoas, animais e mercadorias, provocando
doenças emergentes nesses locais. Neste contexto, citamos a recente introdução do arbovírus
chikungunya no Brasil, tendo ocasionado em poucos meses centenas de casos de febre do
chikungunya no estado da Bahia, e possui formas de transmissão e sintomatologia similar a
dengue, dificultando o diagnóstico diferencial (Figueiredo 2007; Portal Brasil 2014).
O diagnóstico da dengue é dificultado pela sintomatologia inespecífica, portanto é
preciso recorrer ao diagnóstico laboratorial, o qual é baseado na detecção do material genético
2
(Transcrição reversa seguida pela Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)), isolamento
viral e os métodos sorológicos (Lanciotti et al. 1992; Santiago et al. 2013). Para os métodos
sorológicos, existem diversos kits comerciais de imunoensaios disponíveis, constituídos
principalmente pelo ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). O ensaio de ELISA
permite a detecção de anticorpos anti-dengue, porém devido ao período de janela
imunológica, a amostra deve ser coletada a partir do quinto dia do início da doença,
dificultando o diagnóstico precoce (Gubler 1996; Innis 1997). Entretanto, quando o ensaio de
ELISA é fundamentado na detecção do antígeno NS1 (Nonstructural protein 1) do DENV, as
amostras podem ser coletadas e triadas laboratorialmente no momento do surgimento dos
sintomas (Alcon et al. 2002; Shu et al. 2004; Kao et al. 2005; Teles et al. 2005).
No início do século XXI os kits de ELISA voltados para a detecção do antígeno NS1
do DENV surgiram precedidos por anos de pesquisas de ponta e, conforme anteriormente
dito, a grande vantagem do teste é o diagnóstico precoce do DENV. Porém, ao longo dos anos
têm sido observadas variações na acurácia do teste e isso necessita ser estudado com a
finalidade de aperfeiçoar o método laboratorial (Young et al. 2000; Alcon et al. 2002).
Portanto, apesar de existir vários estudos avaliando os testes de captura do NS1 pelo ensaio de
ELISA, ainda não há uma meta-análise avaliando a acurácia diagnóstica dos dois principais
kits comerciais usados (Panbio® e Platelia® NS1 ELISA). Adicionalmente, devido ao
limitado tamanho amostral dos pacientes recrutado em estudos individuais, uma meta-análise
pode aumentar a precisão das estimativas dos estudos individuais.
3
1.1. Dengue: um breve histórico
O surgimento do termo dengue não é claro, mas acredita-se que tenha surgido do idioma
suaíli, o qual é nativo de antigos povos das regiões costeiras do Oceano Índico. Desse modo,
existe uma teoria que a palavra dengue seria derivada da frase suaíli “Ka-Dinga pepo”, que
significa “cãibras e convulsão causada por um espírito maligno”. Portanto, a palavra “dinga”
pode ter sua origem a partir da palavra espanhola “dengue” que significa fastidioso ou
cuidado, em vista da atenção que se deve dar a uma pessoa que sofre de dor óssea e febre
(Dengue virus net 2014).
Acredita-se que o primeiro registro de um caso da dengue tenha sido oriundo de antigos
escritos médicos chineses da dinastia Jin (265-420 DC). Por conseguinte, as primeiras
epidemias da dengue foram registradas há mais de 200 anos, quando os primeiros relatos
evidenciavam casos de uma doença febril semelhante a dengue, e que provavelmente estava
associada a mosquitos. Assim, a primeira epidemia documentada ocorreu em 1779-1780 na
Ásia, África e Norte da América, mostrando que o vírus e o mosquito apresentavam
distribuição mundial nas regiões de trópicos. Entretanto, nesse período a dengue era
considerada uma doença benigna (Gubler & Clark 1995; DENV net 2014).
Os estudos voltados especificamente para a dengue tiveram origem em 1902, quando
Graham fez associação de um artrópode envolvido na transmissão do vírus (Graham 1902).
Consequentemente, além de Graham os trabalhos de Ashburn e Craig (1907), conduzido nas
Filipinas, evidenciavam que o Culex quinquefasciatus seria o vetor da dengue. Todavia, os
estudos de Bancroft (1906), Cleland, Bradley e McDonaldo, conduzidos nos anos de 1916,
1917 e 1919, respectivamente, forneciam evidencias contraditórias, indicando que o vetor
seria o Aedes aegypti. Atualmente, este é considerado o principal vetor da dengue.
Diversos estudos mais aprofundados sobre a dengue tiveram a sua origem nas Filipinas,
quando por volta de 1924-1925 os pesquisadores Joseph F. Siler, Milton Weston Hall e
Arthur P. Hitchens recrutaram voluntários das forças armadas dos EUA com o propósito de
4
investigar problemas de saúde nesses indivíduos (Siler et al. 1926). Posteriormente, outro
estudo foi conduzido na mesma região em 1929-1930 por James S. Simmons e colaboradores.
Estes trabalhos eram voltados para a compreensão da epidemiologia, mecanismo de
transmissão, etiologia, manifestações clínicas, imunidade e prevenção da dengue.
Durante a Segunda Guerra Mundial (1939-1945), a epidemiologia global do DENV foi
dramaticamente alterada no sudeste Asiático, tendo em vista que os movimentos acelerados
das tropas propiciaram a disseminação do vírus entre a população residente da região. Além
do maciço deslocamento humano, também houve uma mudança de comportamento durante a
guerra como, por exemplo, os sistemas de água foram destruídos o que favoreceu a estocagem
da água para uso doméstico e para o controle de incêndios, este fato propiciou maior
disponibilidade de ambientes adequados para a proliferação do vetor nas áreas urbanas. Em
virtude disso, no período pós-guerra houve hiper-epidemia em vários países do sudeste
Asiático. Por conseguinte, foi registrada a primeira epidemia de febre hemorrágica da dengue
(FHD), em Manila nas Filipinas, que ocorreu no período de 1953-1954 (Gubler 1997). A
partir de então, as epidemias de FHD foram registradas em Bangkok, Tailândia, Malásia,
Singapura e Vietnam, no início da década de 60. Logo em seguida, na década de 70, as
epidemias da dengue se espalharam por intensas regiões do sudeste Asiático, África e
Oceania.
Ainda em relação à década de 40 importantes descobertas sobre a dengue foram feitas.
Nesse contexto, o DENV foi isolado em 1943 na Polinésia Francesa e Japão. Mais adiante,
em 1944 a linhagem isolada no Havaí foi denominada de DENV sorotipo 1, logo em seguida
na Nova Guiné uma nova linhagem foi classificada em DENV sorotipo 2 (1944).
Adicionalmente, foi detectado o DENV 3 e 4 nas Filipinas (1956), de modo que essas
classificações baseavam-se nas diferentes propriedades antigênicas apresentadas pelo DENV
(Hotta 1952; Halstead 1974).
5
Nas Américas os bem sucedidos programas de controle e erradicação do vetor da febre
amarela urbana, mesmo vetor da dengue, propiciaram a não ocorrência de epidemias da
dengue. Porém, na década de 70 por falha, ou abandono desses programas, houve a re-
infestação do Aedes aegypti na maioria dos países do continente americano, causando nas
décadas seguintes constantes hiper-epidemias de FHD com magnitude cada vez maior (Osanai
et al. 1983).
1.2. Propriedades do DENV
DENV pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivírus, tendo material genético
constituído por RNA de fita simples e sentido positivo. O virion possui morfologia esférica de
40-60 nm de diâmetro, porém o capsídeo é icosaédrico e o envoltório lipídico contém
proteínas do envelope e da membrana (Figura 1).
Figura 1. Morfologia do DENV, representada de forma esquemática. Na Figura 1A é possível visualizar as 3 proteínas estruturais e o material genético. Em B é destacado a forma das proteínas M e E. Adaptado de Henchal & Putnak 1990.
O genoma viral apresenta apenas uma janela aberta de leitura (Open reading frame:
ORF) que codifica uma poliproteína. Após o processamento da poliproteína é originado três
proteínas estruturais (membrana, envelope e capsídeo) e sete proteínas não-estruturais (NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (Rothman, 2004) (Figura 2). O capsídeo que
A B
6
circunda o material genético é constituído por apenas um tipo de proteína, denominada
proteína C. Para o envelope viral, a estrutura é constituída por uma bicamada lipídica
incorporando a glicoproteína E, a proteína M e resíduos da proteína prM, a qual é
predominante na partícula viral imatura (Chambers et al. 1990; Heinz & Allison 2001;
Mukhopadhyay et al. 2005).
ORF
Figura 2. Genoma viral dos Flavivírus. Em A é mostrado a poliproteína, a qual apresenta uma única janela de leitura. Após a tradução são geradas 10 proteínas (3 estruturais e 7 não estruturais). Na Figura 2B é mostrada a localização da maioria dessas proteínas no retículo endoplasmático (RE). As cabeças de setas vermelha e azul representam o local onde as proteínas virais são clivadas por enzimas do hospedeiro. A seta preta são os locais onde as proteases virais clivam as proteínas. Adaptado de Umareddy et al. 2007.
O genoma do DENV tem tamanho próximo a 11Kb com massa de 4x106 Da. Na
extremidade 5’ existe uma região cap 7 metil guanosina, porém para a extremidade 3’ há
ausência de cauda poliadenilada. A ORF codifica uma poliproteína de aproximadamente 3400
aminoácidos, sendo clivada co- e pós-traducionalmente em proteínas estruturais e não
estruturais. Todavia, as extremidades 5’ e 3’ apresentam duas regiões não codificantes com 96
e 454 nucleotídeos, respectivamente (Chambers et al. 1990; Heinz & Allison 2001).
C prM E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5
A
B Lumen RE
Citoplasma Cit
Furina Sinalase
7
Com um peso molecular de aproximadamente 13,5 kDa, a proteína C, ou proteína do
capsídeo, é o primeiro polipeptídeo a ser sintetizado durante a tradução. Consequentemente, a
proteína C possui grande quantidade de aminoácidos básicos intimamente associados ao RNA
viral, fato este que parece contribuir para a neutralização da carga negativa da molécula de
RNA viral (Chang 1997).
Considerada a maior proteína do envelope do vírus (51-60 kDa), a glicoproteína E tem
importante papel na fixação, fusão da membrana e montagem da partícula viral. Logo após a
fixação e fusão da partícula viral é observado uma série de mudanças conformacionais da
proteína E, impulsionado pelo baixo pH endossomal, que provavelmente contribui para a
liberação intracelular do material genético. Em adição, como a proteína E é o primeiro ponto
de interação entre o vírus e a célula hospedeira, a proteína E possui fator determinante de
tropismo, virulência e representa um grande alvo para os anticorpos neutralizantes (Schibli &
Weissenhorn 2004; Mukhopadhyay et al. 2005; Kielian & Rey 2006; Nemésio et al. 2011).
A proteína M possui duas formas: prM (pré-membrana) e proteína M (Figura 3A). Para
os vírions intracelulares imaturos é observado a presença da prM, a qual está associada a
proteína E. Esta associação protéica provavelmente envolve um papel de proteção da prM a
proteína E na reorganização induzida por pH e fusão prematura durante a secreção, tendo a
prM um papel de chaperona para o empacotamento apropriado e montagem da proteína E na
superfície do vírus (Bartenschlager & Miller 2008; Clyde et al. 2006).
Em relação às proteínas não estruturais (NS1, NS2A/B, NS3, NS4A/B e NS5)
observam-se as seguintes características: NS1 (48 kDa) é conhecida por sua precocidade na
infecção viral, sendo expressa no retículo endoplasmático, na membrana da célula e na forma
secretada. A provável estrutura da NS1 é mostrada na Figura 3B. Acredita-se que a NS1 do
DENV esteja envolvida na replicação do RNA e também tenha um envolvimento na
patogênese e evasão do sistema imune (Mackenzie et al. 1996; Amorim et al. 2014); A NS2A
8
(22 kDa) tem papel proteolítico na clivagem adequada da NS1; Enquanto a NS2B (15 kDa)
está envolvida na clivagem do complexo NS2B-NS3; NS3 (70 kDa) possui ao menos duas
atividades enzimáticas (helicase/protease) que estão envolvidas no processamento da
poliproteína, na replicação do RNA e também está envolvida na síntese do RNA viral (Li et
al. 1999; Lindenbach & Rice 2002); A NS4A (16 kDa) age como uma sequencia sinal para a
translocação da NS4B (27 kDa) para dentro do lúmen do retículo endoplasmático. Tanto a
NS4A quanto a NS4B estão implicadas na localização apropriada de proteínas virais e
montagem da partícula viral. Adicionalmente, tem sido verificado a capacidade da NS4A/B e
NS2A no bloqueio da tradução de sinal mediada por interferon (Lindenbach & Rice 2003;
Clyde et al. 2006); Por fim, a NS5 (105 kDa) tem a função de RNA polimerase viral RNA-
dependente (Chang 1997).
Figura 3. Partícula do DENV, mostrando de forma esquematizada as proteínas prM, E e NS1. Na imagem A é possível observar a mudança conformacional da proteína M e E no virion imaturo e maturo. Figura 3B. Reconstrução 3D da NS1, mostrando a estrutura da proteína. Adptado de Heinz & Allison (2001); Extraído de Gutsche et al. 2011.
No tocante ao ciclo de replicação do vírus, a primeira etapa está relacionada à
interação do vírus com receptores da célula hospedeira, com subsequente endocitose induzida
(Figura 4). O(s) receptor(es) envolvido(s) nessa etapa ainda não foram elucidados, porém
alguns autores tem proposto o envolvimento dos sulfatos de heparina e
lipopolissacarídeo/CD14 que estejam associados a proteínas como prováveis receptores do
DENV (Chen et al. 1997; Chen et al. 1999). Posteriormente, a endocitose ocorre
B A
9
internalização e acidificação da partícula viral no endossomo, com a fusão do vírus,
permitindo a liberação do RNA genômico no citoplasma, o qual serve como um RNAm. A
tradução da ORF no retículo endoplasmático rugoso produz uma grande poliproteína que é
clivada co- e pos-transducionalmente nas proteínas maduras. Assim, o N-terminal da
poliproteína codifica as proteínas estruturais (C, prM e E), seguido pelas sete proteínas não
estruturais.
Figura 4. Imagem esquemática representando o ciclo de replicação dos Flavivírus. Após a interação do vírus com o receptor, ocorre endocitose induzida. No vacúolo fagocítico, o material genômico é liberado e migra para o citoplasma, iniciando os processos de replicação, montagem e maturação da progênie viral que será liberada no espaço extracelular por exocitose. RE: retículo endoplasmático; TGN: compartimentos do complexo de Golgi. Adaptado de: Mukhopadhyay et al. 2005.
A síntese do RNA ocorre em pacotes de vesículas, chamado de complexos de
replicação viral, os quais estão intimamente associados às membranas celulares. O processo
começa com a síntese do RNA de sentido negativo que serve como molde para a replicação
do RNA de sentido positivo. Nessa etapa, destaca-se que a reação enzimática é catalisada pela
atividade RNA-dependente RNA polimerase da proteína viral NS5 em associação a NS3
(protease/helicase), a outras proteínas NS virais e possivelmente a fatores do hospedeiro. À
vista disso, o novo RNA sintetizado associa-se a proteína C no lúmen do retículo
endoplasmático, adquirindo a bicamada lipídica e as proteínas E e prM. Por fim, na rede
10
trans-Golgi ocorre proteólise da proteína prM pela furina, resultando em rearranjo e
homodimerização da proteína E, com a formação de novas partículas virais (Welsch et al.
2009; Gillespie et al. 2010; Gebhard et al. 2011).
1.3. Dados epidemiológicos
Em várias partes do mundo foi observado nas últimas décadas considerável aumento no
número de casos da dengue. Também foi observado um aumento do número de países em
risco de transmissão do DENV, principalmente por causa da constante disseminação do vetor
artrópode. Assim sendo, dados fornecidos pela Organização Mundial de Saúde mostram a
circulação do DENV em ao menos 100 países (Brady et al. 2012).
Conforme anteriormente dito, todo ano ocorrem próximo de 390 milhões de casos de
dengue. Cerca de 70% desses casos procedem de países Asiáticos, principalmente da Índia
que registra 34% de toda a carga global da doença. Logo em seguida vem à África (16%) e as
Américas (14%). Para as Américas, somente Brasil e México registram mais de 50% dos
casos de dengue no continente (Bhatt et al. 2013; Wilson & Chen 2014). Ainda em relação às
Américas, verifica-se que nos últimos anos o número de casos graves da doença aumentou
oito vezes quando comparado às décadas passadas. De modo que alguns dos fatores que
justificam esse cenário é a introdução de novas linhagens virais em curto espaço de tempo,
por exemplo no Brasil no intervalo de 7-10 anos tem sido encontrado novas linhagens virais
(San et al. 2010; Dick et al. 2012). Adicionalmente, um estudo realizado por Messina e
colaboradores (2014) demonstrou a ocorrência de múltiplas linhagens virais do DENV numa
mesma localidade. Confirmando este fato, nos últimos anos foram registradas 1956 novas
linhagens do DENV1, seguido por 1.931, 1.631 e 1.000 do DENV2, 3 e 4, respectivamente
(Figura 5).
11
Figura 5. Mapas mostrando a distribuição espacial dos sorotipos do DENV no período de 1943 a 2013. Nas figuras A, B, C e D é mostrado a distribuição dos DENV1, 2, 3 e 4, respectivamente. Extraído de Messina et al. 2014.
1943-1959 1943-1959
1943-1959 1943-1959
1960-1969 1960-1969
1960-1969 1960-1969
1970-1979 1970-1979
1970-1979 1970-1979
1980-1989 1980-1989
1980-1989 1980-1989
1990-1999 1990-1999
1990-1999 1990-1999
2000-2013
2000-2013
2000-2013
2000-2013
A B
C D
12
1.3.1. A dengue no Brasil
No Brasil, após várias décadas sem considerável registro da doença, surtos da dengue
reemergiram em 1982, com a introdução do DENV1 e 4 na cidade de Boa Vista/Roraima
(Osanai et al. 1983). A partir de então, os surtos da dengue apresentariam magnitude crescente
em números de casos e formas graves da doença nos centros urbanos do país.
Consequentemente, o ano de 1986 é considerado o período em que o DENV começou a
reemergir por todo o país. Dessa forma, neste período o DENV1 foi reintroduzido no estado
do Rio de Janeiro, causando mais de 60 mil casos da doença (Schatzmayr et al. 1986).
Posteriormente, houve um caso de DENV2 em 1989 na cidade de Belém/Pará, entretanto o
caso não foi considerado autóctone porque o paciente era oriundo de Luanda/Angola. Porém
não demorou muito para surgir os primeiros casos autóctones de DENV2, tendo sido
registrado os primeiros casos em 1990 no estado do Rio de Janeiro, e em 1994 houve
epidemia de DENV2 no estado do Ceará, ocorrendo os primeiros casos de FHD (Nogueira et
al. 1990; Vasconcelos et al. 1995).
Durante as décadas de 80 e 90, DENV1 e 2 circularam concomitantemente pelo país
provocando epidemias, porém o cenário mudou a partir de 2000, quando foi introduzido o
DENV3, o qual foi responsável pelas mais graves epidemias de dengue no Brasil (Nogueira et
al. 2001). Por fim, o DENV4 foi identificado em pacientes procedentes da cidade de
Manaus/Amazônia em 2008 (Figueiredo et al. 2008), e rapidamente se disseminou, causando
atualmente frequentes epidemias pelo país (Amâncio et al. 2014; Bertolacci-Rocha et al.
2014).
De acordo com dados fornecidos pelo ministério da saúde, no período de 1990 até
meados de 2014 houve mais de 9 milhões casos de dengue no Brasil. Para esse mesmo
período, foram registrados 2.594 óbitos por dengue no país, porém esses números não
incluem outras doenças que possam ser agravadas pela dengue. Também outro fator
preocupante é que os números de óbitos por dengue vêm aumentando a cada ano, e somente o
13
número de óbitos dos últimos cinco anos representa 63% do total registrado no país. O ano
em que a hiper-epidêmia de dengue foi maior ocorreu em 2013 (~1,5 milhão de casos),
seguido por 2010 (1,01 milhão de casos) e 2011 (764 mil casos). Isso mostra que o número de
casos graves por dengue aumentou consideravelmente, sendo que os grupos etários mais
afetados são as crianças e a população idosa (Portal da Saúde 2014).
Quanto à distribuição dos casos de óbitos por dengue nas regiões brasileiras, a região
Sudeste concentrou a maioria dos casos, com aproximadamente 44%, seguido pela região
Nordeste (30%), Centro-Oeste (13%), Norte (8%) e Sul (3%) (Portal da Saúde 2014).
1.4. Quadro clínico
Em seres humanos, a infecção pelo DENV na maioria dos casos é do tipo assintomática,
ou seja, não causa sinal ou sintomas manifestos. Todavia, os casos sintomáticos e graves da
dengue vêm aumentando com o passar dos anos. À vista disso, o quadro clínico mais
frequente da doença compreende a fase febril, a qual estende por um período de 2 a 7 dias e
coincide com o período de viremia. O período de incubação intrínseco da dengue possui uma
média de 5.9 dias, variando de 3 a 10 dias (Chan & Johansson 2012). Também é comum o
surgimento de dor retro-ocular, calafrios, cefaléia, astenia, anorexia, náuseas, vômitos e
exantema. Além disso, inicialmente a dengue era conhecida como “febre quebra-ossos”
devido à mesma provocar intensa mialgia e artralgia (Rigau-Pérez 1998).
A dengue pode resultar em quadro clínico grave como a FHD, ou síndrome do choque
da dengue (SCD), apresentando elevada taxa de letalidade. Diante disso, os sistemas do
organismo envolvidos no quadro patológico da FHD/SCD são o vascular, hematológico e
hepático. Para o sistema vascular, é observado o extravasamento plasmático devido ao
aumento da permeabilidade dos vasos, fato este que pode resultar em hipotensão e choque,
sendo muitas vezes acompanhados de coagulação intravascular disseminada e hemorragia.
Ademais, nesses casos graves ocorrem acentuada plaquetopenia: devido à supressão da
14
medula óssea pelas citocinas secretas das células ativadas; devido à destruição aumentada das
plaquetas; e também por causa do aumentado no consumo coagulopático das plaquetas (Lei et
al. 2001; Rothman 2004).
Embora seja pouco conhecido, a infecção pelo DENV também é denominada de
hepatite viral, pois ocasiona disfunção hepática, resultando no aumento dos níveis de
transaminase. Além da ocorrência de esteatose microvesicular, necrose hepatocelular e
infiltrados inflamatórios no trato portal hepático. Entretanto, a ocorrência de icterícia e
falência hepática aguda é um evento raro nos pacientes com dengue (Kuo et al. 1992; Huerre
et al. 2001; Trung et al. 2010).
1.5. Diagnóstico do DENV
Os métodos de diagnóstico da dengue são complexos, a julgar pela dificuldade na
identificação da doença envolvendo apenas dados clínicos e epidemiológicos. Posto isto, os
métodos de diagnóstico laboratorial são de grande importância para determinar as infecções
pelo DENV. Além do mais, a confirmação dessas infecções por métodos laboratoriais são de
grande importância, devido aos seguintes fatores: (1) manejo clínico adequado; (2) suporte a
vigilância; (3) diagnóstico diferencial entre outras doenças; (4) estudo de patogênese; e (5)
pesquisas de vacinas (Guzmán & Kouri 2004; Peeling et al. 2010).
Atualmente, existe uma grande variedade de métodos laboratoriais disponíveis, como os
métodos de identificação sorológico, isolamento viral e métodos de detecção molecular. A
escolha do melhor método, muitas vezes depende do estágio da doença no paciente (Figura 6).
Assim, para o diagnóstico precoce, antes do quinto dia da doença é útil os métodos de
isolamento viral, molecular e detecção do NS1. Porém, para as amostras procedentes de
infecção secundária e tardias, com mais de cinco dias do início da doença, é recomendado os
métodos de ELISA IgG e IgM, respectivamente. Apesar de existir inúmeros testes
laboratoriais, nenhum é 100% acurado, até mesmo para o padrão ouro (isolamento viral e
15
métodos moleculares), de modo que muitas vezes é necessário o uso de dois, ou mais métodos
laboratoriais para diminuir a ocorrência de resultados duvidosos (Alcon et al. 2002; Guzmán
& Kouri 2002; De Paula & Fonseca 2004; Peeling et al. 2014).
Figura 6. Representação esquemática do período de incubação, perfil sorológico e métodos de diagnóstico do DENV. Adaptado de: http://www.health.qld.gov.au/cdcg/index/dengue.asp
1.5.1. Métodos de identificação sorológico
Um dos métodos de identificação do DENV é através da sorologia, incluindo os testes
que visam a detecção de anticorpos no soro, ou plasma da espécime biológica a ser analisada.
De forma que os três principais métodos são os testes de inibição da hemaglutinação, testes de
neutralização por redução em placa (PRNT) e os métodos de ELISA. O emprego de tal
método deve se precedido pelo estudo do período de doença em que o paciente se encontra,
pois essa análise permite uma melhor escolha do método mais apropriado para aquela
situação. Assim sendo, pacientes suspeitos de infecção secundária devem ter as suas amostras
clínica triadas para a identificação de anticorpos da classe IgG, enquanto que para amostras de
Risco de choque e hemorragia
IgM
IgG
-4 -2 0 2 4 6 8 10 12
VIREMIAAAA
FEBRE
Picada do mosquito
Detecção Viral: PCR NS1 Isolamento viral
Detecção de Anticorpos: IgM e IgG ELISA
Dias da doença
16
pacientes antes do quinto dia do início da doença, deve-se empregar os métodos de triagem
molecular, ou de NS1, os quais apresentam maior probabilidade de diagnóstico do DENV.
Teste de inibição da hemaglutinação: possui como princípio o fato de alguns vírus
possuírem antígenos que se adsorvem aos eritrócitos, através dos receptores presentes na
membrana destas. Consequentemente, o resultado dessa interação entre antígeno viral e
receptor eritrocítico é a aglutinação dos eritrócitos. Isso é observado quando suspensões de
eritrócitos são colocadas em contato com suspenção de vírus, e acaso o vírus tenha antígenos
que aglutinam os eritrócitos, as mesmas se sedimentam de forma difusa, por ação da
gravidade, no fundo do poço, ou da placa, enquanto na ausência de vírus hemaglutinante, os
eritrócitos também se sedimentam no fundo do poço, ou placa, porém em forma de um botão
compacto. Todavia, para o teste de inibição da hemaglutinação são colocados antígenos virais
(DENV) contras as hemaglutininas virais, soro teste e eritrócitos de ganso, ou humanos do
grupo sanguíneo “O”. Como resultado, se acaso o soro teste possuir anticorpos anti-dengue a
hemaglutinação é inibida. A interpretação do teste é baseada pelos títulos de anticorpos
obtidos em diluições. Assim, DENV é considerado causador de infecção secundária quando
há presença de anticorpos inibidores (>1:20); quando os títulos de anticorpos são menores do
que <1:20, nas amostras de soro da fase aguda, a infecção é considerada primária (Vorndam
& Kuno 1997; Kao et al. 2005).
PRNT: é usado principalmente para análise da imunogenicidade de vacinas. Também é
usado para determinar infecções pelo DENV, quando diluições da amostra de soro do
paciente são incubadas com quantidades definidas do vírus. A interpretação do teste está
relacionada ao título onde há a mais alta diluição do soro que reduz o número de placas de 50
a 90%. À vista disso, quando há um aumento de pelos menos 4 vezes, entre as fases aguda e
convalescente é indicado a presença de infecção recente (Kao et al. 2005).
17
ELISA IgG e IgM: considerado um dos testes mais práticos devido a rapidez, alta
sensibilidade e a facilidade de uso, os métodos de ELISA estão amplamente difundidos nos
laboratórios clínicos. Para o diagnóstico da dengue, diversas marcas comerciais estão
disponíveis, incluindo os testes da Panbio® e PlateliaTM. O método mais útil nos últimos
tempos para a vigilância epidemiológica da dengue é a técnica de ELISA para captura da IgM
(MAC-ELISA). Em relação às principais desvantagens dos métodos ELISA IgM é a
necessidade de ter que esperar passar o período de janela imunológico, ou seja, um prazo de
ao menos cinco dias para a dengue. Dessa maneira o diagnóstico precoce é dificultado. Além
disso, ainda não é possível realizar um diagnóstico dos sorotipos da dengue usando esse teste
e mais, alguns estudos têm mostrado que a depender do sorotipo viral, a acurácia do teste é
prejudicada. Por fim, o ELISA IgG tem sido útil para diferenciar os tipos de infecção:
primária ou secundária. Fato este que pode ser uma informação muito útil ao clínico, por
causa da maior probabilidade das infecções secundárias evoluírem para doença grave
(Guzmán & Kouri 2002; De Paula & Fonseca 2004).
1.5.2. Isolamento viral
Considerado o padrão ouro para o diagnóstico das infecções pelo DENV, o isolamento
viral apresenta quatro sistemas de isolamento: cultura de células de mamíferos, como as
linhagens de células Vero, BHK21 e LLC-MK2; inoculação intracerebral em camundongos
recém-nascidos; inoculação intra-torácica em mosquitos adultos; e cultura de células de
mosquito, como as células C6/36, AP-61, AP-64, Tra-284 e CLA-1 (Kao et al. 2005; Mediana
et al. 2012). A cultura em células de mosquitos, usando a linhagem C6/36 é uma das mais
usadas para o isolamento viral por causa da fácil manutenção e elevada sensibilidade (Igarashi
1978; Vorndam & Kuno 1997).
A identificação, ou constatação do vírus infectando as células ocorre pela visualização
de efeitos citopáticos que são decorrentes da replicação viral, ou através da reação de
18
imunofluorescência com o uso de anticorpos monoclonais. Como nem todos os vírus
produzem efeito citopático, ou devido vários vírus produzirem o mesmo efeito citopático, o
isolamento viral seguido pela reação de imunofluorescência empregando anticorpos
monoclonais é mais sensível, pois é possível haver detecção com baixos títulos virais
(Vorndam & Kuno 1997). Todavia, uma das desvantagens dos métodos de isolamento viral
continua sendo a variável tempo, por exemplo, quando o soro teste é inoculado em cultura de
células pode demorar 10 dias para o surgimento dos efeitos citopáticos, comprometendo o
diagnóstico precoce (Choy & Gubler 2014).
1.5.3. Detecção do material genético
Os métodos laboratoriais que tem como princípio a detecção do material genético, de
determinado agente causando infecção, estão entre os testes de maior acurácia laboratorial.
Assim sendo, os métodos de RT-PCR e PCR em tempo real apresentam elevada sensibilidade
e especificidade para o diagnóstico do DENV (Lanciotti et al. 1992; Pang et al. 2014). Porém,
para a execução destes métodos é necessário equipamentos e insumos laboratoriais de alto
custo financeiro. Além disso, existe alto risco de contaminação, principalmente em relação a
RT-PCR, e é necessário que os laboratoristas estejam altamente treinados para não ocorrer
falhas sistemáticas durante a realização dos testes.
A primeira RT-PCR voltada para a identificação dos sorotipos do DENV foi
desenvolvida por Lanciotti e colaboradores (1992). Os resultados mostraram sensibilidade de
94%, 93%, 100% e 100% para os DENV1, 2, 3, e 4, respectivamente, quando comparado com
o método de isolamento viral. Todavia, o número de amostras testadas foi reduzido, porém
isso não comprometeu a implementação do teste, haja vista que o teste de Lanciotti continua a
ser o método laboratorial mais usado para a detecção do material genético do DENV.
Adicionalmente, outras variantes da RT-PCR vêm sendo usadas como, por exemplo, a
Nested-PCR desenvolvida por Bronzoni e colaboradores (2005).
19
Recentemente, diversos primers e sondas vêm sendo desenhados para ser usados na
PCR em tempo real. Este método molecular apresenta algumas vantagens em relação a PCR
convencional, como a menor possibilidade de contaminação, possibilidade de avaliação da
carga viral e maior acurácia diagnóstica. Dessa forma, estudos avaliando a PCR em tempo
real têm mostrado resultados satisfatórios. Neste contexto, exemplificando o estudo de Alm e
colaboradores (2014), foi observado considerável avanço nas metodologias laboratoriais, onde
o autor produziu uma única sonda para o ensaio de PCR em tempo real que permite a
detecção simultânea dos sorotipos do DENV. Adicionalmente nos últimos anos têm surgido
as multiplex PCR em tempo real, permitindo o diagnóstico de várias doenças, pois são
utilizados vários primers específicos. Assim, exemplificando essa afirmação, multiplex PCR
em tempo real surgiram para o diagnóstico diferencial entre dengue e outras doenças febris
(Cecilia et al. 2014; Pang et al. 2014), representado o que de mais avançado existe na área
laboratorial.
1.5.4. Diagnóstico da NS1 do dengue
Logo após Alcon e colaboradores (2002) terem desenvolvido um método de ELISA
voltado para a detecção do antígeno NS1 do DENV, o presente método foi recebido com
entusiasmo pela comunidade em geral, por causa da possibilidade de diagnóstico precoce da
dengue, e rapidamente o método estava disponível comercialmente, sendo implementado em
diversos laboratórios. Isso se deve ao fato que o NS1 é detectado já no primeiro dia do
surgimento da febre, estendendo até o nono dia da doença. Outras vantagens do método é que
a molécula NS1 é considerada conservada para os sorotipos do DENV, e a sua concentração
permanece pouco alterada nos pacientes com infecção primária ou secundária.
O desenvolvimento do teste por Alcon e colaboradores (2002) consistiu na purificação
do NS1 e inoculação em camundongos, posteriormente anticorpos anti-NS1 policlonal foram
obtidos e adsorvidos em placas de ELISA. Como resultado, foi verificado alta sensibilidade
20
do teste, conseguindo detectar até limites mínimo de 1ng/ml do NS1. Em consequência disso,
foi suposto que se a concentração de NS1 servisse como um marcador de gravidade da
dengue, o teste poderia ser quantitativo, através da medida da densidade óptica (OD). Porém,
isso na prática tornou-se complicado porque muitas vezes pacientes com níveis elevados de
NS1 não evoluíam para a forma grave, apesar de que os níveis de NS1 eram frequentemente
maiores em pacientes com a forma grave da dengue, entretanto em fases tardias da doença.
Adicionalmente, em meio a esse panorama confuso, alguns estudos não tem encontrado
associação significativa entre níveis de NS1 e o curso da infecção (Allonso et al. 2014).
1.6. Patogênese da infecção viral
A patogênese viral refere-se ao processo pelo qual o vírus causa doença. Este processo é
dividido nas seguintes etapas: entrada do vírus no hospedeiro; mecanismo de tropismo
celular; curso da infecção viral (replicação primária, disseminação sistêmica e replicação
secundária); dano tecidual; resposta imune do hospedeiro; “clearance” ou persistência viral; e
disseminação viral. Dessa forma, algumas etapas da patogênese viral já foram anteriormente
discutidas, de modo que logo a seguir daremos ênfase no curso de infecção, resposta imune do
hospedeiro e disseminação do DENV.
Para o DENV o termo tropismo é pouco apropriado, visto que o vírus se replica em
vários tipos de células, incluindo monócitos, macrófagos, células B, células dendríticas, entre
outras (King et al. 1999; Wu et al. 2000; Kou et al. 2010). Em relação à patogênese viral
propriamente dita, é conhecido que o hospedeiro e os fatores virais desempenham importante
papel no desenvolvimento da dengue mais grave. Neste contexto, hipóteses de virulência
sugerem a existência de algumas linhagens do DENV que seja mais virulenta do que outras
linhagens (Vaughn et al. 2000).
Um dos mecanismos que mais tem sido estudado na patogênese da dengue é a resposta
imune do hospedeiro. Sabin (1952) foi pioneiro ao verificar que o sistema imune do
21
hospedeiro estaria envolvido na patogênese da dengue. Em síntese, a forma mais grave da
dengue resultaria da imunoamplificação da infecção dependente de anticorpos (Antibody-
dependent enhancement), ou seja, quando o indivíduo é posteriormente infectado por outro
sorotipo da dengue, denominado de infecção secundária, a probabilidade de a dengue vir a ser
mais grave é maior, pois os anticorpos que foram gerados na infecção primária se ligam a
antígenos do outro sorotipo do DENV de forma pouco eficiente, de modo que isso resulta em
ativação acentuada das células do sistema imune por meio do receptor Fc. Assim, essa
imunoamplificação resulta em produção excessiva de citocinas como IL-1, TNF. Ademais,
ocorre maior internalização das partículas virais e, consequentemente, maior replicação viral.
Por fim, em áreas hiperendêmicas ocorre circulação de vários sorotipos, aumentando as
chances do indivíduo adquirir infecção secundária e a forma mais grave da doença (Gubler &
Trent 1994).
1.7. Profilaxia e tratamento
As principais medidas profiláticas a dengue envolvem diretamente o combate ao
mosquito vetor. Sendo assim, mecanismos que reduzam a proliferação dos mosquitos Aedes
aegypti contribuem para a redução do número de casos humanos de dengue, haja vista que as
áreas infestadas pelo mosquito se sobrepõem às áreas de ocorrência da dengue (Gubler, 2011).
Além disso, a proliferação aumentada dos mosquitos é um dos fatores que precede os
períodos epidêmicos da dengue. Assim, faz-se necessário a adoção de medidas de combate ao
vetor, entre as quais destacamos o impedimento de acúmulo de água próximo à residência
como uma medida eficaz de erradicação dos focos de mosquitos, porém apenas essa medida
tem se mostrado insuficiente para o combate a dengue.
Apesar de ainda não existir uma droga antiviral comercialmente disponível para a
dengue, ao menos os estudos voltados para o desenvolvimento de vacinas contra o vírus tem
progredido consideravelmente nos últimos anos (Durbin & Whitehead 2011; McArthur et al.
22
2013). Como exemplo podemos citar a vacina quimérica tetravalente desenvolvida pelo grupo
Sanofi. Nesse caso os estudos do tipo placebo-randomizados que foram conduzidos em
inúmeros países da Ásia e América do Sul, mostraram resultados satisfatórios dos parâmetros
de segurança e imunogenicidade da vacina. Adicionalmente, esta é a primeira vacina a chegar
à fase 3 dos testes envolvendo seres humanos. Também é a primeira vacina contra a dengue a
ter a sua eficácia clínica estabelecida, tendo sido obtido preliminarmente eficácia clínica
global de 59%, conforme resultados de uma meta-análise conduzida por Da Costa e
colaboradores (2014). Assim, embora essa eficácia clínica possa parecer reduzida é esperado
que a vacina apresente importante papel profilático no combate a dengue, pois poderá
contribuirá para a redução dos casos de infecção pelo DENV, tanto os casos sintomáticos
quanto os assintomáticos.
Além dos esforços para o desenvolvimento de vacinas contra a dengue, diversas
pesquisas tem objetivado analisar potenciais antivirais. Nesse sentido, estudos têm avaliado
diversos compostos que apresentem atividades anti-dengue. Dentre alguns dos mais recentes
compostos analisados, podemos citar os seguintes compostos que tem apresentado atividades
antivirais: o Lanatoside C que inibiu o RNA viral, consequentemente inibiu o ciclo de
replicação viral (Cheung et al. 2014); Latarcin é um peptídeo natural produzido por
antimicrobianos. Foi observado que o peptídeo teve efeitos inibitórios das proteínas virais
NS2B-NS3 e do processo de replicação viral (Rothan et al. 2014); Lovastatin é uma droga que
inibe a enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase. Primariamente
esta droga inibe a síntese de colesterol, porém também afeta outros processos celulares como
a síntese de isoprenóides e glicosilação, devido à inibição da síntese do dolicol. Portanto, foi
verificado que a Lovastatin reduziu os títulos virais em camundongos tratados, entretanto o
seu mecanismo de ação deve ser esclarecido (Martinez-Gutierrez et al. 2014).
23
Diante da grande importância que a dengue representa para a saúde pública de dezenas
de países, faz-se necessário o desenvolvimento de drogas anti-dengue para reduzir as taxas de
morbi-mortalidade e os níveis de transmissão do DENV. Sendo assim, anteriormente
apresentamos algumas drogas anti-dengue em desenvolvimento, porém nesse contexto surgi
uma pergunta: por que ainda não existe nenhuma droga anti-dengue disponível
comercialmente? Entre as prováveis respostas destacamos os seguintes fatores que dificultam
o surgimento do tão esperado antiviral: (1) a existência de quatro sorotipos da dengue
provocando doença, de modo que o antiviral tem que ser eficaz para os quatro sorotipos; (2)
somente há pouco tempo foi estabelecido um modelo animal que mimetize a dengue, em
consequência este fato dificultou os estudos in vivo; (3) a inexistência de poucos sítios ativos
na partícula viral que protejam as drogas da ação das proteases da dengue. Portanto, a fim de
contornar esses empecilhos é preciso desenvolver novas metodologias para a produção de
potentes drogas anti-dengue (Martina et al. 2009; Martinez-Gutierrez et al. 2014).
1.8. Meta-análise: considerações
O termo meta-análise provém do prefixo grego met(a), significando a ideia de
participação, mistura ou intermediação. A história da meta-análise, provavelmente surgiu na
primeira metade do século XIX, quando o matemático alemão Johann C. Friedrich Gauss
(1777-1855) produziu trabalhos voltados para a área da astronomia. Nesse mesmo período, o
matemático francês Pierre-Simon Laplace (1749-1827) constatou que a combinação de dados
de diferentes estudos teria resultados mais confiáveis do que a observação individual. Com o
passar dos anos, já no início do século XX, o matemático e estatístico inglês Karl Pearson
(1857-1936) foi responsável pela primeira publicação no British Medical Journal de um
trabalho de pesquisa que envolvia a utilização das técnicas de meta-análise. Posteriormente,
na década de 70, o estatístico norte-americano Gene V. Glass (1940-) foi o primeiro a
denominar o processo de revisão sistemática da literatura de meta-análise. Entretanto,
24
somente a partir da década de 80 é que os procedimentos de meta-análise começaram a ser
mais cientificamente difundidos (Fontelles 2012).
Atualmente, existem diversos softwares estatísticos, como o R®, Stata® e Meta-
DiSc®, os quais possuem linhas de comando para o desenvolvimento dos cálculos de meta-
análise. Entretanto, apesar da praticidade dos softwares, a utilização dos mesmos exige muitas
vezes o uso de linhas de comando extensas e complexas. Porém, isso não tem sido empecilho
e o número de estudos do tipo meta-análise tem aumentado nos últimos anos.
1.9. Acurácia diagnóstica
A acurácia diagnóstica, refere-se ao grau em que um teste, ou estimativa baseada em um
teste é capaz de determinar o verdadeiro valor do que está sendo medido. Em outras palavras,
entende-se por “acurácia” a proporção de testes verdadeiramente positivos e verdadeiramente
negativos, em relação à totalidade dos resultados. Portanto, quanto melhor a acurácia
diagnóstica, mais próximo o teste se aproxima do padrão-ouro (Beaglehole et al. 1993).
O desempenho de um teste pode ser calculado por meio de vários parâmetros
laboratoriais, os quais incluem sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança, entre
outros. Para tanto a definição desses termos são destacadas abaixo, e na Tabela 1 é mostrado a
formula para o cálculo de cada parâmetro laboratorial de um teste (Beaglehole et al. 1993).
Sensibilidade: é a probabilidade condicional do teste ser positivo dada a presença da
doença, ou seja, é a taxa de verdadeiros positivos.
Especificidade: é a probabilidade condicional do teste ser negativo dada a ausência da
doença, ou seja, é a taxa de verdadeiros negativos.
Valor preditivo positivo: representa a probabilidade de um indivíduo ter realmente a
doença, dado que apresentou um resultado positivo do teste índice.
Valor preditivo negativo: representa a probabilidade de um indivíduo não ter realmente
a doença, dado que apresentou um resultado negativo do teste índice.
25
Razão de verossimilhança positiva: representa um índice que diz quantas vezes é mais
provável um resultado de teste positivo em quem tem a doença do que em quem não tem a
doença.
Razão de verossimilhança negativa: representa um índice que diz quantas vezes é mais
provável um resultado de teste negativo em quem tem a doença do que em quem não tem a
doença. Para este caso, quanto mais próximo de zero melhor será o teste.
Razão de chances diagnóstica: representa um único número que descreve quantas vezes
maiores são as chances de se obter um resultado positivo em uma pessoa com a doença do que
em uma pessoa sem a doença.
Curva ROC: é uma representação gráfica do desempenho dos testes quanto aos
parâmetros de sensibilidade e especificidade (Beaglehole et al. 1993).
Tabela 1. Parâmetros laboratoriais usados para determinar a acurácia de um teste
DOENÇA
TESTE PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO a (VP) b (FP) a+b
NEGATIVO c (FN) d (VN) c+d
TOTAL a+c b+d a+b+c+d=N
a= Verdadeiros positivos; b= Falsos positivos; c= Falsos negativos; d= Verdadeiros negativos
Sensibilidade= a/(a+c); Especificidade= d/(d+b); Valor preditivo positivo= a/(a+b); Valor
preditivo negativo= d/(c+d); Razão de chances diagnóstica= Valor preditivo positivo/Valor
preditivo negativo; Acurácia= (a+d)/N
O julgamento de um teste em bom ou ruim, pode ser obtido pelo índice Kappa, onde é
calculado a concordância entre o teste índice e o padrão ouro. Nessa meta-análise o padrão
ouro para detecção do DENV, foi o isolamento viral, ou algum método molecular (RT-PCR
e/ou PCR em tempo real). Assim sendo, os seguintes índices Kappa são obtidos: excelente (1-
0,81); bom (0,8-0,61); moderado (0,6-0,4); ou ruim (0,2-0) (Kotz & Johnson 1983).
26
2. JUSTIFICATIVA
Quando pela primeira vez o DENV foi isolado em 1943 na Polinésia Francesa e Japão,
a sua detecção continuou por anos em restritos locais. Porém, a disseminação do vetor Aedes
aegypti coincidiu com o aumento “explosivo” dos casos de dengue. Isso aconteceu por causa
do acelerado processo de urbanização, globalização, mudanças climáticas e falhas nos
mecanismos de combate ao vetor. Desse modo, embora o DENV tenha sido isolado na década
de 40, acredita-se que o vírus tenha emergido 1000 anos atrás com um ciclo de transmissão
envolvendo primatas não humanos e mosquitos (Hotta 1952; Wang et al. 2000; Holmes &
Twiddy 2003; Gubler 2011).
Com o passar dos anos, novos métodos de diagnóstico da dengue surgiram e
permitiram uma identificação precoce e diferencial da doença. Todavia, tem-se observado que
apenas os métodos de diagnóstico clínico e epidemiológico são falíveis, haja vista que em
meio às epidemias da dengue, os casos confirmados por dados clínicos e epidemiológicos têm
sido descartados posteriormente por métodos laboratoriais. Também, no momento não existe
um teste laboratorial com desempenho próximo de 100%. Nesse contexto, observa-se que
embora os testes de ELISA sejam práticos, ocorrem vários resultados discordantes em relação
ao teste laboratorial padrão-ouro (Pal et al. 2014). Consequentemente, esses resultados
ambíguos nos levaram as seguintes questões: Qual a sensibilidade e especificidade global dos
kits de ELISA NS1 (DENV) da Panbio® e Platelia™? Quais são os fatores que poderiam
estar interferindo no desempenho do teste? Por conseguinte, a fim de tentar solucionar essas
questões nós conduzimos uma meta-análise, a qual é um tipo de análise estatística de dados,
em que os resultados de vários estudos de pesquisa são agrupados e analisados como se fosse
o resultado de um único grande estudo.
27
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Realizar uma meta-análise da acurácia diagnóstica dos kits comerciais da Panbio® e
Platelia™ do tipo ELISA para a detecção do NS1 do DENV.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar a sensibilidade e especificidade dos kits ELISA-NS1 da Panbio® e Platelia™ na
detecção do DENV;
Determinar a acurácia dos testes em relação aos sorotipos do DENV, ao tipo de infecção e ao
período de coleta das amostras;
Fazer associações entre o desempenho dos dois kits analisados relacionando os parâmetros da
performance dos testes obtido pela análise dos meta-dados;
Realizar uma análise in silico por meio do software ViPR para determinar o grau de
variabilidade do NS1 do DENV em relação aos sorotipos procedentes de regiões distintas das
Américas e Ásia.
28
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Estratégia de pesquisa
A presente meta-análise seguiu as normas orientadas pelo protocolo PRISMA
(Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-analysis) e os métodos propostos
pela colaboração Cochrane (Moher et al. 2009; Higgins & Green 2013). Logo em seguida
foram definidas as seguintes bases de dados para a busca de artigos: PUBMED; EMBASE e
Google Acadêmico. Também nessa etapa usamos uma combinação de descritores para
selecionar os estudos de interesse e o fluxograma das etapas da meta-análise podem ser
visualizados na Figura 7.
Figura 7. Fluxograma das etapas a ser seguidas no processo de meta-análise.
4.2 Seleção dos estudos
Após encontrar estudos nas bases de dados, anteriormente estabelecidas, com os
seguintes descritores, dengue AND diagnóstico, dengue vírus AND diagnóstico, ELISA NS1
AND Dengue, acurácia diagnóstica AND dengue e diagnóstico precoce AND dengue,
realizamos uma análise quanto aos critérios de inclusão/exclusão.
Critérios de inclusão: estudos que avaliassem os parâmetros de sensibilidade e
especificidade envolvendo os kits direcionados para o teste de ELISA, envolvendo a captura
do antígeno NS1 dengue, sendo os kits da Panbio® ou Platelia™.
Avaliação da
qualidade dos estudos
Estratégia
de pesquisa
Seleção dos
estudos
Extração
dos dados
Análise
estatística
PubMed
Embase
Google acadêmico
Descritores:
DENV,
Diagnostico,
Acurária...
Critérios de
inclusão/exclusão
VP, VN, FP, VN
STATA:
sensibilidade,
especificidade
29
Critérios de exclusão: estudos de revisão; pesquisas não envolvendo seres humanos; e
publicações com limitadas informações para calcular os índices de sensibilidade e
especificidade foram excluídos para essa meta-análise. Quanto ao idioma, estudos não
publicados em inglês, espanhol e português foram excluídos.
4.3 Extração dos dados
Os seguintes dados de cada estudo incluídos na meta-análise foram extraídos: autor;
ano de publicação; local de estudo; sexo dos participantes; faixa etária; quantidade de
participantes; método de diagnóstico; delineamento do estudo; dados relacionados à
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo
(VPN). Por conseguinte, os dados relacionados à acurácia do diagnóstico foram plotados em
uma tabela de contingencia 2x2.
4.4 Avaliação da qualidade dos estudos
A análise da qualidade dos estudos foi realizada baseando-se na ferramenta
denominada de avaliação dos estudos quanto à qualidade da acurácia diagnóstica (QUADAS)
(Whiting et al. 2003). A ferramenta QUADAS consistiu de 14 itens chaves, nos quais cada
item foi avaliado por um score como “baixo”, “alto”, “obscuro”, os quais são formulados para
uma resposta, tal como “sim”, “não” e “não claro” que poderão indicar baixo ou alto risco de
viés em relação à qualidade dos estudos selecionados.
4.5 Análise estatística
Nessa meta-análise usamos o software STATA® IC/64 (version 13.1, College Station,
TX) com os comandos MIDAS e METANDI. Para a correção nas células contendo valores
zero, usamos fatores de correção do comando METANDI.
30
A sensibilidade, especificidade, a razão de verossimilhança positiva e negativa (LR+,
LR-) e razão de chance do diagnóstico (DOR), com intervalo de confiança (CI) de 95%, foi
obtido para cada estudo e posteriormente combinado. Em seguida foi plotado, por meio do
software, uma curva do tipo HSROC (Hierarchical summary receiver operating
characteristic) dos estudos selecionados. A curva HSROC é um modelo bivariável que
fornece informações sobre o desempenho geral de um teste através de diferentes limiares.
Dessa forma, quanto mais os estudos se concentram no canto esquerdo superior do gráfico
maior é a sensibilidade e especificidade do teste (Jones & Athanasiou 2005).
Para avaliar potenciais vieses de publicação, utilizamos o funnel plot de Deeks, de
modo que p<0.05 indicaria a presença de viés de publicação (Deeks et al. 2005). Também
utilizamos o monograma de Fagan para calcular a probabilidade pós-teste (Fagan 1975).
4.6. Análise in silico
A análise in silico foi realizada pelo software ViPR (Virus pathogen resource). Para
tanto, as sequencias dos NS1 isoladas da América e Ásia foram recuperadas de um banco de
dado e comparadas entre si. O objetivo dessa análise era verificar o grau de variabilidade
entre as sequencias aminoacídicas do NS1 dos quatro sorotipos do DENV. Além do mais, o
software permite inferir se a diferença encontrada foi estatisticamente significativa, ou não.
31
5. RESULTADOS
Durante a pesquisa foram encontradas 672 citações referentes à dengue, através da
aplicação combinada dos descritores nas três bases de dados anteriormente descritas. Na etapa
final de seleção, tivemos de excluir cinco estudos que apenas avaliaram a sensibilidade dos
métodos laboratoriais, ou fizeram a sobreposição dos resultados dos dois testes em análise
(Kumarasamy et al. 2007; Chuansumrit et al. 2008; McBride 2009; Bisordi et al. 2011; Felix
et al. 2012). Por conseguinte, após aplicação dos critérios de seleção e exclusão, restaram 30
estudos de referência (Dussart et al. 2006; Kumarasamy et al. 2007; Bessof et al. 2008;
Blacksell et al. 2008; Castro 2008; Dussart et al. 2008; Lapphra et al. 2008; Hang et al. 2009;
Phuong et al. 2009; Poloni 2009; Ramirez et al. 2009; Guzman et al. 2010; Lima et al. 2010;
Osorio et al. 2010; Pok et al. 2010; Singh et al. 2010; Araújo et al. 2011; Chua et al. 2011;
Chuansumrit et al. 2011; Duong et al. 2011; Lima et al. 2011; Kassim et al. 2011; Silva et al.
2011; Watthanaworawit et al. 2011; Anders et al. 2012; Blacksell et al. 2012; Aryati et al,
2013; Colombo et al. 2013; Kosasih et al. 2013; Sea et al. 2013), os quais foram
definitivamente incorporados em nossa meta-análise por se tratar de pesquisas experimentais
avaliando a acurácia dos kits de diagnóstico da Panbio® ou Platelia™, os quais tiveram como
princípio a captura do antígeno NS1, por meio da técnica de ELISA indireto. Assim, os
resultados de nossa busca literária são demonstrados na Figura 8.
32
Figura 8. Fluxograma das etapas realizadas durante a meta-análise.
doi:10.1371/journal.pone.0094655.g001
Dentre os estudos incluídos nessa meta-análise, houve um total de 12,105 pacientes
recrutados. Essas amostras foram procedentes de 17 países da América Latina, Ásia e
Oceania, sendo que as pesquisas foram mais frequentemente conduzidas no Brasil (27%)
(Castro 2008; Poloni 2009; Lima et al. 2010; Araújo et al. 2011; Lima et al. 2011; Silva et al.
2011; Colombo et al. 2013; Sea et al. 2013), Vietnam (13%) (Hang et al. 2009; Phuong et al.
2009; Guzman et al. 2010; Anders et al. 2012), Malásia (13%) (Kumarasamy et al. 2007;
Guzman et al. 2010; Chua et al. 2011; Kassim et al. 2011) e Tailândia (13%) (Lapphra et al.
2008; Guzman et al. 2010; Chuansumrit et al. 2011; Watthanaworawit et al. 2011). Em
relação ao delineamento dos estudos, os mesmos foram classificados em dois tipos:
prospectivo e retrospectivo de cohort, dentre os quais somente 12 relataram que suas amostras
Citações identificadas nas bases de dados (n=672) PubMed=224 Embase=183 Google scholar=265
Citações em duplicata, removidas (n=260); Citações claramente não relevante para o tópico (n=362)
Artigos potencialmente relevantes selecionados para análise detalhada (50)
Artigos avaliados integralmente quanto à elegibilidade (n=30)
Inclusão final para meta-análise (n=30)
Excluídos pelas seguintes razões (n=20): Dados necessários não fornecidos (n=5); Usou apenas testa rápido (NS1) ou métodos de detecção de IgG/IgM (n=15)
Iden
tifi
caçã
o T
riag
em
Ele
gibi
lida
de
Incl
usão
33
foram coletadas durante epidemias da dengue (Dussart et al. 2006; Kumarasamy et al. 2007;
Dussart et al. 2008; Lima et al. 2010; Pok et al. 2010; Singh et al. 2010; Duong et al. 2011;
Lima et al. 2011; Aryati et al. 2013; Colombo et al. 2013; Kosasih et al. 2013; Sea et al.
2013). Tipicamente, a maioria das amostras foram coletadas até o sexto dia do inicio dos
sintomas (Dussart et al. 2006; Bessoff et al. 2008; Blacksell et al. 2008; Dussart et al. 2008;
Lapphra et al. 2008; Hang et al. 2009; Phuong et al. 2009; Poloni 2009; Ramirez et al. 2009;
Guzman et al. 2010; Lima et al. 2010; Singh et al. 2010; Silva et al. 2011; Anders et al. 2012;
Blacksell et al. 2012; Colombo et al. 2013; Kosasih et al. 2013; Sea et al. 2013). Por fim, os
dados extraídos da seleção final são apresentados na Tabela 2.
A ferramenta QUADAS consistiu de 14 itens, os resultados da análise podem ser
visualizados na Figure 9. A qualidade da maioria dos estudos foi considerada boa. Nessa
direção, pelo funnel plot de Deeks também não foi encontrado potenciais vieses de publicação
para os dois subgrupos de estudos (p=0.56, Panbio® e p=0.09, Platelia™). Todavia, os itens
do QUADAS relacionados à determinação dos resultados indeterminados, informações
clínicas relevantes (classificação em DF ou DHF), divulgação do cut off e cegamento das
amostras, antes do processamento pelos testes laboratoriais, foram os itens avaliados que mais
apresentaram riscos de viés.
Para a análise in silico foi observado diferenças significativas entre a molécula de NS1
das cepas dos DENV1, 2, 3 e 4 isolados das Américas versus Ásia. Porém, as diferenças
aminoacídicas não estiveram correlacionadas ao epítopo mais conservado da NS1.
34
Tabela 2. Estudos selecionados e dados extraídos para meta-análise
Ref. Delineamen-to do estudo
Localiza-ção
n Sexo Média, Idade (anos)
ResultadosPANBIO® ResultadosPLATELIA™ Método diagnóstico
Sen.% (95% CI)
Spec.% (95% CI)
PPV% (95% CI)
NPV% (95% CI)
Sen.% (95% CI)
Spec.% (95% CI)
PPV% (95% CI)
NPV% (95% CI)
Dussart 2006 Cohort, prospectivo
Guiana Francesa
349 Female 75%
33 88.7 (84-92)
100 (85-100)
89.8 100 ELISA; RT-PCR; VI
Kumarasamy 2007
Cohort, retrospectivo
Malásia 354 NR NR 93.4 100 100 98.9 ELISA; RT-PCR; VI
Bessoff 2008 NR Porto Rico
253 NR NR 64.9 (58-71)
97.8 (88-100)
100 (97-100)
39.3 (31-48)
83.2 (77-88)
100 (92-100)
100 (97.2-100)
62.5 (51-73)
ELISA; Real time RT-PCR; VI
Blacksell 2008 Cohort, prospectivo
Laos 92 NR NR 63.2 (53-73)
100 100 79.4 (71-88)
ELISA; RT-PCR
Castro 2008 Cohort, prospectivo
Brasil 250 Male 58%
35 85.4 94 81 95.6 ELISA; Real time RT-PCR; VI
Dussart 2008 Cohort, retrospectivo
Guiana Francesa
320 NR NR 55.1 (49-61)
97.9 (89-100)
75.2 98 82.4 (77-87)
100 (93-100)
100 100 ELISA; ICG; RT-PCR; VI
Lapphra 2008 Cohort, prospectivo
Tailândia 235 Male 56.2%
17.8 63.2 (56-70)
98.4 (92-100)
99 52.5 ELISA; RT-PCR; VI
Hang 2009 Cohort, prospectivo
Vietnam 138 Male 44.9%
16 83.2 (75-89)
100 (87-100)
100 (97.2-100)
38.2 (22-56)
ELISA; RT-PCR
Phuong 2009 NR Vietnam 459 Male 55%
18.3 37 99.5 90.9 92.2 ELISA; RT-PCR
Poloni 2009 Cohort, prospectivo
Brasil 92 NR NR 70 (59-79) 100 (54-100)
100 (94-100)
18.7 (7.2-36)
ELISA; Real time RT-PCR
Ramirez 2009 NR Venezuela
147 NR NR 60.9 (50-70)
94.4 (81-100)
100 41.4 71.3 (61-80)
86.1 (71-94)
100 49 ELISA; ICG; RT-PCR; VI
Guzman 2010 Cohort, prospectivo
M 2259 NR NR 52 90 76.2 90 66 100 82.3 100 ELISA; RT-PCR; VI
Lima 2010 Cohort, retrospective
Brasil 450 NR NR 72 100 100 78 84 99 98 86 ELISA; RT-PCR; VI
Osorio 2010 Cohort, retrospectivo
Colombia 310 NR NR 71.1 (64-77)
89.1 (80.9-94.7)
94 (89-97) 56.6 (48-65)
70.8 (64-77)
92.3 (85-97)
95.5 (91-98.2)
57.5 (49-66)
ELISA; RT-PCR; VI
Pok 2010 Cohort, prospectivo
Singapura
433 NR NR 67 (57-75) 100 (96-100)
100 (96-100)
73.5 (64-81)
81.7 (73-88)
100 (96-100)
100 (96.4-100)
83.3 (75-88)
ELISA; ICG; RT-PCR
Singh 2010 Cohort, prospectivo
India 2070 NR NR 61.4 100 100 100 ELISA; RT-PCR;
Araújo 2011 Cohort, prospective
Brasil 86 Female 62.5%
27 50 (30-70) 100 (94-100)
66 84.8 ELISA; RT-PCR; VI
Chua 2011 Cohort, prospectivo
Malásia; China; India
558 Male 62%
26 91.6 100 92.3 95.8 ELISA; Real time RT- PCR; VI
Chuansumrit 2011
Cohort, prospectivo
Tailândia 85 NR NR 76.4 100 (83-100)
100 62 ELISA; ICG; VI
35
Duong 2011 Cohort, prospectivo
Cambodia
339 Female 52.3%
4 57.7 (51.4-63.8)
100 100 41.8 (35-49)
ELISA; RT-PCR; VI
Lima 2011 Cohort, retrospectivo
Brasil 450 NR NR 80 100 100 100 ELISA; RT-PCR; VI
Kassim 2011 NR Malásia 208 NR NR 83.7 90.4 86 95 ELISA; RT-PCR
Silva 2011 Cohort, prospectivo
Brasil 147 NR NR 87.5 71 68 85 95 47 58 92 ELISA; ICG; HI
Watthanaworawit 2011
NR Tailândia-Myanmar
162 Male 60.5%
23 54.6 (42-66)
100 (96-100)
100 (91-100)
73.2 (64.4-80.8)
ELISA; Real time RT-PCR
Anders 2012 Cohort, prospectivo
Vietnam 116 NR NR 64.7 (54.5-74.9)
95.8 (88-100)
73.9 96 ELISA; RT-PCR
Blacksell 2012 Cohort, retrospectivo
Tailândia 626 NR NR 44.8 (38-51)
93.2 (88-97)
87.5 92.5 56.5 (50-63)
100 (98-100)
84 100 ELISA; RT-PCR; HI
Aryati 2013 Cohort, prospectivo
Indonésia 503 NR NR 56.4 100 100 43 ELISA; RT-PCR; VI
Colombo 2013 Cohort, prospectivo
Brasil 220 NR NR 82 91 85 89 ELISA; RT-PCR
Kosasih 2013 Cohort, retrospectivo
Indonésia 275 Male 68%
30.7 46.8 (40.2-53.3)
100 100 32 ELISA; RT-PCR;
Sea 2013 Cohort, prospectivo
Brasil 119 NR NR 0 100 0 51 ELISA; RT-PCR; VI
Abreviações: Ref, Estudos de referência; n, n amostral; Sen., Sensibilidade; Spec., Especificidade; NR, Não relatado; M, Multicêntrico; HI, Inibição da hemaglutinação; ICG, Imunocromatográfico; VI, Isolamento viral; RT-PCR, Transcriptase reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase.
doi:10.1371/journal.pone.0094655.t001
36
Figura 9. Ferramenta QUADAS mostrando a avaliação da qualidade dos estudos.
doi:10.1371/journal.pone.0094655.g002
5.1. Acurácia global dos kits comerciais da Panbio® e Platelia™
Dentre os estudos selecionados, 16 avaliaram os ensaios da Panbio® (Bessoff et al.
2008; Blacksell et al. 2008; Dussart et al. 2008; Ramirez et al. 2009; Guzman et al. 2010;
Lima et al. 2010; Osorio et al. 2010; Pok et al. 2010; Singh et al. 2010; Araújo et al. 2011;
Lima et al. 2011; Silva et al. 2011; Watthanaworawit et al. 2011; Blacksell et al. 2012; Aryati
et al. 2013; Colombo et al. 2013) e 23 da Platelia™ (Dussart et al. 2006; Kumarasamy et al.
2007; Bessoff et al. 2008; Castro 2008; Dussart et al. 2008; Lapphra et al. 2008; Hang et al.
2009; Phuong et al. 2009; Poloni 2009; Ramirez et al. 2009; Guzman et al. 2010; Lima et al.
2010; Osorio et al. 2010; Pok et al. 2010; Chua et al. 2011; Chuansumrit et al. 2011; Duong et
al. 2011; Kassim et al. 2011; Silva et al. 2011; Anders et al. 2012; Blacksell et al. 2012;
Kosasih et al. 2013; Sea et al. 2013), isso ocorreu devido a alguns terem feito a associação
entre os dois kits especificados. Portanto em relação à Panbio®, a sensibilidade,
especificidade, LR+, LR- e DOR global foram de 66% (95% CI 61-71), 99% (95% CI 96-
37
100), 98 (95% CI 19-367), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 289 (95% CI 59-1412), respectivamente.
Enquanto para o teste da Platelia™, foram obtidos os seguintes índices global de
sensibilidade, especificidade, LR+, LR- e DOR: 74% (95% CI 63-82), 99% (95% CI 97-100),
175 (95% CI 28-1099), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 663 (95% CI 98-4478), respectivamente. Na
Figura 10A-B é mostrado o gráfico da curva HSROC dos estudos individuais relacionados à
acurácia diagnóstica dos dois testes analisados.
Figura 10. Gráfico HSROC mostrando a acurácia diagnóstica dos estudos incluídos. Os resultados obtidos pelo kit da Panbio® e Platelia™ estão, respectivamente, representados no gráfico A e B. A variação individual dos diâmetros é proporcional ao peso de cada estudo.
doi:10.1371/journal.pone.0094655.g003
5.2. Acurácia dos ensaios quanto ao sorotipo viral e a classificação da infecção
Ao avaliarmos a acurácia dos testes quanto à sensibilidade, DOR, LR+ e LR-,
referentes ao sorotipo da DENV1, obtemos os seguintes valores: 81% (95% CI 73-87), 702
(95% CI 101-4842), 136 (95% CI 23-806) e 0.2 (95% CI 0.1-0.3), respectivamente para o kit
38
da Panbio®. Similarmente, os valores para Platelia™ foram 90% (95% CI 81-95), 5460 (95%
CI 131-225878), 526 (95% CI 12-21602) e 0.09 (95% CI 0.04-0.19).
Quanto ao DENV2 os parâmetros laboratoriais, descritos acima na mesma ordem,
foram: 74% (95% CI 67-80), 507 (95% CI 55-4663), 133 (95% CI 17-1023) e 0.3 (95% CI
0.2-0.4), respectivamente para o kit da Panbio®; 73.3% (95% CI 61-83), 714 (95% CI 37-
13466), 191 (95% CI 12-3090) e 0.26 (0.17-0.4), respectivamente para o kit da Platelia™.
Já para o DENV3, os parâmetros descritos acima, também na mesma ordem foram:
70.7% (95% CI 63-78), 481 (95% CI 33-6869), 141 (95% CI 11-1780) e 0.3 (95% CI 0.2-
0.4), respectivamente para o kit da Panbio®; 83% (95% CI 75-89), 2353 (95% CI 72-7e+4),
397 (95% CI 12-13119) e 0.16 (95% CI 0.11-0.25), respectivamente para o kit da Platelia™.
Por fim a sensibilidade, DOR, LR+ e LR- para o DENV4 foram: 37% (95% CI 26-50),
18 (95% CI 6-63), 12 (95% CI 4-38) e 0.6 (95% CI 0.5-0.8), respectivamente para o kit da
Panbio®; 58% (95% CI 30-81), 96848 (95% CI 14-6e+8), 41006 (95% CI 6-3e+8) e 0.4 (95%
CI 0.2-0.8), respectivamente para o kit da Platelia™.
Em relação à classificação da dengue em infecção do tipo primária ou secundária,
foram obtidas as seguintes estimativas global quanto aos parâmetros de sensibilidade, DOR,
LR+ e LR- na infecção primária: 75% (95% CI 66-82.5), 7114 (95% CI 18-2e+6), 1761 (5-
601666) e 0.24 (95% CI 0.17-0.34), respectivamente para o kit da Panbio®; 94.6% (95% CI
91-97), 2036 (95% CI 341-12130), 110 (95% CI 23-518) e 0.05 (95% CI 0.03-0.09),
respectivamente para o kit da Platelia™. Ao passo que esses índices laboratoriais, para a
infecção secundária foram: 57% (95% CI 47-67), 3443 (95% CI 12-9e+5), 1484 (95% CI 6-
4e+5) e 0.4 (95% CI 0.3-0.5), respectivamente, para o kit da Panbio®; 66% (95% CI 53-77),
632 (95% CI 47-8374), 216 (95% CI 13-3453) e 0.3 (95% CI 0.2-0.5), respectivamente, para
o kit da Platelia™.
39
5.3. Acurácia dos ensaios quanto às manifestações clínicas da dengue
No intuito de verificar se os pacientes com as formas clínicas moderada (febre da
dengue/DF), ou grave da dengue (DHF/DSS), apresentavam variações significativas na
performance dos testes, realizamos uma estimativa global sobre a acurácia dos testes. Nesse
caso, houve apenas a utilização do ensaio Platelia™, avaliado os parâmetros laboratoriais
frente às diferentes formas clínicas dos pacientes. Em suma, apenas cinco estudos fizeram
essa avaliação, conforme mostrado na Figura 11A-B. Assim, houve sensibilidade de 69%
(95% CI 43-86) e de 60% (95% CI 48-70) para a DF(A) e FHD(B), respectivamente.
Figura 11. Forest plot para a sensibilidade do kit da Platelia™ na DF e FHD.
doi:10.1371/journal.pone.0094655.g004
5.4. DOR e probabilidade pós-teste
A DOR sumariza a acurácia diagnóstica do teste índice como um único número que
descreve quantas vezes é maior a chance de se obter um resultado positivo em uma pessoa
com a doença do que em alguém sem a doença. Como descrito anteriormente, os valores
40
obtidos das DOR foram consideravelmente elevados, isso ocorreu devido aos altos valores da
sensibilidade e especificidade. Nesse caso uma função da DOR plotada no gráfico,
apresentaria um comportamento exponencial, subindo de forma abrupta, numa clara
correlação positiva com os índices de sensibilidade e especificidade (Glas et al. 2003; Buehler
et al. 2013).
A fim de obter a probabilidade pós-teste, ou seja, a utilidade clínica do teste,
utilizamos o nomograma de Fagan pelo qual fizemos uma simulação de um ambiente que
apresentava uma prevalência de 37% da dengue com base nos estudos selecionados. Assim a
probabilidade, nesse modelo, de alguém ter a doença e não ser detectado pelo teste Panbio®
seria de 17%. Enquanto para o teste Platelia™, um resultado negativo poderia está associado
a 13% dos indivíduos com a doença (Figura 12A-B).
Por outro lado, a probabilidade pós-teste dos pacientes doentes terem o teste positivo
seria de 98% e 99%, respectivamente para os kits da Panbio® e Platelia™. Mostrando assim,
que especificamente esses testes de captura do antígeno NS1 representam uma ferramenta
importante no diagnóstico da dengue.
Figura 12. Nomograma de Fagan usado para demonstrar a probabilidade pós-teste. Em A é representado a probabilidade pós-teste para o kit da Panbio®, enquanto em B os dados estão relacionados ao kit da Platelia™. doi:10.1371/journal.pone.0094655.g005
41
6. DISCUSSÃO GERAL
Os estudos incluídos nessa meta-análise tiveram uma sensibilidade e especificidade
global do kit Panbio® variando de 45% a 100%, e de 71% a 100% respectivamente.
Enquanto, para o kit Platelia™ a sensibilidade variou de 0% a 95% e a especificidade variou
de 47% a 100%. Quando realizamos uma estimativa global da sensibilidade, houve
superioridade do Platelia™, tendo sido de 74% (95% CI 63-82), enquanto para o Panbio® foi
de 66% (95% CI 61-71). No que diz respeito a essa maior sensibilidade do primeiro ensaio,
ainda não existe hipóteses justificando o porquê desse desfecho, porém temos observado que
o sorotipo viral pode influenciar a acurácia do teste, alterando assim a sensibilidade, de forma
que tanto o teste da Panbio®, quanto o Platelia™, tiveram maior sensibilidade para o
DENV1. Todavia, houve maior número de participantes com DENV1, incluídos para análise
pelo teste Platelia™ (Dussart et al. 2006; Bessoff et al. 2008; Blacksell et al. 2008; Dussart et
al. 2008; Ramirez et al. 2009; Guzman et al. 2010; Lima et al. 2010; Pok et al. 2010; Duong et
al. 2011; Silva et al. 2011; Kosasih et al. 2013), fato este que pode ter influenciado na
estimativa global, apesar de nossos resultados ser similares a literatura científica, na qual vêm
se verificando maior sensibilidade da Platelia™.
Nossos achados em relação à sensibilidade dos testes frente ao sorotipo viral são
condizentes parcialmente com a literatura científica, de modo que a menor sensibilidade
verificada em ambos os testes foi de 37% (Panbio®) e 58% (Platelia™) para o DENV4.
Todavia, alguns estudos têm relatado também menor sensibilidade do Platelia™ para o
DENV2 (Dussart et al. 2008; Ramirez et al. 2009; Guzman et al. 2010; Silva et al. 2011;
Blacksell et al. 2012). A baixa acurácia do teste Panbio®, quanto a epidemia do DENV4, foi
recentemente analisada por Colombo et al. 2013 e Sea et al. 2013, tendo sido constatado a
ocorrência de falsos negativos. Ainda não é sabido o porquê da menor sensibilidade dos testes
ELISA NS1 em pacientes infectados com o DENV4, porém algumas hipóteses podem ser
elencadas: (i) apesar da glicoproteína NS1 ser conservada, poderia haver diferenças
42
quantitativas na forma secretada, dependendo do sorotipo viral, assim consequentemente
ocorreria menor disponibilidade de NS1, o que reduziria as chances de sua detecção; (ii) outro
fator plausível poderia ser a maior incidência do DENV4 em infecções secundárias; (iii)
existiria polimorfismo no gene NS1 associado com epítopos. Entretanto, essas especulações
necessitem de mais estudos para comprovação.
Em uma corrida in silico, usando o software Virus Pathogen Resource (ViPR:
www.viprbrc.org) para verificar o grau de variabilidade da proteína NS1 de sorotipos do
DENV1-4 com o cruzamento das sequencias completas da Ásia (1466 cepas) versus América
do Sul (476 cepas), foi constatado a existência de significante variabilidade entre as
sequências do NS1 em 83 posições aminoacídicas identificadas. Porém, na conhecida região
consenso do NS1 “111LRYSWKTWGKA121” (Falconar et al. 1994) houve apenas um
polimorfismo nucleotídico (substituição do R por K na posição 112) para o DENV4, o qual
era procedente de 23 linhagens da América do Sul e Ásia. Assim parece que a princípio isso
não seja um dos principais fatores a influenciar o teste, mas será preciso compreender se as
variações aminoacídicas externas podem ter alguma influência nesse epítopo.
Conforme havíamos anteriormente definido, a NS1 é uma glicoproteína que passa por
modificações pós-traducionais, possuindo três locais de glicosilação (Asn-130, Asn-175 e
Asn-207) (Akey et al. 2014). Essas modificações pós-traducionais não foram analisadas
durante nosso estudo in silico porque o software não permite essa análise. De modo que
futuramente seria interessante essa análise, com o intuito de saber se existem consideráveis
modificações glicosídicas na NS1 do DENV4 que estariam tornando o antígeno menos
imunogênico, ou alterando a conformação do antígeno a ponto de dificultar a ligação do
anticorpo do kit e, dessa forma, reduzindo a sensibilidade de ambos os testes quanto ao
DENV4. Nesse sentido, não existem estudos especificamente fazendo essa análise, embora
alguns autores têm constatado que a perca da região Asn-130 do NS1 resultou em atenuação
43
da infecção pelo DENV em camundongos (Muylaert et al. 1996). Sendo assim, futuras
análises envolvendo mudanças pós-traducionais da NS1 de acordo com o sorotipo do DENV
poderão ser de grande importância na elucidação da menor sensibilidade dos kits quanto ao
DENV4.
A detecção e semi-quantificação do NS1 é proporcional OD obtida a 450/620 nm. Dos
kits que foram analisados, o cut off é determinado pela média das ODs dos calibradores mais
devios padrão, e os valores expressos em escalas que podem ser interpretadas como negativo,
equivoco ou positivo. A curva de calibração para detecção do NS1 é obtida pela comparação
entre diferentes diluições do antígeno e os valores resultantes expressos em ODs por uma
leitora de ELISA. Nesse sentido, Young et al. (2000) calculou a porção linear da curva padrão
para determinar a concentração sérica do NS1, obtendo limite mínimo de 4 ng/ml. Como
algumas diluições das amostras testes são feitas, em caso de haver diferenças quantitativas na
secreção do NS1, a depender dos diferentes sorotipos da dengue, isso poderia diminuir a
sensibilidade do teste. Se de fato, o NS1 do DENV4 estiver em menores quantidades, seria
interessante buscar aumentar a detecção do teste, através da obtenção de uma nova curva de
calibração com menores diluições das amostras testes.
A fundamentação do diagnóstico da dengue apenas em dados clínicos e
epidemiológicos podem resultar em erros (Terzian et al. 2011; Daumas et al. 2013), isso
acontece devido ao quadro clínico inespecífico da dengue. A fim de contornar essa
obscuridade, aplica-se o diagnóstico laboratorial, o qual é decisivo para a correta
identificação. Um dos principais frutos dos métodos laboratoriais é permitir a triagem dos
pacientes suspeitos de tais enfermidades, consequentemente é possível implementar o manejo
clínico mais adequado, e também devido ao mesmo propiciar maior eficácia no sistema de
vigilância epidemiológica. Os sistemas de vigilância epidemiológica são importantes no
controle das epidemias, ainda mais que no caso da dengue, a circulação de um novo sorotipo
44
do DENV, muitas vezes, procede às epidemias. De forma que a ocorrência constante de
epidemias da dengue pode gerar maior incidência de infecções secundárias, a qual está
correlacionada positivamente com maiores chances de risco da FHD (Huy et al. 2013). Nesse
contexto, foi observado que em ambos os testes analisados houve menor sensibilidade nos
pacientes com infecções secundárias, fato esse preocupante, pois seria mais útil melhor
acurácia dos testes nessa etapa, devido à possibilidade desses pacientes evoluírem para a
forma mais grave da doença.
O “pecado antigênico original” proposto por Sabin (1952) salienta que, em sucessivas
infecções pelo DENV, os anticorpos de memória conferem apenas proteção transitória contra
as infecções por sorotipos heterólogos, de modo que os anticorpos gerados nas infecções
secundárias seriam mais efetivos na neutralização do sorotipo que provocou a infecção
primária, ao invés da secundária. Por conseguinte, a classificação da dengue em infecção do
tipo primária ou secundária permite verificar se novos sorotipos estão sendo introduzidos em
determinadas regiões, além de ser um fator de mau prognóstico nos pacientes. A estimativa
global da sensibilidade de ambos os kits foram consideradas elevadas nos pacientes com
infecções primárias (77%, Panbio®; 95.5%, Platelia™). Por outro lado, nos pacientes com
infecções secundárias houve perca de sensibilidade de ambos os kit, tendo esses índices
diminuídos em 24% (Panbio®) e 31% (Platelia™). É provável que isso se deva a maior oferta
de anticorpos se ligando ao antígeno NS1, embora fracamente o neutralizando (Wahala et al.
2011), consequentemente teria menor oferta de NS1 a ser capturado pelos testes. Nesse
sentido, a fim de elevar a sensibilidade dos testes têm se realizado a dissociação dos
complexos anticorpos-NS1, por meio do tratamento das amostras testes com o ácido 1.5 M
Glycine hydrochloride (pH 2.8) (Koraka et al. 2003). Embora esse método tenha elevado à
sensibilidade dos testes, apenas um estudo (Lapphra et al. 2008), dentre os dez que
distinguiram os tipos de infecções (Kumarasamy et al. 2007; Blacksell et al. 2008; Castro
45
2008; Phuong et al. 2009; Lima et al. 2010; Pok et al. 2010; Lima et al. 2011; Aryati et al.
2013; Kosasih et al. 2013), fez as dissociações entre antígeno-anticorpo.
Nós realizamos uma estimativa global da sensibilidade dos kits correlacionando-a com
a procedência geográfica dos pacientes. Houve melhor acurácia dos testes em amostras
provenientes da América latina, com os valores de 70% (CI 63-76 [Panbio®]) e 80% (CI 75-
85 [Platelia™]), enquanto para os pacientes que procediam da Ásia e Oceania esses índices
foram 59% (CI 51-66 [Panbio®]) e 73% (CI 61-82 [Platelia™]). Ao constatarmos esses
achados não podemos inferir que houve diferenças significativas entre os grupos étnicos, até
porque estes resultados são discordantes do estudo multicêntrico realizado por Guzman et al.
2010. Acreditamos que as diferenças de sensibilidade dos testes, frente aos diversos grupos
étnicos, se devam, provavelmente, ao processo de evolução epidemiológica dos sorotipos da
DENV, em qual haveria maior restrição das espécies de uma mesma região geográfica ser
resultantes de linhagem viral ancestral (Costa et al. 2012). Essa teoria é reforçada por meio de
análises filogenéticas que vem elucidando as origens e evolução molecular do DENV em
diferentes regiões geográficas do mundo, mostrando a alta diversificação genética da dengue,
na qual mesmo dentro de um único genótipo existem vários subgrupos de diferentes
sublinhagens (Weaver et al. 2009). Nesse contexto Watanabe et al. 2012, por meio de estudos
em camundongos, constataram que a secreção do NS1 é dependente da linhagem viral. Isso
reforça que a depender das linhagens virais co-circulantes pode afetar, decisivamente, a
acurácia dos testes que detectam o antígeno NS1.
Apesar de mencionarmos acima que as diferenças dos parâmetros laboratoriais
observada em associação aos diferentes grupos étnicos se devam, principalmente, a um
processo de evolução molecular do DENV, não podemos descartar a influência do hospedeiro
nessa dinâmica molecular. Nesse sentido Mairiang et al. (2013) constataram que existem
diversas interações proteicas entre o DENV e os hospedeiros humanos e mosquitos. Por
46
conseguinte, haveria uma interação entre o genótipo do hospedeiro e do patógeno (DENV),
embora isso tenha sido demonstrado apenas no principal vetor da dengue, Aedes aegypti
(Fansiri et al. 2013). Enfim, o hospedeiro pode influenciar a evolução dinâmica molecular do
patógeno, entretanto até que ponto o peso dessa influência, entre o patógeno infectando
humanos em determinada região geográfica, afetem os métodos laboratoriais por nós usados
devem ser definidos, a fim de melhorar a performance dos ensaios.
Além dos ensaios ELISA NS1, existem os métodos imunocromatográficos, os quais
são conhecidos como testes rápido, pois os resultados são obtidos em média 30 minutos.
Diversos estudos avaliaram os testes rápidos para NS1, com a sensibilidade variando de 51%
a 90% (Kumarasamy et al. 2007; Chuansumrit et al. 2008; McBride 2009; Osorio et al. 2010;
Bisordi et al. 2011; Felix et al. 2012). Desse modo, observa-se que não existem apenas um
método perfeito na identificação das infecções por DENV, mas sempre que possível é
prudente incluir outros métodos. Acreditamos que uma das melhores escolhas seja a
combinação dos métodos de ELISA NS1 e teste rápido NS1, juntamente com um método de
detecção de IgG, para aumentar a sensibilidade nas infecções do tipo secundárias.
47
7. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos pela presente meta-análise mostraram boa estimativa global da
sensibilidade dos kits de ELISA para detecção do NS1 do DENV, tendo variando de 66%
(95% CI: 61 a 71 % [Panbio®]) a 74% (95% CI 63-82 [Platelia™]). A especificidade foi
próxima de 100% para ambos os kits. Com relação ao desempenho dos testes de acordo com o
sorotipo viral, foi verificado que os dois kits tiveram menor sensibilidade para o DENV4
(37%, 95% CI: 26-50 [Panbio®]; 58%, 95% CI: 30-81 [Platelia™]). A especificidade do
Platelia™ foi menor para amostras de pacientes com FHD do que a forma clássica da dengue.
Em síntese, observamos que os principais fatores que influenciaram a acurácia diagnóstica
foram: o tipo de infecção (primária versus secundária); o sorotipo viral; e a precocidade da
coleta das amostras. Todavia, até que ponto e como esses fatores alteram a acurácia
diagnóstica necessitam de mais estudos, no intuito de aperfeiçoar ainda mais esses testes.
48
REFERÊNCIAS
Akey DL, Brown WC, Dutta S, et al. Flavivirus NS1 structural reveal surface for associations
with membranes and the immune system. Science 2014; 343:881-85.
Alcon S, Talarmin A, Debruyne M, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay specific to
dengue virus type 1 nonstructural protein NS1 reveals circulation of the antigen in blood
during the acute phase of disease in patient experiencing primary or secondary infection.
Journal of Clinical Microbiology 2002; 40:376-81.
Allonso D, Meneses MDF, Fernandes CA, et al. Assessing positivity and circulating levels of
NS1 in samples from a 2012 dengue outbreak in Rio de Janeiro, Brazil. PLoS ONE 2014;
9:113634.
Alm E, Lesko B, Lindegren G, et al. Universal single-probe RT-PCR assay for diagnosis of
dengue virus infections. PLoS Neglected Tropical Diseases 2014; 8:e3416.
Amâncio FF, Ferraz ML, Almeida MCM, et al. Dengue virus serotype 4 in a highly
susceptible population in Southeast Brazil. Journal of Infection and Public Health 2014;
7:547-52.
Amorim JH, Alves RPS, Boscardin SB. The dengue virus non-structural 1 protein: risk and
benefits. Virus Research 2014; 181:53-60.
Anders KL, Nguyet NM, Quyen NTH, et al. An evaluation of dried blood spots and oral
swabs as alternative specimens for the diagnosis of dengue and screening for past dengue
virus exposure. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2012; 87:165-70.
Araújo FMC, Brilhante RSN, Cavalcanti LPG, et al. Detection of the dengue non-structural 1
antigen in cerebral spinal fluid samples using a commercially available enzyme-linked
immunosorbent assay. Journal of Virological Methods 2011; 177:128-31.
Aryati A, Trimarsanto H, Yohan B, et al. Performance of commercial dengue NS1 ELISA and
molecular analysis of NS1 gene of dengue viruses obtained during surveillance in
Indonesia. BMC Infectious Diseases 2013; 13:611.
49
Ashburn PM, Craig CF. Experimental investigations regarding the etiology of dengue fever.
Journal of Infectious Diseases 1907; 4:440-75.
Bartenschlager R, Miller S. Molecular aspects of Dengue virus replication. Future
Microbiology, London, v. 3, n. 2, p. 155-165, 2008.
Beaglehole R, Bonita R, Kjellstrom T. Basic epidemiology. World health organization,
Geneva, 1993.
Bertolacci-Rocha LG, da Cunha RV, de Castro Lichs GG, et al. Introduction of the dengue
virus type 4 in the state of Mato Grosso do Sul, Brazil. Cadernos Saude Publica 2014;
30:1789-92.
Bessoff K, Delorey M, Sun W, Hunsperger E. Comparison of two commercially available
dengue virus (DENV) NS1 capture enzyme-linked immunosorbent assays using a single
clinical sample for diagnosis of acute DENV infection. Clinical and Vaccine Immunology
2008; 15:1513-18.
Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al. The global distribution and burden of dengue. Nature.
2013;496:504–7.
Bisordi I, Rocco IM, Suzuki A, et al. Evaluation of dengue NS1 antigen detection for
diagnosis in public health laboratories, São Paulo state, 2009. Revista do Instituto de
Medicina Tropical de Sao Paulo 2011; 53:315-20.
Blacksell SD, Mammen Jr. MP, Thongpaseuth S, et al. Evaluation of the Panbio dengue virus
nonstructural 1 antigen detection and immunoglobulin M antibody enzyme-linked
immunosorbent assays for the diagnosis of acute dengue infections in Laos. Diagnostic
Microbiology and Infectious Disease 2008; 60:43-49.
Blacksell SD, Jarman RG, Gibbons RV, et al. Comparison of seven commercial antigen and
antibody enzyme-linked assays for detection of acute dengue infection. Clinical and
Vaccine Immunology 2012; 19:804-10.
Brady OJ, Gething PW, Bhatt S, et al. Refining the global spatial limits of dengue virus
transmission by evidence-based consensus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2012;
6(8):e1760.
50
Bronzoni RVM, Baleotti F, Nogueira RMR, et al. Duplex reverse transcription-PCR followed
by nested PCR assays for detection and identification of Brazilian Alphaviruses and
Flaviviruses. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43:696-702.
Buehler AM, Figueró M, Moreira FR, Cavalcanti AB, Sasse A, Berwanger O. Diretrizes
metodológicas: elaboração de revisão sistemática e meta-análise de estudos diagnósticos de
acurácia. Disponível em:
http://200.214.130.94/rebrats/publicacoes/dbrs_Diagn_v_final.pdf. Acessado em 17 de
dezembro de 2013.
Castro LA. Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da infecção pelo vírus
dengue-3 em comparação a outros métodos laboratoriais utilizados no diagnóstico da
dengue. Dissertação de Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada. Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto, SP, 2008. 100p.
Cecilia D, Kakade M, Alagarasu K, et al. Development of a multiplex real-time RT-PCR
assay for simultaneous detection of dengue and chikungunya viruses. Archives of Virology
2014. Doi 10.1007/s00705-014-2217-x.
Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, et al. Flavivirus genome organization, expression, and
replication. Annual Review of Microbiology 1990; 44: 649-88.
Chan M, Johansson MA. The incubation periods of dengue viruses. PLoS ONE 2012
7:e50972.
Chang, G. J. Molecular biology of dengue virus. In: Gubler, D. J.; Kuno, G. (Ed). Dengue and
Dengue Hemorrhagic Fever. New York: CAB International, 1997. p. 175-197.
Chen Y, Maguire T, Hileman RE, et al. Dengue virus infectivity depends on envelope protein
binding to target cell heparan sulfate. Nature Medicine 1997;3:866–871.
Chen YC, Wang SY, King CC. Bacterial lipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of
primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent
mechanism. Journal of Virology 1999;73:2650–2657.
51
Cheung YY, Chen KC, Chen H, et al. Antiviral activity of lanatoside C against dengue virus
infection. Antiviral Research 2014; 111:93-99.
Choy MM, Gubler DJ. Isolation and titration of dengue viruses by the mosquito inoculation
technique. Methods in Molecular Biology 2014; 1138:15-25.
Chua KB, Mustafa B, Abdul Wahab AH, et al. A comparative evaluation of dengue
diagnostic tests based on single-acute serum samples for laboratory confirmation of acute
dengue. Malaysian Journal of Pathology 2011; 33:13-20.
Chuansumrit A, Chaiyaratana W, Pongthanapisith V, et al. The use of dengue nonstructural
protein 1 antigen for the early diagnosis during the febrile stage in patients with dengue
infection. Pediatric Infectious Disease Journal 2008; 27:43-48.
Chuansumrit A, Chaiyaratana W, Tangnararatchakit K, et al. Dengue nonstructural protein 1
antigen in the urine as a rapid and convenient diagnostic test during the febrile stage in
patients with dengue infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2011;
71:467-69.
Clyde K, Kyle JL, Harris E. Recent Advances in Deciphering Viral and Host Determinants of
Dengue Virus Replication and Pathogenesis. Journal of Virology 2006; 80:11418-31.
Colombo TE, Vedovello D, Araki CS, et al. Dengue 4 false negative results by Panbio dengue
early ELISA assay in Brazil. Journal of Clinical Virology 2013; 58:710-13.
Costa RL, Voloch CM, Schrago CG. Comparative evolutionary epidemiology of dengue virus
serotypes. Infection, Genetics and Evolution 2012; 12:309-314.
Da Costa VG, Marques-Silva AC, Floriano VG, Moreli ML. Safety, immunogenicity and
efficacy of a recombinant tetravalent dengue vaccine: a meta-analysis of randomized trials.
Vaccine 2014; 32:4885-92.
Daumas RP, Passos SR, Oliveira RV, et al. Clinical and laboratory features that discriminate
dengue from other febrile illnesses: a diagnostic accuracy study in Rio de Janeiro, Brazil.
BMC Infectious Diseases 2013; 8:13-77.
52
De Paula SO, Fonseca BAL. Dengue: A Review of the Laboratory Tests a Clinician Must
Know to Achieve a Correct Diagnosis. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2004;
8:390-398.
Deeks JJ, Macaskill P, Irwig L. The performance of tests of publication bias and other sample
size effects in systematic reviews of diagnostic test accuracy was assessed. Journal of
Clinical Epidemiology 2005; 58:882-893.
Dengue virus net. Disponível em http://www.denguevirusnet.com/history-of-dengue.html
Acesso em 15 de dezembro de 2014.
Dick OB, San Martin JL, Montoya RH, et al. The history of dengue outbreaks in the
Americas. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2012; 87:584–93.
Duong V, Ly S, Try PL, et al. Clinical and virological factors influencing the performance of
a NS1 antigen-capture assay and potential use as a marker of dengue disease severity.
PLoS Neglected Tropical Diseases 2011; 5:e1244.
Durbin AP, Whitehead SS. Next-generation dengue vaccines: novel strategies currently under
development. Viruses 2011; 3:800-14.
Dussart P, Labeau B, Lagathu G, et al. Evaluation of an enzyme immunoassay for detection of
dengue virus NS1 antigen in human serum. Clinical and Vaccine Immunology 2006; 13:
1185-89.
Dussart P, Petit L, Labeau B, et al. Evaluation of two new commercial tests for the diagnosis
of acute dengue virus infection using NS1 antigen detection in human serum. PLoS
Neglected Tropical Diseases 2008; 2:e280.
Fagan TJ. Letter: Nomogram for Bayes theorem. New England Journal of Medicine 1975;
293:257.
Falconar AK, Young PR, Miles MA. Precise location of sequential dengue virus subcomplex
and complex B cell epitopes on the nonstructural-1 glycoprotein. Archives of Virology
1994; 137:315–26.
53
Fansiri T, Fontaine A, Diancourt L, et al. Genetic mapping of specific interactions between
Aedes aegypti mosquitoes and dengue viruses. PLoS Genetics 2013; 9:e1003621.
Felix AC, Romano CM, Centrone CC, et al. Low sensitivity of NS1 protein tests evidenced
during a dengue type 2 virus outbreak in Santos, Brazil, in 2010. Clinical and Vaccine
Immunology 2012; 19:1972-76.
Figueiredo LT. Emergent arboviruses in Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical 2007; 40:224-29.
Figueiredo RMP, Naveca FG, Bastos MS, et al. Dengue virus type 4, Manaus, Brazil.
Emerging Infectious Diseases 2008; 14:667-69.
Fontelles MJ. Bioestatística aplicada à pesquisa experimental. Editora LF, Vol.1, Sao Paulo
2012, p.99-129.
Gebhard LG, Filomatori CV, Gamarnik A. Functional RNA elements in the dengue virus
genome. Viruses 2011; 3:1739-56.
Gillespie LK, Hoenen A, Morgan G, Mackenzie JM. The endoplasmic reticulum provides the
membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. Journal of
Virology 2010 ;84:10438–10447.
Glas AS, Lijmer JG, Prins MH, Bonsel GJ, Bossuyt PMM. The diagnostic odds ratio: a single
indicator of test performance. Journal of Clinical Epidemiology 2003; 56:1129-35.
Graham H. The Dengue: A study of its pathology and mode of propagation. Med Rec (New
York) 1903; 61: 204-207.
Gubler DJ, Trent DW. Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public
health problem in the Americas. Infectious Agents and Diseases, New York, v. 2, p. 383-
393, 1994.
Gubler DJ, Clark GG. Dengue/Dengue hemorrhagic fever: the emergence of a global health
problem. Emerging Infectious Diseases 1995; 1:55-57.
Gubler DJ. Serological diagnosis of dengue haemorrhagic fever. Dengue Bull 1996; 20:20-23.
54
Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever; its history and resurgence as a global
public health problem. In Dengue and dengue Hemorrhagic Fever (Gubler DJ and Akuno
G, eds). 1997, pp.1-22, CAB International Press.
Gubler DJ. Dengue, urbanization and globalization: the unholy trinity of the 21st century.
Tropical Medicine and Healthy 2011; 39:3-11.
Gutsche I, Coulibaly F, Voss JE, et al. Secreted dengue virus nonstructural protein NS1 is an
atypical barrel-shaped high-density lipoprotein. Proceedings of the National Academy of
Science 2011; 108:8003-8.
Guzmán MG, Kouri G. Dengue: an update. The Lancet Infectious Diseases, New York, v. 2,
p. 33-42, 2002.
Guzmán MG, Kouri G. Dengue diagnosis, advances and challenges. International Journal of
Infectious Diseases 2004; 8:69-80.
Guzman A, Istúriz RE. Update on the global spread of dengue. International Journal of
Antimicrobial Agents 2010; 36:S40-S42.
Guzman MG, Jaenisch T, Gaczkowski R, et al. Multi-country evaluation of the sensitivity and
specificity of two commercially-available NS1 ELISA assays for dengue diagnosis. PLoS
Neglected Tropical Diseases 2010; 4:e811.
Halstead SB. Etiologies of the experimental dengues of Siler and Simmons. The American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene 1974; 23:974-82.
Hang VT, Nguyet NM, Trung D, et al. Diagnostic accuracy of NS1 ELISA and lateral flow
rapid tests for dengue sensitivity, specificity and relationship to viraemia and antibody
responses. PLoS Neglected Tropical Diseases 2009; 3:e360.
Henchal EA, Putnak JR. The dengue viruses. Clinical Microbiology Reviews 1990; 3:376-
396.
Heinz FX, Allison SL. The machinery for flavivirus fusion with host cell membranes. Current
Opinion in Microbiology 2001; 4:450-55.
55
Higgins JPT, Green S, editors. Cochrane handbook for systematic reviews of interventions.
Version 5.1.0:6.4.1. The Cochrane Collaboration; 2011. http://www.cochrane-
handbook.org. Acessado em 10 outubro 2013.
Holmes EC, Twiddy SS. The origin, emergence and evolutionary genetics of dengue virus.
Infection, genetics and evolution 2003; 3:19-28.
Hotta S. Experimental studies on dengue. I. Isolation, identification and modification of the
virus. Journal of Infectious Disease 1952; 90:1-9.
Huerre MR, Lan NT, Marianneau P, et al. Liver histopathology and biological correlates in
five cases of fatal dengue fever in Vietnamese children. Virchows Archiv 2001; 438:107–
115.
Huy NT, Van Giang T, Thuy DH, et al. Factors associated with dengue shock syndrome: a
systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases 2013; 7:e2412.
Igarashi A. Isolation of a Singh’s Aedes albopictus cell clone sensitive to dengue and
chikungunya viruses. The Journal of General Virology 1978; 40:531-544.
Innis B. Antibody responses to dengue virus infections Gubler DJ, Kuno G, eds. Dengue and
Dengue Haemorrhagic fever. New York: CAB International 1997; 221-43.
Jones CM, Athanasiou T. Summary receiver operating characteristic curve analysis
techniques in the evaluation of diagnostic tests. Annals Thoracic Surgery 2005; 79:16–20.
Kao CL, King CC, Chao DY, Wu HL, Chang GJ. Laboratory diagnosis of dengue virus
infection: current and future perspectives in clinical diagnosis and public health. Journal of
Microbiology, Immunology and Infection 2005; 38:5-16.
Kassim FM, Izati MN, TgRogayah TAR, et al. Use of dengue NS1 antigen for early diagnosis
of dengue virus infection. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine Public Health
2011; 42:562-9.
Kielian M, Rey FA. Virus membrane-fusion proteins: more than one way to make a hairpin.
Nature Reviews Microbiology 2006; 4:67-76.
56
King AD, Nisalak A, Kalayanrooj S, et al. B cells are the principal circulating mononuclear
cells infected by dengue virus. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and
Public Health 1999; 30:718–728.
Koraka P, Burghoorn-Maas CP, Falconar A, et al. Detection of immune-complex-dissociated
nonstructural-1 antigen in patients with acute dengue virus infections. Journal of Clinical
Microbiology 2003; 41:4154-59.
Kosasih H, Alisjahbana B, Widjaja S, et al. The diagnostic and prognostic value of dengue
nonstructural 1 antigen detection in a hyper-endemic region in Indonesia. PLoS One 2013;
8:e80891.
Kotz S, Johnson NL. Encyclopedia of statistical sciences. New York: John Wiley & Sons
1983; 4:352-54.
Kou Z, Quinn M, Chen H, et al. Monocytes, but not T or B cells, are the principal target cells
for dengue virus infection among human peripheral blood mononuclear cells. Journal of
Medical Virology 2008; 80:134–146.
Kumarasamy V, Chua SK, Hassan Z, et al. Evaluating the sensitivity of a commercial dengue
NS1 antigen-capture ELISA for early diagnosis of acute dengue virus infection. Singapore
Medicine Journal 2007; 48:669-73.
Kumarasamy V, Wahab A, Chua SK, et al. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-
capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue virus infection. Journal of
Virological Methods 2007; 140:75-79.
Kuo CH, Tai DI, Chang-Chien CS, et al. Liver biochemical tests and dengue fever. American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene 1992; 47:265–270.
Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ et al. Rapid detection ant typing of dengue viruses from
clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of
Clinical Microbiology 1992; 30:545-51.
57
Lapphra K, Sangcharaswichai A, Chokephaibulkit K, et al. Evaluation of an NS1 antigen
detection for diagnosis of acute dengue infection in patients with acute febrile illness.
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2008; 60:387-91.
Lei HY, Yeh TM, Liu HS, et al. Immunopathogenesis of dengue virus infection. Journal of
Biomedical Science 2001; 8:377-88.
Li H, Clum S, You S, et al. The serine protease and RNA-estimulated nucleoside
triphosphatase and RNA helicase functional domains of dengue virus type 2 NS3 converge
within a region of 20 amino acids. Journal of Virology 1999; 73:3108-16.
Lima MRQ, Nogueira RMR, Schatzmayr HG, Santos FB. Comparison of three commercially
available dengue NS1 antigen capture assays for acute diagnosis of dengue in Brazil. PLoS
Neglected Tropical Diseases 2010; 4:e738.
Lima MRQ, Nogueira RMR, Filippis AMB, Santos FB. Comparison of two generations of the
Panbio dengue NS1 capture enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical and Vaccine
Immunology 2011; 18:1031-33.
Lindenbach BD, Rice CM. Flaviviridae: the viruses and their replication. In BN Fields, DM
Knipe, PM Howley, Virology. Lippincott-Willian & Wilkins, Philadelphia.
Lopes AD, Mathers CD, Ezzati M, Jamison DT, Murray CJ. Global burden of dengue and risk
factors. Oxford: Oxford University Press; 2006.
Mackenzie JM, Jones MK, Young PR. Immunolocalization of the dengue virus nonstructural
glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA replication. Virology 1996; 220:232-40.
Mairiang D, Zhang H, Sodja A, et al. Identification of new protein interactions between
dengue fever virus and its hosts, human and mosquito. PLoS One 2013; 8:e53535.
Martina BEE, Koraka P, Osterhaus ADME. Dengue virus pathogenesis: an integrated view.
Clinical Microbiology Reviews 2009; 22:564–581.
Martinez-Gutierrez M, Correa-Londoño LA; Castellanos JE, et al. Lovastatin delays infection
and increases survival rates in AG129 mice infected with dengue virus serotype 2. PLoS
ONE 2014; 9:e87412.
58
McArthur MA, Sztein MB, Edelman R. Dengue vaccines: recent developments, ongoing
challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines 2013; 12:933-53.
McBride WJH. Evaluation of dengue NS1 test kits for the diagnosis of dengue fever.
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2009; 64:31-36.
Medina F, Medina JF, Colón C, et al. Dengue virus: isolation, propagation, quantification, and
storage. Currents Protocols in Microbiology 2012; supplement 27: 15D.2.1-15D.2.24.
Messina JP, Brady OJ, Scott TW, et al. Global spread of dengue virus types: mapping the 70
year history. Trends in Microbiology 2014; 22:138-46.
Moher D, Liberati A, Tetzlaff J, et al. Preferred reporting items for systematic reviews and
meta-analyses: the PRISMA statement. PLoS Medicine 2009; 6:e1000097.
Mukhopadhyay S, Kuhn RJ, Rossman MG. A structural perspective of the flavivirus life
cicle. Nature Reviews Microbiology 2005; 3:13-22.
Muylaert IR, Chambers TJ, Galler R, Rice CM. Mutagenesis of the N-linked glycosylation
sites of the yellow fever virus NS1 protein: effects on virus replication and mouse
neurovirulence. Virology. 1996 Aug 1;222:159–168
Nemésio H, Palomares-Jerez F, Villalaín J. The membrane-active regions of the dengue virus
proteins C and E. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes 2011; 1808:2390-2402.
Nogueira RM, Miagostovich MP, Lampe E, Schatzmayr HG. Isolation of dengue virus type 2
in Rio de Janeiro. Memorias Instituto Oswaldo Cruz 1990; 85:253.
Nogueira RM, Miagostovich MP, de Filippis AM, et al. Dengue virus type 3 in Rio de
Janeiro, Brazil. Memorias Instituto Oswaldo Cruz 2001; 96:925-26.
Osanai CH, Travassos da Rosa AP, Tang AT, et al. Dengue outbreak in Boa Vista, Roraima.
Preliminary report. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo 1983; 25:53–4.
Osorio L, Ramirez M, Bonelo A, Villar LA, Parra B. Comparison of the diagnostic accuracy
of commercial NS1-based diagnostic tests for early dengue infection. Virology Journal
2010; 7:361.
59
Pal S, Dauner AL, Mitra I, et al. Evaluation of dengue NS1 antigen rapid tests and ELISA kits
using clinical samples. PLoS ONE 2014; 9:e113411.
Pang Z, Li A, Li J, et al. Comprehensive multiplex one-step real-time taqman qRT-PCR
assays for detection and quantification of hemorrhagic fever viruses. PLoS ONE 2014;
9:e95635.
Peeling RW, Artsob H, Pelegrino JL, et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue. Nature
Reviews Microbiology 2010; S30-S38.
Phuong HL, Thai KTD, Nga TTT, et al. Detection of dengue nonstructural 1 (NS1) protein in
Vietnamese patients with fever. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2009;
63:372-78.
Pok KY, Lai YL, Sng J, Ng LC. Evaluation of nonstructural 1 antigen assays for the diagnosis
and surveillance of dengue in Singapore. Vector-Borne and Zoonotic Diseases 2010;
10:1009-16.
Poloni TRRS. Detecção e tipificação do vírus da dengue por RT-PCR em tempo real.
Dissertação de mestrado em Biociências Aplicadas à Farmácia. Universidade de São
Paulo. Ribeirão Preto, SP, 2009, 56p.
Portal Brasil. Ministério da Saúde atualiza situação do vírus chikungunya. Disponível em:
http://www.brasil.gov.br/saude/2014/12/ministerio-da-saude-atualiza-situacao-do-virus-
chikungunya Acesso em 05 de janeiro de 2015.
Portal da Saúde. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/situacao-
epidemiologica-dados-dengue Acesso em: 20 de dezembro de 2014.
Ramirez AH, Moros Z, Comach G, et al. Evaluation of dengue NS1 antigen detection tests
with acute sera from patients infected with dengue virus in Venezuela. Diagnostic
Microbiology and Infectious Disease 2009; 65:247-53.
Rigau-Pérez JG. The early use of break-bone fever (quebranta huesos, 1771) and dengue
(1801) in Spanish. American Journal of Tropical Medicine and Hyg 1998; 59:272-74.
60
Rotan HA, Bahrani H, Rahman NA, et al. Identification of natural antimicrobial agents to
treat dengue infection: In vitro analysis of latarcin peptide activity against dengue virus.
BMC Microbiology 2014; 14:140.
Rothman, A. L. Dengue: defining protective versus pathologic immunity. The Journal of
Clinical Investigation, Annals Arborovirus 2004; 11:946-951.
Sabin AB. Research on dengue during world war II. American Journal of Tropical Medicine
and Hygiene 1952; 1:30-50.
San Martin JL, Braithwaite O, Zambrano B, et al. The epidemiology of dengue in the
Americas over the last three decades: a worrisome reality. American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene 2010; 82:128–35.
Santiago GA, Vergne E, Quiles Y, et al. Analytical and clinical performance of the CDC real
time RT-PCR assay for detection and typing of dengue virus. PLoS Neglected Tropical
Disease 2013; 7:e2311.
Schatzmayr HG, Nogueira RMR, Travassos da Rosa APA. An outbreak of dengue virus at
Rio de Janeiro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 1986; 81:245–246.
Schibli DJ, Weissenhorn W. Class I and class II viral fusion protein structures reveal similar
principles in membrane fusion. Molecular Membrane Biology 2004; 21:361–371.
Sea VRF, Cruz ACR, Gurgel RQ, et al. Underreporting of dengue-4 in Brazil due to low
sensitivity of the NS1 Ag test in routine control programs. PLoS One 2013; 8:e64056.
Shepard DS, Undurraga EA, Halasa YA. Economic and disease burden of dengue in southeast
Asia. PLoS Neglected Tropical Diseases 2013;7:e2055.
Shu PY, Huang JH. Current advances in dengue diagnosis. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology 2004; 11:642-50.
Siler JF, Hall MW, Hitchens AP. Dengue: its history, epidemiology, mechanism of
transmission, etiology, clinical manifestations, immunity, and prevention. Manila:
Monograph of the Philippine Bureau of Science 1926, n.20.
61
Silva FG, Silva SJS, Rocco IM, et al. Evaluation of commercial kits for detecting the antigen
NS1-dengue-São Paulo. Bepa 2011; 8:14-26.
Simmons JS, St. John JH, Reynolds FHK. Experimental studies of dengue. Manila:
Monograph of the Philippine Bureau of science 1931, n.29.
Singh MP, Majumdar M, Singh G, et al. NS1 antigen as an early diagnostic marker in dengue:
report from India. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2010; 68:50-54.
Teles FR, Prazeres DM, Lima-Filho JL. Trends in dengue diagnosis. Reviews in Medical
Virology 2005; 15:287-302.
Terzian AC, Mondini A, Bronzoni RV, et al. Detection of Saint Louis encephalitis virus in
Dengue-suspected cases during a dengue 3 outbreak. Vector-Borne and Zoonotic Diseases
2011; 11:291-300.
Trung DT, Thao LTT, Hien TT, et al. Liver involvement associated with dengue infection in
Adults in Vietnam. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2010; 83:774-80.
Umareddy I, Pluquet O, Wang QY, et al. Dengue virus serotype infection specifies the
activation of the unfolded protein response. Virology Journal 2007; 4:91.
Vasconcelos PF, de Menezes DB, Melo LP, et al. A large epidemic of dengue fever with
dengue hemorrhagic cases in Ceara state, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical
de Sao Paulo 1994; 37:253-255.
Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern,
and virus serotype correlate with disease severity. Journal of Infectious Diseases
2000;181:2–9.
Vorndam V, Kuno G. Laboratory Diagnosis of dengue virus infection. In: Gubler DJE, Kuno
G. (Ed.). Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. New York: CAB International, 1997. p.
313-333.
Wahala WMPB, Silva AM. The human antibody response to dengue virus infection. Viruses
2011; 3:2374-95.
62
Wang E, Ni H, Xu R, et al. Evolutionary relationships of endemic/epidemic and sylvatic
dengue viruses. Journal of Virology 2000; 74:3227-3234.
Watanabe S, Tan KH, Rathore APS, et al. The magnitude of dengue virus NS1 protein
secretion is strain dependent and does not correlate with severe pathologies in the mouse
infection model. Journal of Virology 2012; 86:5508-14.
Watthanaworawit W, Turner P, Turner CL, et al. A prospective evaluation of diagnostic
methodologies for the acute diagnosis of dengue virus infection on the Thailand-Myanmar
border. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2011;
105:32-37.
Weaver SC, Vasilakis N. Molecular evolution of dengue viruses: contributions of
phylogenetics to understand the history and epidemiology of the preeminent arboviral
disease. Infection, Genetics and Evolution 2009; 9:523–540.
Welsch S, Miller S, Romero-Brey I, Merz A, Bleck CK, Walther P, Fuller SD, Antony C,
Krijnse-Locker J, Bartenschlager R. Composition and three-dimensional architecture of the
dengue virus replication and assembly sites. Cell Host & Microbe 2009; 5:365–375.
Whiting P, Rutjes AWS, Reitsma JB, Bossuyt PMM, Kleijnen J. The development of
QUADAS: a tool for the quality assessment of studies of diagnostic accuracy included in
systematic reviews. BMC Medical Research Methodology 2003;3.
WHO. Disponível em: http://www.who.int/topics/dengue/en/ Acessado em 12 de agosto
2014.
Wilson ME, Chen LH. Dengue: update on epidemiology. Current Infectious Disease Reports
2014; 17:457.
Wu SJ, Grouard-Vogel G, Sun W, et al. Human skin Langerhans cells are targets of dengue
virus infection. Nature Medicine 2000;6:816–820.
Young PR, Hilditch PA, Pickering D, et al. An antigen capture enzyme-linked
immunosorbent assay reveals high levels of the dengue virus protein NS1 in the sera of
infected patients. Journal of Clinical Microbiology 2000; 38:1053-57.
63
ANEXO
A Meta-Analysis of the Diagnostic Accuracy of TwoCommercial NS1 Antigen ELISA Tests for Early DengueVirus Detection
Vivaldo G. da Costa*, Ariany C. Marques-Silva, Marcos L. Moreli*
Virology Laboratory, Federal University of Goias, Jataı, Brazil
Abstract
Background: Dengue virus (DENV) NS1 antigen detection is regarded as an early diagnostic marker. Accordingly, severalstudies have evaluated the performance of tests that utilize NS1 capture, but the results of individual studies may be limiteddue to the restricted sample size of the patients recruited. Therefore, our objective was to perform a meta-analysis of thediagnostic accuracy of two commercial NS1 ELISAs (Panbio and Platelia).
Methods and Results: Studies of interest were found in PubMed, Embase and Google Scholar databases using definedinclusion/exclusion criteria. A total of 30 studies containing 12,105 total enrolled patients were included. The results were asfollows: 1) Panbio assays showed low overall performance, sensitivity 66% (95% confidence interval (CI) 61–71), specificity99% (95% CI 96–100), positive likelihood ratio (LR+) 98 (95% CI 20–464), negative likelihood ratio (LR-) 0.3 (95% CI 0.2–0.4),diagnostic odds ratio (DOR) 289 (95% CI 59–1412); 2) Platelia assays showed high overall performance, sensitivity 74% (95%CI 63–82), specificity 99% (95% CI 97–100), LR+ 175 (95% CI 28–1099), LR- 0.3 (95% CI 0.2–0.4), DOR 663 (95% CI 98–4478).The lowest sensitivity values were for secondary infections (57% [95% CI 47–67] and 66% [95% CI 53–77] for Panbio andPlatelia, respectively) and for the detection of DENV4. Regarding clinical manifestations, the sensitivity of Platelia was 69%(95% CI 43–86) and 60% (95% CI 48–70) for fever and dengue hemorrhagic fever, respectively. In addition, the sensitivity ofboth tests was slightly lower for samples from Southeast Asia and Oceania.
Conclusion: DENV1 samples gave higher sensitivity results for both tests. We observed that factors negatively influencingthe tests, such as the type of infection, geographical origins of samples and viral serotypes, require further investigation tooptimize the diagnostic accuracy.
Citation: Costa VGd, Marques-Silva AC, Moreli ML (2014) A Meta-Analysis of the Diagnostic Accuracy of Two Commercial NS1 Antigen ELISA Tests for EarlyDengue Virus Detection. PLoS ONE 9(4): e94655. doi:10.1371/journal.pone.0094655
Editor: Ana Fernandez-Sesma, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, United States of America
Received January 21, 2014; Accepted March 18, 2014; Published April 11, 2014
Copyright: ß 2014 Costa et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This study was supported by grant no. 201310267000308 from the Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Goias (FAPEG). VGC receivedfellowship from FAPEG. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected] (VGC); [email protected] (MLM)
Introduction
Dengue is a pandemic disease that has been neglected but is
reemerging, putting approximately three billion people in tropical
and subtropical regions at risk of this viral infection [1,2].
Therefore, dengue poses a major threat to the public health
systems of many countries, considering the occurrence of millions
of cases and thousands of deaths annually [3].
Dengue virus (DENV), genus Flavivirus, is antigenically classified
into four serotypes (DENV1-4). DENV is an arbovirus (Arthro-
pod-borne virus) and is increasingly infecting humans, with the
incidence of dengue showing a 30-fold increase within the last 50
years [3–6]. Dengue disease results in a wide clinical spectrum
with undifferentiated febrile symptoms, hindering early diagnosis
and clinical management. Thus, DENV infections can be
asymptomatic or present as the classical clinical picture of dengue
fever (DF). In revised WHO classification system (2009), DF was
divided into dengue with or without warning signs and severe
dengue. We will use the classification into DF/dengue hemor-
rhagic fever (DHF)/or dengue shock syndrome (DSS), since it
continues to be widely used [2,7].
Laboratory techniques involved in the diagnosis of DENV are
based on the detection of viral genetic material, the specific
detection of IgG/IgM antibodies and the detection of viral
antigens, such as nonstructural protein 1 (NS1) [8–10]. NS1 is a
glycoprotein that is abundantly produced by viruses in the early
stages of infection, and it is found within the infected cells, in the
cell membranes and secreted into the extracellular spaces [11,12].
Therefore, one advantage of laboratory methods that perform
NS1 antigen capture is the precocity of this marker, present at the
onset of symptoms, in contrast to IgM, which is detected later,
beginning at the fifth day of disease.
Currently, several laboratory methods that use the capture of
DENV NS1 antigen are available [13–17]. The successful
implementation of these methods reflects on the good performance
of these tests. Despite the existence of several studies evaluating
tests for an NS1 capture ELISA assay, no meta-analysis evaluating
the diagnostic accuracy of these commercial kits has been
PLOS ONE | www.plosone.org 1 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
performed. Due to the limited sample size of patients recruited in
individual studies, meta-analysis may increase the accuracy of
estimates of individual studies. Therefore, we conducted a meta-
analysis of the accuracy of diagnosis for Panbio NS1 and Platelia
NS1 ELISA assay kits to obtain the overall estimated and
summarized performance of the tests in the detection of DENV.
Materials and Methods
Search strategyThis meta-analysis was guided by the standard PRISMA
protocol (Preferred Reporting Items for Systematic reviews and
Meta-analysis (Table S1)) and methods proposed by the Cochrane
Collaboration [18,19]. PubMed; Embase and Google Scholar
databases were searched for articles using a combination of
descriptors to select the studies of interest.
Study selectionAfter finding previously published studies in the databases with
the descriptors ‘‘dengue’’ OR ‘‘dengue virus’’ AND ‘‘diagnosis’’
OR ‘‘ELISA NS1’’ OR ‘‘early diagnostic’’ OR ‘‘diagnostic
accuracy’’ OR ‘‘performance test’’, we performed an analysis on
the inclusion/exclusion criteria.
As inclusion criteria, we used studies that evaluated the
sensitivity and specificity parameters of ELISA kits involving the
capture of dengue NS1 antigen and the Panbio (Alere, Brisbane,
Australia) or Platelia (Marnes-la-Coquette, France; Hercules, CA,
USA (Bio-Rad)) kits.
As exclusion criteria, we did not review studies that were not
published in English, Spanish or Portuguese or studies with limited
information for calculating sensitivity and specificity. We excluded
specific articles types, for instance review articles, comments, the
editorial, letters and conference abstract. Additionally, two authors
reviewed the studies independently, in case of disagreement a third
author was consulted.
Data extractionThe following data from each study included in the meta-
analysis were extracted: author, year of publication, place of study,
gender, age and number of participants, method of diagnosis,
study design, sensitivity and specificity data, positive predictive
value (PPV) and negative predictive value (NPV). The data to be
extracted were analyzed in the following subgroups: classification
of infection, viral serotype, period of the collection of samples,
geographic origin of patients and clinical picture presented.
Subsequently, the data related to the accuracy of the diagnosis
were plotted on a 262 contingency table.
Quality assessmentThe analysis of the quality of the studies was performed based
on a tool known as the quality assessment of diagnostic accuracy
studies (QUADAS), which allows for the identification of
important design elements in diagnostic accuracy studies [20].
The QUADAS tool consists of 14 key items (sufficient test
description and reference, representative spectrum, reported
withdrawals and indeterminate results, relevant clinical informa-
tion, index test results blinded, definition positive test result, cutoff
values, complete verification of diagnosis, avoided clinical review
bias, appropriate selection and reference standard, and acceptable
detail between tests). Items are evaluated using a score of ‘‘low’’,
‘‘high’’, or ‘‘obscure’’, which are formulated for an answer as
‘‘no’’, ‘‘yes’’ and ‘‘unclear’’, respectively, that may indicate low or
high risk of publication bias. Each of 14 items was scored from 1 to
0, with a total quality score between 11 and 14 was considered
‘‘good’’, between 7 and 10, ‘‘moderate’’, and 6 or less was
considered ‘‘poor’’.
Statistical analysisSTATA IC/64 software (version 13.1, College Station, TX)
with MIDAS and METANDI commands was used for the meta-
analysis. For correction in the cells containing zero values,
correction factors from METANDI commands were used.
The sensitivity (true positive rate), specificity (true negative rate),
positive likelihood ratio and negative (LR+, or LR-, is estimated by
the ratio of the proportion of positive, or negative, tests in the
diseased versus no-diseased subjects) and diagnostic odds ratio
(DOR is calculated as the LR+ divided by the LR-), with a
confidence interval (CI) of 95%, were obtained for each study and
subsequently combined. Cochran Q chi-square test and the I2
statistic were explored to assess the heterogeneity of the included
studies. Random-effects model was used if the result of the Q test
was significant (p,0.05) and I2.50%. The meta-regression was
planned to be used if there was high heterogeneity (I2.50%) [21].
Additionally, an hierarchical summary receiver operating charac-
teristic (HSROC) type curve of the selected studies was then
plotted with the software. The HSROC curve is a bivariate model
that provides information on the overall performance of a test
through different thresholds. We also constructed the summary
receiver operating characteristics (SROC) curve and the respective
area under the curve that serves a global measure of the test
performance [22].
To assess potential publication bias, we used the Deeks funnel
plot, with p,0.05 indicating the presence of publication bias [23].
Fagan nomograms, a two-dimensional graphical tool for estimat-
ing how much the result of a diagnostic test changes the
probability that a patient has a disease, was also used to estimate
the clinical value of the index test, which is based on the LR+ and
LR- obtained from the meta-analysis [24].
Results
Our search found 672 citations related to dengue through the
combined application of descriptors in the three databases
described above. During the final stage of selection, we excluded
five studies that only assessed the sensitivity of laboratory methods
or did the overlap the results of the two tests in their analysis [13–
17]. After the exclusion criteria were applied, 30 baseline studies
remained [25–54], which were included in our meta-analysis
because they involved experimental research evaluating the
diagnostic accuracy of the Panbio or Platelia kits, which used
NS1 antigen capture in an indirect ELISA format. The results of
our literature search are shown in Figure 1.
Among the studies included in the meta-analysis, there were a
total of 12,105 patients recruited. These patient samples were
collected from 17 countries in Latin America, Asia and Oceania,
and the most studies were conducted in Brazil (27%)
[29,34,37,41,45,47,52,54], Vietnam (13%) [32,33,36,49], Malay-
sia (13%) [26,36,42,46] and Thailand (13%) [31,36,43,48].
Regarding the design of the studies, they were classified into two
types: prospective and retrospective cohorts, of which only twelve
reported that their samples were collected during dengue
outbreaks [25,26,30,37,39,40,44,45,51–54]. Typically, most sam-
ples were collected until the sixth day of the onset of symptoms
[25,27,28,30–37,40–42,47,49,50,52–54]. The data extracted from
the final selection are shown in Table 1.
The QUADAS tool consists of 14 items, and the results of the
analysis can be seen in Figure 2. The quality of all studies was
generally moderate, with median QUADAS score of 9 (Table S2).
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 2 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
However, the items related to the determination of the indeter-
minate results, including relevant clinical information (classifica-
tion DF or DHF) and disclosure of the cut-off and blinding of
samples before processing by laboratory tests, were evaluated items
that presented more risk of bias. Additionally, the Deeks funnel
plot did not show potential publication bias for the two subgroups
of studies (p = 0.56 and p= 0.09) (Figure S1), yet a significant
amount of heterogeneity were detected for the two tests (I2 ranged
from 85% to 97%). Meta-regression showed that the covariates,
origin of the samples, period of sample collection and retrospective
versus prospective samples were items that contributed to diversity
among studies (Table S3).
Overall accuracy of the Panbio and Platelia commercialkitsAmong the selected studies, 16 assessed the trials of Panbio
[27,28,30,35–41,45,47,48,50–52] and 23 assessed the trials of
Platelia [25–27,29–39,42–44,46,47,49,50,53,54]. In relation to
Panbio, the sensitivity, specificity, LR+, LR- and DOR overall
were 66% (95% CI 61–71), 99% (95% CI 96–100), 98 (95% CI
19–367), 0.3 (95% CI 0.2–0.4) and 289 (95% CI 59–1412),
respectively. Similarly, the values for Platelia were 74% (95% CI
63–82), 99% (95% CI 97–100), 175 (95% CI 28–1099), 0.3 (95%
CI 0.2–0.4) and 663 (95% CI 98–4478), respectively. The area
under summary ROC curve were 0.84 (95% CI 0.80–0.87
(Panbio)) and 0.96 (95% CI 0.94–0.97 (Platelia)) (Figure S2) and
the graphs of the HSROC curves of the individual studies for the
diagnostic accuracy of two tests analyzed are shown in Figure 3A–
B.
Accuracy of the tests on the viral serotype andclassification of infectionWhen evaluating the accuracy of tests for sensitivity, DOR,
LR+ and LR- for serotype DENV1, we obtained the following
values: 81% (95% CI 73–87), 702 (95% CI 101–4842), 136 (95%
CI 23–806) and 0.2 (95% CI 0.1–0.3), respectively, for Panbio.
Similarly, the values for Platelia were 90% (95% CI 81–95), 5460
(95% CI 131-225878), 526 (95% CI 12-21602) and 0.09 (95% CI
0.04–0.19).
For DENV2, pooled sensitivity was 74% (95% CI 67–80), DOR
was 507 (95% CI 55–4663), LR+ and LR- were 133 (95% CI 17-
1023) and 0.3 (95% CI 0.2–0.4), respectively, for Panbio. In
Platelia, pooled sensitivity was 73.3% (95% CI 61–83), DOR was
714 (95% CI 37-13466), LR+ and LR- were 191 (95% CI 12-
3090) and 0.26 (95% CI 0.17–0.4), respectively.
For DENV3, pooled sensitivity was 70.7% (95% CI 63–78),
DOR was 481 (95% CI 33-6869), LR+ and LR- were 141 (95%
CI 11-1780) and 0.3 (95% CI 0.2–0.4), respectively, for Panbio. In
Platelia, pooled sensitivity was 83% (95% CI 75–89), DOR was
2353 (95% CI 72-7e+4), LR+ and LR- were 397 (95% CI 12-
13119) and 0.16 (95% CI 0.11–0.25), respectively.
For DENV4, pooled sensitivity was 37% (95% CI 26–50), DOR
was 18 (95% CI 6–63), LR+ and LR- were 12 (95% CI 4–38) and
0.6 (95% CI 0.5–0.8), respectively, for Panbio. In Platelia, pooled
sensitivity was 58% (95% CI 30–81), DOR was 96848 (95% CI
Figure 1. Flowchart of the steps performed in the meta-analysis.doi:10.1371/journal.pone.0094655.g001
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 3 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
Table 1. Summary of the included studies.
Ref. Study Design Location
Sample
(n) Sex
Median
Age, y ResultsPANBIO ResultsPLATELIA
Dengue
prevalence
(%)
Diagnostic
method
Sen.%
(95% CI)
Spec.%
(95% CI)
PPV%
(95% CI)
NPV%
(95% CI)
Sen.%
(95% CI)
Spec.%
(95% CI)
PPV%
(95% CI)
NPV%
(95% CI)
25 Cohort,prospective
French Guiana 349 Female 75% 33 88.7 (84–92.4)
100 (84.9–100)
89.8 100 72 ELISA; RT-PCR; VI
26 Cohort,retrospective
Malaysia 354 NR NR 93.4 100 100 98.9 37.5 ELISA; RT-PCR; VI
27 NR Puerto Rico 253 NR NR 64.9 (58.2–71.1)
97.8 (88.4–99.6)
100 (97.2–100)
39.3 (30.7–48.5)
83.2 (77.5–87.7)
100 (92.1–100)
100 (97.2–100)
62.5 (51–72.8)
82 ELISA; Real timeRT-PCR; VI
28 Cohort,prospective
Laos 92 NR NR 63.2 (53.4–73)
100 100 79.4 (71.2–87.7)
41 ELISA; RT-PCR
29 Cohort,prospective
Brazil 250 Male 58% 35 85.4 94 81 95.6 32 ELISA; Real timeRT-PCR; VI
30 Cohort,retrospective
FrenchGuiana
320 NR NR 55.1 (49–61.2)
97.9 (88.9–99.9)
75.2 98 82.4 (77.3–86.7)
100 (92.6–100)
100 100 69 ELISA; ICG; RT-PCR; VI
31 Cohort,prospective
Thailand 235 Male 56.2% 17.8 63.2 (55.7–70)
98.4 (91.7–99.7)
99 52.5 72.8 ELISA; RT-PCR; VI
32 Cohort,prospective
Vietnam 138 Male 44.9% 16 83.2 (75.5–89.3)
100 (86.7–100)
100 (97.2–100)
38.2 (22.2–56.4)
90 ELISA; RT-PCR
33 NR Vietnam 459 Male 55% 18.3 37 99.5 90.9 92.2 12 ELISA; RT-PCR
34 Cohort,prospective
Brazil 92 NR NR 70 (59–79.2)
100 (54.1–100)
100 (94–100)
18.7 (7.2–36.4)
93 ELISA; Real timeRT-PCR
35 NR Venezuela 147 NR NR 60.9 (50.4–70.5)
94.4 (80.9–99.4)
100 41.4 71.3 (61–80)
86.1 (70.9–94.4)
100 49 59 ELISA; ICG; RT-PCR; VI
36 Cohort,prospective
M 2259 NR NR 52 90 76.2 90 66 100 82.3 100 76 ELISA; RT-PCR; VI
37 Cohort,retrospective
Brazil 450 NR NR 72 100 100 78 84 99 98 86 49 ELISA; RT-PCR; VI
38 Cohort,retrospective
Colombia 310 NR NR 71.1 (64.6–77)
89.1 (80.9–94.7)
94 (89.1–97.1)
56.6 (48.1–64.8)
70.8 (64.1–76.8)
92.3 (84.8–96.9)
95.5 (91–98.2)
57.5 (49.1–65.7)
70 ELISA; RT-PCR; VI
39 Cohort,prospective
Singapore 433 NR NR 67 (57.3–75.7)
100 (96.4–100)
100 (96.4–100)
73.5 (64.3–81.4)
81.7 (73.1–88.4)
100 (96.4–100)
100 (96.4–100)
83.3 (75.3–88.2)
37 ELISA; ICG; RT-PCR
40 Cohort,prospective
India 2070 NR NR 61.4 100 100 100 41 ELISA; RT-PCR;
41 Cohort,prospective
Brazil 86 Female62.5%
27 50 (29.9–70.1)
100 (94–100) 66 84.8 30 ELISA; RT-PCR; VI
42 Cohort,prospective
Malaysia;China; India
558 Male 62% 26 91.6 100 92.3 95.8 34 ELISA; Real timeRT- PCR; VI
43 Cohort,prospective
Thailand 85 NR NR 76.4 100 (82.8–100)
100 62 65 ELISA; ICG; VI
DengueNS1
Diag
nostic:
AMeta-A
nalysis
PLO
SONE|www.plosone.org
4April
2014
|Volume9
|Issu
e4
|e94655
Table 1. Cont.
Ref. Study Design Location
Sample
(n) Sex
Median
Age, y ResultsPANBIO ResultsPLATELIA
Dengue
prevalence
(%)
Diagnostic
method
Sen.%
(95% CI)
Spec.%
(95% CI)
PPV%
(95% CI)
NPV%
(95% CI)
Sen.%
(95% CI)
Spec.%
(95% CI)
PPV%
(95% CI)
NPV%
(95% CI)
44 Cohort, prospective Cambodia 339 Female52.3%
4 57.7 (51.4–63.8)
100 100 41.8 (34.7–49.2)
72 ELISA; RT-PCR; VI
45 Cohort,retrospective
Brazil 450 NR NR 80 100 100 100 51 ELISA; RT-PCR; VI
46 NR Malaysia 208 NR NR 83.7 90.4 86 95 38 ELISA; RT-PCR
47 Cohort,prospective
Brazil 147 NR NR 87.5 71 68 85 95 47 58 92 47 ELISA; ICG; HI
48 NR Thailand-Myanmar
162 Male60.5%
23 54.6 (42–66)
100 (96–100) 100 (91–100)
73.2 (64.4–80.8)
44 ELISA; Real timeRT-PCR
49 Cohort,prospective
Vietnam 116 NR NR 64.7 (54.5–74.9)
95.8 (87.8–100)
73.9 96 82 ELISA; RT-PCR
50 Cohort,retrospective
Thailand 626 NR NR 44.8 (38–51)
93.2 (88–97) 87.5 92.5 56.5 (50–63)
100 (98–100) 84 100 71 ELISA; RT-PCR; HI
51 Cohort,prospective
Indonesia 503 NR NR 56.4 100 100 43 42 ELISA; RT-PCR; VI
52 Cohort,prospective
Brazil 220 NR NR 82 91 85 89 31 ELISA; RT-PCR
53 Cohort,retrospective
Indonesia 275 Male68%
30.7 46.8 (40.2–53.3)
100 100 32 80 ELISA; RT-PCR;
54 Cohort,prospective
Brazil 119 NR NR 0 100 0 51 49 ELISA; RT-PCR; VI
Abbreviations: Ref, Reference studies; y, year; Sen., Sensitivity; Spec., Specificity; NR, Not reported; M, Multicenter; HI, Hemagglutination inhibition; ICG, Immunochromatographic; VI, Virus isolation.doi:10.1371/journal.pone.0094655.t001
DengueNS1
Diag
nostic:
AMeta-A
nalysis
PLO
SONE|www.plosone.org
5April
2014
|Volume9
|Issu
e4
|e94655
Figure 2. The assessment of methodological quality items shown for all included studies. Proportions of studies rated as ‘‘yes’’, ‘‘no’’, or‘‘unclear’’ for each QUADAS item.doi:10.1371/journal.pone.0094655.g002
Figure 3. HSROC plot displaying diagnostic accuracy results of included studies. Panbio (A) and Platelia (B) kits. The circle diameter (studyestimate) is proportional to the weight given to each study. Summary sensitivity and specificity is marked by a red square.doi:10.1371/journal.pone.0094655.g003
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 6 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
14–6e+8), LR+ and LR- were 41006 (95% CI 6–3e+8) and 0.4
(95% CI 0.2–0.8), respectively.
Regarding the classification of dengue primary or secondary
infection types, the following global estimates for primary infection
were obtained for the parameters of sensitivity, DOR, LR+ and
LR-: 75% (95% CI 66–82.5), 7114 (95% CI 18–2e+6), 1761 (95%
CI 5-601666) and 0.24 (95% CI 0.17–0.34), respectively, for
Panbio, and 94.6% (95% CI 91–97), 2036 (95% CI 341–12130),
110 (95% CI 23–518) and 0.05 (95% CI 0.03–0.09), respectively,
for Platelia. For secondary infection, these laboratory indices were
57% (95% CI 47–67), 3443 (95% CI 12–9e+5), 1484 (95% CI 6–
4e+5) and 0.4 (95% CI 0.3–0.5), respectively, for Panbio, and 66%
(95% CI 53–77), 632 (95% CI 47–8374), 216 (95% CI 13–3453)
and 0.3 (95% CI 0.2–0.5), respectively, for Platelia.
Accuracy of the tests regarding clinical manifestations ofdengueTo verify whether patients with moderate clinical forms (DF) or
severe dengue (DHF/DSS) showed significant variations in the
performance of the tests, we performed a global estimate of the
accuracy of the tests. In this case, only Platelia was used for
laboratory evaluation of the different clinical forms of the patients.
Only five studies performed this calculation, with forest plot of
sensitivity showing values that ranged from 25% to 95%
(Figure 4A–B). The pooled sensitivity was 69% (95% CI 43–86)
and 60% (95% CI 48–70) for DF (A) and DHF (B), respectively.
DOR and post-test probabilityThe DOR is commonly considered a global measure of test
performance that summarizes the diagnostic accuracy of the index
test as a single number that describes how many times greater the
chance is of getting a positive result in a person with the disease
than in someone without the disease. As described above, the
values of DOR were considerably high due to the high values of
sensitivity and principally of the specificity observed in this study.
In this case, a function of DOR plotted on the graph would
present an exponential behavior, rising abruptly and presenting a
clear positive correlation with the sensitivity and specificity
[55,56].
To obtain the post-test probability, we used Fagan’s nomogram
for which we performed a simulation of an environment that had a
prevalence of 37% for dengue disease, with base on the studies
selected. Thus, the probability in this model of someone having the
disease and not being detected by the NS1 Panbio ELISA test was
17%. In the same situation for the NS1 Platelia ELISA test, a
negative result was associated with 13% of individuals with the
disease (Figure 5A–B). In contrast, the post-test probability of sick
patients with a positive test was 98% and 99%, respectively, for
Figure 4. Forest plot of the sensitivity of Platelia kit. Forest plot of the sensitivity of each study and pooled sensitivity for studies thatdistinguished clinical features of patients infected with DENV into DF (A) and DHF (B). The sensitivity is represented by the circles in squares and thehorizontal lines represent the point estimate (95% CI for each included study). Diamonds represent the pooled estimate (95% CI).doi:10.1371/journal.pone.0094655.g004
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 7 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
Panbio and Platelia. Thus, showing that these tests specifically
capture the NS1 antigen is important in the diagnosis of dengue.
Discussion
The studies included in this meta-analysis had a global
sensitivity and specificity ranging from 45% to 100% and 71%
to 100%, respectively, for Panbio and ranging from 0% to 95%
and from 47% to 100%, respectively, for Platelia. When we
performed an overall estimate of sensitivity, a superiority of
Platelia (74% [95% CI 63–82]) over Panbio (66% [95% CI 61–
71]) was detected. With respect to this increased sensitivity of the
former test, there are no hypotheses explaining this outcome, but it
has been observed that viral serotype can influence the accuracy of
the test, thereby changing the sensitivity and resulting in both the
Panbio and Platelia tests having higher sensitivity for DENV1.
However, there were more participants with DENV1 included for
analysis using the Platelia test [25,27,28,30,35–37,39,44,47,53], a
fact that may have influenced the overall estimate, although our
results are similar to the scientific literature, which demonstrates a
higher sensitivity for Platelia.
Our findings in relation to the sensitivity of the tests against viral
serotypes are partially consistent with the scientific literature, with
a lower sensitivity observed for both tests (37% for Panbio and
58% for Platelia) for DENV4. However, some studies have also
reported a lower sensitivity for Platelia for DENV2
[30,35,36,47,50]. The low accuracy of the Panbio during an
epidemic of DENV4 and Platelia were recently analyzed by
Colombo et al. [52] and Sea et al. [54], who observed the
occurrence of false negatives. It is not yet known why the NS1
ELISA has a lower sensitivity in the patients infected with
DENV4, but some hypotheses can be postulated: (i) there could be
quantitative differences in the secreted NS1 form, depending on
the viral serotype, which may lead to less availability of NS1 and
reduced chances of detection, (ii) the higher incidence of DENV4
in secondary infections, and (iii) there could be presence of
polymorphism in the NS1 gene associated with immune epitopes.
However, these speculations require additional studies to confirm
them.
In silico analysis using the Virus Pathogen Resource software
(ViPR: www.viprbrc.org) to assess the degree of variability of the
NS1 protein of DENV1-4 serotypes of the complete sequences
from Asia (1466 strains) versus South America (476 strains) revealed
Figure 5. Fagan’s nomogram for the calculation of post-test probabilities. A pre-test probability of 37% for dengue disease was fixed, whichwas estimated by the number of symptomatic cases in selected studies. (A) Panbio had a post-test probability of 98%. For Platelia kits (B) post-testprobability was 99%, ie, with an estimated prevalence of 37%, if this patient tests positive, the post-test probability that she truly has dengue wouldbe 99% (solid line in red). On the other hand, if patient tests negative, the post-test probability that she truly has dengue would be 17% (A) or 13% (B)(blue dotted line). The results were obtained by the following calculations: pretest odds =prevalence/1-prevalence; post-test odds =pretest odds xLR- (LR+); post-test probability = post-test odds/1+post-test odds. LR, likelihood ratio.doi:10.1371/journal.pone.0094655.g005
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 8 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
the existence of significant variability between NS1 sequences. At
least 83 amino acid positions were identified (Table S4). However,
in the known consensus NS1 region ‘‘111LRYSWKTWGKA121’’
[57], there was only one polymorphism (replacing R with K at
position 112) in DENV4; this polymorphism was found in 23
strains from South America and Asia. Thus, it appears that this
polymorphism is not the main factor influencing the test but will
be important for understanding whether external variant amino
acids can have some influence on the immune epitope.
The detection and semi-quantitation of NS1 is proportional to
the optical density (OD) measured at 450/620 nm [10]. The kits
that were analysed determine the cut off by the average and
standard deviations of the OD values from calibrators and the
values are expressed in scales that can be interpreted as negative,
indeterminate or positive. The calibration curve for the detection
of NS1 is obtained by comparing different dilutions of the antigen,
and the resulting values are expressed in OD units, as measured
using an ELISA reader. Accordingly, Young et al. [12] calculated
the linear portion of the standard curve to determine the serum
NS1 concentration, obtaining a minimum threshold of 4 ng/ml. If
there are quantitative differences in the secretion of NS1,
depending on the different DENV serotypes, this could reduce
the sensitivity of the test when certain dilutions are made. Indeed,
if NS1 DENV4 is present in smaller amounts, it would be
interesting to increase the detection test by obtaining a new
calibration curve with lower dilutions of the test samples.
The determination of dengue diagnosis only with clinical and
epidemiological data may result in errors [58,59]. To circumvent
this problem, a laboratory diagnosis is crucial for correct
identification. One of the main benefits of laboratory methods is
to allow the screening of patients suspected of such diseases to
implement the most appropriate clinical management and to
provide greater efficiency of the epidemiological surveillance
system. The epidemiological surveillance systems are important in
the control of outbreaks, as in cases of dengue, where movement of
a new serotype of DENV often proceeds to epidemic proportions.
The constant occurrence of dengue outbreaks can result in a
higher incidence of secondary infections, which are positively
correlated with a higher risk of DSS [60]. In this context, a lower
sensitivity in patients with secondary infections was found for both
analyzed tests, a fact that is worrisome because it would be useful
to have a better test accuracy at this stage, due to the possibility of
these patients progressing to more severe forms of the disease.
The ‘‘original antigenic sin’’ proposed by Sabin (1952) notes
that, in successive infections by DENV, antibody memory may
confer only transient protection against heterologous serotype
infections, so that antibodies generated in secondary infections
would be more effective in the neutralizing the viral serotype that
caused the primary infection instead of the secondary one. The
overall assessment of the sensitivity of both kits indicated that it
was considered elevated in patients with primary infection (77%
Panbio; 95.5% Platelia). In contrast, in secondary infections, there
was a loss of sensitivity for both kits (24% for Panbio and 31% for
Platelia). It is likely that this is due to the increased supply of
antibodies, although weakly neutralizing [61], binding to the NS1
antigen. Accordingly, to increase the sensitivity of the tests,
complex NS1 antibodies are separated by treatment of the test
samples with acid [62]. Although this method has improved the
sensitivity of the tests, only one study [31] among the ten that
distinguished the types of infections [26,28,29,32,37,39,45,51,53]
performed this step to dissociate antigen and antibody.
We conducted an overall estimate of the sensitivity of the kits
correlated with the geographic origin of patients. The tests had a
slight better accuracy for samples from Latin America, with values
of 70% (95% CI 63–76 [Panbio]) and 80% (95% CI 75–85
[Platelia]), while these rates for patients who were from Southeast
Asia and Oceania were 59% (95% CI 51–66 [Panbio]) and 73%
(95% CI 61–82 [Platelia]). From these findings, it cannot be
inferred that there were significant differences between geograph-
ical origins because even these results differ from the multicenter
study conducted by Guzman et al. [36]. We believe that the
differences in the sensitivity of the tests are most likely attributed to
the process of the epidemiological evolution of DENV serotypes,
in which a greater restriction of species from the same
geographical region may be the result of the viral ancestral
lineage [63]. This theory is supported by a phylogenetic analysis
that elucidated the origins and molecular evolution of DENV in
different geographic regions of world and showed the high genetic
diversity of dengue, in which there are several clusters of different
sublineages even within a single genotype [64]. In this context,
Watanabe et al. [65], through studies in mice, have found that the
secretion of NS1 is dependent on the viral strain. This reinforces
the idea that co-circulating viral strains can affect the accuracy of
tests that detect the NS1 antigen.
Although we mention above that the observed differences in
laboratory parameters, in association with different geographical
origins of patients, are mainly due to a process of molecular
evolution of DENV, we cannot rule out the influence of the host in
these molecular dynamics. In this sense, Mairiang et al. [66] found
that there are several interactions between the protein of DENV
and human and mosquito hosts. Therefore, there may be an
interaction between the genotype of the host and the pathogen
(DENV), although this has been demonstrated only in the main
dengue vector, Aedes aegypti [67]. While the host may influence the
molecular dynamics of the evolution of the pathogen, to what
extent this influences the pathogen infecting humans in certain
geographical regions and how this may affect the laboratory
methods used should be defined to improve the performance of
assays.
The DOR obtained in this meta-analysis was on average usually
greater than 500. In fact, the high variations of values for
sensitivity and specificity were also reflected in the DOR, which
may vary from zero to infinity with higher values denote a better
discriminatory diagnostic test [56]. Additionally, the post-test
(Fagan’s nomogram) probability was also high (Figure 5A–B),
indicating a good clinical utility of the tests, although caution is
needed in their interpretation because the samples included in the
studies were mostly from symptomatic patients suspected of
dengue, which increased the overall rates of prevalence.
In addition to the NS1 ELISA, there are immunochromato-
graphic methods, which are known as rapid tests because results
are obtained on average within 30 minutes. Several studies have
evaluated the NS1 rapid tests, with sensitivities ranging from 51%
to 90% [13–17,38]. So although very good methods for
identification of DENV infections exist and are in use, it is
prudent to include additional methods whenever possible. We
believe that one of the best choices is the combination of NS1
ELISA methods and an NS1 rapid test, along with a method for
detection of IgG to increase sensitivity in secondary type
infections.
Our meta-analysis had several limitations. First, there are two
generations of the Panbio NS1 ELISA, and the latest second-
generation kit had a higher sensitivity. Among the analyzed
studies, few authors identified the generation of the kits used in
their experiments, so our overall estimate of the sensitivity of
Panbio could be influenced by this aspect. Second, although the
specificity was almost 100%, it should be noted that only a few
authors used a different pathological group of dengue, while most
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 9 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
used samples from healthy individuals and blood donors. We
understand that this happens because of the abundance and ease
of obtaining these samples, but it is critical to avoid biases and to
test the assays more in relation to other flavivirus and similar
diseases. Third, only a third of the studies made a distinction
between or disclosed the serotypes of DENV. Perhaps this factor,
along with precocity of the samples, had a greater influence on the
accuracy of tests. Fourth, there was statistically significant
heterogeneity across the included studies. In an effort to explore
source of heterogeneity, meta-regression revealed that origin,
period and retrospective samples might is causing diversity on
sensitivity and specificity. Fifth, only a few studies reported that the
samples were from primary or secondary infections. Sixth, we used
available data to calculate the sensitivity up to the sixth day of
blood collection; however, some studies had a period of sample
collection lasting until the ninth day of the febrile phase and this
factor can also significantly compromise the accuracy of tests.
Finally, data were not divided into additional groups based on
other variables, such as gender or age, due to the limitations of
original information for each patient included in the studies.
In conclusion, despite the above limitations mentioned, this
meta-analysis showed a good overall estimate of sensitivity ranging
from 66% (95% CI 61–71 [Panbio]) to 74% (95% CI 63–82
[Platelia]). Specificity was near 100% for both kits. The main
factors influencing the diagnostic accuracy were the type of
infection (primary versus secondary), viral serotype, geographical
origins of samples and how early the samples were collected.
However, to what extent and how these factors affect the
diagnostic accuracy require more studies in order to optimize
these tests.
Supporting Information
Figure S1 Deek’s funnel plot asymmetry test for
publication bias. Deek’s funnel plot asymmetry test not
suggested potential publication bias (p = 0.56 in the Panbio kit
(a)), (p = 0.09 in the Platelia kit (b)).
(TIF)
Figure S2 Summary ROC curve plot with sensitivity and
specificity for Panbio (A) and Platelia (B). Each large X
represents individual study in meta-analysis. Summary operating
point is a single sensitivity/specificity point estimated by the results
of studies. AUC= area under the curve.
(TIF)
Table S1 PRISMA Checklist.
(DOC)
Table S2 Methodological quality of the 30 included
studies.
(XLSX)
Table S3 Univariate meta-regression analyses of the
sensitivity and specificity.
(DOCX)
Table S4 Amino acid positions of NS1 identified with
significant variations. The positions and variability were
obtained by the crossing of the NS1 strains DENV1-4 from Asia
and South America.
(XLSX)
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: VGC MLM. Performed the
experiments: VGC ACMS MLM. Analyzed the data: VGC ACMS.
Contributed reagents/materials/analysis tools: VGC. Wrote the paper:
VGC.
References
1. Hotez PJ, Bottazzi ME, Franco-Paredes C, Ault SK, Periago MR (2008) Theneglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review ofdisease burden and distribution and a roadmap for control and elimination.PLoS Negl Trop Dis 2: e300. doi:10.1371/journal.pntd.0000300. PubMed:18820747.
2. WHO (2009) Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention andcontrol. Available: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241547871_eng.pdf. Accessed 2013 December 16.
3. Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, Buchy P, Farrar J, et al. (2010) Dengue: acontinuing global threat. Nat Rev Microbiol 8: S7–S16. doi: 10.1038/nrmicro2460. PubMed: 21079655.
4. Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM (1990) Flavivirus genomeorganization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol 10: 649–688.doi: 10.1146/annurev.mi.44.100190.003245. PubMed: 2174669.
5. Phillips ML (2008) Dengue reborn: widespread resurgence of a resilient vector.Environ Health Perspect 116: A382–8. PubMed: 18795135.
6. Tabachnick WJ (2010) Challenges in predicting climate and environmentaleffects on vector-borne disease episystems in a changing world. J Exp Biol 213:946–954. doi: 10.1242/jeb.037564. PubMed: 20190119.
7. Martina BE, Koraka P, Osterhaus AD (2009) Dengue virus pathogenesis: anintegrated view. Clin Microbiol Rev 22: 564-8. doi: 10.1128/CMR.00035-09.PubMed: 19822889.
8. Lai YL, Chung YK, Tan HC, Yap HF, Yap G, et al. (2007) Cost-effective real-time reverse transcriptase PCR (RT-PCR) to screen for Dengue virus followedby rapid single-tube multiplex RT-PCR for serotyping of the virus. J ClinMicrobiol 45: 935–941. doi: 10.1128/JCM.01258-06. PubMed: 17215345.
9. Alexander DQF, Aralı MVR, Elvira OR, Angel VCL (2006) Evaluation of IgMdetermination in acute serum for the diagnosis of dengue in an endemic area.Enferm Infecc Microbiol Clin 24: 90–92. PubMed: 16545316.
10. Alcon S, Talarmin A, Debruyne M, Falconar A, Deubel V, et al. (2002)Enzyme-linked immunosorbent assay specific to dengue virus type 1 nonstruc-tural protein NS1 reveals circulation of the antigen in the blood during the acutephase of disease in patients experiencing primary or secondary infections. J ClinMicrobiol 40: 376–381. doi: 10.1128/JCM.40.2.376-381.2002. PubMed:11825945.
11. Shu PY, Huang JH (2004) Current advances in dengue diagnosis. Clin DiagnLab Immunol 11: 642–650. doi: 10.1128/CDLI.11.4.642–650.2004. PubMed:15242935.
12. Young PR, Hilditch PA, Bletchly C, Halloran W (2000) An antigen captureenzyme-linked immunosorbent assay reveals high levels of the dengue virusprotein NS1 in the sera of infected patients. J Clin Microbiol 38: 1053–1057.PubMed: 10698995.
13. Kumarasamy V, Chua SK, Hassan Z, Wahab AHA, Chem YK, et al. (2007)Evaluating the sensitivity of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISAfor early diagnosis of acute dengue virus infection. Singapore Med J 48: 669–73.PubMed: 17609831.
14. Chuansumrit A, Chaiyaratana W, Pongthanapisith V, Tangnararatchakit K,Lertwongrath S, Yoksan S (2008) The use of dengue nonstructural protein 1antigen for the early diagnosis during the febrile stage in patients with dengueinfection. Pediatr Infect Dis J 27: 43–48. PubMed: 18162937.
15. McBride WJH (2009) Evaluation of dengue NS1 test kits for the diagnosis ofdengue fever. Diagn Microbiol Infect Dis 64: 31–36. doi: 10.1016/j.diagmicro-bio.2009.01.002. PubMed: 19232865.
16. Bisordi I, Rocco IM, Suzuki A, Katz G, Silveira VR, et al. (2011) Evaluation ofdengue NS1 antigen detection for diagnosis in public health laboratories, SaoPaulo state, 2009. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 53: 315–20. PubMed:22183454.
17. Felix AC, Romano CM, Centrone CC, Rodrigues CL, Villas-Boas L, et al.(2012) Low sensitivity of NS1 protein tests evidenced during a dengue type 2virus outbreak in Santos, Brazil, in 2010. Clin Vaccine Immunol 19: 1972–76.doi: 10.1128/CVI.00535-12. PubMed: 23100478.
18. Moher D, Liberati A, Tetzlaff J, Altman DG, Altman D, et al. (2009) Preferredreporting items for systematic reviews and meta-analyses: the PRISMAstatement. PLoS Med 6: e1000097. doi: 10.1371/journal.pmed.1000097.PubMed: 19621072.
19. Higgins JPT, Green S, editors (2011) Cochrane handbook for systematic reviewsof interventions. Version 5.1.0:6.4.1. The Cochrane Collaboration; Available:http://www.cochrane-handbook.org. Accessed 2013 October 10.
20. Whiting P, Rutjes AWS, Reitsma JB, Bossuyt PMM, Kleijnen J (2003) Thedevelopment of QUADAS: a tool for the quality assessment of studies of
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 10 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
diagnostic accuracy included in systematic reviews. BMC Med Res Methodol 3:
25. doi: 10.1186/1471-2288-3-25. PubMed: 14606960.
21. Higgins JP, Thompson SG, Deeks JJ, Altman DG (2003) Measuring
inconsistency in meta-analyses. BMJ 327: 557–560. doi: 10.1136/
bmj.327.7414.557. PubMed: 12958120.
22. Jones CM, Athanasiou T (2005) Summary receiver operating characteristiccurve analysis techniques in the evaluation of diagnostic tests. Ann Thorac Surg
79: 16–20. doi: 10.1016/j.athoracsur.2004.09.040. PubMed: 15620907.
23. Deeks JJ, Macaskill P, Irwig L (2005) The performance of tests of publication
bias and other sample size effects in systematic reviews of diagnostic test
accuracy was assessed. J Clin Epidemiol 58: 882–893. doi: 10.1016/j.jclinepi.2005.01.016. PubMed: 16085191.
24. Fagan TJ (1975) Letter: Nomogram for Bayes theorem. N Engl J Med 293: 257.
doi: 10.1056/NEJM197507312930513. PubMed: 1143310.
25. Dussart P, Labeau B, Lagathu G, Louis P, Nunes MRT, et al. (2006) Evaluation
of an enzyme immunoassay for detection of dengue virus NS1 antigen in human
serum. Clin Vaccine Immunol 13: 1185–89. doi: 10.1128/CVI.00229-06.
PubMed: 16988003.
26. Kumarasamy V, Wahab A, Chua SK, Hassan Z, Chem YK, et al. (2007)
Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratorydiagnosis of acute dengue virus infection. J Virol Methods 140: 75–79. Available:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2006.11.001. Accessed 2013 December
14.
27. Bessoff K, Delorey M, Sun W, Hunsperger E (2008) Comparison of two
commercially available dengue virus (DENV) NS1 capture enzyme-linkedimmunosorbent assays using a single clinical sample for diagnosis of acute
DENV infection. Clin Vaccine Immunol 15: 1513–18. doi: 10.1128/
CVI.00140-08. PubMed: 18685015.
28. Blacksell SD, Mammen Jr MP, Thongpaseuth S, Gibbons RV, Jarman RG, et
al. (2008) Evaluation of the Panbio dengue virus nonstructural 1 antigendetection and immunoglobulin M antibody enzyme-linked immunosorbent
assays for the diagnosis of acute dengue infections in Laos. Diagn Microbiol
Infect Dis 60: 43–49. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2007.07.011. PubMed:
17889487.
29. Castro LA (2008) Avaliacao da deteccao da proteına NS1 no diagnostico dainfeccao pelo vırus dengue-3 em comparacao a outros metodos laboratoriais
utilizados no diagnostico da dengue. Dissertacao de Mestrado em Imunologia
Basica e Aplicada. Universidade de Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP. 100p.
30. Dussart P, Petit L, Labeau B, Bremand L, Leduc A, et al. (2008) Evaluation of
two new commercial tests for the diagnosis of acute dengue virus infection usingNS1 antigen detection in human serum. PLoS Negl Trop Dis 2: e280.
doi:10.1371/journal.pntd.0000280. PubMed: 18714359.
31. Lapphra K, Sangcharaswichai A, Chokephaibulkit K, Tiengrim S, Piriyakarn-
sakul W, et al. (2008) Evaluation of an NS1 antigen detection for diagnosis of
acute dengue infection in patients with acute febrile illness. Diagn MicrobiolInfect Dis 60: 387–91. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2007.11.010. PubMed:
18191361.
32. Hang VT, Nguyet NM, Trung D, Tricou V, Yoksan S, et al. (2009) Diagnostic
accuracy of NS1 ELISA and lateral flow rapid tests for dengue sensitivity,
specificity and relationship to viraemia and antibody responses. PLoS Negl TropDis 3: e360. doi:10.1371/journal.pntd.0000360. PubMed: 19156192.
33. Phuong HL, Thai KTD, Nga TTT, Giao PT, Hung LQ, et al. (2009) Detection
of dengue nonstructural 1 (NS1) protein in Vietnamese patients with fever. Diagn
Microbiol Infect Dis 63: 372–78. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2008.12.009.
PubMed: 19232866.
34. Poloni TRRS (2009) Deteccao e tipificacao do vırus da dengue por RT-PCR em
tempo real. Dissertacao de mestrado em Biociencias Aplicadas a Farmacia.
Universidade de Sao Paulo. Ribeirao Preto, SP. 56p.
35. Ramirez AH, Moros Z, Comach G, Zambrano J, Bravo L, et al. (2009)Evaluation of dengue NS1 antigen detection tests with acute sera from patients
infected with dengue virus in Venezuela. Diagn Microbiol Infect Dis 65: 247–53.
doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.07.022. PubMed: 19733994.
36. Guzman MG, Jaenisch T, Gaczkowski R, Hang VTT, Sekaran SD, et al. (2010)
Multi-country evaluation of the sensitivity and specificity of two commercially-available NS1 ELISA assays for dengue diagnosis. PLoS Neglected Trop Dis 4:
e811. doi:10.1371/journal.pntd.0000811. PubMed: 20824173.
37. Lima MRQ, Nogueira RMR, Schatzmayr HG, Santos FB (2010) Comparison of
three commercially available dengue NS1 antigen capture assays for acute
diagnosis of dengue in Brazil. PLoS Negl Trop Dis 4: e738. doi:10.1371/journal.pntd.0000738. PubMed: 20625558.
38. Osorio L, Ramirez M, Bonelo A, Villar LA, Parra B (2010) Comparison of the
diagnostic accuracy of commercial NS1-based diagnostic tests for early dengue
infection. Virol J 7: 361. doi: 10.1186/1743-422X-7-361. PubMed: 21134275.
39. Pok KY, Lai YL, Sng J, Ng LC (2010) Evaluation of nonstructural 1 antigen
assays for the diagnosis and surveillance of dengue in Singapore. Vector-Borne
Zoonotic Dis 10: 1009–16. doi: 10.1089/vbz.2008.0176. PubMed: 20426686.
40. Singh MP, Majumdar M, Singh G, Goyal K, Preet K, et al. (2010) NS1 antigen
as an early diagnostic marker in dengue: report from India. Diagn MicrobiolInfect Dis 68: 50–54. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2010.04.004. PubMed:
20727470.
41. Araujo FMC, Brilhante RSN, Cavalcanti LPG, Rocha MFG, Cordeiro RA, et
al. (2011) Detection of the dengue non-structural 1 antigen in cerebral spinal
fluid samples using a commercially available enzyme-linked immunosorbent
assay. J Virol Methods 177: 128–31. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.07.003.
PubMed: 21798288.
42. Chua KB, Mustafa B, Abdul Wahab AH, Chem YK, Khairul AH, et al. (2011)
A comparative evaluation of dengue diagnostic tests based on single-acute serum
samples for laboratory confirmation of acute dengue. Malays J Pathol 33: 13–20.
PubMed: 21874746.
43. Chuansumrit A, Chaiyaratana W, Tangnararatchakit K, Yoksan S, Flamand M,
Sakuntabhai A (2011) Dengue nonstructural protein 1 antigen in the urine as a
rapid and convenient diagnostic test during the febrile stage in patients with
dengue infection. Diagn Microbiol Infect Dis 71: 467–69. doi: 10.1016/
j.diagmicrobio.2011.08.020. PubMed: 21996098.
44. Duong V, Ly S, Try PL, Tuiskunen A, Ong S, et al. (2011) Clinical and
virological factors influencing the performance of a NS1 antigen-capture assay
and potential use as a marker of dengue disease severity. PLoS Negl Trop Dis 5:
e1244. doi:10.1371/journal.pntd.0001244. PubMed: 21811645.
45. Lima MRQ, Nogueira RMR, Filippis AMB, Santos FB (2011) Comparison of
two generations of the Panbio dengue NS1 capture enzyme-linked immunosor-
bent assay. Clin Vaccine Immunol 18: 1031–33. doi: 10.1128/CVI.00024-11.
PubMed: 21525305.
46. Kassim FM, Izati MN, TgRogayah TAR, Apandi YM, Saat Z (2011) Use of
dengue NS1 antigen for early diagnosis of dengue virus infection. Southeast
Asian J Trop Med Public Health 42: 562–9. PubMed: 21706934.
47. Silva FG, Silva SJS, Rocco IM, Silveira VR, Suzuki A, et al. (2011) Evaluation of
commercial kits for detecting the antigen NS1-dengue-Sao Paulo. Bepa 8: 14–
26.
48. Watthanaworawit W, Turner P, Turner CL, Tanganuchitcharnchai A, Jarman
RG, et al. (2011) A prospective evaluation of diagnostic methodologies for the
acute diagnosis of dengue virus infection on the Thailand-Myanmar border.
Trans R Soc Trop Med Hyg 105: 32–37. doi: 10.1016/j.trstmh.2010.09.007.
PubMed: 21035827.
49. Anders KL, Nguyet NM, Quyen NTH, Ngoc TV, Tram TV, et al. (2012) An
evaluation of dried blood spots and oral swabs as alternative specimens for the
diagnosis of dengue and screening for past dengue virus exposure. Am J Trop
Med Hyg 87: 165–70. doi: 10.4269/ajtmh.2012.11-0713. PubMed: 22764309.
50. Blacksell SD, Jarman RG, Gibbons RV, Tanganuchitcharnchai A, Mammen Jr
MP, et al. (2012) Comparison of seven commercial antigen and antibody
enzyme-linked assays for detection of acute dengue infection. Clin Vaccine
Immunol 19: 804–10. doi: 10.1128/CVI.05717-11. PubMed: 22441389.
51. Aryati A, Trimarsanto H, Yohan B, Wardhani P, Fahri S, Sasmono RT (2013)
Performance of commercial dengue NS1 ELISA and molecular analysis of NS1
gene of dengue viruses obtained during surveillance in Indonesia. BMC Infect
Dis 13: 611. doi:10.1186/1471-2334-13-611. PubMed: 24571329.
52. Colombo TE, Vedovello D, Araki CS, Cogo-Moreira H, Dos Santos INP, et al.
(2013) Dengue 4 false negative results by Panbio dengue early ELISA assay in
Brazil. J Clin Virol 58: 710–13. doi: 10.1016/j.jcv.2013.10.021. PubMed:
24238889.
53. Kosasih H, Alisjahbana B, Widjaja S, Nurhayati, Mast Q, et al. (2013) The
diagnostic and prognostic value of dengue nonstructural 1 antigen detection in a
hyper-endemic region in Indonesia. PLoS One 8: e80891. doi:10.1371/
journal.pone.0080891. PubMed: 24260501.
54. Sea VRF, Cruz ACR, Gurgel RQ, Nunes BTD, Silva EVP, et al. (2013)
Underreporting of dengue-4 in Brazil due to low sensitivity of the NS1 Ag
test in routine control programs. PLoS One 8: e64056. doi: 10.1371/
journal.pone.0064056. PubMed: 23715529.
55. Buehler AM, Figuero M, Moreira FR, Cavalcanti AB, Sasse A, Berwanger O.
Diretrizes metodologicas: elaboracao de revisao sistematica e meta-analise de
estudos diagnosticos de acuracia. Available: http://200.214.130.94/rebrats/
publicacoes/dbrs_Diagn_v_final.pdf. Accessed 2013 December 17.
56. Glas AS, Lijmer JG, Prins MH, Bonsel GJ, Bossuyt PMM (2003) The diagnostic
odds ratio: a single indicator of test performance. J Clin Epidemiol 56: 1129–35.
doi:10.1016/S0895-4356(03)00177-X. PubMed: 14615004.
57. Falconar AK, Young PR, Miles MA (1994) Precise location of sequential dengue
virus subcomplex and complex B cell epitopes on the nonstructural-1
glycoprotein. Arch Virol 137: 315–26. PubMed: 7944953.
58. Daumas RP, Passos SR, Oliveira RV, Nogueira RM, Georg I, et al. (2013)
Clinical and laboratory features that discriminate dengue from other febrile
illnesses: a diagnostic accuracy study in Rio de Janeiro, Brazil. BMC Infect Dis 8:
13–77. doi: 10.1186/1471-2334-13-77. PubMed: 23394216.
59. Terzian AC, Mondini A, Bronzoni RV, Drumond BP, Ferro BP, et al. (2011)
Detection of Saint Louis encephalitis virus in Dengue-suspected cases during a
dengue 3 outbreak. Vector Borne Zoonotic Dis 11: 291–300. doi: 10.1089/
vbz.2009.0200. PubMed: 20645866.
60. Huy NT, Van Giang T, Thuy DH, Kikuchi M, Hien TT, et al. (2013) Factors
associated with dengue shock syndrome: a systematic review and meta-analysis.
PLoS Negl Trop Dis 7: e2412. doi:10.1371/journal.pntd.0002412. PubMed:
24086778.
61. Wahala WMPB, Silva AM (2011) The human antibody response to dengue virus
infection. Viruses 3: 2374–95. doi: 10.3390/v3122374. PubMed: 22355444.
62. Koraka P, Burghoorn-Maas CP, Falconar A, Setiati T, Djamiatun K, et al.
(2003) Detection of immune-complex-dissociated nonstructural-1 antigen in
patients with acute dengue virus infections. J Clin Microbiol 41: 4154–59. doi:
10.1128/JCM.41.9.4154-4159.2003. PubMed: 12958240.
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 11 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
63. Costa RL, Voloch CM, Schrago CG (2012) Comparative evolutionary
epidemiology of dengue virus serotypes. Infect Genet Evol 12: 309–314. doi:
10.1016/j.meegid.2011.12.011. PubMed: 22226705.
64. Weaver SC, Vasilakis N (2009) Molecular evolution of dengue viruses:
contributions of phylogenetics to understand the history and epidemiology of
the preeminent arboviral disease. Infect Genet Evol 9: 523–540. doi: 10.1016/
j.meegid.2009.02.003. PubMed: 19460319.
65. Watanabe S, Tan KH, Rathore APS, Rozen-Gagnon K, Shuai W, et al. (2012)
The magnitude of dengue virus NS1 protein secretion is strain dependent and
does not correlate with severe pathologies in the mouse infection model. J Virol86: 5508–14. doi: 10.1128/JVI.07081-11. PubMed: 22419801.
66. Mairiang D, Zhang H, Sodja A, Murali T, Suriyaphol P, et al. (2013)Identification of new protein interactions between dengue fever virus andits hosts, human and mosquito. PLoS One 8: e53535. doi:10.1371/journal.pone.0053535. PubMed: 23326450.
67. Fansiri T, Fontaine A, Diancourt L, Caro V, Thaisomboonsuk B, et al. (2013)Genetic mapping of specific interactions between Aedes aegypti mosquitoes anddengue viruses. PLoS Genet 9: e1003621. doi: 10.1371/journal.pgen.1003621.PubMed: 23935524.
Dengue NS1 Diagnostic: A Meta-Analysis
PLOS ONE | www.plosone.org 12 April 2014 | Volume 9 | Issue 4 | e94655
