UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Manić V. Branislav

Mikropropagacija vrste Micromeria thymifolia (Scop.)

Fritsch

Master rad

Niš, 2014.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Mikropropagacija vrste Micromeria thymifolia (Scop.)

Fritsch

Master rad

Kandidat: Mentor:

Manić V. Branislav Dr Dragana D. Stojičić

Broj indeksa: 57 Vanredni profesor

Niš, 2014.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Micropropagation of Micromeria thymifolia (Scop.)

Fritsch

Master thesis

Candidat: Mentor:

Manić V. Branislav Dr Dragana D. Stojičić

No. of index: 57 Associate professor

Niš, 2014.

Zahvalnica

Zahvaljujem se mentoru, profesorki dr Dragani Stojičić na izboru

teme, ukazanom poverenju i pomoći pri samoj izradi ovog master rada.

Takođe se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći

i strpljenju prilikom realizacije eksperimentalnog dela ovog rada. Ovaj

master rad je rađen u okviru doktorske disertacije asistentkinje Svetlane

Tošić i sadrži još uvek nepublikovane rezultate.

Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici i prijateljima na nesebičnoj

podršci i ljubavi, i ovaj rad posvećujem njima!

Skraćenice

IAA - indol - 3 sirćetna kiselina

BA (BAP) - benzil - 6 aminopurin

IBA - indol - 3 buterna kiselina

NAA - naftil sirćetna kiselina

2,4-D - 2,4 - dihlor fenoksi sirćetna kiselina

Sadržaj: 1. Uvod .......................................................................................................................................................... 1

1.1. Familija Lamiaceae ............................................................................................................................ 2

1.1.1. Rod Micromeria .......................................................................................................................... 3

1.1.2. Vrsta Micromeria thymifolia ....................................................................................................... 5

1.2. Kultura in vitro ................................................................................................................................... 7

1.2.1. Mikropropagacija ........................................................................................................................ 8

1.2.2. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro ................................................................ 12

2. Cilj istraživanja ........................................................................................................................................ 14

3. Materijali i metode ................................................................................................................................. 16

3.1. Biljni materijal ................................................................................................................................. 17

3.2. Metode sterilizacije .......................................................................................................................... 17

3.2.1. Sterilizacija eksplantata ............................................................................................................. 17

3.2.2. Sterilizacija hranljivih podloga ................................................................................................. 18

3.2.3. Sterilizacija laboratorije, radnih površina i pribora ................................................................... 18

3.3. Hranljiva podloga ............................................................................................................................. 19

3.3.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia ......................................... 20

3.4. Statistička obrada podataka .............................................................................................................. 21

4. Rezultati .................................................................................................................................................. 22

4.1. Uvođenje Micromeria thymifolia u kulturu in vitro ......................................................................... 23

4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria thymifolia ........................ 23

4.3. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia .................................................. 30

5. Diskusija .................................................................................................................................................. 32

6. Zaključak .................................................................................................................................................. 35

7. Literatura ................................................................................................................................................. 37

Sažetak

Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch je višegodišnja biljka iz familije Lamiaceae,

poznata po svojim aromatičnim svojstvima i korišćenju u medicinske svrhe. U ovom radu ispitan

je uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka, kao i na produkciju

biomase ove biljke. Korišćena je MS podloga sa dodatkom različitih koncentracija citokinina -

BA i auksina - IAA. MS podloga sa dodatkom 30 μM BA i 0,57 μM IAA bila je najpogodnija za

indukciju aksilarnih pupoljaka, dok je njihova najveća prosečna dužina zabeležena na

eksplantatima gajenim na podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA. Najveća prosečna sveža masa

zabeležena je na eksplantatima gajenim na MS podlozi sa dodatkom 30 μM BA i 0,57 μM IAA,

dok je najveća prosečna vrednost suve mase bila na podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM

IAA.

Ključne reči: Micromeria thymifolia, aksilarni pupoljci, BA, IAA.

Abstract

Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch is a perennial herb in the family Lamiaceae,

known for its aromatic properties and use for medical purposes. According to the literature up to

now, this plant has not been introduced in vitro culture. In this work, the influence of growth

regulators, on the induction and axillary bud elongation were tested, as well as the biomass

production of the plant. We used MS medium supplemented with different concentrations of

cytokinins - BA and auxins - IAA. MS medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA

was the most suitable for the induction of axillary buds, while their longest average length

observed in the medium with 1 μM BA and 0,57 μM IAA. The highest average fresh weight was

observed on MS medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA, while the highest

value of dry weight was on the base with the addition of 1 μM BA and 0,57 μM IAA.

Keywords: Micromeria thymifolia, axillary buds, BA, IAA.

1

1. Uvod

2

1.1. Familija Lamiaceae

Familija Lamiaceae (usnatice) je predstavljena sa 240 rodova i preko 7200 vrsta koje su

rasprostranjene širom Zemlje, izuzev Arktika (Braüchler et al., 2008). Najveće bogatstvo rodova

i vrsta ove familije je u oblasti Mediterana i Male Azije. Familija Lamiaceae je među

najbrojnijim u ovom delu Evrope i u flori Balkanskog poluostrva predstavljena je sa 371 vrstom,

a od toga su 84 vrste Balkanski endemiti. U Srbiji ima 147 vrsta ove familije koje su

predstavljene u okviru 30 rodova. Familija Lamiaceae je brojna familija, koju čine biljke sa

velikim značajem za čoveka.

Vrste familije Lamiaceae su kosmopolitskog rasprostranjenja i naseljavaju pretežno suva

i dobro osunčana staništa. Samo mali broj vrsta naseljava hladnije predele. Postoje vrste koje

rastu na skoro svim kontinentima, dok su neke ograničene na male oblasti, poput rtanjske metlice

(Nepeta rtanjensis) koja raste samo u Srbiji na planini Rtanj (Ljajević-Grbić, 2008).

Pripadnici familije Lamiaceae mogu biti zeljaste ili drvenaste biljke u obliku žbunova ili

polužbunova, retko drveće ili lijane. Stablo im je četvorougaono, listovi su po dva u pršljenu, bez

zalistaka, prosti ili na različite načine deljeni. Na nadzemnim vegetativnim organima nalaze se

žlezdane dlake, često u obliku glavice ili žlezdane ljuspice. Cvetovi kod ovih biljaka su

zigomorfni, retko aktinomorfni (Mentha), dvopolni, petočlani, ređe četvoročlani. Čašica se

sastoji od pet sraslih listića, cevasta je, kod nekih predstavnika čak dvousnata. Krunica je

sastavljena od pet listića, koji su u donjem delu srasli u cev, dok je gornji deo razdvojen na dva

dela: gornju usnu i donju usnu. Andreceum se sastoji od 4 prašnika, ili od 2 prašnika i 2

staminodije. Tučak je sinkarpan, sagrađen od dva oplodna listića. Plodnik je nadcvetan, dvook,

ili zbog sekundarno razvijene pregrade četvorook i u svakom okcu sadrži po jedan semeni

zametak. Cvetovi su grupisani u cimozne cvasti, vrlo retko su pojedinačni. Plod se najčešće

sastoji iz 4 oraščića (Tatić i Blečić, 2002).

Familiju Lamiaceae čine biljke sa važnom primenom u medicini, farmaciji i kozmetičkoj

industriji, jer sadrže veliki broj aktivnih sastojaka. Najvažnije je to što sadrže etarska ulja

(Slavkovska et al., 2005), a kao glavni sastojci se izdvajaju aromatični alkoholi, fenoli, terpeni,

3

ketoni, aldehidi itd. Najpoznatiji predstavnici familije su: majčina dušica, nana, bosiljak,

ruzmarin, žalfija, lavanda, origano, matičnjak, mrtva kopriva, rtanjski čaj, srdačica i mnogi drugi.

Osim kao lekovite, poznate su i kao korovske i rudimentarne vrste.

I vrste roda Micromeria su dobro poznate kao aromatične vrste, jer sadrži značajne

količine etarskog ulja.

1.1.1. Rod Micromeria

Prvi put rod Micromeria opisuje Bentham 1829. godine. Rod Micromeria sadrži vrste

koje se prostiru od Himalaja do Makaronezijskog arhipelaga (Madeira, Kape Verde i Kanarska

ostrva) i od Mediterana do Južne Afrike i Madagaskara (Morales, 1991; Brauchler et al., 2008).

Slika 1. Rasprostranjenost roda Micromeria u svetu (Brauchler, 2008)

4

Ovaj rod je predstavljen sa 54 vrste, 32 podvrste i 13 sorti. U flori Srbije i Crne Gore je

predstavljen sa 10 vrsta, od kojih su 7 endemične (Šilić, 1979).

Rod Micromeria smatra se delom nejasno definisanog “Satureja kompleksa”. Budući da

postoje jasne morfološke raznolikosti, mnogi taksonomisti su podelili ovaj kompleks u nekoliko

rodova: Satureja L., Clinopodium L., Calamintha Mill., Acinos Mill. i Micromeria Benth.

(Boissier, 1879). Sa druge strane, postoje taksonomisti koji spajaju ove grupe u jedan rod – rod

Satureja s.l.

Boissier je koristio termin “sekcija”, za klasifikaciju vrsta iz roda Micromeria. Na osnovu

morfoloških karakteristika i filogenetskih odnosa Boissier (1879) deli rod Micromeria u tri

sekcije:

Pseudomelissa (M. thymifolia, M. albanica, M. pulegium, M. dalmatica)

Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora)

Cymularia

Na osnovu molekularnih analiza, pokazano je da je rod Micromeria polifilan, pa su vrste

iz sekcije Pseudomelissa prebačene u rod Clinopodium, gde zbog srodnosti i zbog morfoloških

karakteristika i pripadaju (Arabaci et al., 2010).

Postojanje velikog broja sinonima za pojedine vrste iz roda Micromeria potvrđuje da

postoje određene nejasnoće u pogledu taksonomije i nomenklature. Tako se kroz literature često

može naći da su neke vrste smeštene u rod Thymus, Satureja, Calamintha i dr.

Uglavnom aromatične, vrste roda Micromeria su često označene kao biljke sa

farmakološkim svojstvima. Koriste se kao lekovi protiv prehlade, poremećaja srca, bolova u

grudima, glavobolje, kožnih infekcija, očnih zapaljenja i zubobolje. Ističu se nihovo anestetičko,

antiseptičko, antireumatsko dejstvo, kao i stimulacija centralnog nervnog sistema (Gulluce et al.,

2004). Etarska ulja vrsta iz roda Micromeria imaju značajna antioksidantna, antibakterijska i

antifugalna dejstva (Duru et al., 2004).

5

1.1.2. Vrsta Micromeria thymifolia

Carstvo: Plantae

Razdeo: Magnoliophyta

Klasa: Magnoliopsida

Red: Lamiales

Familija: Lamiaceae

Rod: Micromeria

Vrsta: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch

*sinonim - Clinopodium thymifolium (Scop.) Kuntze

Slika 2. Rasprostranjenost vrste M. thymifolia (Scop.) Fritsch

6

M. thymifolia je višegodišnja biljka sa mirisom sličnim menti, vitka, tamno zelena sa

blago sjajnim lišćem i sa brojnim, uspravnim, sitnim cvetovima. Prosečna biljka je visoka 20-30

cm. Lišće je dugačko 5-20 mm, eliptičnog do ovalnog oblika. Cvetovi su dugački 5-9 mm, bele i

roze boje, grupisani tako da formiraju cvasti. Cveta u letnjem periodu. Na Balkanskom

poluostrvu se može naći na suvim, stenovitim i dobro osunčanim mestima, na nadmorskoj visini

od 30 do 2000 m. Ne podnosi previše vode.

Slika 3. Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch

Micromeria thymifolia se na području Mediterana koristi kao začin i kao medicinska

biljka (Hammer et al., 2005). Lišće se koristi za spremanje čaja. Istražen je sastav i diuretični

efekat etarskog ulja nadzemnih delova ove biljke. Ustanovljeno je da osnovu ulja čine ciklični

monoterpeni sa kiseonikom, a najzastupljeniji je pulegon (67,53%). Etarsko ulje deluje kao

diuretik, čemu posebno doprinosi pulegon (Vladimir-Knežević et al., 2005).

7

1.2. Kultura in vitro

Razmnožavanje biljaka može biti polno (generativno) i bespolno (vegetativno). Kod

polnog razmnožavanja, putem semena, dolazi do spajanja naslednog materijala roditelja. Kod

vegetativnog razmnožavanja, iz ćelija, tkiva ili vegetativnih organa, mogu se razviti nove

jedinke, genetski istovetne sa matičnom biljkom. Danas u biljnoj proizvodnji vegetativnim

razmnožavanjem, postoje metode, koje se dele na tehnike makropropagacije i mikropropagacije.

Kultura biljnog tkiva predstavlja poseban način proizvodnje novih individua u

laboratorijskim uslovima in vitro. Iz vegetativnih delova samo jedne biljke uzete iz prirode,

moguće je proizvesti veliki broj novih jedinki, gajenjem na hranljivoj podlozi, u sterilnim,

kontrolisanim laboratorijskim uslovima.

Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu pojedine organe,

embrione ili celu biljku, zavisi od:

- totipotencije - sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele i da regenerišu

pojedine organe, embrione ili celu biljku

- plastičnosti - sposobnost biljke da menja svoj program rastenja, metabolizma i razvića u

zavisnosti od uslova sredine.

Vegetativna propagacija obuhvata nekoliko načina razmnožavanja, to su:

a) Mikropropagacija - permanentna kultura pupoljaka;

b) Organogeneza - formiranje pupoljaka de novo;

c) Somatska embriogeneza - razviće embriona iz somatskih ćelija;

d) Androgeneza i ginogeneza - razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog

gametofita bez oplođenja;

e) Somatska hibridizacija - somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne ćelije i da

fuzijom daju novi organizam.

8

Tehnike kulture biljaka in vitro se mogu podeliti i po tipu eksplantata koji se uvode u

kulturu: ćelije, tkiva ili organi.

Primena tehnike kulture in vitro može da ima poseban značaj kod očuvanja ugroženih i

retkih vrsta, tako što će se one u laboratorijskim uslovima umnožiti i zatim vratiti na prirodna

staništa. Takođe, veliki značaj ima i u farmaciji, šumarstvu i hortikulturi jer se bitno smanjuje

pritisak na prirodne populacije onih biljaka koje su bitne u navedenim privrednim granama. Vrlo

veliki značaj ima i u borbi za suzbijanje i eliminaciju biljnih virusa. Pošto se virusi, po pravilu,

ne nalaze u meristemskim ćelijama, razmnožavanjem zdravog materijala u kulturi dobija se

zdravo vegetativno potomstvo. Ako se iz obolele biljke izoluju meristemi, može se dobiti

potomstvo oslobođeno od virusa.

1.2.1. Mikropropagacija

U širem smislu termin mikropropagacija označava svaki način razmnožavanja biljaka u

kulturi in vitro.

U užem smislu označava razmnožavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih

pupoljaka, koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih

primordija (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996; Nešković et al., 2003).

Mikropropagacija se primenjuje kod brzog razmnožavanja novih genotipova, održavanja

interesantnih genotipova, ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka selekcije i

oplemenjivanja, regeneracije izdanaka i celih biljaka u genetičkom inženjerstvu (Vinterhalter i

Vinterhalter, 1996). U laboratorijskim uslovima u kojima je moguće obezbediti apsolutnu

kontrolu uslova rasta i zdravstvenog stanja kulture, mikropropagacija omogućava veliku brzinu

razmnožavanja. Na osnovu toga, mikropropagacija je dala rešenje za savremenu rasadničku

proizvodnju gde su neki od prvih radova bili na hrizantemi (Earl i Langhans, 1975).

Tokom razvoja kulture in vitro predložene su različite podele samog procesa. Prva je bila

definisana u tri koraka ili faze in vitro multiplikacije biljaka, ali je kasnije ova podela adaptirana.

9

Danas je najviše u upotrebi podela koju su dali Debergh i Maene (1981), koja podrazumeva faze

od 0-4.

Faza 0: Izbor majke biljke i njena priprema

Pre nego se počne sa mikropropagacijom treba pažljivo odabrati majku biljku, koja treba

da je tipičan predstavnik vrste i bez ikakvih vidljivih simptoma bolesti. Naziv ,,nulta” potiče od

toga što to nije faza samog razmnožavanja, već obuhvata postupke pravilnog prikupljanja,

prenošenja i čuvanja biljnog materijala. Kao početni materijal, u postupcima klonskog

razmnožavanja biljaka, preporučuje se vršni meristem.

Faza 1: Uspostavljanje aseptične kulture

Ova faza je, u stvari, prva faza klonskog razmnožavanja. Ona obuhvata:

- dobijanje aseptične kulture odabranog biljnog materijala;

- izolaciju dela biljke koji kloniramo (meristem, list, tučak, koren i dr.);

- celokupnu sterilizaciju posuđa, pribora, prostora;

- pripremanje i sterilizaciju hranljivih podloga.

Za uspešnost ove faze prvo je potrebno da eksplantat koji se uvodi u kulturu, bude bez

mikrobne kontaminacije, a zatim da ostvari neku vrstu rastenja, rast vršnog izdanka ili formiranje

kalusa. Obično se kultura započinje većom količinom početnog materijala (eksplantata). Nakon

kraćeg vremena inkubacije, svaka od posuda za kulturu za koju se utvrdi da je kontaminirana

(bilo da je u pitanju eksplantat ili podloga) mora biti odstranjena.

10

Faza 2: Produkcija (razmnožavanje) propagula

Osnovni cilj ove faze jeste produkcija tj. umnožavanje kloniranih biljka (ili novih

mladica, izdanaka ili propagula), koje su, kad se odvoje od kulture, sposobne da nastave rastenje

i da daju kompletnu biljku.

U ovoj fazi je najvažnije voditi računa da se postigne razmnožavanje bez gubitka

genetičke stabilnosti. Umnožavanje se može obavljati na različite načine, a koja metoda će se

primeniti to zavisi od rezultata koji se želi postići (broj biljaka, biljke sa određenim osobinama i

sl.), od vrste biljke koja se klonira i njenih bioloških ograničenja. Faza multiplikacije se ponavlja

sve dok se ne dobije željeni broj biljaka.

Faza 3: Priprema za rast u prirodnom okruženju

Izdanci ili biljke dobijene u fazi 2 su jako male i nesposobne za rast i samoodržavanje u

zemlji ili kompostu. Zato faza 3 podrazumeva sve korake neophodne za individualan rast biljaka,

sposobnih za fotosintezu i preživljavanje bez dodatka ugljenih hidrata. Neke biljke zahtevaju

poseban tretman tokom ove faze da ne bi ostale malog rasta ili dormantne kada se prebace iz

uslova kultiviranja. Kao što je Murashige predložio, ova faza podrazumeva ukorenjavanje

izdanaka in vitro pre prebacivanja u zemlju. Rizogeneza se obično indukuje u podlozi sa

auksinom. Tek kada adventivno korenje dostigne odgovarajuću dužinu, biljke se mogu

postepeno prenositi u ex vitro uslove.

Faza 4: Priprema i prenos biljaka u uslove spoljašnje sredine

Prenos biljaka iz in vitro u ex vitro uslove je veoma važan. Ako se ne obavi pažljivo,

transfer može da rezultira velikim gubitkom propagiranog materijala. Brojni su razlozi za to,

pošto se klonirane biljke razlikuju od biljka gajenih u ex vitro uslovima po brojnim anatomskim i

funkcionalnim karakteristikama.

11

Izdanci dobijeni kulturom razvijali su se u uslovima velike vlažnosti i niskog intenziteta

svetlosti, što za rezultat daje slabo razvijen epikutikularni voštani sloj lista. Stomaterni aparat

kod ovih biljaka je atipičan i nije u mogućnosti da se zatvara u uslovima niske relativne

vlažnosti. Ovo uslovljava da in vitro biljke gube vodu vrlo brzo čim se prebace u uslove

spoljašnje sredine.

In vitro tehnike poseduju sledeće prednosti u odnosu na tradicionalne metode razmnožavanja:

a) Razmnožavanje in vitro je mnogo brže od razmnožavanja in vivo;

b) Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti in vivo;

c) Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže nego biljke koje rastu in vivo, jer su

oslobođene patogena (virus free) i infekcija bakterijama i gljivama;

d) In vitro omogućava razmnožavanje samo zdravih biljaka;

e) Vegetativno razmnožavanje in vitro se može započeti sa vrlo malo biljnog materijala kao

početnog eksplantata;

f) Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju

određenih kultura;

g) Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti ugroženih i retkih vrsta;

h) Kultura in vitro je korisna za osnivanje banke gena.

Pored prednosti, in vitro tehnike imaju i nedostatke. Kao nedostaci kuture in vitro navode se:

a) U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska;

b) Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro;

c) Prenos biljaka iz in vitro u in vivo uslove je ponekad težak i mukotrpan posao;

d) Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva;

e) U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je teška.

12

1.2.2. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro

Gajenje kultura in vitro podrazumeva kontrolu svih činilaca, od izbora eksplantata i

uspostavljanja aseptičnih uslova, zatim manipulacije razvića u kulturi putem definisanja sastava

hranljive podloge, posebno balansa hormona, do kontrole spoljašnjih faktora sredine kao što su

svetlost, vlažnost i temperatura.

Uspešnost kulture ćelija, tkiva ili organa zavisi od sastava same podloge, koja bi trebalo da

zadovolji nutritivne i fiziološke potrebe ćelija u kulturi. No, bez obzira na različitost hranljivih

podloga, zajedničko za sve je da one moraju da sadrže sledeće:

- voda;

- agar;

- mineralne soli;

- ugljeni hidrati;

- vitamini;

- regulatori rastenja (biljni hormoni).

Biljni hormoni imaju ključnu ulogu u regulaciji rastenja biljnih kultura in vitro, jer

kontrolišu ne samo brzinu rastenja jednog organa ili tkiva, već svojim balansom mogu izazvati

diferenciranje organa, odnosno mogu da usmere i usklade rastenje kompleksnih struktura, kao

što su izdanci ili embrioni. U biljne hormone koji se koriste u kulturi in vitro spadaju:

1) Auksini - često se dodaju hranljivim podlogama. Prouzrokuju izduživanje ćelija i bubrenje

tkiva, ćelijsku deobu (obrazovanje kalusa), obrazovanje adventivnih korenova, inhibiciju

obrazovanja adventivnih i bočnih izdanaka, a često i embriogenezu u suspenzionim kulturama. U

auksine spadaju IAA, IBA, NAA ili 2.4-D.

13

2) Citokinini - često se koriste za stimulaciju rastenja i razvića. Najviše se koriste kinetin,

BA, 2iP i PBA. Oni obično pokreću deobu ćelija, naročito ako se dodaju zajedno sa auksinima.

U većim koncentracijama (1-10 mg/l) mogu indukovati obrazovanje adventivnih izdanaka, ali se

obrazovanje korenova u tom slučaju zaustavlja. Prirodni citokinin je i zeatin. Važno je

napomenuti da odnos koncentracija auksina i citokinina određuje razvoj biljne kulture. Veća

koncentracija auksina (manja koncentracija citokinina) indukuje razvoj korenova. Veća

koncentracija citokinina (manja koncentracija auksina) indukuje razvoj izdanaka. Jednaka

koncentracija ovih hormona indukuje razvoj kalusa.

3) Giberelini - grupa biljnih hormona koja se, generalno, slabo koristi u in vitro kulturi viših

biljaka. Ovi hormoni stimulišu izduživanje stabla izvesnih biljaka patuljaste forme.

4) Abscisinska kiselina (ABA) i etilen - hormoni koji se nekad označavaju inhibitorima, jer

vrše negativan uticaj na kulturu in vitro. U nekim slučajevima ABA izaziva pokretanje

obrazovanja kalusa (odnosno rasta kalusa), kao i sazrevanje embriona u procesu embriogeneze,

ali veoma retko.

Osmotski potencijal, pH podloge, svetlost i temperatura su još neki, od mnogih faktora,

koji bitno utiču na rast i razvuće biljaka gajenih u kulturi in vitro.

14

2. Cilj istraživanja

15

Cilj istraživanja:

Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. thymifolia i ispitivanje

uticaja kombinacije citokinina i auksina na rastenje i izduživanje aksilarnih pupoljaka

Ispitivanje uticaja kombinacije citokinina i auksina na produkciju biomase eksplantata M.

thymifolia

Statistička obrada dobijenih rezultata

Izvođenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa literaturnim podacima

16

3. Materijal i metode

17

3.1. Biljni materijal

Biljni materijal je uzorkovan sa lokaliteta u zapadnoj Srbiji, u klisuri Belog Rzava kod

Kotromana. Biljke vrste Micromeria thymifolia uzorkovane su u vegetativnoj fazi. Tokom

eksperimentalnog rada, kao eksplantati su korišćeni nodalni segmenti približno iste veličine

(Stojičić i Tošić, 2014, nepublikovan rezultat). Vršni pupoljci nisu korišćeni. Eksplantati su

postavljeni na hranljivu podlogu MS (Murashige i Skoog, 1962) sa različitim koncentracijama

regulatora rastenja, citokinina (BA) i auksina (IAA). Na svaku podlogu postavljano je 30

nodalnih eksplantata i to po 10 eksplantata u tri tegle.

3.2. Metode sterilizacije

Sterilizacija je postupak kojim se kompletno odstranjuju ili uništavaju svi oblici

mikroorganizama. U kulturi in vitro postoje 4 glavna izvora infekcija: biljka, hranljiva podloga,

vazduh i istraživač (neprecizan rad) (Marić, 1995).

3.2.1. Sterilizacija eksplantata

Ako se eksplantat izoluje iz biljke koja je rasla u prirodi neophodno je izvršiti površinsku

sterilizaciju, sa ciljem da se sa spoljašnosti primarnog eksplantata biljke uklone mikroorganizmi

koji bi mogli prilikom uvodjenja eksplantata u kulturu in vitro da kontaminiraju hranljivu

podlogu (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996). Površinska sterilizacija se izvodi tako što se nodalni

segmenti isecaju, smeštaju u odgovarajuće sterilne posude i tretitaju sredstvom za površinsku

sterilizaciju.

Jedinjenja koja se najčešće koriste u tu svrhu su: alkohol (uglavnom se koristi 70% alkohol);

varikina; K-hipohlorit, Ca-hipohlorit; sublimat ili živin hlorid (HgCl2) rastvoren u česmenskoj

vodi.

18

Biljke Micromeria thymifolia su sterilisane korišćenjem 30%-tnog rastvora varikine u

trajanju od 25 minuta i potom ispirane tri puta sterilnom destilovanom vodom. Radi eliminacije

gljivične infekcije eksplantati su izlagani delovanju 0,05%-tnog rastvora nistatina u trajanju od

24 časa, nakon čega su isprani tri puta sterilnom destilovanom vodom, a zatim preneti na

hranljivu podlogu (Stojičić i Tošić, 2014, nepublikovan rezultat).

3.2.2. Sterilizacija hranljivih podloga

Sterilizacija hranljive podloge se može obaviti na više načina:

- Fizičkim uništavanjem mikroorganizama pomoću suvog toplog vazduha, pare ili

zračenja;

- Fizičkim odstranjivanjem mikroorganizama pomoću filtracije ili pranjem;

- Hemijskim uništavanjem mikroorganizama (etilen-hlorid, Na-hipohlorit, K-hipohlorit,

Ca-hipohlorit, antibiotici);

- Autoklaviranjem (sterilizacija vrućom parom pod povišenim pritiskom).

Sterilizacije hranljive podloge u našem eksperimentu je vršena u autoklavu, na temperaturi

od 120°C u trajanju od 30 minuta.

3.2.3. Sterilizacija laboratorije, radnih površina i pribora

Radna prostorija i površine su sterilisane pomoću UV lampe, najmanje dva sata pre

početka rada. Radne površine su sterilisane 96%-tnim alkoholom i pre početka eksperimenta, kao

i više puta tokom rada.

Instrumenti, petri kutije i ostalo posuđe i pribor, sterilisani su suvom sterilizacijom u

trajanju od 1-2 sata na temperaturi od 160-180 °C. Pre sterilizacije u suvom sterilizatoru, objekti

se stavljaju u metalne kutije ili uvijaju u foliju, kako nakon sterilizacije ne bi došlo do

19

kontaminacije. Pincete i skalpeli su sterilisani iskuvavanjem u destilovanoj vodi do 30 min,

nakon čega su uranjeni u 96%-tni etil-alkohol. Pre upotrebe, metalni pribor se zagreva do

usijanja nad plamenom špiritusne lampe. Tokom rada, pribor treba više puta menjati, vraćati u

alkohol i sterilisati na plamenu.

3.3. Hranljiva podloga

Osnovna hranljiva podloga na kojoj su gajeni eksplantati vrste M. thymifolia bila je MS

podloga (Murashige i Skoog, 1962). Vrednost pH podloge se pre autoklaviranja uglavnom

podešava na 5,8, ali treba uzeti u obzir da ta vrednost može da se promeni nakon autoklaviranja,

kao i da sama biljka može da utiče na promenu (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996). Sastav za

pripremu prikazan je u tabeli 1:

Tabela 1. Sastav MS hranljive podloge

Makro mineralne soli MS (mg/l)

NH4 NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2× 2H2O 440

MgSO4× 7H2O 370

KH2PO4 170

Mikro mineralne soli MS (mg/l)

Mn SO4 × 4H2O 22,3

Zn SO4× 7H2O 8,6

H3BO3 6,2

KJ 0,83

NaMoO4 × 2H2O 0,25

CuSO4 × 5 H2O 0,025

CoCl2 × 6 H2O 0,025

FeSO4 × 7H2O 27,8

Na2EDTA 37,3

20

Organski dodaci MS (mg/l)

vitamin B1 0.4

vitamin B6 0.5

nikotinska kiselina 0.5

glicin 2.0

mioinozitol 100

saharoza 30 000

agar 700

3.3.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia

U ovom eksperimentu, da bi se ispitao uticaj regulatora rastenja na indukciju aksilarnih

pupoljaka, u osnovnu hranljivu MS podlogu dodati su citokinin (BA) - u rasponu koncentracija

od 0,1 μM do 30 μM, i auksin (IAA) u koncentraciji 0,57 μM. Korišćene kombinacije regulatora

rastenja su prikazane u tabeli 2:

Tabela 2. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia

Hranljiva

podloga 1 2 3 4 5 6 7 8

BA (μM) 0 0 0,1 0,3 1 3 10 30

IAA (μM) 0 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57

Eksplantati su gajeni u kulturi 28 dana, na temperaturi od 21 ± 2 °C i fotoperiodu od 16

sati svetlosti i 8 sati mraka. Nakon 28 dana eksplantati su vađeni sa podloge i određivan je broj

pupoljaka koji se razvio i merena je njihova dužina. Takođe, za svaki eksplantat je izmerena

njegova sveža masa, a nakon nekoliko dana sušenja i suva masa. Sva merenja mase, obavljena su

na automatskoj analitičkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg. Dobijeni podaci su obrađeni

statistički, a dobijene prosečne vrednosti predstavljene su u narednom poglavlju.

21

3.4. Statistička obrada podataka

Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura

ANOVA i test LCD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki

parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su

različitim slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.

22

4. Rezultati

23

4.1. Uvođenje Micromeria thymifolia u kulturu in vitro

Vrsta M. thymifolia u kulturu in vitro uvedena je od strane Stojičić i Tošić (2014,

nepublikovani rezultati). Sa biljaka iz sterilne kulture uzeti su nodalni eksplantati (deo dve

internodije sa listovima u čijem pazuhu su se nalazili začeci aksilarnih pupoljaka). Nodalni

eksplantati su postavljeni na hranljive podloge sa različitim koncentracijama regulatora rastenja

gde su proveli 4 nedelje. U tom periodu odstranjeni su eksplantati koji su bili zaraženi nekom

infekcijom ili eksplantati koji su bili nekrotični. Zdrav biljni materijal iskorišćen je za indukciju

aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima M. thymifolia i praćenje produkcije biomase.

4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima

Micromeria thymifolia

Nodalni eksplantati M. thymifolia postavljeni su na MS hranljivu podlogu: bez regulatora

rastenja (kontrola), sa auksinom IAA (0,57 µM) i sa kombinacijom auksina IAA (0,57 µM) i

različitih koncentracija citokinina BA (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 i 30 µM ). Ubrzo nakon postavljanja

eksplantata na MS hranljivu podlogu, bez ili sa citokininom BA i auksinom IAA, moglo se

primetiti razviće aksilarnih pupoljaka i njihovo izduživanje na svim postavljenim eksplantatima.

Od ukupno 240 eksplantata smestenih u 24 tegle, po 10 eksplantata u svakoj, samo u jednoj tegli

došlo je do kontaminacije i pojave plesni, pa je ta tegla izuzeta iz dalje obrade podataka. U roku

od dve nedelje došlo je od uočavanja aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M.

thymifolia.

U tabeli 3 je prikazan prosečan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu kao i prosečna

dužina aksilarnih pupoljaka. Najveći broj pupoljaka formiran je na eksplantatima gajenim na

podlozi sa 0,57 μM IAA i 30 μM BA, dok je prosečna dužina pupoljaka bila najveća kada su oni

gajeni na podlozi sa 0,57 μM IAA i 1 μM BA.

24

Tabela 3. Uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka M. thymifolia

Tretman Prosečan broj pupoljaka

po eksplantatu

Prosečna dužina pupoljaka

(mm)

1 Bez hormona 8,84 ± 0,86ab

4,32 ± 0,34a

2 0,57 μM IAA 6,87 ± 0,56a 5,99 ± 0,43

b

3 0,57 μM IAA + 0,1 μM BA 6,72 ± 1,04a 5,40 ± 0,45

ab

4 0,57 μM IAA + 0,3 μM BA 8,00 ± 1,07ab

6,20 ± 0,52bc

5 0,57 μM IAA + 1 μM BA 7,67 ± 1,14ab

7,69 ± 0,69d

6 0,57 μM IAA + 3 μM BA 7,96 ± 0,77ab

5,87 ± 0,40b

7 0,57 μM IAA + 10 μM BA 8,96 ± 0,80ab

5,79 ± 0,37b

8 0,57 μM IAA + 30 μM BA 9,00 ± 0,61b 7,30 ± 0,41

cd

Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p≤0.05

MS podloga bez hormona bila je jedna od najpogodnijih za razvoj u pogledu indukcije

aksilarnih pupoljaka, budući da je u proseku formirano 8,84 pupoljaka po eksplantatu. Sa druge

strane, izduživanje tih aksilarnih pupoljaka bilo je najslabije na ovoj podlozi, pa je prosečna

dužina pupoljaka iznosila 4,32 mm (Tab. 3). Eksplantati formirani na ovoj podlozi bili su

normalno razvijeni, uglavnom nešto niži ali prilično razgranati. Listovi koji su bili u dodiru sa

podlogom su nekrozirali (Sl. 4).

Slika 4. M. thymifolia na MS podlozi bez hormona, a) grupa biljaka u tegli, b) pojedinačni eksplantat

a b

MS

M. thymifolia

MS

M. thymifolia

25

Na podlozi MS sa 0,57 μM IAA, bez dodatka citokinina, razvijen je manji prosečan broj

aksilarnih pupoljaka nego na kontrolnoj podlozi i on je iznosio 6,87 po eksplantatu. U odnosu na

podlogu bez hormona, uočava se povećanje prosečne dužine pupoljaka, pa je ona za ovu podlogu

iznosila 5,99 mm (Tab. 3). Eksplantati su svetliji, sa mestimičnim tamnim mrljama i sa nešto

slabije razvijenim listovima (Sl. 5).

Slika 5. M. thymifolia na MS podlozi sa 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli, b) pojedinačni eksplantat

Najmanji prosečan broj pupoljaka po eksplantatu zabeležen je na MS podlozi sa 0,1 μM

BA i 0,57 μM IAA (Tab. 3). Prosečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka po eksplantatu

iznosio je 6,72, a njihova prosečna dužina bila je 5,40 mm, što je takođe među najnižim

vrednostima, upoređujući prosečnu dužinu pupoljaka na svim podlogama. Među eksplantatima

uglavnom dominira žbunasta, zbijena forma, sa nešto krupnijim listovima (Sl. 6).

MS + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

26

Slika 6. M. thymifolia na MS podlozi sa 0,1 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,

b) pojedinačni eksplantat

Na hranljivoj podlozi MS sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA zabeleženo je povećanje

prosečanog broja aksilarnih pupoljaka, ali je taj broj ipak manji od onog u kontolnoj grupi, kod

eksplantata na podlozi bez hormona. Ovde se razvilo prosečno 8,00 aksilarnih pupoljaka po

eksplantatu, a njihova prosečna dužina je iznosila 6,20 mm (Tab. 3). Eksplantati su bili izduženi,

svetliji i sa manjim brojem listova. Uočena je nekroza na obodu najstarijih listova (Sl. 7).

Slika 7. M. thymifolia na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,

b) pojedinačni eksplantat

MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

27

Eksplantati gajeni na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA formirali su prosečno 7,67

aksilarnih pupoljaka. Ovo je podloga na kojoj je zabeležena najveća prosečna dužina aksilarnih

pupoljaka i ona je iznosila je 7,69 mm (Tab. 3). Eksplantati su bili malo niži nego na drugim

podlogama, ali sa bogatim grananjem i krupnim listovima (Sl. 8).

Slika 8. M. thymifolia na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,

b) pojedinačni eksplantat

Na MS podlozi sa 3 μM BA i 0,57 IAA prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je

7,96, a njihova prosečna dužina 5,87 mm (Tab. 3). Na ovoj podlozi su najizraženiji eksplantati

sa žbunastom formom, niski i sa velikim brojem jako razvijenih, zbijenih listova (Sl. 9).

MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

28

Slika 9. M. thymifolia na MS podlozi sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,

b) pojedinačni eksplantat

Na podlogama sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA prosečan broj aksilarnih pupoljaka iznosio je

8,96, što je među najvećim zabeleženim vrednostima u ovom istraživanju, veći i od onog u

kontrolnoj grupi tj. podlozi bez hormona. Prosečna dužina pupoljaka na eksplantatima na ovoj

podlozi iznosila je 5,79 mm (Tab. 3). Eksplantati su bili vitalni, razvijeni, sa bogatim grananjem.

Na nekima od njih primećena je pojava tamnijih mrlja na listovima (Sl. 10).

Slika 10. M. thymifolia na MS podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,

b) pojedinačni eksplantat

MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

29

Najveći prosečan broj aksilarnih pupoljaka razvijen je na eksplantatima na MS podlozi sa

30 μM BA i 0,57 IAA i iznosio je 9,00 po eksplantatu. Ovo je podloga koja je najviše odgovarala

razvoju biljaka vrste Micromeria thymifolia, pa je i prosečna dužina pupoljaka bila velika i

iznosila je 7,30 mm (Tab. 3). Samo je na podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA zabeležena veća

prosečna dužina. Na osnovu samog izgleda eksplantata moglo se zaključiti da je ovo podloga

koja je najpogodnija za njihov razvoj. Svi postavljeni eksplantati su uspešno razvijeni, sa

najvećom prosečnom visinom biljaka u odnosu na ostale podloge. Listovi su se razvili u velikom

broju (Sl. 11).

Slika 11. M. thymifolia na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,

b) pojedinačni eksplantat

Na histogramu 1. može se videti uporedni prikaz svih prethodno navedenih podataka o

prosečnom broju pupoljaka po eksplantatu, kao i o prosečnoj dužini tih aksilarih pupoljaka,

predstavljenih po podlogama. Jasno se uočava da su, izuzimajući podlogu bez hormona, za

formiranje aksilarnih pupoljaka, najpogodnije bile podloge sa najvišom koncentracijom BA. Sa

druge strane, za izduživanje tih pupoljaka ne može se izvesti takav zaključak. Na MS podlozi bez

hormona zabeležena je najmanja prosečna dužina pupoljaka, posle koje se beleži rast na ostalim

podlogama, ali ne baš proporcionalno sa povećanem koncentracije BA. Tako je za izduživanje

MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia

MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA

M. thymifolia a b

30

bočnih pupoljaka najpogodnija bila MS podloga sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA, a ne ona sa 30 μM

BA kako je možda očekivano.

Histogram 1. Delovanje regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka Micromeria

thymifolia

4.3. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia

U sklopu ispitivanja uticaja različitih regulatora rastenja iz podloge na indukciju i

izduživanje aksilarnih pupoljaka, ispitani su i uticaji istih tretmana na produkciju biomase

biljaka. Prvo je merena sveža masa za svaki eksplantat posebno, na svim koncentacijama, a kroz

2-3 nedelje, nakon što bi se ti eksplantati sušili na sobnoj temperaturi, merena je i njihova suva

masa. Dobijeni rezultati predstavljeni su u tabeli 4.

31

Tabela 4. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia

Tretman Prosečna sveža masa

(mg)

Prosečna suva masa

(mg)

1 Bez hormona 0,075 ± 0,0072ab

0,0095 ± 0,0008ab

2 0,57 μM IAA 0,064 ± 0,0048a 0,0071 ± 0,0006

a

3 0,57 μM IAA + 0,1 μM BA 0,081 ± 0,0097abc

0,0094 ± 0,0009ab

4 0,57 μM IAA + 0,3 μM BA 0,088 ± 0,0107abcd

0,0095 ± 0,0012ab

5 0,57 μM IAA + 1 μM BA 0,116 ± 0,0150de

0,0108 ± 0,0015b

6 0,57 μM IAA + 3 μM BA 0,094 ± 0,0096bcd

0,0094 ± 0,0008ab

7 0,57 μM IAA + 10 μM BA 0,105 ± 0,0069cde

0,0107 ± 0,0008b

8 0,57 μM IAA + 30 μM BA 0,126 ± 0,0106e 0,0108 ± 0,0008

b

Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p0.05

Sasvim očekivano, budući da su eksplantati bili najrazvijeniji, sa krupnim listovima,

najveća prosečna sveža masa po eksplantatu zabeležena je na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57

IAA i iznosila je 0,126 mg. Visoke vrednosti su zabeležene i na podlogama sa dodatkom 1 μM

BA i 10 μM BA.

To su tri podloge na kojima je i prosečna suva masa po eksplantatu bila najveća, ali

posebno treba istaći MS podlogu sa 1 μM BA i 0,57 IAA, gde je ta masa iznosila 0,0128 mg. To

je ista podloga na kojoj je zabeležena najveća prosečna dužina aksilarnih pupoljaka, što je

svakako uticalo na povećanje sveže i posebno suve mase.

32

5. Diskusija

33

Biljke iz roda Micromeria su u naučnim radovima najčešće opisivane sa stanovišta

etarskih ulja koja sadrže. Utvrđivanje sastava etarskih ulja bitno je da bi se na pravi način vršilo

njihovo dalje iskorišćavanje u farmaceutske svrhe, obzirom na mnoga pozitivna, medicinska

svojstva ovih ulja.

Slavkovska et al. (2005) utvrdili su da je grupa Pseudomelissa, gde između ostalih spada i

vrsta Micromeria thymifolia, jako bogata etarskim uljima (>0,5%) gde dominiraju oksigenisani

monoterpeni. Nešto ranije, Marinković et al. (2003) su potvrdili antibakterijsku aktivnost

esencijalnih ulja biljke M. thymifolia, a kao glavne sastojke ističu pulegon (32,81%), piperiton i

izomenton. Šavikin et al. (2008) potvrđuju da su to pulegon, zastupljen sa čak 50,4%, piperiton

sa 10,3% i piperiton oksid. Marin et al (2013) su izvršili detaljno ispitivanje trihoma vrste

Micromeria thymifolia, kao glavnih sekretornih organa, i tom prilikom je urađena histohemijska,

mikromorfološka i ultrastrukturalna analiza. Ristić et al (1997) su uradili analizu hloroformskih

ekstrakata ove biljke i došli do rezultata da preovlađuju nezasićene masne kiseline, a

najzastupljenije su palmitinska, linolna i linolenska.

U ovom radu opisan je postupak mikropropagacije vrste Micromeria thymifolia u

uslovima in vitro, sa ciljem određivanja najbolje kombinacije hormona u MS podlozi, radi što

uspešnije indukcije aksilarnih pupoljaka, njihovog izduživanja i produkcije biomase. Biljni

hormoni koji su korišćeni bili su BA iz grupe citokinina i IAA iz grupe auksina. MS podloga sa

dodatkom 30 μM BA i 0,57 IAA bila je najpogodnija za indukciju aksilarnih pupoljaka, a

podloga sa 1 μM BA i 0,57 IAA najpogodnija za njihovo izduživanje.

Kombinaciju ovih hormona u podlozi uspešno su koristili mnogi autori u svojim

istraživanjima, kod biljaka iz familije Lamiaceae ali i drugih familija. Tako Elhag (1991)

utvrđuje da je podloga sa 0,3 mg/L BA i 0,3 mg/L IAA najbolja za rast i izduživanje pupoljaka

vrste Catha edulis iz familije Celastaceae. Duhoky i Rasheed (2010) nalaze da je za vrstu

Gardenia jasminoides (familija Rubiaceae) to podloga sa 1,5 mg/L BA i 0,6 mg/L IAA. Što se

tiče familije Lamiaceae, Mišić et al (2006) nalaze da niske koncentracije auksina u kombinaciji

sa citokininom pozitivno utiču na indukciju izdanaka i stimulišu njihov rast, kod vrste Salvia

brachyodon (familija Lamiaceae). Za indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka biljke Mentha

viridis najbolja je MS podloga sa 2,0 mg/L BA and 0,5 mg/L IAA, prema Rahman et al (2013).

34

Zielinska et al (2011) su do sličnih rezultata došli ispitujući vrstu Agastache rugosa. Kod nekih

biljaka, adekvatnija je bila kombinacija nekih drugih hormona ili prisustvo samo jednog od njih.

Tako je kod vrste Mentha arvensis, kombinacija BA i kinetina dala dobre uslove za indukciju i

multiplikaciju izdanaka (Akram et al, 2013), dok je kod vrsta Prunella vulgaris (Rasol, 2009),

Origanum sipyleum (Oluk i Çakır, 2009) i Ocimum kilimandscharicum (Saha et al, 2010) to bio

samo BA.

Izduživanje aksilarnih pupoljaka vrste Micromeria thymifolia u našem istraživanju bilo je

najbolje na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA. Ovo je kombinacija hormona koja je u

drugim radovima retko upotrebljavana za izduživanje pupoljaka. Pattnaik i Chand (1996) su za

izduživanje aksilarnih pupoljaka vrsta Ocimum americanum i Ocimum sancum, koristili podlogu

sa BA i giberelinom, a kod vrste Mentha piperita povoljna je bila visoka koncentracija zeatina

(Laslo et al, 2011). Postoje i podaci da kod nekih biljaka iz familije Lamiaceae citokinin BA

deluje inhibitorno (Mišić et al. 2006) i da je uspešnije izduživanje na podlogama bez hormona,

ali to u našem eksperimentu nije bio slučaj.

Kao novina u ovom istraživanju, rađena je analiza uticaja hormona BA i IAA iz podloge

na produkciju mase biljaka Micromeria thymifolia. Najveća vrednost prosečne sveže mase

zabeležena je na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA i iznosila je 0,126 mg, dok je najveća

prosečna suva masa bila na podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM IAA i iznosila je 0,0108

mg. Podloga bez dodatka citokinina, samo sa auksinom 0,57 μM IAA, bila je najmanje pogodna

za razvoj biomase. Na njoj su zabeležena i najniža prosečna sveža i najniža prosečna suva masa.

35

6. Zaključak

36

U ovom radu detaljno je opisano uspostavljanje i uspešno gajenje vrste Micromeria

thymifolia (Scop.) Fritsch u kulturi in vitro. Ispitan je uticaj regulatora rastenja (auksina i

citokinina) na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka, kao i na produkciju biomase ove

biljke.

Najveći prosečan broj aksilarnih pupoljaka zabeležen je na eksplantatima koji su gajeni

na MS podlozi sa dodatkom 30 μM BA i 0,57 μM IAA. Ovo je bila podloga koja je odgovarala i

izduživanju pupoljaka, ali je ipak najveća prosečna dužina aksilarnih pupoljaka zabeležena na

eksplantatima na MS podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM IAA. Pojave adventivnih

korenova nije bilo.

Najveću prosečnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na MS podlozi sa dodatkom 30

μM BA i 0,57 μM IAA, dok je najveća prosečna vrednost suve mase zabeležena na

eksplantatima na MS podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM IAA.

Na osnovu rezultata koji su dobijeni može se zaključiti da je vrstu Micromeria thymifolia

moguće uspešno gajiti i razmnožavati u kulturi in vitro, što može biti jako značajno u pogledu

očuvanja i zaštite ove vrste.

37

7. Literatura

38

1) Akram, M., Afrasiab, H., Mahmood, S., Aftab, F., 2007: Monoterpene contents in in vitro

cultures and field-grown plants of Japanese mint Mentha arvensis L. Pak. j. biochem.

mol. biol., 40 (2): 74 79.

2) Arabaci, T., Dimenci, T., Celep, F., 2010: Morphological character analysis in Turkish

Micromeria Benth. (Lamiaceae) species with a numerical taxonomic study. Turkish

Journal of Botany, 34: 379 – 389.

3) Boissier, E., 1879: Flora Orientalis. Basel & Geneve.

4) Brauchler, C., Ryding, O., Heubl, G., 2008: The genus Micromeria (Lamiaceae), a

synoptical update. Willdenowia, 38: 363 – 410.

5) Debergh, P., Maene, L., 1981: A scheme for commercial propagation of ornamental

plants by tissue culture, Sci. Hort., 14: 335 – 345.

6) Duhoky, M., Rasheed, K., 2010: Effect of different concentration of BA and IAA on

micropropagation of Gardenia jasminoides. Mesopotamia J.of Agric., 38 (2): 1 14.

7) Duru, M., Öztürk, M., Uğur, A., Ceylan, Ö., 2004: The constituents of essential oil and

in vitro antimicrobial activity of Micromeria cilicica from Turkey. Journal of

Ethnopharmacology, 94 (1): 43 48.

8) Earle, E.D., Langhans, R.W., 1975: Carnation propagation from shoot tips cultured in

liquid medium. HortScience, 10: 608 – 610.

9) Elhag, H., 1991: In Vitro Propagation of Catha edulis. HortScience, 26 (2): 212.

10) Güllüce, M., Sökmen, M., Şahin, F., Sökmen, A., Adigüzel, A., Özer, H., 2004:

Biological activities of the essential oil and methanolic extract of Micromeria

fruticosa (L) Druce ssp serpyllifolia (Bieb) PH Davis plants from the eastern Anatolia

region of Turkey. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84 (7): 735 741.

11) Hammer, K., Laghetti, K., Pistrick, K., 2005: Calamintha nepeta (L.) Savi and

Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch cultivated in Italy. Genetic Resourses and Crop

Evolution, 52 (2): 215 219.

12) Laslo, V., Zăpârţan, M., Vicaş, S., Agud, E., 2011: Use of nodal explants in "in vitro"

micropropagation of Mentha piperita L.. Analele Universităţii din Oradea, 14: 247

251.

13) Ljajević-Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J., Soković, M., Mišić, D., Grubišić, D.,

Ristić, M., 2008: Antifungal activity of Nepeta rtanjensis essential oil. J. Serb. Chem.

Soc., 73 (10): 961 – 965.

39

14) Marin, M., Jasnić, N., Ascensão, L., 2013: Histochemical, micromorphology and

ultrastructural investigation in glandular trichomes of Micromeria thymifolia. Botanica

Serbica, 37 (1): 49 53.

15) Marinković, B., Vuković-Gašić, B., Knezević-Vukčević, J., Marin, P. D., Soković, M.,

Duletić-Lausević, S., 2003: Antibacterial activity of the essential oil of Micromeria

thymifolia and M.albanica (Lamiaceae). Bocconea, 16 (2): 1131 1134.

16) Marić, M., 1995: Kultura biljnih tkiva. Draganić, Beograd.

17) Mišić, D., Grubišić, D., Konjević, R., 2006: Micropropagation of Salvia brachyodon

through nodal explants. Biologia planetarium, 50 (3): 473 476.

18) Morales, V., 1991: El genero Micromeria Bentham (Labiateae) en la Peninsula Iberica e

Islas Baleares. Anales Jard. Bot. Madrid, 48: 131 – 156.

19) Murashige, T., Skoog, F., 1962: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays

with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497.

20) Nešković, M., Konjević, R., Ćulafić, LJ., 2003: Fiziologija biljaka. NNK - International,

Beograd.

21) Oluk, E.A., Çakır, A., 2009: Micropropagation of Origanum sipyleum L., an endemic

medicinal herb of Turkey. African Journal of Biotechnology, 8 (21): 5769 5772.

22) Pattnaik, S., Chand, P.K., 1996: In vitro propagation of the medicinal herbs Ocimum

americanum L. syn. O. canum Sims. (hoary basil) and Ocimum sanctum L. (holy basil).

Plant Cell Rep, 15 (11): 846 850.

23) Rahman, M. M., Ankhi, U. R., Biswas, A., 2013: Micropropagation of Mentha viridis L.:

An aromatic medicinal plant. International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 4: 2926

– 2930.

24) Rasool, R., Kamili, A., Ganai, B., Akbar, S., 2009: Effect of BAP and NAA on Shoot

Regeneration in Prunella Vulgaris. Journal of Natural Sciences and Mathematics,

Qassim University, 3 (1): 21 26.

25) Ristić, N., Palić, R., Kitić, D., Stojanović, G., 1997: The fatty acids from some plants of

Micromeria genus. Facta universitatis, 1 (4): 53 56.

26) Saha, S., Dey, T., Ghosh, P., 2010: Micropropagation of Ocimum kilimandscharicum

Guerke (Labiatae). Acta biologica Cracoviensia, 52 (2): 50 – 58.

40

27) Slavkovska, V., Couladis, M., Bojović, S., Tzakou, O., Pavlović, M., Lakušić, B., Jancić,

R., 2005: Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria Bentham

from Serbia and Montenegro. Plant Systematics and Evolition, 255: 1 – 15.

28) Tatić, B., Blečić, V., 2002: Sistematika i filogenija viših biljaka. Zavod za udžbenike i

nastavna sredstva, Beograd.

29) Vinterhalter, D., Vinterhalter, B., 1996: Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.

Axial, Beograd.

30) Vladimir-Knežević, S., Jurišić-Grubešić, R., Kalođera, Z., Blažević, N., 2005: Diuretični

učinak eteričnog ulja vrste Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch. Knjiga sažetaka, Treći

hrvatski kongres farmacije, Zagreb.

31) Zielinska, S., Piatczak, E., Kalemba, D., Matkowski, A., 2011: Influence of plant growth

regulators on volatiles produced by in vitro grown shoots of Agastache rugosa (Fischer &

C.A.Meyer) O. Kuntze. Plant Cell Tiss Organ Cult, 107: 161 – 167.

32) Šavikin, K., Menković, N., Zdunić, G., Tasić, S., Ristić, M., Stević, T., Dajić-Stevanović,

Z., 2010: Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oils

of Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch., M. dalmatica Benth., and Satureja

cuneifolia Ten. and Its Secretory Elements. Journal of essential oil research, 22 (1): 91-

96.

33) Šilić, Č., 1979: Monografija radova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria

Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije. Zemaljski muzej Bosne i

Hercegovine, Sarajevo.

41

Biografija kandidata

Manić Branislav je rođen 17.02.1989. godine u Pirotu. Osnovnu školu ,,8. septembar“ u

Pirotu završio je 2004. godine sa Vukovom diplomom. Iste godine upisao je Gimnaziju u Pirotu,

prirodno-matematički smer. Nakon završetka srednje škole, 2008. godine upisao je osnovne

akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu Univerziteta u Nišu, Departman za

biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završio je 2011. godine sa zvanjem ,,biolog“.

Iste godine upisao je master akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-

matematičkog fakulteta u Nišu, smer - Biologija. Master akademske studije završio je 2014.

godine sa zvanjem ,,master biolog“.

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Бранислав Манић

Ментор, МН: Драгана Стојичић

Наслов рада, НР: Микропропагација биљке Micromeria thymifolia (Scop.)

Fritsch

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2014.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

49 стр., 11 слика, 4 табеле, 1 хистограм

Научна област, НО: биологијa

Научна дисциплина, НД: биологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria thymifolia, аксиларни пупољци, BA, IAA

УДК 581.165.7:582.929.4

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch је вишегодишња биљка из фамилије Lamiaceae,

позната по својим ароматичним својствима и коришћењу у медицинске сврхе. У

овом раду испитан је утицај регулатора растења на индукцију и издуживање

аксиларних пупољака, као и на продукцију биомасе ове биљке. Коришћена је МS

подлога са додатком различитих концентрација цитокинина - BА и ауксина - IАА.

МS подлога са додатком 30 μМ BA и 0,57 μМ IАА била је најпогоднија за индукцију

аксиларних пупољака, док је њихова највећа просечна дужина забележена на

експлантатима гајеним на подлози са 1 μМ BА и 0,57 μМ IАА. Највећа просечна

свежа маса забележена је на експлантатима гајеним на МS подлози са додатком

30 μМ BА и 0,57 μМ IАА, док је највећа просечна вредност суве масе била на

експлантатима гајеним на подлози са додатком 1 μМ BА и 0,57 μМ IАА.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан,

ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Branislav Manić

Mentor, MN: Dragana Stojičić

Title, TI: Micropropagation of Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2014.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

49 pages, 11 figures, 4 tables, 1 histogram

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: biology

Subject/Key words, S/KW: Micromeria thymifolia, axillary buds, BA, IAA

UC 581.165.7:582.929.4

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch is a perennial herb in the family Lamiaceae,

known for its aromatic properties and use for medical purposes. In this work, the

influence of growth regulators, on the induction and axillary bud elongation were

tested, as well as the biomass production of the plant. We used MS medium

supplemented with different concentrations of cytokinins - BA and auxins - IAA. MS

medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA was the most suitable for the

induction of axillary buds, while their longest average length observed in the medium

with 1 μM BA and 0,57 μM IAA. The highest average fresh weight was observed on

MS medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA, while the highest value of

dry weight was on the base with the addition of 1 μM BA and 0,57 μM IAA.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1