Analisis Filogenetik GenNukleokapsid Protein Virus Tetelo

Isolat Bali

1. Zahrina Nur Laela (4401412020)2. Shella Aprilia C.Z (4401412021)3. Ros Setiani (4401412040)4. Futikhatul Fitriana (4401412043)

Rombel 2 Pendidikan Biologi

Mikromol (Filogenetik)

Semakin dekat => Semakin dekat kekerabatan

Filogenetik

Mikromolekul

Komposisi dasar nukleotida dari DNA bakteri=> komposisi DNA G (Guanine) dan C (Cytosine) dari sumber tunggal

selalu sama, sebagaimana A (Adenine) dan T (Thymine).

Keberadaan C + G menandakan bakteri memiliki kekerabatan yang

dekat

Kloning, Sikuensing dan Analisis Filogenetik Gen

Nukleokapsid Protein Virus Tetelo Isolat Bali-1/07

Anak Agung Ayu Mirah Adi1, I Made Kardena1, Nyoman Mantik Astawa2,Ketut Santhia Adhy Putra3, Yoshihiro Hayashi4,Yasunobu Matsumoto4

Laboratorium Patologi, 2.Laboratorium Virologi Fakultas Kedokteran HewanUniversitas Udayana, Jln. P B Sudirman Denpasar BaliTelepon:(0361) 223791;email:mirah638@yahoo.co.id

Newcastle disease virus (NDV)

Tetelo (Newcastle disease )

1. Diamplifikasi dengan RT-PCR

2. Kloning

4. Sikuensing dan Analisis Filogenetik

3. Perbanyakan dan Purifikasi Plasmid Rekombinan

METODE YANG DIGUNAKAN

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

RNA Virus Tetelo diisolasi

transkripsi balik yakni RNA virus tetelo diubah menjadi cDNA

Produk PCR yang didapat kemudian diamati dengan elektroforesis

divisualisasikan dengan larutan ethidium bromide dan dimurnikan

Pemurnian DNA dan reaksi PCR A overhang

Potongan gel yang berisi pita sasaran 540 bps dimurnikan dengan mempergunakan wizard SV gel and PCR clean up system

Pemurnian DNA

PCR A overhang

menambahkan ujung adenin dilakukan pada mesin thermocyler pada suhu 72derajat C selama 10 menit

Hasil reaksi ini dinamai dengan DNA A+

Kloning

proses ligasi (ligation) yaitu penempelan DNA ke dalam vektor (plasmid) untuk membuat plasmid rekombinan

Fragmen DNA A+ ditempelkan kedalam vektor pT7BlueT

proses transformasi yaitu proses transfeksi vektor ke dalam sel kompeten.

Vektor plasmid yang telah diligasi dengan DNA insert (sisipan) kemudian ditransfeksikan ke dalam sel kompeten E coli (Nova Blues singles-Novagen) dengan metode Heat shock

Ada 2 Tahap

PCR E coli dan Pembuatan Replika Memilih 8 koloni yang berwarna putih

Masing-masing disubkultur untuk membuat replika pada lempengan agar LB

Dihomogenkan dengan mesin thermocycler

Produk PCR di elektrophoresis(20 menit) dan diwarnai dengan ethidium bromide

Sementara itu lempengan agar replika diinkubator

PCR mixture

Memilih koloni pada plate agar LB replika

Inkubasi pd Shaker inkubatorDikultur pada falcon tube

(5ml media LB)

Purifikasi plasmid rekombinan

Mengukur konsentrasi PR

Disimpan pada suhu – 20 C

Sekuensing dan Analisis Filogenetik

Dilabel CEQ TM , DTCS Quick start kit,

Dipilih 3 klon plasmid rekombinan

dijajarkan dengan sekuens nukleotida gen NP representasi NDV strain virulen dan avirulen

Analisis filogenetik dengan program MEGA 4

Disekuensing dengan CEQ – 200x L DNA Analysis system

Hasil= sekuens nukleotida

nukleokapsid protein (NP) -> purifikasi -> ligasi -> vektor pT7BlueT (plasmid pUC19) -> host E.colii

gen NP isolat Bali-1/07, berada dalamsatu cluster dengan isolat virulen dari genotip

VII seperti: Guangxii, KBNP dan Sterna denganprosentase kemiripan sikuen nukleotida

berturut-turut sbb; 92%,91,4% dan 91 %.

KESIMPULANIsolat Bali-1/07 berada dalam satu kelompok dengan isolat virulen dari genotipe VII. Prosentase kemiripan sikuen nukleotida berturut-turut sbb; 92%, 91,4% dan 91 %.

Isolat ini berada dalam kelompok yang berbeda dengan virus ND strain avirulen/vaksin seperti B1/47 dan LaSota/46.

Daftar Pustaka

Adi, Anak Agung Ayu Mirah dkk. 2011. Kloning, Sikuensing dan Analisis Filogenetik Gen Nukleokapsid Protein Virus Tetelo Isolat Bali-1/07. Jurnal Veteriner. Vol. 12 No. 3: 173-179.

Jawetz, Melnic, & Adelberg’s. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Salemba Medika.

Triana, Evi. 2005. Analisis Filogenetik Rhizobia yang Diisolasi dari Aeschynomene spp. B I O D I V E R S I T A S. Volume 6, Nomor 4 Oktober 2005 Halaman: 233-237.

1. Apa penyebab tetelo dan bagaimana dan pencegahannya? (Iis Sutiyani)

Jawab :Penyebab dari tetelo adalah Cara pencegahan Vaksinasi yang teratur sesuai dengan program yang dianjurkan yaitu:1) Umur ayam antara Umur ayam antara 4-7 hari, vaksinasi dengan vaksin aktif melalui tetes mata

yaitu cukup tetes pada mata kiri atau kanan juga dilakukan vaksinasi inaktif yang disuntikan pada kulit leher dengan menggunakan Spuit atau spet dengan dosis 0,2-0,25 CC pada waktu yang sama.

2) Umur ayam antara 18 hari - 21 hari dilakukan vaksinasi(revaksinasi) dengan vaksin aktif galur lasota / Clone melalui tetes mata atau air minum.

3) Setelah vaksinasi kedua, vaksinasi selanjutnya dapat dilakukan pada umur ayam tiga bulan atau empat bulan atau setiap akan memasuki bulan peralihan.

Memelihara ayam dalam kandang terbatas serta menjaga kebersihan ayam, jangan memasukkan ayam luar sebelum dikarantina atau divaksin dan dipastikan tidak membawa penyakit.

2. Apabila NDS menyerang manusia, gejala apa yang muncul akibat penyakit tersebut? (Syahrizal)Jawab:

NDS (Tetelo) juga dapat menyerang manusia. Manusia dapat tertular NDV tetapi tidak memberikan gejala yang signifikan, biasanya berupa konjungtivitis (radang selaput mata).

3. Mengapa dilakukan pewarnaan dengan ethidium bromide setelah produk PCR di elektroforesis? (Windy Oktaviani)

Jawab : Karena untuk membentuk flouresensi terang pada ikatannya

dengan DNA sehingga sejumlah kecil fragmen DNA dapat difoto pada gel.