živa 6/2012 271 ziva.avcr.cz

miky proudových koridorů a šíření druhův krajině, jejich reakce na povodňovouzátěž i znečištění apod., a vůbec poprvé sesnažíme tuto dynamiku kvantifikovat. Vý -zkum měkkýšů v náplavech dosud zdale-ka neřekl své poslední slovo a zejménapokud by byl provázen i studiem dalšíchnáplavových objektů, především vytřídě-ných semen, mohl by poskytnout řadunových poznatků o přírodním dění.

5

5 Dnešní „civilizace“ se obráží i ve složení náplavů, jak dokládá náplavDunajce v národním parku Pieniny (!),který pozůstává především z plechovekpřiplavených z „kulturní“ krajiny výše proti proudu. Snímky V. Ložka,pokud není uvedeno jinak

V prvním dílu tohoto seriálu (Živa 2012,3: 104–106) jsme již uvedli, že tvorba mi -krobiálního biofilmu probíhá v několikazákladních fázích – atrakce buněk, jejichadheze, akumulace a disperze. Vznikubiofilmu však obvykle předchází vytvoře-ní pelikuly – vrstvy iontů a organickýchmolekul, které se na základě fyzikálníchinterakcí navážou na čistý povrch a usnad-ňují vazbu bakterií. Pelikula vzniká v pro-středí bohatém na organické látky (krevnířečiště, dutina ústní apod.) během něko-lika málo minut. V krevním řečišti se najejí tvorbě podílejí různé bílkoviny (např.albuminy), ionty sodíku a draslíku, glyko -proteiny (např. fibronektin) a další makro-molekuly.

Přítomnost takového povrchu zjistí vol-ně plovoucí bakterie během několika mi -nut (atrakce) a náhodně, nebo s pomocíreceptorů se začnou usazovat (fáze adhezea později akumulace). Počáteční vazba jeovlivněna elektrickými náboji vznikají -cími mezi povrchem a buňkami (tvorbavodíkových můstků), Van der Waalsovýmisilami a elektrostatickou přitažlivostí.Později se bakterie pevně přichytí (adhe-rují) za vzniku specifických vazeb. Vazbymají povahu chemickou, nebo jde o vaz-by mezi receptorem na povrchu bakteriea adhezinem (molekulou zprostředkujícípřichycení) na kolonizovaném povrchu.K pevně uchyceným bakteriím se přidáva -jí další, vznikají mikrokolonie a dochází

k jejich rozrůstání dělením i koagregací,tedy vazbou dalších bakterií k bakteriímv biofilmu. Usazené buňky produkují poly-merní látky, zejména polysacharidy, kte-ré tvoří další ze základních stavebníchsložek biofilmové vrstvy. Extracelulárníhmota a voda představují celkem asi 98 %objemu bakteriální biofilmové struktury.Do této vrstvy se také mohou vázat buňky,bílkoviny a další látky z těla hostitele.

Během hodin až dní vzniká zralý bio-film s houbovitými strukturami bakteriía exopolysacharidů, s dutinami a kanálkyumožňujícími přísun živin i do jeho hlub-ších vrstev. Na přirozených površích lid-ského těla (dutina ústní, střevní sliznice,vagina) se tvoří rozsáhlá konsorcia různýchdruhů bakterií, k nimž se mohou přidati jiné mikroorganismy (améby, kvasinkyapod.). Při kolonizaci umělých povrchův primárně sterilních částech lidského těla(jako je např. krevní řečiště) jde většinouo biofilm jednodruhový, zatímco umělépovrchy v místech s přirozenou mikrofló-rou osídlují vícedruhová společenstva.

Po dosažení určité buněčné hustoty seze zralého biofilmu začínají oddělovat buďjednotlivé buňky, nebo celé jejich shlukyi s částmi biofilmu (fáze disperze). Buňkyse uvolňují zpět do prostředí, např. dokrevního řečiště, a mohou kolonizovat dal-ší vhodné povrchy. Tím v biofilmu vznikádynamická rovnováha, která je regulovánadostupností živin, podmínkami vnějšíhoprostředí, ale i buňkami samotnými, např.systémem quorum-sensing (hlavní regulač-ní a komunikační prostředek bakte riálníhospolečenstva, blíže Živa 2012, 3: 104–106),nebo produkcí látek, které degradují poly-merní struktury biofilmu a napomáhají takuvolnění buněk. Existuje řada různých fo -rem a struktur biofilmu, které vznikají v zá -vislosti na vlastnostech okolního prostředí(např. pH, hydrodynamické síly), přítom-nosti a dostupnosti živin a kyslíku a po dlezastoupení konkrétních druhů bakterií.

Rezistence k antimikrobiálním látkámJe známo, že mikrobiální buňky v biofilmujsou mnohonásobně odolnější k antimi -krobiálním látkám (biocidům) než plank-tonické buňky stejného kmene. Zvýšená

Veronika Holá

Mikrobiální biofilmy3. Biofilmová společenstvalidského těla a biofilmové infekce

Z celkového množství všech buněk obsažených v lidském těle je těch skutečnělidských pouze desetina (okolo 1013). Celých 90 % tvoří buňky naší přirozenémikroflóry, tedy bakterie (řádově 1014). Velká část z nich se vyskytuje v biofil-mu. Na druhou stranu v této formě rostou i bakterie patogenní, způsobující one-mocnění různých orgánů a orgánových soustav. Biofilm jako forma existencemikrobů je tedy z pohledu medicíny velmi důležitý. Mikroorganismy v biofilmuse totiž vyznačují zvýšenou odolností vůči obranným mechanismům hostitelea schopnost růstu bakterií v biofilmu je též spojována s vysokou přirozenourezis tencí těchto společenstev k účinkům antibiotik, což se z hlediska klinickémikro biologie považuje za důležitý faktor virulence společný všem biofilmům.Biofilmy se tak pro svou schopnost přichytit se k povrchům implantovanýchchirurgických náhrad a zařízení nebo k poškozeným tkáním mohou stát příči-nou přetrvávajících infekcí.

rezistence biofilmů k biocidům je proká-zána in vitro (účinnost biocidů byla o jedenaž čtyři řády nižší oproti buňkám plankto-nickým) a je významnou komplikací u in -fekcí implantátů a cizích těles in vivo.

Biofilmová rezistence se projevuje ně -kolika základními mechanismy, které seliší v závislosti na druhu mikroba schop-ného tvořit biofilm, a aplikované antimi -krobiální látky. Rozdíl je též v tom, jakéreakce se projevují v počáteční fázi růstua jaké u plně vyzrálého a starého biofilmu.Mezi nejvýznamnější a nejvíce prostudo-vané mechanismy biofilmové rezistencepatří: fyzikální a chemické bariéry brání-cí průniku látek do biofilmové vrstvy, sní-žená rychlost růstu buněk v biofilmu, akti-vace univerzální stresové odpovědi, vznikurčité rezistentní skupiny buněk (perzis-torů), vznik fenotypu specifického probiofilm a exprese pravděpodobných genůrezistence. Všechny tyto faktory se v bio-filmu spíše vzájemně doplňují, než působíjednotlivě. Roli hrají i „klasické“ me cha -nismy bakteriální rezistence (jako např. sní-žená propustnost buněčné stěny, enzyma-tická inaktivace antimikrobiální látky, jejíaktivní vylučování z buňky nebo modifi-kace či nahrazení cíle jejího účinku), kterése projevují i v planktonických bakteriál-ních kulturách. Ve vícedruhovém biofilmuje problematika rezistence ještě složitější.� Snížený průnik látek do biofilmuBiofilmová vrstva může tvořit bariéru dvě-ma způsoby – jako síto nepropouštějícívětší molekuly, nebo jako donor volnýchvazebných míst. Mechanismus síta po -skytuje účinnou ochranu proti velkýmmolekulám imunitního systému hostitele,jako jsou např. antimikrobiální proteiny –lysozymy a komplement. Poměrně silněhydratované polyanionické polysacharidya glykoproteiny biofilmové vrstvy působíjako výměníky iontů a adsorbují kationtyantimikrobiálních látek. Ve většině přípa-dů však polysacharidová bariéra postuptěchto látek pouze zpomalí – příklademjsou fluorované chinolony. I tato časováprodleva však může zvýšit efektivitu obra-ny bakteriální buňky, např. enzymatickédegradace pronikající antimikrobiální látky.� Pomalý růst biofilmu a heterogenita mikrobiální populacePři nasycení určitého prostředí bakterieminebo při úbytku živin dochází v bakteriálnípopulaci ke zpomalení růstu, které obec-ně provází zvýšená rezistence k antibioti-kům cíleným na rostoucí bakterie. Někte-ré studie prokázaly, že růstová rychlostmikrobů (např. Staphylococcus epidermi-dis) v biofilmu silně ovlivňuje jeho citli-vost – čím rychlejší růst, tím dříve tatoantibiotika buňky inaktivují.

Ve vyzrálých biofilmech lze pozorovattrojrozměrnou strukturu s mnoha typymikroprostředí, jež se liší např. osmolari-tou, přísunem živin či buněčnou hustotou.Gradienty živin, různé odpadní produktya četné signalizační faktory, to vše přispívák heterogenitě. Proto se nabízí předpoklad,že i mikrobiální společenstvo biofilmu jeheterogenní a jednotlivé buňky nebo jejichpopulace žijí v rozdílných podmínkách,a tedy i rostou různou rychlostí.� Vznik perzistorůJiž v r. 1944 publikoval Joseph W. Biggerv časopise The Lancet článek o svých vý -

zkumech s účinkem penicilinu na bakterie.Jedním z poznatků bylo, že při vystavenístafylokokové kultury účinkům penicilinupřežila malá část buněk, které Bigger nazvalperzistoři. Počet perzistorů v bakteriálnípopulaci odhadl na 10-6 a ukázal též, žejejich kultivací a množením vzniká popu-lace nerozeznatelná od té původní – po -dobně citlivá k inhibici růstu penicilinema se stejným procentem nových perzisto-rů. Tyto pokusy se podařilo zopakovat seshodnými závěry i u jiných bakterií – pře-žívající perzistoři jsou tedy pouze fenoty -povou variantou původního kmene. V řaděstudií byla přítomnost těchto buněk identi -fikována i v biofilmech.� Univerzální odpověď na stresBakterie odpovídají na nedostatek živina na jiné environmentální stresy synté-zou sigma-faktorů. Ty regulují transkripcigenů, jejichž produkty zmírňují účinkystresu – aktivuje se mechanismus univer-zální odpovědi založený např. na změněpropustnosti buněčné membrány pro anti-mikrobiální látky.� Vznik biofilmového fenotypuJiž před 10 lety se objevila v lékařské mikro -biologii teorie, že primární adheze bakte-rií k povrchu může vést k indukci neborepresi genů, které mohou dále ovlivnitmnohé fyziologické odpovědi. DNA micro -array analýzy ukázaly, že se exprese genůmezi biofilmovými a planktonickými buň-kami skutečně liší, např. u Bacillus subtilis

o 6 %, u Pseudomonas aeruginosa o 1 %.V případě S. epidermidis se odlišnostprojevuje mimo jiné expresí specifickýchoperonů (tedy skupin genů vytvářejícíchfunkční jednotky se společnou regulací).Taková indukce genotypu specifickéhopro biofilm pak může vést k aktivaci me -chanismů potlačujících účinky antimikro-biálních látek.� Další mechanismyRole systému quorum-sensing v biofilmo-vé rezistenci k antimikrobiálním látkámnení dosud zcela jasná. Svou roli hrajestáří a zralost biofilmové vrstvy, čemužodpovídají i klinické zkušenosti s léčboubiofilmových infekcí. V případě časnýchinfekcí bývá např. v ortopedii odstraněníložiska s ponecháním protézy úspěšnějšínež u pozdních pooperačních infekcí,které měly čas se určitou dobu vyvíjet.

V biofilmu se také díky úzkému kon-taktu buněk mohou snáze šířit plazmidya extrachromozomální úseky DNA. Právěplazmidy a transpozony kódují rezistencik řadě antimikrobiálních látek. Četnostitohoto horizontálního přenosu (Živa 2006:1–6) genetické informace jsou v biofilmuo několik řádů vyšší než v planktonickékultuře stejné bakterie.

Biofilm v lidském těle� Přirozená mikroflóraNa různých místech našeho těla se mikro-organismy udržují často právě ve forměbiofilmu. Jde o biofilmy na povrchu sliz-nic, zubní skloviny a pokožky, které jsouvystaveny vlivu mikrobů z vnějšího pro-středí. Naše přirozená mikroflóra je za nor-mální situace nejen nepatogenní, ale na -opak působí pozitivně jako další stupeňobrany před patogeny (colonisation resis -tance, tedy obrana tím, že je povrch již osíd-len zástupci přirozené mikroflóry). Přiro-zená mikroflóra brání kolonizaci nejenpasivně, ale i aktivně – produkcí látek, kte-ré využívá na svou ochranu, a tím pomáhácelému organismu. Příkladem může býttvorba bakteriocinů (látek bílkovinnéhocharakteru s antibiotickým účinkem) nebotřeba kyseliny mléčné produkované lakto-bacily na vaginální sliznici. Pozitivnímefektem přirozené mikroflóry v trávicímtraktu je rozklad látek, které naše vlastníenzymy nejsou schopny štěpit, stejně jakoprodukce látek, které si lidské tělo samovyrobit nedokáže (např. vitamín K). Pokudse však naruší rovnováha mezi makroorga -nismem a přirozenou mikroflórou (např.oslabením odolnosti hostitele, přílišnýmnamnožením těchto mikrobů), mohou býti zástupci přirozené mikroflóry příčinouvzniku zánětu v daném místě, nebo další-ho šíření mikrobů v těle hostitele.

Vlastnosti a složení přirozené mikro flóryse u jedince mění s věkem. Ekologicképodmínky se též mění při každém, i drob-ném lékařském zákroku v dané části těla,např. při vytržení zubu nebo jakékoli ope-raci. Dočasné změny ve složení a stabilitěmikrobiálních společenstev (zejména trávi-cího traktu) mohou být ovlivněny i frekven-cí a typem stravy či léčbou antibiotiky.� Dutina ústníZdaleka ne všechny mikroorganismy, kterése dostanou do dutiny ústní, jsou schopnyji kolonizovat. Nacházejí se zde různé bio-topy, které jsou osídleny rozdílnými mi -

ziva.avcr.cz 272 živa 6/2012

1

1 Rozložení subgingiválního zubníhoplaku (části zubu zanořené do dásně).Podle: M. Gajardo (2009) kreslilaM. Chumchalová, upraveno2 Vrstva smíšeného biofilmu s bakterie-mi Staphylococcus epidermidis a kvasin-kami Candida parapsilosis u pacientas katétrovou sepsí. Buňky jsou přichycenyna povrchu katétru a tvoří mikrokolonieobalené extracelulární hmotou. Díkymikroskopickému průkazu biofilmu sepodařilo odhalit oba původce ještě v denodběru a zahájit cílenou léčbu o dva dnydříve než při konvenčních technikáchkultivace. Barveno toluidinovou modří.Foto: V. Holá a F. Růžička

povrchzubu

plak souvisejícíse zubem

plak souvisejícís epitelem

apikálníplak

bakterieplaku proniklé doměkkýchtkání

bakterie na povrchukosti a jejíresorpce

živa 6/2012 273 ziva.avcr.cz

krobiálními společenstvy lišícími se ne -jen zastoupením mikrobů, ale i složenímextracelulární složky biofilmu. Zcela od -lišnými podmínkami pro kolonizaci se vy -značují povrchy sliznic, např. rtů, vnitřnístrany tváří (bukální sliznice), měkkéhopatra nebo jazyka, a povrch zubů. Na zu -bech najdeme různé typy biofilmu mezičástí zanořenou do dásně (subgingivální,obr. 1) a korunkou (supragingivální). Udá-vá se, že se v dutině ústní vyskytuje ca 700bakteriálních druhů. Na jejích sliznicíchse vytváří biofilmové společenstvo slože-né zejména z různých druhů viridujícíchstreptokoků a zástupců rodu Neisseria, alei dalších bakteriálních rodů, např. Haemo -philus a Lactobacillus. Na jazyku se přidá -vají anaerobní bakterie, např. rody Veillo -nella, Fusobacterium a Bacteroides.

Jedním z nejznámějších biofilmů je zub-ní plak. Při jeho tvorbě dominují zpočátkustreptokoky, které v průběhu několika dnůnásledují tzv. sekundární a terciární kolo-nizátoři. Mezi typické sekundární koloni-zátory patří aktinomycety a Fusobacteriumnucleatum, které slouží jako „most“ meziStreptococcus gordonii a pozdními kolo-nizátory, např. S. salivarius, zástupci roduPrevotella, Propionibacterium, Porphyro-monas, Veillonella aj. Kongregace jednot-livých bakteriálních druhů je zprostřed-kována specifickými adheziny na jejichpovrchu. Plně vyzrálého biofilmu mohoumikroby dosáhnout zejména na špatněpřístupných místech, např. v mezizubníchprostorech. Do tohoto stavu se zubní plakdostává v průběhu 2–3 týdnů, kdy se ustálícharakteristický biofilm složený z poměr-ně stálého společenstva bakterií. Zubníplak přirozené mikroflóry je důležitou sou-částí ochranných mechanismů hostitele –pomáhá bránit kolonizaci zubní sklovinyexogenními mikroorganismy. Na druhoustranu je však hlavní příčinou onemocně-ní dásní a závěsného aparátu zubů (paro-dontopatie) a rozhodujícím faktorem přitvorbě zubního kazu. Jeho mineralizacívzniká zubní kámen.

Ve formě biofilmu k zubní skloviněadherují i bakterie považované za nejvý-znamnější původce zubního kazu – strep-tokoky ze skupiny S. mutans. Tyto bakte-rie syntetizují ze sacharózy polysacharidyglukany a fruktany lepivé konzistence,

které slouží nejen jako pomůcka pro sil-nější přilnutí k zubní sklovině, ale i jakozásobárna živin pro období bez dostateč-ného přísunu cukrů ve stravě. Tyto strepto -koky jsou zároveň schopny rychle tvořitz cukrů kyseliny a množit se i za nízkéhopH, přičemž hodnot pH nutných k demi-neralizaci skloviny dosahují rychleji nežostatní bakterie. Zaostává za nimi i rodLactobacillus považovaný z hlediska vzni-ku zubního kazu za druhou silně rizikovouskupinu. Vezmeme-li však v úvahu výraz-né rozdíly v mikrobiálním složení zubníhoplaku odebíraného ze stejného místa v du -tině ústní v různé době, je velmi neprav-děpodobné, že za vznik a rozvoj zubníhokazu mohou pouze tyto dvě malé skupinybakterií. Je známo, že prakticky všechnymikroby zubního plaku mají kvůli svýmbiochemickým vlastnostem kariogenní úči-nek (mohou vyvolávat vznik kazu).

Zubní plak i další biofilmy ústní dutinyjsou zdrojem bakterií, které mohou být pří-činou biofilmových infekcí krevního řečiš-tě, vzniku endokarditidy (zánětu srdečnínitroblány), infekce cévních implantátůa katétrů. Do krevního oběhu se dostávajípři invazivních výkonech, ale i při drob-ných poraněních, např. při čištění zubů.� Trávicí soustavaV trávicím traktu se přítomná přirozenámikroflóra přímo účastní na jeho funkci.Bakterie okyselují střevní obsah, produku-jí vitamíny (např. B12 a K) a blokují pře-měnu dusičnanů na dusitany. Samotnákolonizace střevní sliznice nepřetržitěstimuluje imunitní systém střeva.

Sliznici střeva pokrývá stále se obměňu-jící hlenová vrstva, která je spolu s přise-dajícími patogeny odstraňována peristal-tikou. Kolonizace střeva bakteriemi je tedyvelmi dynamický proces – přítomnost jed-notlivých druhů a kmenů bakterií se můžečasto měnit (kolonizace versus vytlačová-ní). Ve střevní mikroflóře bylo detekovánokolem tisíce bakteriálních druhů a zhru-ba 10 tisíc kmenů. Zástupci přirozené mi -kroflóry využívají k přežití v tomto eko-systému zejména adhezinů a bičíků, díkynimž jsou schopni udržet se i ve vazkémhlenu. Navíc biofilm se podle některýchpublikovaných prací nenachází pouze nastřevní sliznici, ale i na částečkách potra-vy, které střevem procházejí.

Řada zástupců přirozené mikroflóry trá-vicího traktu patří mezi striktní anaeroby(v tlustém střevě až 99 %), kam řadímenapř. zástupce rodů Bacteroides (ca 30 %všech bakterií ve střevě), Fusobacterium,Clostridium, Peptococcus, Peptostreptococ -cus, Ruminococcus a Eubacterium. Dalšíbakterie se ve střevě vyskytují v menší míře,jako např. enterobakterie (Escherichia coli,rody Klebsiella a Enterobacter aj.), zástupcibifidobakterií (např. Bifidobacterium bi -fidum), laktobacilů (Lactobacillus acido -philus, L. bulgaricus, L. casei aj.) neboEnterococcus faecalis.� KůžeNa kůži vytváří biofilm zejména Staphylo -coccus epidermidis. Usazuje se mezi buň-kami dlaždicového epitelu do hloubky 5–10vrstev a kolonizuje mazové žlázy a vlasovéa chlupové míšky. Jeho přítomnost snižu-je riziko kolonizace kůže např. S. aureus,který by zde našel rovněž vhodné pod-mínky, ale ve srovnání se S. epidermidispředstavuje pro člověka větší riziko. Kro-mě S. epidermidis se na kůži vyskytujíi další druhy stafylokoků, korynebakteriaa některé streptokoky.� Dýchací traktI při nerovnováze v mikrobiálním spole-čenstvu horních cest dýchacích se projevu-jí infekce způsobené mikroorganismy, kteréjsou jinak součástí přirozené mikroflóry.Jde např. o Moraxella catarrhalis, Haemo -philus parainfluenzae a Neisseria me -ningitidis. Z nepatogenních bakterií v hor-ních cestách dýchacích najdeme zejménaviridující streptokoky. U určitého procen-ta jedinců přetrvávají v biofilmu horníchcest dýchacích i patogeny, např. S. aureusči H. influenzae. Po většinu času nevyvo-lávají klinické známky onemocnění, kterézpůsobují, k propuknutí nemoci docházíopět až při narušení rovnováhy v organis-mu (předchozí virovou infekcí horníchcest dýchacích apod.). I kolonizace pato-geny, jako je S. aureus, může být pro jedin-ce výhodná – byla prokázána souvislosts přítomností S. aureus v horních cestáchdýchacích a nižším výskytem hnisavýchstreptokokových angín.� Urogenitální traktPřirozenou a nejpočetnější složkou vagi-nálních biofilmů jsou laktobacily, z nichpak zástupci komplexu L. acidophilus

2

(zejména L. iners, L. crispatus, L. gasseri,L. jensenii). Laktobacily produkují kyse linumléčnou snižující okolní pH (na hodnotypH 3,8–4,2), peroxid vodíku a bakterioci-ny. Kyselinu uvolňují fermentací glyko-genu, jímž jsou vyplněny povrchové buňkyvrstevnatého poševního epitelu – glyko-gen se tam hromadí pod vlivem ženskýchpohlavních hormonů estrogenů a vaginál-ní buňky tak vlastně podporují bakteriepro svou ochranu. Uvedené tři faktory spo-lečně výrazně omezují růst patogenní mi -kroflóry. Ve vaginálním biofilmu se dálenacházejí např. i bifidobakterie, entero -koky, peptokoky, peptostreptokoky a dalšíaerobní i anaerobní bakterie.

Biofilmové infekce a související onemocněníBakterie ve formě biofilmu způsobují řaduchronických a obtížně léčitelných one-mocnění. Růst ve formě biofilmu pro něpředstavuje významný faktor virulence –již bylo řečeno, že usnadňuje kolonizaciumělých i přirozených povrchů, ale takéchrání před imunitním systémem a účin-kem antibiotik. U biofilmových infekcí sečasto nedají splnit Kochovy postuláty (sou-bor čtyř pravidel prokazujících příčinnousouvislost mezi patogenem a onemocně -ním) a dá se proto obtížněji prokázat, žebiofilm je původcem dané choroby. V ně -kterých případech lze nanejvýš říci, žemezi přítomností mikroorganismů v bio-filmu a onemocněním je určitý vztah – ně -kdy těsnější (např. u cystické fibrózy nebou postižení chlopní při endokarditidě),jindy slabší (např. u chronické prostatitidyči zánětu středouší).

Umělé povrchyČasté používání implantátů a plastovýchpomůcek v medicíně je jednou z hlavníchpříčin rostoucího významu biofilmů. Tytopovrchy představují svými fyzikálně-che-mickými vlastnostmi vhodný podklad provznik biofilmu.� Krevní řečištěMezi nejzávažnější biofilmová onemoc-nění patří infekce umělých implantátůzavedených do krevního řečiště, tj. pře-devším katétrů, cévních protéz, umělýchchlopní nebo kardiostimulačních elekt-rod. Jen v USA je každoročně zavedenovíce než 15 milionů katétrů, v Německu1,75 milionu katétrů za rok (infekce vznikáu 1–5 %), implantováno více než 70 ti -síc kardiostimulátorů (infikováno 1–3 %)a více než 18 tisíc umělých chlopní (infiko -váno 0,4–6 %).

Ke komplikacím spojeným s vysokouúmrtností (kolem 25 %) patří infekce umě-lých chlopní. Riziko jejich vzniku se tedypohybuje v rozmezí 0,4–6 % a nejčastěj-šími původci jsou stafylokoky. Z dalšíchbakterií se podílejí, podobně jako u infek-cí nativních chlopní, viridující strepto-koky, enterokoky a S. aureus, méně častogramnegativní bakterie a kvasinky (rodCandida).

U katétru bakterie kolonizují jak vnější,tak vnitřní povrch. Nejčastěji bývají izo-lovány S. epidermidis a jiné koaguláza -negativní stafylokoky (50–70 %), dále pakS. aureus, enterokoky, gramnegativní ne -fermentující tyčky (pseudomonády aj.),enterobakterie (E. coli, Klebsiella pneumo -

niae aj.), kvasinky rodu Candida a další.Biofilm na katétrech se stává zdrojem dal-ší infekce a může vést až k sepsi a selháníživotně důležitých orgánů. Zároveň sez ložiska uvolňují jednotlivé buňky, shlukybuněk i infikované tromby (krevní sraže-niny) a po odnesení krevním tokem mohouzaložit nová ložiska zánětu. Relativně vy -soká úmrtnost v těchto případech (5–25 %)je spojena právě se vznikem sepsí a dalšíchkomplikací a s jejich obtížnou léčbou.� Močové cestyInfekce močových cest spojené s dlouho-dobou katetrizací jsou velmi častým problé -mem způsobeným biofilmy. Jejich výskytsouvisí s délkou doby zavedení katétru.U katétrů zavedených méně než 7 dnůbývá infikováno 10–50 % pacientů, přikatetrizaci delší než 28 dní se infekce roz-víjí prakticky vždy. Katétry jsou pro bakte -rie přímým vstupem až do močového mě -chýře a výrazně jim usnadňují kolonizacimočových cest. Dochází pak k dalším kom-plikacím, např. k ucpávání katétrů krys-talickými nánosy bakteriálního původu,tvorbě močových kamenů a pyelonefriti-dám (zánětům ledvin). Podle některýchstudií může toto zvýšené dráždění močo-vých cest vést až k nádorovému bujení.

Mezi nejčastější kolonizátory močovýchkatétrů patří Enterococcus faecalis, E. coli,Klebsiella pneumoniae, druhy rodu Pro -teus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylo-coccus epidermidis, Enterobacter aero -genes a další. Velmi často se vyskytujísmíšené bakteriální populace. Bakterie sena povrch katétrů mohou dostat již přijejich zavádění, migrací z okolních tkánípo jeho povrchu, nebo mohou postupovatvnitřkem katétru, např. z vaků na shro-mažďování moči. Přítomnost některýchbakterií (P. aeruginosa, druhy rodu Pro -teus a další) vede ke zvyšování pH moči.Při vysokých koncentracích vápníku a dal-ších minerálů pak dochází k mineralizacibiofilmu a vzniku bakteriálních močovýchkamenů (ty tvoří zhruba 15–20 % všechmočových kamenů).� Kloubní náhradyNejčastějšími patogeny infekcí kloubníchnáhrad jsou stafylokoky. Velmi dobré pod-mínky se nacházejí v oblasti mezi vlastníkloubní náhradou a kostí, která je samot-ným zákrokem traumatizována. Přichycenía pomnožení bakterií napomáhá pokrytíumělých ploch fibrinem a dalšími bílkovi -nami a přítomnost hematomů z traumati-zované tkáně. Infekce kloubních náhradvedou k jejich uvolnění a nefunkčnosti,bakterie mohou navíc přestoupit do okolníkosti a tkání.� Další umělé povrchyK dalším povrchům s rizikem vzniku in -fekce patří např. kontaktní čočky, kde seuplatňují zejména koagulázanegativní sta-fylokoky, Pseudomonas aeruginosa a zá -stupci rodů Proteus a Candida. Tyto biofil-my mohou obsahovat i améby (např. z roduAcanthamoeba). Dochází k chronickémudráždění rohovky, případně k rozvoji zá -nětu.

Rovněž kolonizace povrchu nitrodělož-ních tělísek může vést až k zánětům dělo-hy a následnému zánětu v oblasti pánve.Nitroděložní tělíska bývají pravidelněosídlena aktinomycetami a bakteriemipoševní mikroflóry, u žen trpících záněty

byly v tomto biofilmu prokázány také beta-hemolytické streptokoky, S. aureus, E. colinebo anaerobní bakterie.

Bakteriální biofilm se vytváří i na mno-ha dalších umělých pomůckách a implan-tátech, jako např. na kanylách zaváděnýchdo průdušnice (P. aeruginosa, K. pneumo-niae aj.), postiženy mohou být i hlasivko-vé protézy (streptokoky, stafylokoky, kan-didy), dialyzační katétry, drény ran, zubníprotézy apod.

Biofilmy měkkých tkáníDobře prostudovaná je role bakterií Burk-holderia cepacia a Pseudomonas aeru -ginosa vyvolávajících těžké záněty plicu nemocných cystickou fibrózou. Sníže-ná samočisticí schopnost sliznic v dol-ních cestách dýchacích u těchto pacientůvede k jejich vyšší náchylnosti k infekcím.Dochází ke kolonizaci dýchacích cest, B. ce -pacia a P. aeruginosa produkují velkémnožství biofilmové polymerní matrix, ježchrání bakterie před fagocytózou i účinkyantibiotik. Bakterie dlouhodobě přežívajív plicní tkáni, a tak se rozvíjí těžký chro-nický zánět plic, který špatně reaguje naléčbu a vede až ke smrti nemocného.

Mezi závažné biofilmové infekce přiro-zených povrchů patří infekční endokardi -tida. Její výskyt se pohybuje kolem 3,6 pří-padů na 100 tisíc obyvatel za rok a býváobvykle způsobena streptokoky (viridují-cí streptokoky, pneumokoky a S. bovis),stafylokoky a enterokoky, méně často pakněkterými gramnegativními bakteriemia kandidami. Původci těchto endokarditidbývají součástí běžné mikroflóry sliznicnebo kůže a do krevního oběhu se dostá-vají porušením kožní nebo slizniční barié -ry. Významným předpokladem pro vznika rozvoj bakteriální endokarditidy je takésrdeční vada – poškozený endokard, nakterý se bakterie přichytí. Biofilm omezujesprávné fungování srdeční chlopně a dáleji poškozuje. Zároveň přítomnost jeho lo -žiska v krevním řečišti je příčinou chronic-ké sepse (neléčená může během několikaměsíců vyústit v úmrtí pacienta). Uvolněnéinfikované tromby mohou vyvolat emboliinebo rozsev infekčního procesu do jinýchčástí krevního řečiště.

Růst bakterií ve formě biofilmu se podílítaké např. na zánětu středouší nebo pro-staty. U těchto infekcí, zejména v jejich

ziva.avcr.cz 274 živa 6/2012

3

chronické fázi, často není možno mikrobaprokázat klasickými kultivačními postupya záněty neodpovídají na léčbu. Přestov biopsiích lze pozorovat zřetelné biofilmyobsahující mikrokolonie bakterií uvnitřpolymerní matrix a přítomnost mikrobůlze prokázat i pomocí molekulárně-biolo-gických technik. U bakteriálních zánětůstředouší nacházíme jako nejčastějšíhopůvodce Haemophilus influenzae, Strepto-coccus pneumoniae, Moraxella (Branha-mella) catarrhalis, Streptococcus pyogenesnebo Staphylococcus aureus, řidčeji paki další bakterie. Zánět prostaty, který je

v časných fázích dobře léčitelný antibioti -ky, může přecházet do chronické prostati -tidy, kdy je léčba již mnohem obtížnější.Jako nejčastější původce se zde uplatňujeE. coli, ale příčinou mohou být i další en -terobakterie (rody Klebsiella, Enterobacter,Serratia), P. aeruginosa, Staphylococcusepidermidis a další koagulázanegativnístafylokoky nebo E. faecalis. Méně častojsou prokázanými původci prostatitid i zá -stupci rodů Corynebacterium, Mycoplas-ma, Bacteroides, Chlamydia či Gardnerella.

Kromě výše uvedených zánětů středo -uší a prostaty biofilmy ztěžují léčbu téžnapř. u zánětů hltanu a patrových mandlí(faryngitidy a tonzilofaryngitidy). Nejčas-tějším původcem bakteriálních faryngitida tonzilofaryngitid je u dětí i u dospělýchS. pyogenes a lékem volby je tedy penici-lin. Přestože dosud nebyl zaznamenán je -diný případ kmene S. pyogenes rezistent-ního k penicilinu, selhává tato léčba až vetřetině případů. Jedním z možných vysvět-lení, které je podloženo rovněž opakova-nými experimenty, je právě schopnost růs-tu kmenů S. pyogenes ve formě biofilmu,kde bakterie odolávají mnohem vyššímkoncentracím antibiotik.

Problematika ranZvláštním případem jsou infekce ran. Ze -jména v chronických a špatně se hojícíchranách lze prokázat komplexní mikro biálníspolečenstva. Biofilm nacházíme již 10hodin po infekci etiologickým agens. Nej-dříve se objevují zástupci aerobních nebofakultativně anaerobních bakterií, např.S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa,Stenotrophomonas maltophilia, Entero-coccus faecalis, Proteus mirabilis, E. colinebo druhy rodů Corynebacterium, Strep-tococcus, Klebsiella apod., o něco pozdějianaerobní bakterie, např. rody Bacteroides,Peptostreptococcus, Peptococcus nebo Pre-votella.

DovětekVšechny biofilmové infekce znamenají propacienty i celý systém zdravotnické péčedelší a složitější léčbu, delší rekonvales-cenci a vyšší náklady. Proto by prevencevzniku biofilmových infekcí měla být ne -zbytnou součástí péče o pacienta.

živa 6/2012 275 ziva.avcr.cz

7

54

6

3 Barvení karbolfuchsinem lze v rutin-ní mikrobiologické diagnostice použítk detekci biofilmpozitivních mikrobůz tekutých kultur. Kmen (nebo klinickývzorek) se kultivuje 24 hodin ve zkumavce v nutričně bohatém bujónu,poté se stěr z vnitřní stěny nanese napodložní sklíčko a fixuje. Nátěr se barvíza tepla koncentrovaným karbolfuchsi-nem a oplachuje roztokem modré skalice. Buňky získají sytě fialovou barvu, biofilmová vrstva (v okolí sytě fialových buněk) barvu růžovou. Na snímku kmen Pseudomonas aeruginosa tvořící biofilm4 Mikroskopický snímek biofilmu Staphylococcus epidermidis, barvenoalciánovou modří, která se selektivněváže na polysacharidy. Stafylokoky rostoucí ve formě biofilmu produkujívelké množství extracelulárních poly -sacharidů – na obr. dobře patrná polysacharidová biofilmová vrstva obklopující shluky stafylokokovýchbuněk. 5 Mikroskopický snímek kvasinkovéhobiofilmu (typická je tvorba pseudohyf)barveného alciánovou modří. Kvasinkové buňky rostoucí ve formě biofilmu produkují pouze malé množstvíextracelulární hmoty, která je těsněobklopuje. Snímky V. Holé, není-li uvedeno jinak6 Plně vyzrálý biofilm je komplexnítrojrozměrná struktura s mnoha odlišný-mi typy mikroprostředí, což přispívák heterogenitě v mikrobiální populaci

biofilmu. Různorodost je možné zviditelnit barvením akridinovou oranží. Výsledná barva je totiž ovlivněnapoměrem RNA/DNA. Buňky s vysokýmrelativním obsahem RNA (rychle rostoucíbuňky) se barví do oranžova až oranžovo-červena, buňky s nízkým relativnímobsahem RNA (pomalu rostoucí) do zelena až žlutozelena. Na snímkuobarvený biofilm bakterie Staphylo -coccus epidermidis. Foto: V. Holá a F. Růžička7 Zástupci rodu Proteus jsou schopnipohybu po povrchu močového katétru.Na snímku laboratorní test k prokázánítéto schopnosti u konkrétního typu katétru. Kmen bakterie se naočkuje na jednu polovinu agaru a po 24hodinovékultivaci se hodnotí schopnost bakteriedostat se na druhou polovinu Petrihomisky přes můstek tvořený testovanýmkatétrem. Foto: V. Holá a T. Peroutková