mier romero

VII Simposio Internacional sobre la Flora Silvestre en Zonas Áridas

Biotecnología Vegetal

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REGENERACIÓN IN VITRO DE CARNEGIEA GIGANTEA (ENGELM.) BRITT. & ROSE (CACTACEAE).

Mier Romero Germán1, González-Caballero Octavio1, Estrada Galván Bárbara1, Chávez-Ávila Víctor M1. y Mata-Rosas Martín2

.

1Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México.

2

[email protected]; [email protected] Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero, Instituto de Ecología A.C. Jalapa, Veracruz.



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RESUMEN

Carnegiea gigantea (Engelm.) Britt. & Rose (Cactaceae), “sahuaro”, especie columnar nativa de Sonora (México) y Arizona (Estados Unidos). A pesar de la destrucción de su hábitat y del saqueo con fines comerciales, no está catalogada en la NOM-059-ECOL-2001 y sólo se encuentra en el Apéndice II de CITES como toda la Familia Cactaceae. No se cultiva y debido a su lento y largo ciclo de vida su conservación requiere un procedimiento efectivo como la propagación por Cultivo de Tejidos, por lo que este estudio explora la regeneración de plantas in vitro. 50 semillas fueron sembradas en una mezcla de tepojal y tierra negra (1:1), fotop. 12h luz, 32ºC; asimismo, 50 semillas más, fueron sembradas asépticamente en medio MS 50%; fotop. 16h luz, 25±2°C. Algunas semillas germinaron dentro de la primera semana de cultivo. Al término de 90 días se evaluó la germinación: ex vitro fue del 48%; en tanto in vitro fue de 44%. Un segundo lote de 100 semillas escarificadas con H2SO4

Plántulas de 9 meses, germinadas in vitro fueron seccionadas en ápices, bases de tallos, cotiledones y raíces que fueron sembrados en medio MS 50% con ANA y BA en diferentes concentraciones. Después de 3 meses de inducción ápices y bases de tallos regeneraron brotes adventicios de las areolas.

fue sembrado in vitro. La germinación fue más acelerada, a los 15 días habían germinado 30%, a los 60 días 56%.

Palabras clave: Cultivo de Tejidos Vegetales, Carnegiea gigantea, Cactaceae, germinación in vitro



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INTRODUCCIÓN

La gran diversidad de nuestro país es el resultado de la combinación de variaciones

topográficas y climáticas, que al mezclarse, crean un mosaico de condiciones ambientales y

microambientes. Asimismo, México, es una “zona de transición” o convergencia entre las

floras y faunas neártica y neotropical, además de tener una larga y compleja historia

geológica de aislamiento en algunas regiones, lo que ha favorecido la evolución de un gran

número de endemismos (Flores-Villela y Gerez, 1994; Soberón y Llorente, 1993; Toledo,

1988). Como resultado, México ocupa el tercer lugar en biodiversidad en el mundo. El

segundo en reptiles (717 especies), el tercero en mamíferos (449), el cuarto en anfibios

(284); el 32% de la fauna es endémica (Williams-Linero et al., 1992) y el cuarto lugar en

diversidad de especies vegetales, resguardando cerca del 10% de la flora del mundo, con un

estimado de 22 411 especies (Magaña y Villaseñor, 2002).

Las cactáceas constituyen un grupo de plantas nativas del continente americano, ya

que se extienden ampliamente por todo el Nuevo Mundo. Durante su evolución se han

diversificando en un gran número de especies y formas de vida. Se estima de forma

conservadora, que las cactáceas incluyen cerca de 110 géneros y 2000 especies, de las

cuales México posee 52 géneros, es decir, el 47% del total reconocido para la familia y 850

especies silvestres, lo que equivale a cerca del 42% de las especies de la familia

(Mandujano et al., 2002; Arias, 1993; Olalde, 2001).

Las cactáceas columnares se encuentran taxonómicamente dentro de la tribu

Pachycereeae, una de las nueve Tribus que conforman a la Subfamilia Cactoideae,

existiendo aproximadamente 170 especies, de las cuales 80 se encuentran en México

(Casas, 2002).

Carnegiea gigantea, los saguaros ó sahuaros, como comúnmente se les conoce, son

las cactáceas columnares típicas de la región del Pinacate, en Sonora, aunque cabe

mencionar que su distribución geográfica está compartida con los Estados Unidos, ya que



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esta especie también se puede encontrar en el desierto que corresponde al estado de Arizona

(Arias, 1997). Otro estudio arroja datos de que se distribuye al suroeste y centro de Arizona

y raramente al sureste de California, Estados Unidos. En Sonora, se distribuye al noroeste

sobre la planicie costera hasta Mesa Masiaca, al sureste de Navojoa (Martin et al., 1998).

También es frecuente en Isla Tiburón (Turner et al., 1995).

Es notable resaltar que esta especie no se encuentra catalogada como amenazada

por la NOM-059-ECOL-2001, ni por la UICN, a pesar de que se sabe del excesivo saqueo

por parte de coleccionistas y personas dedicadas al comercio internacional de especies

ornamentales (Robbins, 2003). Sólo se encuentra catalogada como toda la Familia

Cactaceae en el Apéndice II de CITES.

El género comprende una sola especie, la cual es una cactácea columnar de entre 5-

14 m de altura y 65 cm de diámetro, de tallo simple ó con escasas ramas laterales que salen

de diversas alturas. Costillas de 11-25, obtusas de 1-3 cm de ancho. Areolas de color

pardo, en tallos juveniles distantes entre sí por 2.5 cm; en ejemplares adultos la distancia

disminuye y presentan abundante fieltro de color pardo. Acúleos radiales pueden ser 12 ó

más y las centrales de 3-6 con 7 cm de longitud; 15-30 en las areolas floríferas, situadas

cerca del ápice de los tallos. Son de color pardo y se van volviendo grises a medida que la

planta envejece. Flores infundibuliformes de 8-13 cm de largo, situadas en la parte

subapical del tallo con tépalos cortos, de color blanco ceroso, las anteras de color amarillo,

con olor a putrefacción. Son nocturnas y permanecen activas hasta media mañana

dependiendo de la temperatura ambiental. Fruto oblongo-elipsoide, es una baya de color

rojo por dentro y verde por fuera, la parte de adentro es comestible, escamas distantes, con

1-3 acúleos ó ausentes. Semillas numerosas de 2000-2500 por fruto, de color negras, casi

esféricas de 1.8-2 mm de diámetro (Fig. 1) (Paredes et al., 2000).



176

Fig. 1. Carnegiea gigantea. A) Ejemplares adultos, B) Flores, C) Frutos y D)

Semillas.

Los métodos de propagación y almacenamiento in vitro pueden ser empleados como

parte de los programas de conservación ex situ de diferentes especies incluyendo las que se

encuentran en peligro de extinción. En los últimos años, el cultivo de tejidos vegetales ha

emergido como una herramienta para lograr la propagación de varias especies vegetales, ya

que se mantiene una rápida y continua producción de plantas a partir de solo un pequeño

fragmento de tejido, por tanto el potencial de esta técnica en la recuperación de especies

amenazadas resulta trascendente (Malda et al., 1999).

El Cultivo de Tejidos Vegetales es una rama de la Biología que basada en la

totipotencialidad celular ha establecido un conjunto de técnicas que hacen posible dividir a

un organismo en sus bloques constituyentes y cultivar asépticamente in vitro: protoplastos,

células, tejidos, órganos, embriones y plántulas en condiciones controladas (medio

nutritivo, luz, temperatura, atmósfera, pH, reguladores de crecimiento, etc.), permitiendo al

investigador variar las condiciones de cultivo y/ó el tipo de explante y llegar a dirigir las

respuestas morfogenéticas y biosintéticas de las células, pudiendo lograr una gran variedad

de objetivos, entre ellos: almacenamiento ó conservación de germoplasma, nuevos métodos

de hibridación y/ó mejoramiento, investigación básica, propagación, erradicación ó

recuperación de plantas libres de patógenos, esta técnica ha sido empleada en diferentes

especies vegetales con diversos usos (Chávez, 1993).

A B C D



177

Las cactáceas representan un grupo taxonómico con un alto número de especies en

peligro de extinción. Éstas, por lo general presentan lento crecimiento, condiciones muy

especificas y esporádicas de floración, producción de semillas, germinación y producción

de descendencia; por ello los métodos convencionales de propagación llevados a cabo

mediante semillas, vástagos, esquejes o injertos, en muchas ocasiones resultan inadecuadas

en especies que no producen brotes, que tienen una tasa de germinación baja y/o lento

crecimiento (Clayton et al., 1990). Algunos investigadores han propuesto el uso del cultivo

de tejidos para propagar especies de esta familia (Mauseth, 1979; Johnson y Emino, 1979).

Estas técnicas representarían una alternativa para el estudio y conservación de

germoplasma valioso (Smith et al., 1991), así como para resolver el problema de satisfacer

la demanda en aquellas especies de interés comercial y de esta forma reducir las presiones

que afectan y merman a las poblaciones silvestres (Fay, 1994).

Con base en la literatura, se puede mencionar que las cactáceas ofrecen amplias

perspectivas para su cultivo in vitro, además de que los resultados obtenidos hasta ahora,

permiten vislumbrar aplicaciones de impacto para la propagación masiva de estas plantas y

su rescate del riesgo de extinción (Rubluo, 1990). El presente estudio exploró la

germinación de C. gigantea, así como el potencial regenerativo de distintos explantes

somáticos de plántulas.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Material vegetal y desinfección

Antes de someter a las semillas al tratamiento de desinfección, se estratificaron a 4 OC durante 24h. Posteriormente se enjuagaron con agua destilada. Se desinfectaron 100

semillas con una solución jabonosa por 5 min, sin enjuagar se sumergieron en alcohol

70% (v/v) 1 min, y se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio (blanqueador

doméstico) al 30% (v/v) 25 min; 50 de las semillas se enjuagaron 3 veces con agua

destilada esterilizada y se sembraron asépticamente en medio de cultivo MS (1962), el

resto de las semillas se enjuagaron de igual manera y se sembraron en una charola con

sustrato esterilizado.



178

Germinación in vitro y ex vitro de las semillas.

Se sembraron in vitro 50 de las semillas, en frascos GerberR

con tapas de plástico

que contenían medio MS (1962) 50%, sacarosa 30g/l, pH 5.7, y agar 8.5 g/l. Las semillas

se incubaron a 25 ± 2°C; fotoperiodo 16h luz/8h oscuridad.

Las semillas restantes se sembraron ex vitro en una charola translúcida que

contenía una mezcla cernida de tepojal y tierra negra 1:1 esterilizada. La charola se

mantuvo cerrada, a una temperatura de 32°C, bajo el fotoperíodo natural del día en la

Ciudad de México.

Inducción de explantes de plántulas in vitro

Al término de 9 meses de iniciados los cultivos, aquellas plántulas germinadas in

vitro que tenían una longitud en su tallo entre 0.5 a 1.5 cm les fueron disectados los

cotiledones, raíces, ápices (0.3 a 0.5 cm) y la parte restante del tallo fue dividida

longitudinalmente (bases de tallos) (0.4 a 1.5 cm long). Los explantes fueron sembrados en

medio de inducción MS 100%, pH 5.7, suplementado con ANA/BA (0, 0.1, 0.5, 1.0/0, 0.5,

1.0 1.5, 2.0 mg/L). Los explantes permanecieron en medio de inducción durante 2 meses y

fueron incubados a una temperatura de 25 ± 2°C; fotoperiodo 16h luz/8h oscuridad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Germinación de semillas

El paso inicial para un proceso de regeneración in vitro es el de obtener un cultivo

aséptico de material vegetal. El uso de semillas hace posible utilizar un fuerte proceso de

desinfección superficial, asegurando que las plántulas germinadas in vitro estén libres de

contaminación microbiana (George y Sherrington, 1984). Hay reportes que indican que los



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tejidos jóvenes tienen una mayor capacidad regenerativa en comparación con los presentes

en un individuo adulto (Vyskot y Jara, 1984).

El criterio que se siguió para determinar la germinación de las semillas fue la

emergencia de la radícula. Al término de los primeros 7 días de haber iniciado los cultivos

ya habían germinado 2 semillas (4%); a los 12 días 4 semillas, 8% de germinación. Las

plántulas medían 3-6 mm de longitud, sin tomar en cuenta la raíz y los cotiledones.

Presentaron una coloración rojiza probablemente debido a la presencia de betalaínas

(Fig.3).

Bajo condiciones ex vitro a los 4 días de haber sido sembradas, 4 semillas (8%)

habían germinado; y a los 12 días ya habían germinado 21 semillas (42%). Las plántulas

fueron más grandes que las germinadas in vitro con 6-9 mm de longitud y de un color verde

brillante (Fig. 2).

Cabe resaltar que en ambas condiciones, las semillas germinaron de manera

asincrónica durante un periodo de 90 días. A pesar de que todas las semillas fueron

sometidas al mismo tratamiento de estratificación y de desinfección, fue clara la diferencia

tanto en el porcentaje de germinación como en las características morfológicas de las

plántulas germinadas en las dos condiciones de cultivo. El mayor porcentaje de

germinación así como las mejores características morfológicas en el cultivo ex vitro

pudieron deberse a la temperatura de incubación (32°C), ya que fue mayor en comparación

con la temperatura de incubación in vitro 25°C ± 2°C.

Las cactáceas tienen un amplio intervalo de respuesta a la temperatura, para la

mayoría de las especies los rangos van de 17 a 34ºC, con valores óptimos frecuentemente

de 25ºC (Nobel, 1980). Hay reportes para la germinación de semillas de C. gigantea que

indican una temperatura de 25°C como la óptima y una exposición directa a la luz (Alcorn

y Martin, 1974; Steenbergh y Lowe 1977), sin embargo, en condiciones naturales la

temperatura en el día es mayor, superando los 30°C incluso llegando hasta los 40°C. Por tal

motivo, una mayor temperatura pudo promover una germinación y un crecimiento más



180

rápido en las semillas de C. gigantea.

Tabla 1. Porcentajes de germinación de semillas de C. gigantea sembradas ex vitro

(32ºC) e in vitro en medio MS 50%, a una temperatura de 25±2ºC, fotoperiodo de 16 h

luz y 8 de oscuridad. Resultados después de 30, 60 y 90 días.

Condiciones de

siembra

30 días 60 días 90 días

In vitro

16% 40% 44%

Ex vitro

44% 46% 48%

Figura 2. Plántulas de C. gigantea germinadas ex vitro. A) 7 días, B) 60 días), C) 120

días.

A) B) C)

A) C)

D)

B)



181

Figura 3. Plántulas de C. gigantea germinadas in vitro. A) 7 días, B) 60 días, C) 120

días.

1b. Inducción de explantes de plántulas in vitro.

Durante el tiempo de inducción, se observaron varias respuestas por parte de los

explantes, la oxidación fue evidente en todos los tratamientos, afectando de manera letal a

los cotiledones y en menor grado a los ápices y bases de tallos (Gráfica 1, Fig. 4). La

coloración del medio o los explantes que se tornan de color café o negros, es un fenómeno

frecuente observado durante el establecimiento de los cultivos con el propósito de la

micropropagación. Cuando los tejidos sufren algún daño, como el causado por la acción del

corte de los explantes, comúnmente se liberan varios compuestos que se oxidan y causan

que el tejido se oscurezca (Preece y Compton, 1991).

Gráfica 1. Porcentaje de oxidación. Resultados al término de 2 meses de iniciados los

cultivos



182

Figura 4. Apariencia de los distintos tipos de explante de C. gigantea sembrados en

medio MS después de 1 mes de inducción. A) Ápice, donde eventualmente hubo la

formación de raíces; B) Base de tallo, donde se observa la formación de callo en la

zona de corte y C) Cotiledón oxidado en su totalidad.

Los explantes que tuvieron una respuesta morfogenética, presentaron dentro de los

primeros dos meses de cultivo y aún en medio de inducción, un crecimiento y su coloración

pudo ser café o mantuvieron una coloración verdosa, de aspecto húmedo. Aparecieron

sobre su superficie estructuras nodulares, a manera de pequeños domos que crecieron, se

elongaron y en su ápice llegaron a diferenciar areolas con espinas, evidenciando la

formación de brotes adventicios (Fig. 5).

La mayor formación de brotes se dio a partir de los ápices, seguidos de las bases de tallos y

se observó que correspondían a concentraciones altas de reguladores de crecimiento

(Gráfica 2).

A) C) B)



183

Gráfica 2. Formación de brotes por tipo de explante. Resultados al término de 3 meses

de iniciados los cultivos

Fig. 5. Regeneración in vitro de brotes adventicios en A) Ápices y B) Bases de tallo de

Carnegiea gigantea después de 3 meses de cultivo.

La germinación de las semillas no arrojó grandes diferencias numéricas entre las

condiciones in vitro y ex vitro, sin embargo, deben valorarse que ex vitro las plántulas

tuvieron un desarrollo más rápido y de aspecto más normal que in vitro. Por otro lado, las

plántulas in vitro hicieron posible la disponibilidad de material vegetal aséptico que

permitieron la regeneración de muchas más plántulas que las obtenidas directamente de las

semillas. El CTV demostró ser una viable alternativa en el conocimiento de esta especie,

para su conservación y abre la posibilidad de un aprovechamiento que evite seguir

ANA/BA mg/l

0.5/1.5 0/2.0

1.0/2.0 0.1/2.0



184

agotando las poblaciones silvestres de este recurso en peligro de extinción.

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