Microscopia electrónica de criofractura

La técnica de la criofractura fue desarrollada de manera temprana en la década de 1950 por el científico Russell Steere, sin embargo no fue hasta 1960, cuando Daniel Branton comienza investigar mediante criofractura y a exhibir las imágenes obtenidas, demostrando que poseían la claridad necesaria para convencer al mundo científico de su utilidad en la investigación. Esta técnica llegó a su auge como fuente de investigación celular en las décadas del 70 y 80, al proporcionar avances en la comprensión de la organización estructural de membranas y organelos imposibles de identificar mediante el uso de otras técnicas existentes.

HISTORIA

La criofractura es una técnica utilizada en microscopia electrónica, consistente en la congelación de muestras biológicas con nitrógeno líquido (-195,8°C), seguido de un corte o fractura y el sombreado metálico o recubrimiento con carbono de la superficie de la muestra. Luego procediendo a la eliminación del tejido biológico subyacente al sombreado y la observación de esta réplica de la muestra mediante el uso de un microscopio electrónico.

Existen 4 pasos esenciales para la realización de una replica por criofractura:

1. Congelación rápida de la muestra:Esto se logra sumergiendo rápidamente la muestra (previamente tratada con un crioprotector como el glicerol para evitar la formación de cristales de hielo en el interior de la muestra) en nitrógeno líquido, a una temperatura cercana a los -195,8 °C.

TÉCNICA

2. Fractura de la MuestraSe lleva a cabo en condiciones de vacío, bajo una cuchilla de diamante o romperla en una dispositivo de bisagra. También existe la variante simple de la técnica, en que la facturación se efectúa en una atmósfera de nitrógeno liquido, a una presión de 3 ATM con el uso de una cuchilla de afeitar.

TÉCNICA

TÉCNICA

3. Fijación de platino - carbonoSe procede a evaporar una fina capa de carbono - platino sobre la muestra. Así, las características topográficas de la superficie congelada se convierten en variaciones en el espesor de la capa de platino depositada sobre la muestra.

TÉCNICA

TÉCNICA

TÉCNICA

4. Limpieza de la réplicaPosteriormente a la fijación, la muestra se lleva a presión atmosférica y se le deja calentar a temperatura ambiente. El material biológico restante en la replica es eliminado mediante el empleo de una solución de ácido crómico, hipoclorito de sodio u otros agentes limpiadores.

TÉCNICA

TÉCNICA

A la izquierda se muestra una imagen parcial de una célula vista por criofractura, en la imagen vemos la membrana (m), el citoplasma (c) y el núcleo (n). A la derecha se muestra una

ampliación de la membrana plasmática, esta imagen sugiere que las proteínas de membrana -que se observan como granos- se hayan integradas en una superficie constituida por fosfolípidos.

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap308.htm

http://biol1c201.blogspot.mx/2009_05_01_archive.html

http://www.actamicroscopica.org/uploads/Suplementos/Vol_18_Supp_A_2009_Memorias_CONVEMI_2008/orales/materiales/tecesp/CITES3.pdf