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Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Microbiología parcial 2.
Citoplasma Bacteriano (protoplasma).
1. Parte de la célula que está dentro de la membrana
citoplasmática.
2. Tiene una consistencia parecida a un gel: compuesto de
agua, enzimas, sustancias nutritivas, desechos, y gases.
3. Contiene estructuras celulares: ribosomas, cromosoma y
plásmidos.
4. La matriz citoplasmática son las sustancias dentro de esta
membrana, excluyendo el material genético.
5. Material genético. En bacterias el 90% es expresable y 10 % es regulatorio (no se expresa); en levaduras el
70% es expresable, mientras que en el ser humano, sólo el 3%.
Cromosoma (ADN) disperso en el citoplasma bacteriano (También es llamado nucleoide). Puede ser
circular o lineal (como en actinomicetos o streptomyces).
El ADN circular se encuentra superenrollado y se organiza en dominios mediante las proteínas like
histonas (por ejemplo H, HU, IHF, H1, HLP1, P), para formar hebras infraenrolladas.
Existen enrollamientos positivos (hélice sobreenrollada, que se protege contra radiaciones) y
negativos (infraenrollada, es más común).
En el proceso de enrollamiento, participan las enzimas topoisomerasas que tuercen la hebra.
Ejemplos de topoisomerasas: ADN-girasa (clase II): Es blanco de algunos antibióticos, está presente
en bacterias y muchas arqueas. Topoisomerasa I: elimina el superenrollamiento y regresa la cadena al
estado relajado
Plásmidos. Son porciones de material genético extracromosómico, en general son circulares pero existen
algunos lineales.
Pueden ser unicopia (una sola replicación por ciclo celular que se coordina con la replicación
genómica) o multicopia (pueden reproducirse varias veces, independientes a la reproducción de la
bacteria).
Algunos de ellos contienen genes que proporcionan características diferentes a las bacterias, como
el plásmido F (plásmido conjugativo) que puede transferirse a otras bacterias mediante la conjugación,
tiene una región denominada región Tra que se excreta por el pili sexual mediante un sistema de secreción
tipo IV, éste sólo es recibido una vez y se vuelve una bacteria F+.
Otros, llamados plásmidos episomales, pueden integrarse al cromosoma y se replican bajo control
de éste. Existen plásmidos que se combinan con el ADN cromosómico llamados transposones. Secuencias
de inserción. Transposasas transposones(elaborada). Normales y Replicativos. Modelo de círculo rodante.
Endonucleasa (enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos).
Griffith: Ciertos péptidos activan señales de la célula.
Transcriptasa reversa: se utiliza en eucariontes para copiar una parte de ADN.
Bacteriófagos: abren canales.
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Un transposón o elemento genético transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de
manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una célula, un fenómeno conocido
como transposición. En este proceso, se pueden causar mutaciones y cambio en la cantidad de ADN
del genoma. Anteriormente fueron conocidos como "genes saltarines" y son ejemplos de elementos
genéticos móviles.
El transposón modifica el ADN de sus inmediaciones, ya sea arrastrando un gen codificador de
un cromosoma a otro, rompiéndolo por la mitad o haciendo que desaparezca del todo. En algunas
especies, la mayor parte del ADN basura (hasta un 50% del total del genoma) corresponde a
transposones.
A diferencia de los provirus, los transposones se integran en el ADN celular en lugares bien
determinados. Su existencia fue propuesta por Barbara McClintock en el maíz, sin embargo, su
existencia no se demostró hasta mucho más tarde en bacterias. Por ello fue laureada con el Premio
Nobel en 1983.
Los plásmidos son herramientas muy importantes en los estudios de biología molecular, se emplean
como vectores (agentes generalmente orgánicos que sirven como medio de transmisión de un organismo a otro) de genes
para la transformación de células. Los eucariontes no contienen plásmidos, pero pueden insertárseles para que produzcan
una determinada proteína.
Teniendo un plásmido, se puede insertar material genético a través de enzimas de restricción.
ARN. En la célula existen tres tipos principales de ARN (ácido ribonucleico).
•ARNm (mensajero)
•ARNt (de transferencia)
•ARNr (ribosomal). S son unidades de
sedimentación que no son aditivas, sino que se
les aplica una centrifugación y las subunidades
corren diferente que el ribosoma completo.
Los polisomas o polirribosomas son
los ribosomas unidos a una molécula de ARN
mensajero y que se encuentran sintetizando los
péptidos. Son visibles al microscopio electrónico.
http://www2.uah.es/biomodel/model1j/rna-prot/ribosoma.htm
6. A diferencia de los eucariotes, en las bacterias no existen compartimentos, por los que los procesos
de replicación de ADN, transcripción (ADN → ARNm) y traducción (ARNm + ARNt + ARNr →
Proteínas) ocurren en el citoplasma.
7. Inclusiones citoplasmáticas. (presentes en algunos microorganismos)
Gránulos de polisacáridos. Unidades de glucosa que son reserva de carbono y energía que se forma en un
exceso de carbono.
Glucógeno. Almidón(se identifica con lugol: solución yodo-yodurada).
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Inclusiones lipídicas. Aparecen en varias especies de Micobacterium, Bacillus,
Azotobacter (alginatos), Spirillum.
Su nombre genérico es poli-β-hidroxialcanoatos (PHA) que se forman en exceso de
carbono. Pueden observarse al microscopio electrónico de transmisión o con
colorantes solubles en aceites.
Gránulos metacromáticos (volutina). Reserva de fosfato que se ponen en evidencia con una tinción con el
azul de toluidina, al combinarse con el polifosfato da un color violeta rojizo. Este fenómeno se
denomina metacromasia.
Gránulos de azufre. Reserva de fosfato que se ponen en evidencia con una
tinción con el Bacterias quimiolitotrofas y fototróficas que oxidan el H2S a Sº, este
último forma acumulaciones refringentes y visibles al microscopio (brillan en fondo
oscuro). El Sº puede ser oxidado nuevamente para producir SO42- y las inclusiones
desaparecen.
Cianoficinas. Polímero de carbono y nitrógeno que se forma en cianobacterias
(bacterias fotosintéticas). Es el único material de reserva conocido de nitrógeno y no es
sintetizado en los ribosomas. Se tiñen con azul de metileno.
Carboxisomas. Son acumulaciones de la enzima 1,5-di fosfato
carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) empleada por los microorganismos autótrofos
para fijar CO2 mediante el ciclo de Calvin, donde se une a una pentosa y la
molécula de 6C puede ser aprovechada en el metabolismo para formar
finalmente AcCoA.
Magnetosomas. Partículas de magnetita (Fe3O4). Imparten propiedades magnéticas, lo
cual se cree orienta a las bacterias. Rodeados por una membrana.
Vacuolas de gas. Formadas por dos diferentes proteínas: GvpA (Gas Vacuole
Protein A) y GvpC. Estas vesículas permiten a los
microorganismos flotar en los sistemas acuáticos. Hay
desplazamiento vertical en una columna de agua en
respuesta a cambios ambientales (inflan las bolsitas). Las producen las cianobacterias, las
bacterias fototróficas verdes y púrpura, y algunas aqueobacterias. Parecen
como granitos de arroz.
Preparaciones microbiológicas.
http://microexpfqunam.blogspot.mx/
1. Preparaciones en fresco (microorganismos vivos). Tinciones supravitales, se introducen en el
organismo mientras las células aún se encuentran vivas, colorante muy diluido.
2. Preparaciones fijas y teñidas (microorganismos muertos)
Hongos Condiciones ácidas. Exoenzimas secretadas.
Frotis: capa delgada de muestra extendida
sobre un portaobjetos que permite el paso de la
luz a través de ella.
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Impronta. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, es como un sello y se obtienen muestras delgadas.
Gota de cultivo líquido. Se toma una gota y se coloca en portaobjetos.
Cultivo sólido suspendido.
Frotis sanguíneo. Gota en portaobjetos especial. Se usa para buscar protozoarios, cápsulas o diferenciales.
Cinta adhesiva transparente.
Hisopo. Puede ser de alginatos, algodón o un abatelenguas.
Se puede fijar con calor (frotis seco) o con solventes como etanol o metanol.
A los micobacterium puede fijárseles con solución de albúmina.
Tinciones. 1. Positivas. Se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
Simples (1 solo colorante: azul de metileno, safranina, cristal violeta, etc.) y compuestas (como
Gimsa, Wright y May Crünwald).
Pueden usarse mordentes (compuestos químicos intensificadores de color aumentando la afinidad
colorante-molécula) y decolorantes.
2. Negativas. El fondo se tiñe de oscuro para observar células o estructuras refringentes, como la
cápsula donde se usa tinta china (tinción negativa de cápsula)
3. Diferenciales. Se pueden diferenciar las distintas especies por su coloración. (ZIehl-Neelsen, Gram).
4. Selectivas. Son utilizadas para dar color y aislar partes específicas de los microorganismos
(Endosporas, Flagelo, Núcleo).
Generalmente, se mezclan los colorantes con glicerina, ya que pueden ser muy agresivos y dañar a la célula.
Colorantes.
Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; están formados por un
grupo cromóforo que es la parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar sales le
permite disociarse y combinarse. Si se rompen los enlaces conjugados, la molécula deja de tener color. Se
unen a proteínas o ácidos nucleicos.
1. Ácidos El cromóforo es el anión de la molécula (eosina).
2. Básicos. El cromóforo es el catión de la molécula (azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina).
Técnicas de tinción.
3. Tinción simple.
Frotis fijo con calor, seco.
Nos señala la forma, agrupación
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4. Tinción de cápsula (Selectiva)
Extendido, no se puede fijar al calor porque se deshidratan las cápsulas,
se seca al aire.
Muestra + tinta china o nigrosina (carbón activado)
Safranina de Gram (es mejor la safranina 0.5, más concentrada) o Cristal Violeta
(1 min)
5. Tinción de endosporas (Selectiva). Sólo se tiñe el exosporio.
Verde de maquila 5% con emisiones de vapor de agua (10 minutos). Situación estresante
para que permita el paso del colorante.
Lavar con agua
Safranina 0.5% (1minuto)
6. Tinción de flagelo. Tampoco se puede fijar el colorante con una tinción simple.
Colorante primario. Pararosa anilina (preparada en el momento).
Mordente. Acido tánico, permite la fijación, principalmente al flagelo. Se deja depositar.
Colorante de contraste. Azul de metileno.
Proteus: Vibrio con flagelo perítrico. Se cultiva en agar inclinado, se gotea
SSI (solución salina) en la parte alta y se separan dos fases (la mitad es medio de
cultivo líquido), se mantiene a 37°C. Frotis: se toma la muestra con mucho
cuidado con una pipeta Pasteur y se coloca en un portaobjetos con un
rectángulo marcado con marcador de cera, se deja secar sin calor y se procede
a la tinción.
7. Tinción de Gram.
Colorante primario. Cristal violeta 1% en sol. de oxalato de amonio al 0.85% (1 min).
Penetra en las células, en G- no pasa a citoplasma.
Mordente. Lugol Iº/KI 1g/2g en 300 mL de agua (1 minuto). Forma complejos.
Decoloración. Etanol-Acetona 70:30 hasta eliminar el exceso de colorante para que no
se mezclen. Las G- pierden cristal violeta ya que se daña su membrana externa. Las G+ deshidratan
su pared y no permiten salir el colorante.
Colorante de contraste Safranina 0.25% (1 minuto).
Los hongos no tienen Gram, porque su pared está hecha de quitina.
8. Tinción de Ziehl-Neelsen.
Serología (anticuerpos)
PCR
Baciloscopía: es la técnica más segura para detectar
tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis).
Se toma la primera expectoración del día.
Neutralizar ácido.
Se deja secar una gota de muestra (frotis) y se
sella con albúmina.
Medio de cultivo 37 °C.
Ácidos micólicos retienen la fucsina básica
(Bacterias AAR: ácido alcohol resistentes)
El azul de metileno de Loeffler, se ha dejado oxidar 6 meses.
También tiñe esporas.
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Microscopía.
Tipos de microscopías:
Metabolismo microbiano.
Suma de reacciones bioquímicas requeridas para la generación de energía (catabolismo) y el uso de ella para
sintetizar material celular a partir de moléculas del medio ambiente (anabolismo).
Las reacciones catabólicas producen energía como
ATP, el cual es utilizado en las reacciones anabólicas
para sintetizar el material celular a partir de nutrientes.
1. Enzimas: proteínas con función de catalizadores
biológicos; reducen la
energía de activación
de una reacción
química. Son
específicas para un
sustrato.
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Grupo prostético: molécula no proteica que se une a la proteína(enzima) y forma parte de su estructura.
Cofactor (inorgánico) o coenzima (orgánico): se unen a la enzima para
que aumente la afinidad por el sustrato. La enzima cuando no está
unida al cofactor se le llama apoenzima.
Coenzimas de oxido-reducción: NAD+(principal coenzima
de óxido-reduccion; acarreador de electrones), NADP+,
FAD+, FMN+.
Otras coenzimas: CoA, Vitaminas.
La actividad enzimática es la cantidad de producto formado por
unidad de tiempo. Es modificada por factores que afectan a las proteínas, por
ejemplo: la temperatura y el pH. El pH que al influir sobre las cargas eléctricas,
podría alterar la estructura del centro activo y, por lo tanto, también influirá
sobre la actividad enzimática. La temperatura elevada desnaturaliza las
moléculas proteicas por lo que los sitios activos se ven modificados. La enzima
se satura a cierta concentración del sustrato, o sea que aunque aumentemos
la concentración, no aumentará la velocidad de la catálisis puesto que se ha
alcanzado la velocidad máxima de la enzima.
INHIBIDORES ENZIMATICOS.
Un inhibidor competitivo se une a la enzima en el sitio
activo, impidiendo la entrada y unión del sustrato. Un
inhibidor alostérico modifica la afinidad de la enzima
por el sustrato, al unirse en un sitio distinto (sitio
alostérico) al sitio activo.
REGULACIÓN DE LAS VÍAS METABÓLICAS.
Regulación por producto final de la reacción ->
Cuando hay suficiente producto, éste es un inhibidor
de una enzima reguladora, generalmente la primera
para que no se siga efectuando la vía.
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REGULACIÓN DE LA EXPRESION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS (nivel genético).
Nivel transcripcional: inducción (mayor transcripción) y represión (menos transcripción)-> operones. Atenuación y
procesamiento del ARNm.
Nivel traduccional: Regulación de la síntesis de las proteínas ribosómicas. Inhibición de la síntesis de proteínas.
ATP.
Compuesto de alta energía, (los enlaces fosfato son muy energéticos y por ello son usados por medio de su formación y
rompimiento para almacenar y liberar la energía obtenida de los procesos catabólicos).
Formación de enlaces fosfato:
1. Fosforilación a nivel de sustrato. (se forma el ATP apartir de ADP + Pi, en un sitio alostérico de una enzima que
cataliza una reacción que libera energía, utilizando esa energía para crear el enlace fosfato)
2. Cadena respiratoria. (fosforilación oxidativa, que se da en la membrana plasmática de bacterias y en la
mitocondria en eucariotes, por medio de un gradiente de H+ y en algunos casos Na+, generado por el paso del electrón
disminuyendo gradualmente su potencial a través de distintos complejos proteicos, algunos de los cuales son canales
para H+ que se abren al pasar por ellos el electrón y van generando un gradiente elctroquímico de protones, los cuales
pasan a través de una proteína ATPasa que se encarga de fosforilar ADP)
(Justo debajo de ciclo de Krebs viene la explicación más completa)
3. Fotofosforilación. Los pigmentos captan la energía luminosa proveniente del sol (fotones) y la llevan al
fotosistema uno (P680), donde esta clorofila es excitada a un estado de mayor energía (mayor potencial), por lo que el
electrón va disminuyendo su potencial a medida que pasa por distintos complejos acarreadores de electrones, luego
pasa al fotosistema dos (P700), quien recibe otro fotón, quien pasa a un estado excitado y vuelve a disminuir su potencial
gradualmente, generando un gradiente electroquímico de protones a medida que el electrón pasa por las proteínas
canal con centros redox, el cual es dispersado de manera similar a la cadena respiratoria; por medio de una ATPasa.
Glucólisis
La vía de la glucólisis (EMP), se encuentra en todos los eucariotes y muchas especies de bacterias.
1. En la primera etapa hay gasto de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa
La glucosa siempre que entra a la célula es fosforilada, a manera de que no salga de nuevo por la membrana
y se encuentre en un flujo constante hacia el interior de la célula, además, esta glucosa-6-fosfato se isomeriza a
fructosa-6P y luego se vuelve a fosforilar a fructosa-1,6-bisfosfato que ya es una molécula simétrica; cada fosforilación
requiere de un ATP que done su grupo fosfato, convirtiéndose en ADP.
Fuente de energía
Luz fotótrofas
Fuente de carbono
c. orgánicos fotoheterótrofos
CO2 fotoautótrofos
Redox quimiótrofas
c. orgánicos quimioheterótrofos
Fuente de carbono
c. orgánicos quimioheterótrofos
CO2
c. inorgánicos quimilotótrofos
Fuente de carbono
c. orgánicos mixótrofos
CO2 litoautótrofos
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2. En la segunda parte se forman 4 moléculas de ATP por fosforilación a nivel de sustrato (cuando una molécula
fosforilada posee una gran energía de hidrólisis puede ceder su grupo fosfato a un ADP, para formar ATP) y 2 moléculas
de NADH (molécula reducida a la que se conoce como poder reductor que si suponemos que el ATP es el efectivo en
energía, el NADH es como un cheque que se va a canjear en la cadena de transporte de electrones por 3 ATPs por
cada molécula de NADH que cede su electrón).
Esa fructosa1,6bisP, se rompe en dos moléculas de 3 carbonos: gliceraldehído3P y 3dihidroxiacetonafosfato,
que se isomeriza a gliceraldehido3P éste gliceraldehído va sufriendo cambios conformacionales y va pasando
por intermediarios de alta energía que ceden su grupo fosfato a un ADP en 2 ocasiones; como teníamos 2
moléculas de gliceraldehído 3P por gaca molécula de fructosa1,6bisP, se generan en total 4 ATP en esta parte,
además en una de las reacciones, se libera NADH que también se multiplica por 2.
3. La ganancia total son 4 ATP y 2 NADH, y como se invirtieron 2 ATP para fosforilar la glucosa, la ganancia neta es de 2
ATP por molécula de glucosa que se convierte por esta vía en piruvato (molécula de 3 C sin grupo fosfato).
Ciclo de las pentosas fosfato
Es una vía anabólica, ya que produce los precursores de la ribosa (5 carbonos), para formar los ácidos nucleicos y
provee de eritrosa fosfato (4 carbonos) como precursor de aminoácidos aromáticos.
Se produce en está vía NADPH, la mayor fuente de electrones de la biosíntesis (NADH se le llama poder reductor, y
NADPH es un poder reductor biosintético) y varias de sus reacciones las comparte con el ciclo de
Calvín (fase independiente de la luz en la fotosíntesis, donde se utiliza la energía ganada en la fase luminosa para
formar fructosa mediante la fijación de CO2)
Mecanismo:
1. Se tienen 3 moléculas de glucosa6P que se oxidan a a 6-fosfogluconolactona (una lactona es un éster cíclico),
produciéndose 3 NADPH.
2. Las 6-fosfogluconolactonas se rompen para
formar 3 moléculas de 6-fosfogluconato, que
después son oxidadas, reduciendo 3 NADP+ a
NADPH y se descarboxilan, liberando 3
moléculas de CO2 y son transformadas así en
ribulosa5P (Ru5P) que es un azúcar de 5
carbonos (pentosa).
3. Una de esas Ru5P, es isomerizada a ribosa5P
(R5P), y las otras dos se isomerizan a xilulosa5P
(Xu5P). Dos carbonos de la Xu5P son transferidos
por medio de una trancetolasa a una R5P,
formando sedoheptulosa7P y gliceraldehído3P;
obsérvese que de dos moléculas de 5 carbonos,
se formaron una de 3 carbonos y una de 7
carbonos.
4. Se remueven 3C de la sedoheptulosa7P y se
unen al gliceraldehído3P , formando ahora un
azúcar de 4 carbonos (eritrosa4P) y un azúcar de
6 carbonos (fructosa6P)
5. Esa eritrosa recibe 2C de la otra Ru5P, resultando
otra fructosa 6P y un gliceraldehído3P.
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Vía Entner-Doudoroff
Muchos tipos de bacterias no poseen la enzima fosfofructocinasa-1 (PFK1 de la glucólisis, donde la
fructosa6P se fosforila mediante un gasto de ATP a ADP a fructosa1,6bisP).
Una vía alterna es Entner-Doudoroff, en la cual la glucosa 6P es convertida a del 6-fosfogluconato que es
deshidratado a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG) que ya se rompe en 2 moléculas e 3C (piruvato y
Gliceraldehído-3-fosfato).
Fermentación.
Se realiza en condiciones anaeróbicas.
Utiliza el NADH producido en la
glucólisis que no es canjeado en la cadena
respiratoria, ya que no hay O2 para que
acepte los electrones, por lo que emplea
como aceptor de electrones a una
molécula orgánica: reduce el ácido pirúvico
(piruvato generado) ya sea por glucólisis, vía de
las pentosas o vía de Entner-Doudoroff.
Ácido fórmico, etanol
(saccaromyces) (malta-> cerveza, frutas-> vino,
etc.), ácido láctico (lactobacillus), ácido
propiónico, (etanol-> ácido
acético)(acetobacter aceti), etc…
Madre de vinagre: consorcio
formado por levadura y bacteria; acetobacter y saccaromyces.
Acido láctico
Leche → Yogurt y queso (Lactobacillus,
Streptococcus)
Granos → Pan de centeno (Lactobacillus
bulgaricus)
Col → Chucrut o Sauerkraut (Lactobacillus
plantarum)
Carne → Salchichas (Pediococcus)
Otras fermentaciones
Ácido propiónico y CO2
Leche → Queso suizo (Propionibacterium
freudenreichii)
Acetona y butanol (Clostridium
acetobutylicum)
Glicerol (Saccharomyces cerevisiae)
Ácido cítrico → melazas (Aspergillus niger)
Metano → Ácido acético (Methanosarcina)
Ácido ascórbico → Sorbitol (Acetobacter)
Ciclo de Krebs = Ciclo de los ácidos tricarboxílicos = Ciclo del ácido cítrico
Piruvato Acetil-CoA (enzima: piruvato deshidrogenasa). La acetil-CoA también se forma por la β-oxidación de los
ácidos grasos.
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Éste piruvato es oxidado a CO2 en el CK (ciclo de Krebs).
Mecanismo:
1. El oxalacetato u ácido oxalacético es una molécula de 4C, que se une al grupo acetil (2C) para formar ácido
cítrico.
2. Éste ácido cítrico es isomerizado y oxidado, liberando NADH y CO2, por lo que nos queda una molécula de 5C,
llamada ácido-α-cetoglutárico, que es oxidado a su vez, liberando NADH, ATP y CO2 a ácido succínico (4
carbonos).
3. Éste es oxidado a ácido fumárico, liberando FADH2 (que es otro poder reductor, acarreador de electrones),
que pasa a su vez, liberando otro NADPH a oxalacetato.
Por Acetil-CoA se forman 2 moléculas de NADH, una de NADPH y una de FADH2, además de un ATP por FNS
(fosforilación a nivel de sustrato).
Fosforilación oxidativa.
Las coenzimas reducidas (como el NADH), transfieren los electrones a un aceptor Menor potencial redox
final oxidado, no directamente (como en la fermentación), sino a través de una cadena
transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado, que se
reduce.
Respiración aerobia: el aceptor final es el O2
Respiración anaerobia: el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.)
La transferencia de electrones se da en la dirección de mayor potencial redox, con
la liberación de energía libre que se va a traducir en un potencial electroquímico de
protones, cuya disipación a través de ATPasas de membrana origina ATP, conociéndose
este proceso como fosforilación oxidativa. Mayor potencial redox
Éste proceso se da en la membrana citoplasmática en procariontes, o la membrana interna en cloroplastos y
mitocondrias. La membrana interna es pues, muy selectiva y rica en proteínas que llevan a cabo el proceso de
transporte de electrones:
NADH deshidrogenasa. (complejo proteico 1) Transfiere los e- y los H+ del
NADH; es una proteína tipo canal que al pasar el electrón por ella, se abre
y hace pasar H+ contra gradiente (es un tipo de transporte activo).
Flavoproteínas. Transfieren los e- y los H+.
Proteínas de hierro y azufre. Acarreador de electrones.
Citocromos. Acarreador de electrones.
No proteínas
Quinonas. (coenzimas Q; moléculas orgánicas no proteicas, embebidas en
la membrana que también transfieren los e- y los H+).
En la fosforilación aerobia:
Los electrones pasan primero al complejo 1 (si provienen del acarreador NADH) o
al complejo 2 (si provienen de FADH2); ambos complejos donan su electrón a las quinonas, quienes lo transfieren al
complejo 3; éste lo transfiere al citocromo C (citocromo es una proteína periférica pequeña que posee un centro
redox); del citocromo C, el electrón pasa al complejo 4, que finalmente, dona el electrón al oxígeno (O2 O22-), quien
se une a dos protones H+ (que ya pasaron a través de la ATPasa hacia el citoplasma) para formar H2O. Los complejos
1,3 y 4 son canales de protones, mientras que el complejo 2 es simplemente un acarreador.
El donador es el NADH o el FADH2; el aceptor es el O2 y el producto final es H2O.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
El gradiente de protones generado, es utilizado para la síntesis de ATP mediante una proteína ATPsintasa
(ATPasa); quien posee dos complejos:
Complejo F0 responsable de la transferencia de protones a través de la membrana. Embebido en la membrana
citoplasmática.
Complejo catalítico F1 responsable de la interconversión de ADP+ Pi y ATP. Se encuentra en el lado citoplasmático.
http://www.youtube.com/watch?v=WggF8DGEmEs
La ATPasa es reversible; puede funcionar como bomba de protones contra gradiente, mediante la hidrólisis de
ATP.
En la respiración anaerobia, los compuestos que se reducen en lugar del O2 pueden ser:
Oxidación del Hidrógeno.
Las bacterias captan H2 y poseen la enzima hidrogenasa (que tiene un
cofactor de Ni 2+ en su estructura), ésta rompe la molécula en dos
átomos de H y puede estar en la membrana y generar un gradiente de
protones, así como transferir los electrones a una cadena de transporte, o
bien, estar en el citoplasma y utilizar esos hidrógenos para generar
NADPH, que junto con el CO2 entran a ciclo de Calvin para generar
carbohidratos.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Oxidación del azufre
La vía de la sulfito oxidasa es la más común en la oxidación de compuestos de sulfito.
La adenosina fosfosulfato reductasa (APS) la emplean pocos microorganismos que oxidan el sulfito.
Los electrones liberados entran a nivel del citocromo C, para formar ATP.
El NADH es producido por un flujo reverso de electrones para producir NADH necesario para la fijación del CO2
en el ciclo de Calvin.
Oxidación del azufre
1. Nitrificación paso 1: Oxidan el amonio a nitritos.
NH4+ + 1½O2 → NO2 - + 2 H+ + H2O
Proteínas de membrana citoplasmática que llevan a cabo éstas funciones:
Amonia Monooxigenasa (AMO). Proteína transmembranal; Oxida el
NH4+ a hidroxilamina (NH2OH).
Hidroxilamina oxidoreductasa (HAO). Proteína periplásmica; Oxida
la hidroxilamina a NO2- (nitrito).
2. Nitrificación paso 2:
Nitrito Oxidoreductasa (NOR). Proteína transmembranal.
NO2- + ½O2 → NO3-
3. Las bacterias nitrificantes fijan CO2 por el ciclo de Calvin. Las que
oxidan nitrito pueden ser heterótrofas con glucosa y otros
compuestos orgánicos.
Oxidación del hierro
Fe2+ + H+ + 1¼O2 → Fe3+ + ½H2O
Rusticianina. Proteína periplásmica que contiene Cobre.
Los electrones liberados entran a nivel del citocromo C, para formar ATP.
La bacteria vive en pH bajos, para obtener su gradiente de protones.
El NADH es producido por un flujo reverso de electrones para producir NADH
necesario para la fijación del CO2 en el ciclo de Calvin (Ver página 14).
Organismos Autótrofos
Organismos que utilizan el CO2 como fuente de carbono y lo pueden incorporar por diversas vías:
Ciclo de Krebs reverso. Bacterias verdes del azufre (Chlorobium)
Vía del Hidroxipropionato. Bacterias verdes (Chloroflexus)
Vía Acetil CoA reductiva. Bacterias acetogénicas (Clostridiumthermoaceticum, Acetobacterium
woodii), metanogénicas (Methanobacterium thermoautotrophicum) y autótrofas sulfato
reductoras (Defulfobacterium autotrophicum)
Ciclo de Calvin. Bacterias púrpura, cianobacterias, algas, plantas verdes, muchas bacterias
quimiolitótrofas y algunas arqueobacterias halófilas e hipertermófilas.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
La fijación es realizada por la enzima Ribulosa bifosfato carboxilasa (RubisCO) que forma cúmulos llamados
carboxisomas.
Fotosíntesis.
Consta de 2 fases:
1. Fase Luminosa: fotofosforilación
(catabólica), la energía solar es
transformada en energía
química (ver en la página 8).
2. Fase independiente de la luz:
ciclo de Calvin-Benson
(anabólica), involucra la fijación
de CO2 como fuente de
carbono para el crecimiento
celular.
Mecanismo del ciclo de Calvin:
La enzima RUBISCO fija el CO2 a
la ribulosabisfosfato (5 carbonos) y divide
la molécula en 2 moléculas de 3-
fosfoglicerato (cada una de 3C), la cual
es fosforilada y reducida a
gliceraldehido3P, que como sabemos,
es precursor de la fructosa.
Después se da la regeneración de Ribulosa bifosfato, que es el sustrato para la fijación de nuevas moléculas de CO2.
Los organismos fotótrofos convierten la energía luminosa en energía química para formar ATP.
Fotosíntesis oxigénica. Cianobacterias, algas y plantas
1
2
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Fotofosforilación acíclica
Ocurre en la fotosíntesis oxigénica. El donador de electrones es el agua y el aceptor final es una
coenzima oxidada. Hay producción de oxígeno.
Fotosíntesis anoxigénica. Bacterias púrpura, verdes y heliobacterias.
Fotofosforilación acíclica
Ocurre en la fotosíntesis anoxigénica. Los donadores de electrones son principalmente: H2S, Sº, S2O32-.
Los electrones son devueltos a la bacterioclorofila por medio de transportadores (cadena reversa).
Fotofosforilación no fotosíntetica (mediada por el pigmento
bacteriorodopsina). Halobacterium sp (arquea halofílica). Crecen en
agua de mar (salmuera) en las salinas de evaporación.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
La bacteriorrodopsina tiene siete hélices alfa que comprenden toda la sección de
la membrana. El cromóforo retinal todo-trans (púrpura) esta unido covalentemente
mediante una base de Schiff al grupo ε-amino de una Lys. Una serie de residuos Asp
y Glu, y moléculas de agua asociadas aportan la vía transmembranal para los
protones (flechas rojas).
En cianobacterias, la ficoeritrobilina y la ficocianobilina como pigmentos capturadores de la luz. Las ficobilinas están
unidas covalentemente a proteínas de unión específicas, formando las ficobiliproteínas, que se asocian en complejos
ordenados llamados ficobilisomas. Estas son las principales estructuras de captación de luz en los microorganismos. (Son
como antenas)
En estos ensamblajes los pigmentos de ficobilina se unen a proteínas específicas que forman pigmentos llamados
ficoeritrina (PE), ficocianina (PC) y aloficocianina (AP). La energía de los fotones absorbidos por PE o PC es transmitida por AP
a la clorofila a del centro de reacción mediante un proceso conocido como transferencia de excitones.
Medios de cultivo 1. Macronutrientes en los medios de cultivo
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
2. Micronutrientes en los medios de cultivo
3. Factores de crecimiento
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
4. Clasificación.
Composición
Naturales o complejos. No tienen una composición definida. Sangre, suelo, frutas, etc. o medios que contengan
ingredientes cuya composición no esté completamente definida como el extracto de levadura, peptonas o el agua
de la llave.
Sintéticos. Composición completamente conocida, componentes son extrapuros, como en los medios empleados
para investigación.
Estado
Medios líquidos. Generalmente tienen componentes completamente solubles. Son útiles en la propagación de
microorganismos pero tienen la desventaja de que no se pueden detectar contaminaciones.
Medios fluidos. Contienen agar aprox. 0.1%, consistencia líquida pero la presencia de agar disminuye la velocidad de
disolución de O2 ambiental. Se emplea generalmente en el cultivo de microorganismos anaerobios y
microaerofílicos.
Semisólidos. 0.2 a 0.8% de agar, son suaves y permiten observar la movilidad de los microorganismos. Esta
consistencia es utilizada en los medios de transporte, las pruebas de movilidad, pruebas biquímicas y pruebas
genéticas.
Sólidos. 1.5 a 2.0% de agar, consistencia dura y forman un soporte para el crecimiento microbiano. Se emplean para
cultivo, aislamiento, diferenciación, cuantificación, pruebas de sensibilidad y en algunos casos para conservación
(inclinados).
Uso
Enriquecidos. Contienen componentes ricos nutritivamente y permite el crecimiento de microorganismos no
exigentes.
Ejemplos:
•Agar cuenta estándar (cuenta en placa)
•Infusión cerebro y corazón (BHI)
•Agar Soya Tripticaseína (TSA)
•Agar nutritivo (AN)
•Agar sangre (AS)
De enriquecimiento. Contiene componentes y condiciones que permiten el desarrollo de un tipo microbiano y
disminuyen la velocidad de crecimiento de la flora acompañante.
Ejemplos:
•Agua peptonada pH 9: Detección de V. cholerae
•Caldo tetrationato: Pre-enriquecimiento para Salmonella
Caldo selenito: Detección de Salmonella, Enterobacter sakazakii y Yersinia enterocolitica
Selectivos. Contiene componentes que permiten el desarrollo de un tipo microbiano e inhiben el crecimiento de los
demás microorganismos.
Ejemplos:
•Agar cetrimida
•Caldo bilis verde brillante
•Agar Bacillus cereus
•Agar Sabouraud cicloheximida
Diferenciales. Contiene componentes que permiten diferenciar las actividades metabólicas de los microorganismos
inoculados. La presencia de indicadores o el uso de reveladores después de la incubación ponen de manifiesto la
actividad.
Ejemplos:
•Agar DNAsa
•Agar almidón
•Agar cromogénico para Candida
Diferenciales y selectivos.
Agar sal y manitol
•Agar eosina azul de metileno (EMB)
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
•Agar XLD
•Agar Endo
•Agar Mc Conkey
De conservación. Algunos medios de cultivo son empleados para la conservación temporal de microorganismos,
como son:
•Medio sólido en caja a 4ºC (hasta 1 semana).
•Medio de agar inclinado 4ºC (hasta 2 semanas) con sello de glicerol estéril a 4ºC (varios meses dependiendo del
microorganismo).
•Medio fluido de tioglicolato con carne molida con sello de aceite mineral estéril a temperatura ambiente (varios
meses
dependiendo del microorganismo).En la liofilización también se emplea la leche descremada (años).
De transporte. Son medios que se emplean para el transporte de muestras sin alterar la viabilidad y la proporción de
microorganismos. Tienen consistencia semisólida, con amortiguador de pH y reducidos en nutrientes para preservar la
proliferación de microorganismos por varias horas. Las muestras se recolectan con asas o con hisopos de alginatos
que no inhiben a los microorganismos.
•Medio Amies
•Medio de Stuart
De transporte. Son medios de cultivo que tienen los nutrientes para poner en evidencia la actividad metabólica de
un microorganismo puro. Pueden emplear reveladores y/o indicadores.
Pruebas bioquimicas
Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificación y
clasificación de bacterias y hongos.
Partes.
Sustrato (contenido en el medio de cultivo)
Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo)
Producto
Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)
1. Hidrólisis del almidón. Polímero de glucosa compuesto de amilosa (poco
ramificada) y amilopectina (más ramificada).
Agar almidón. Sustrato: Almidón Enzima: Amilasa (exoenzima). Producto:
Glucosa. Revelador: Lugol que forma un complejo color café-púrpura que
desaparece cuando el almidón ha sido degradado.
2. Degradación de la caseína. Las proteasas son excretadas al medio para la
degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere
el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el color blanco
alrededor del crecimiento microbiano.
Agar Leche Descremada. Sustrato: Caseína Enzima: Caseinasa
(Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere.
3. Hidrólisis de la lecitina y reducción del telurito. Las colonias productoras de lecitinasa
forman una zona opaca a su alrededor. El medio de Baird Parker es empleado para
el aislamiento y cuantificación de estafilococos coagulasa positivos, al que se
adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias típicas de S. aureus son
oscuras por la reducción del telurito (TeO32-) a Teo, además presentan el halo de
hidrólisis de la lecitina.
Agar yema de huevo/Agar Baird Parker. Sustrato: Lecitina. Enzima: Lecitinasa
hidroliza la lecitina (fosfolípido). Producto: Fosforilcolina. Revelador: No requiere.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
4. Licuefacción de la gelatina. La gelatina es una proteína que cuando es hidrolizada por la
gelatinasa en los aminoácidos que la componen, pierde su característica de gelificar. Si al
refrigerar el medio en donde se incubó por 7 días el microorganismo la gelatina cuaja, el
microorganismo creció pero no la degradó. Otra opción es con carbón activado, si éste se
esparce por todo el medio, quiere decir que hubo degradación.
Gelatina Nutritiva (base nutritiva en caldo y después se agrega el gelificante)
Sustrato: Gelatina (proteína). Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima). Producto:
Aminoácidos. Revelador: No requiere o puede emplearse el carbón activado en polvo.
5. Fermentación. Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser
incorporados, algunos requieren de ser degradados en monómeros y transportados a la
célula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía
fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto orgánico se observa por la
acidez en el medio de cultivo y la formación de gas capturado en la campana de
fermentación. Prueba positiva (ácido y gas), si únicamente vira el indicador se trata de
prueba posistiva (ácido).
Medio base caldo rojo de fenol (indicador pH), con campana de fermentación
(Durham). Sustrato: Carbohidrato o polialcohol. Vía: Fermentativa. Producto: Ácidos orgánicos. Indicador: Rojo de
fenol (bugambilia, rojo, amarillo), púrpura de bromocresol (púrpura, violeta, amarillo) o cualquier indicador de pH.
6. Oxidación/fermentación. Las bacterias obtienen energía a partir de
hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos;
fermentativo u oxidativo. Prueba para determinar si el
microorganismo oxida, fermenta o es facultativo. Se inoculan dos
tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina
para impedir la entrada de oxígeno.
Hugh and Leifson. Sustrato: Carbohidratos. Vías: Fermentativa
y/u Oxidativa. Producto: Acido pirúvico. Indicador: Azul de
bromotimol u otro indicador ácido/base.
7. Fermentación ácida o neutra.
Fermentación ácido mixta: Los productos son ácidos orgánicos que provocan un descenso del pH inicial (indicador:
amarillo pH por encima de 5,1 y rojo pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de ácido pirúvico
(piruvato) formadas, se reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del
acético pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 .
Fermentación butilenglicólica: en ésta, parte del piruvato se metaboliza
produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la mayor parte del
piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol,
productos que son neutros.
Para determinar la presencia de los productos neutros (acetoína) (prueba de Voges-
Proskauer): Se agrega un poco de a-naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto
lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita
fuertemente. La acetoína reacciona con el a-naftol, y produce un cromóforo rojo en
presencia de oxígeno. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la parte superior del tubo;
Prueba negativa no tiene coloración).
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer (Caldo RM/VP) Sustrato: Glucosa. Vías: Fermentación ácida o neutra.
Producto: Ácidos orgánicos o acetoína. Reveladores: Solución de Rojo de Metilo, Alfa
Naftol y KOH 40%.
8. Utilización del citrato. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única
fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de
nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Vía: Varias dependientes
del pH del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Acetoína en condiciones
ácidas. Indicador: Azul de bromotimol.
9. Agar Hierro de Kligler (KIA). Identificación de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. En presencia de
tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman
H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en
condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro
ferroso metálico.
Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan el medio.
Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa y debido a la
baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio (el pico de
flauta).
Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la
lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio.
Alcalino: rojo/bugambilia, Ácido: amarillo.
Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína. Vía: Fermentativa
Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa Productos: Ácidos mixtos y H2S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+.
10. Medio SIM (Sulfhídrico Indol Movilidad). Derivación del de Kligler. (medio semisólido) Sustratos: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y
tiptofanasa. Producto: H2S e Indol. Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA).
Resultados: 1. Reducción del azufre (precipitado negro). 2. Formación de indol a partir de triptófano (se forma un
cromóforo rojo en la superficie) y 3. Movilidad (si se esparce por el tubo de ensaye o si sólo se presenta en la parte
donde se inoculó).
1. 2. 3.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
5. Ureasa. La hidrólisis de la urea por la ureasa libera dos moléculas de amoniaco
que alcaliniza el medio. Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa.
Producto: Amoníaco. Indicador: Rojo de fenol.
6. Reducción de nitratos. Anaerobios y asimiladores de nitrógeno.
Reducción asimilativa: los nitratos pasan a -NH2
Reducción desasimilativa: se reduce hasta formar N2
Nitrato reductasa (NAR). (la que se quiere medir)
Nitrito reductasa (NIR).
NO reductasa (NOR).
N2 reductasa (N2OR).
Caldo nitratos Sustrato: Nitrato de sodio. Enzima: Nitrato reductasa. Producto: Nitritos. Revelador: Reactivos de Griess (a
y b) (ácido sulfanílico y dimetil-a-naftilamina (a-naftilamina) que forman un cromóforo rojo, después de 24 horas de la
incubación, en presencia del nitrito.
Cuando la prueba resulta negativa para
nitritos se utiliza la campana de fermentación o la prueba del
zinc, ya que es posible que la bacteria haya logrado reducir
aún más el nitrito hasta N2 (donde se observaría la presencia
de un gas). El zinc, reduce nitrato a nitrito, y si sale positiva,
quiere decir que la bacteria no logró reducir el nitrato.
7. Descarboxilasa. Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas (prueba
positiva)lo que incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las
descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. Medio base de descarboxilasas (caldo con aa. Y fuente de carbono) u otros medios como LIA
(lisina.hierro.agar) o MIO (algo con quitina..) Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Lis.
Producto: Amoníaco y diaminas. Indicador: Púrpura de bromocresol.
8. Coagulasa. Exoenzima producida por S. aureus, (factor de virulencia) esta enzima
actúa sobre los factores de la coagulación presentes en el plasma y forma un coagulo
visible con las proteínas del hospedero para evadir a sistema inmune.
Plasma de conejo. Sustrato: Factores de la coagulación. Enzima: Coagulasa
(estafilocoagulasa). Producto: Coagulo. Revelador: No requiere.
9. Oxidasa. Se debe a un sistema de citocromo oxidasa (complejo IV, ver fosforilación
oxidativa). La prueba positiva se observa por la oxidación del reactivo de Kovacs (incoloro,
reducido) formándose un producto colorido. amarillo es negativo, fucsia y azul marino es prueba
positiva.
Cultivo de medio nutritivo Sustrato: Compuesto reducido. Enzima: Oxidasa. Producto: Compuesto
oxidado. Revelador: Reactivo de Kovacs: diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%.
Crecimiento Bacteriano
Crecimiento: incremento en el # de células
Bipartición (fisión binaria): una célula se divide para formar dos iguales.
Generación: intervalo que transcurre en la formación de dos células.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Fisión binaria: cada célula hija recibe una copia del cromosoma, ribosomas, complejos macromoleculares, así como
monómeros y iones inorgánicos para existir como una célula independiente. El ADN se ancla a la membrana y así, cada
célula hija se queda con una copia.
Se forma un septo que dará lugar a cada una de las células, las envolturas
rodean a cada copia del ADN y finalmente se da la separación de las células.
Proteinas Fts (filamentous temperature sensitive): forman el aparato de división (divisoma)
o FtsZ polimeriza y forma un anillo en el centro de la célula.
o FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energía para ensamblar proteínas
en el divisoma.
o ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmática.
o FtsI es una proteína involucrada en la síntesis de peptidoglucano, también
llamada proteína de unión a penicilina (su actividad es bloqueada).
Replicación del ADN
Previo a la formación del anillo FtsZ que se forma en el espacio entre los cromosmas duplicados.
o MinC: inhibidor de la división celular y previene que FtsZ ensamble el anillo hasta que el centro se encuentre formado.
o MinE: inhibe la actividad de MinC y se ancla al centro de la división.
o FstK participa en la elongación.
o FstZ: tiene actividad de GTP hidrolasa, libera energía para la polimerización y despolimerización, así como para el
ensamblaje y desensamblaje del anillo.
Proteína MreB y la forma de las bacterias.
La presencia de esta proteína se ha relacionado con las bacterias no cocoides.
o FtsZ tubulina bacteriana.
o MreB actina bacteriana.
Autolisinas: realizan pequeñas aberturas, presentes en el complejo divisoma.
La síntesis del nuevo peptidoglocano deja en las células Gram positivas una cicatriz. (de
donde empieza a sintetizar la célula hija su propio péptidoglucano)
La abertura y síntesis deben ser coordinadas para evitar la autolisis de la célula.
Bactoprenol y transpeptidacion.
El bactoprenol (proteína en el periplasma de gran negativas) acarrea los precursores de la pared celular, en el
periplasma interactúa con la enzima que inserta los precursores de pared celular y cataliza la formación del enlace
glucosídico.
La transpeptidasa forma el enlace peptídico entre las cadenas de aminoácidos de las unidades de mureína.
Crecimiento bacteriano: duplicación de un cultivo de manera regular durante un intervalo de tiempo.
o Grafica logarítmica: muestra el crecimiento exponencial; puede calcularse el tiempo de generación.
Tiempo de generación (G): tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique.
G = t/n
n= numero de generación
t=tiempo
No= número inicial de microorganismos
N = No2n
lg N = lg No + n lg 2
El crecimiento se produce en progresión geométrica:
1 generación -------------> 2 células
2 generaciones -------------> 4 células
3 generaciones -------------> 8 células
Bacteria que se duplica más rápido: E. coli Más lenta: Treponema pallidum
Curva de crecimiento: A (Fase Lag). Latencia/adaptación: no aumento significativo d densidad celular, crecimiento asincrónico.
B (Fase Log). Crecimiento exponencial, sincrónico y se alcanza la máxima velocidad de crecimiento.
C (Fase pre-estacionaria). Retardo, desaparece crecimiento exponencial, microorganismos en estrés.
D (Fase estacionaria). Estacionario: equilibrio entre los microorganismos vivos y muertos.
E (Fase de muerte). El equilibro desaparece y predominan los microorganismos muertos. No hay nutrientes para el
recambio y las condiciones del medio de cultivo son adversas para el crecimiento.
Tipos de cultivo.
Cultivo en lote. Varios matraces, muestrear de cada uno en el tiempo, se construye una curva, método analítico
analítico a pequeña escala.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Cultivo en lote alimentado. Cambiar condiciones, inducir algún sistema.
Cultivo en continuo. Fermentador (bioreactor) para cultivo. La cepa se inocula en fase log, cuando entra en fase
preestacionaria, debe depurarse y utilizar más medio de cultivo a modo de evitar que entren en fase estacionaria y su
producción sea eficiente.
Temperatura (1). Gelificación de la membrana; los procesos de transporte se llevan a cabo
lentamente y no hay crecimiento.
(2). Las reacciones enzimáticas aumentan su velocidad.
(3). Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo a su máxima velocidad. (no
todas, cada enzima tiene su temperatura óptima).
(4). Desnaturalización de proteínas y membrana citoplasmática. Lisis térmica.
pH Microorganismos patógenos.
Acidofilos 1-6
Neutrofilos 7-10
Alcalofilos 11-14
Oxigeno.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Cultivo de anaerobios. Se lleva a cabo en jarra de anaerobiosis.
NaHCO3 + NaBH4 + O2 → CO2 + H2O + H2
Radicales generados en respiración aerobia.
O2 + e- → O2- Superoxido
O2- + e- + 2H+ → H2O2 Peróxido de hidrógeno
H2O2 + e- + H+ → H2O + OH- Radical hidroxilo
Superoxido dismutasa (SOD) Enzima detoxificante que se hace cargo del superóxido.
O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2
Catalasa. Enzima detoxificante que se hace cargo del peróxido.
H2O2 + H2O2 → 2H2O + O2
Peroxidasa.
H2O2 + NADH + H+ → 2H2O + NAD+
Concentración de solutos.
Actividad del agua (aw ): disponibilidad del agua para los microorganismos.Osmófilos y xerófilos pueden vivir en bajas aw
Solutos compatibles: Los forman los microorganismos para compensar la
concentración de solutos exterior. (para poder vivir en medios hipertónicos)
Aminoácidos: Glicina-betaína y ectoina
Carbohidratos: Sacarosa y trehalosa
Poli alcoholes: Manitol y glicerol
Otros: KCl y propionato dimetilsulfonico (PDS)
TABLA DE EXTREMOFILOS
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Medición del crecimiento microbiano.
1 Viables. Presencia de microorganismos vivos. Al menos 24 horas incubación e interpretación de resultados.
Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo de los
microorganismos a cuantificar.
Cuenta en placa. Principalmente cuantificación de bacterias y hongos. UFC (Unidades Formadoras de Colonias).
Se emplean diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia
formada provenga de un solo microorganismo (Criterio: 25 a 250 UFC por
placa).
Se reporta como: #UFC/unidad de volumen o peso.
http://people.rit.edu/~gtfsbi/IntroMicro/20081MicrobialGrowthCh6.htm
TECNICAS DE CUENTA EN PLACA:
Vaciado (se vacia la muestra y después se pone el agar), extendido (se
extiende la muestra sobre el agar ya preparado)
Miles y Misra. Las placas son divididas en sectores. Preparación de diluciones
seriadas de una suspensión bacteriana. Se toman en cuenta los sectores
donde hay menos de 20 UFC. El número de bacterias viables se obtiene
calculando la media de cada dilución en las repeticiones realizadas.
Asa calibrada. Tomar volúmenes pequeños, inoculados en la superficie del
agar mediante la técnica de siembra masiva. Las colonias son contadas y se
multiplican por el factor de dilución del asa empleada. Se determinan las
UFC/g o mL de muestra.
Filtración. La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su
malla con poros de 0.25-0.45µm. Esta membrana se transfiere a un medio de
cultivo para el desarrollo de colonias.
Número más probable. También llamada técnica de dilución en tubo: estimación
estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de
obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de
muestra inoculado.
Microorganismos COLIFORMES.
Coliformes totales: bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h a 35°C.
Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente:
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales: bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a
las 48 h de incubación a 44 °C. Este grupo no incluye una especie determinada; la más prominente es Escherichia coli.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
2 Totales. Microorganismos vivos y muertos no se pueden distinguir. Son rápidos pero se requiere contar en algunos casos
con curvas de calibración.
Recuento microscópico.
1. Cámaras de Petroff-Hausser y de Neubauer.
Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras.
No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean
observadas al microscopio.
No distinguen células vivas de muertas.
2. Cuenta de Breed.
Se usa: muestra a evaluar (directa o diluida), objetivo micrométrico, asa
calibrada o micropipeta
Área de la muestra = bxh y convertir a µm2
Determinar el área del campo: A= πxr2(µm2)
Observar 10 campos, contar las bacterias de cada uno de ellos y obtener el promedio X
Factor= Am/Ac
Calcular el número de bacterias por mL x Factor x 100 = bacterias_____ /mL
100 es la dilución inicial al tomar 0.01mL
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Nefelometría (Turbidimetría). La turbidez producida por el crecimiento microbiano e determina por la
densidad óptica (DO) que puede ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK).
Longitud de onda (λ)
•Bacterias 540nm
•Protozoarios 580nm
•Levaduras 600nm
Actividad metabólica (producción de CO2).
CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O
Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2NaCl
NaOH (residual) + HCl → NaCl + H2O
Peso seco y determinación de proteína. Más proteína, más células.
El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas se obtiene por el secado de un volumen en un horno a
105°C hasta peso constante. Útil para grandes volúmenes. Desventaja: componentes volátiles pueden perderse y puede
existir degradación. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado.
Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.
Factores que afectan la sobrevivencia de los microorganismos. Esterilización: destrucción de toda forma de vida microbiana.
Esterilización comercial: destruye esporas de Clostridium botulinum.
Desgerminación: eliminación de microorganismos en un área limitada.
Sanitización: eliminación de microorganismos patógenos.
Desinfección: destrucción de formas vegetativas en superficies inertes.
Antisépsis: tratamiento químico en tejidos vivos.
Asepsis: ausencia de contaminación significativa.
Técnicas asépticas: minimizan la contaminación en áreas y equipos.
Biocida: mata a los microorganismos
Bio-estático: detiene el crecimiento de los microorganismos.
Biolítico: tiene acción sobre membrana o pared celular.
Sepsis: indica contaminación por bacterias. En medicina describe una
infección en el torrente sanguíneo.
1. Agentes químicos.
•Mecanismo de acción
•Concentración
•Tiempo de exposición
•Factores ambientales
•Susceptibilidad de los microorganismos
•Edad de los microorganismos
•Presencia de materia orgánica
Fenoles y sus derivados. Destrucción de la membrana citoplasmática y desnaturalización de enzimas.
Biguanidas. Destrucción de la membrana citoplasmática.
Clorhexidina. Bactericida no tóxico. Se emplea en infecciones bucales, en la prevención de infecciones
tras cirugía bucal, combate y reduce la formación de la placa dental, lavado quirúrgico y lavado antiséptico.
Halógenos.
CLORO.
Agente oxidante.
Usado como desinfectante de superficies, agua y equipos.
SOLUCIONES DE IODO.
Se une a residuos de tirosina y desnaturaliza proteínas.
Antiséptico y desinfectante.
Alcoholes. Solubiliza lípidos y desnaturaliza proteínas.
Etanol e isopropanol. Bactericida y funguicida. Antiséptico no afecta esporas y virus envueltos.
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Metales pesados.
Colorantes. Cristal violeta, verde brillante, eosina.
Combinación específica con ácidos nucleicos principalmente.
Biostáticos. Antifúngicos, antisépticos locales, inhibidores en los medios de cultivo selectivos.
Surfactantes.
1. Jabones aniónicos ácidos. Remoción mecánica de microorganismos. Germicida de piel. Algunos
contienen otros antimicrobianos.
2. Detergentes aniónicos ácidos. Interacción con la membrana citoplasmática cargada, probable
inactivación o destrucción de enzimas. Sanitizante. No tóxico, no corrosivo, actúa rápidamente y es de amplio
espectro. Equipo de procesamiento de alimentos.
3. Detergentes catiónicos. Desnaturalización de proteínas, inhibición de enzimas y destrucción de la
membrana citoplasmática. Bactericidas, bacteriostático, funguicida y virucida, destruye virus envueltos.
Antiséptico de piel, instrumentos, utensilios y gomas. Cloruro de Benzalconio.
Ácidos orgánicos. Conservadores (ácido sórbico, ácido benzoico, ácido ortofosfórico, ácido cítrico,
ácido ascórbico) Inhibición metabólica. Antifúngicos en alimentos y cosméticos.
Aldehídos. Inactivan proteínas por la formación de enlaces covalentes con grupos funcionales (-NH2, -
OH, -COOH y –SH)
Formaldehído. Biocida. Eliminación de bacterias y virus en vacunas. Conservación de especímenes biológicos.
Glutaraldehído. Esterilizante. Biocida de bacterias incluyendo a M. tuberculosis, esporas y virus.
Peroxigénos. Su mecanismo de acción es la oxidación de moléculas.
Ozono. Desinfectante en agua. Costoso.
Peróxido de hidrógeno H2O2. Antiséptico y desinfectante. Esporocida. Usado en heridas y superficies.
Peróxido de benzoilo. Antiséptico contra bacterias anaerobias en el tratamiento del acné.
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Ácido peracético. Esterilizante. Biocida para hongos y bacterias, endoesporas y virus. No tóxico. Desinfectante
de equipo médico y de procesamiento de alimentos.
Esterilizantes gaseosos. Esterilizantes de plásticos y materiales termosensibles. Desnaturalizan proteínas.
Análogos. Moléculas similares a material celular.
Antibióticos.
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Antibiograma.
Resistencia.
Natural
Adquirida
Una cruzada
Una asociada
Factores Físicos.
Calor húmedo
Ebullición. Desnaturaliza los componentes celulares.
•Punto térmico mortal. Temperatura variable y tiempo constante. La temperatura que destruye a los
microorganismos en un tiempo determinado.
•Periodo térmico mortal. Tiempo variable y temperatura constante. El tiempo que tardar en destruir a los
micoorganismos en una muestra a una temperatura determinada.
Tindalización. Proceso de destrucción de formas vegetativas
por medio de vapor de agua y una incubación para favorecer la
germinación de endosporas, para posteriormente repetir el proceso.
Pasteurización lenta. Calentar la leche entre 62 y 64ºC y mantener durante 30 minutos. Luego enfriar entre
4 y 10ºC .
Pasteurización rápida. Llamada también pasteurización continua o bien HTST (High Temperature Short
Time), consiste en aplicar a la leche una temperatura de 72 - 73ºC en un tiempo de 15 a 20 segundos.
Una leche ultrapasteurizada: 110ºC y 115ºC por 4 segundos, mientras que la leche esterilizada : 140-150ºC en 2 s;
inyección de vapor purificado, con la cual se eleva la temperatura; la leche pasa inmediatamente a una
cámara de vacío, en donde ocurre una expansión del líquido con la siguiente separación del vapor.
Todo tratamiento térmico a temperaturas inferiores al 100°C son considerados métodos de pasteurización.
Autoclave. Esterilización 121ºC, 15lb, 20 minutos. Esterilización comercial 70ºC.
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Calor seco
Produce desecación de la célula, es esto tóxico por los niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas.
Transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.
La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está
seco o la actividad de agua del medio es baja.
Ventajas:
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilización respecto al calor húmedo.
Materiales que se pueden esterilizar: materiales no alterables por el calor, no hace falta que sean porosos pero sí
que resistan altas temperaturas, durante prolongados periodos de tiempo.
Estufas de esterilización (horno). Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia circula por la
cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras. Se mantiene una temperatura estable mediante
termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito eléctrico.
Para el control del proceso existen:
•Métodos físicos. Uso del termómetro interno vs externo.
•Métodos químicos. Cinta testigo y tiras reactivas.
•Métodos biológicos. Bioindicadores de B. subtilis.
Temperaturas bajas. Disminuye la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Provoca la formación de
cristales*. Conservación de alimentos, reactivos y muestras biológicas.
•Refrigeración 4ºC.
•Congelación -20ºC*
•Ultracongelación -96ºC*
Tiempo de reducción decimal D. Es el tiempo que una población se reduce en 10 ordenes a una
temperatura determinada. Es característico de cada microorganismo.