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3ª Aula:Cultivo e Crescimento de MO

S.Mendo08/09Conceitos/conhecimentos chave a

apreender• Diferentes tipos nutricionais dos microrganismos• Crescimento e manutenção de microrganismos em

laboratório (culturas puras e contagem de bactérias- UFC, tipos de meios de cultura; técnicas de inoculação)

• Curva de crescimento bacteriano e taxa específica de crescimento

• Influência de alguns factores no crescimento microbiano (pH, temperatura, nutrientes, oxigénio)

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� Nutrientes – substâncias utilizadas na biossíntese e produção de energia (necessárias ao crescimento dos microrganismos).

� 95% composição da célula microbiana-�Macronutrientes: C, O, S, H, N, P (constituintes de hidratos de carbono, lípidos proteínas, ác. nucleicos); e outros (Mg2+, Ca2+, Fe2+/3+)

� as células também necessitam de elementos vestigiais-Micronutrientes: Mn, Co, Zn, Mo (em pequenas quantidades- �)

� NUTRIÇÃO MICROBIANA

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FONTE DE CARBONO

faz parte do esqueleto de todos as células

Conceito de Auxotrofia vs Prototrofia

� FONTES DE C, ENERGIA, H e e-

Autotróficos: utilizam o CO2 como única fonte de Carbono

Heterotróficos: utilizam moléculas orgânicas reduzidas como fonte de C (geralmente produzidas por outros organismos)M

icro

gani

smos

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� FONTE DE ENERGIA DE H OU e-

ENERGIA

Fototróficos: luz

Quimiotróficos: Oxidação de compostos orgânicos e

inorgânicos

H ou e-Litotróficos: moléculas inorgânicas reduzidas

Organotróficos: moléculas orgânicas reduzidas

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Tipos nutricionaisdos microrganismos Fontes de E, H/electrões e C

Fotolitotróficos autotróficos

Fotoorganotróficos heterotróficos

Quimiolitotrófico autotrófico

Quimiolitotrófico heterotróficos

Luz; Mol. Inorgânica dadora de H e e- ; CO2

Luz; Mol. orgânica dadora de H e e-; Mol. orgânica como fonte de C (CO2 pode ser usado)

Química (Mol. Inorg.); Mol. Inorg dadora de H e e- ; CO2 como fonte de C

Química (Mol. org.); Mol. Orgânica; Mol. Orgânica como fonte de C

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OUTROS REQUISITOS NUTRICIONAIS

Enxofre:

Cys, MetAlguns hidr. de carbonoBiotina

Fósforo:

ProteínasÁcidos nucleicosfosfolípidos

Azoto:

AminoácidosPurinasPirimidinasLípidos

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compostos orgânicos, componentes essenciais da célula, sintetizados por MO

� aminoácidos

� purinas e pirimidinas

� vitaminas (pequenas mol. orgânicas que fazem parte de cofactoresenzimáticos)

BiotinaNiacinaRiboflavina-B2-Ácido fólico Ex. Lactobacillus: várias mutações acumuladas

� FACTORES DE CRESCIMENTO

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� CRESCIMENTO E MANUTENÇÃO DE MICRORGANISMOS EM LABORATÓRIO

Mei

os d

e cu

ltura

DEFINIDOS OU SINTÉTICOS

COMPLEXOS(peptona, extracto de carne e extracto de levedura)ex: NB e TSB

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� TIPOS DE MEIOS DE CULTURA

• MEIOS DE USO GERAL

• SELECTIVOS

• DIFERENCIAIS

Meios sólidos: 1,5-2% de Agar (agente solidificante)

Meios semi- sólidos: 0,7% de Agar (“soft agar”)

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� ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

� Em habitas naturais os MO crescem em populações mistas contendo diferentes espécies

� Estudos de MO implica o seu isolamento em culturas puras

� Espalhamento em placa de Petri contendo meio agarizado

� Diluições da cultura mista inoculadas em placa de agar

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Método de isolamento de colónias bactérianas: riscado por exaustão

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� MORFOLOGIA DAS COLÓNIAS BACTERIANAS

figura

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“Processo pelo qual todas as células vivas, esporos viáveis, vírus e viróides são destruídos”

� Calor húmido: autoclave, 121ºC, 1atm, 15-20 min.

� Calor seco: estufa seca, 180ºC, 2h; chama.

� Filtração: membrana de acetato de celulose c/ 0,22�m de Ø

� Radiação: ionizante, UV

� ESTERILIZAÇÃO

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� Filtração por membranas

� TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO

� Riscado em placa - culturas puras

� Sementeira à superfície(100�l de amostra)

� Sementeira por incorporação(análise quantitativa de uma amostra muito contaminada)

dil. décimais

S.Mendo08/09Diluições décimais

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Filtração

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Expresso em UFC– Unidade Formadora de Colónias

CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS

� placa de agar, 4ºC (2-3 semanas)� glicerol, -20ºC (meses)� glicerol, -80ºC (anos)� liofilizados (alguns anos)

� CONTAGEM DE COLÓNIAS BACTERIANAS

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� CRESCIMENTO MICROBIANO

Aumento dos constituintes celulares – pode ser medido pelo aumento do tamanho das células/ nº de células(FISSÃO BINÁRIA E GEMULAÇÃO)

Curva de crescimento: : gráfico do logaritmo do nº de células x tempo de incubação, representa o crescimento de um MO num sistema fechado sem adição de nutrientes.

TEMPO DE DUPLICAÇÃO (td) ou GERAÇÃO (tg): a população duplica durante um determinado intervalo de tempo (fase exponencial).

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Tempo Nºdivisões 2n População (N 0 x2n)0 0 n=0 1

20 1 n=1 240 2 n=2 460 3 n=3 8

EXEMPLO: E. coli (em condições adequadas) – td = 20min.

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µµµµ < µµµµ máx

µµµµ = µµµµ máx µµµµ = 0

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CRESCIMENTO MICROBIANO EXPRESSO POR EQUAÇÕES MATEMÁTICAS:

N = N0 x 2n

log N- log N0 + n log2

log N- log N0 = nlog2; n= log N- log N0 / log 2

= log N – log N0 / 0,301 = 3,3 (log N- log N0)

n = t/ td Se a população crescer durante o tempo t(n = nºde gerações)

Nt = 2n N0

lnNt - lnN0 = nln2 = 0,693 t/ tdEquação expressa em log

Equação geral para o crescimento de células(N = nºde células)

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� CRESCIMENTO EXPONENCIAL

A representação gráfica dos logaritmos naturais da densidade populacional em função do tempo traduz-se numa relação linear (utiliza-se papel logarítmico).

Assumindo que, numa cultura microbiana, em condições de crescimento equilibrado, a taxa de aumento da população no tempo t é proporcional à densidade populacional x, então a taxa de específica crescimento (�) é dada por:

�= 1/x . dx/dt

Integrando xt= x0 . e�t ln xt= ln x0 . �t

Corresponde ao declive da recta

1

2 3

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A taxa específica de crescimento (�) relaciona-se com o tempo médio de duplicação (td) para a população, por substituição de xt= 2x0 e t= td na eq. 3:

td= ln2/� = 0.693/ �

. A taxa específica de crescimento é um indicador da resposta do MO às condições e ao meio em que estão a crescer.

Cada MO tem o seu td característico, relacionado com a taxa específica de crescimento � .

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E. coli

EXEMPLO

� Meio rico (LB), a 37ºC (td pequeno e � maior)

� Meio mínimo ou temperaturas superiores/ inferiores conduzem a uma alteração do td e do �

� Existe sempre um valor de � óptimo para cada espécie

LB

MM

�(t)

(Log

nºcé

l)

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CRESCIMENTO DIÁUXICO: em meios complexos, contendo por exemplo dois substratos como fontes de C e energia. (por exemplo glucose e lactose).

t

nºde

cél

glucose

lactose

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� AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Geralmente são avaliados um de dois parâmetros:I. massa celularII. nºde células

I. DETERMINAÇÃO DA MASSA CELULAR� métodos directos pesagem dos MO (peso seco)� métodos indirectos dispersão da luz que atravessa a suspensão

Medida da diminuição da luz transmitida – densidade óptica (DO) (Absorvência)

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II. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS(contagem ao microscópio usando câmaras de contagem)

� Nem todas as bactérias que se contam vão dar origem a uma colónia.

� Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única célula, o que nem sempre é verdade. Os resultados são expressos em U.F.C.

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Câmaras de Neubauer

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� FACTORES QUE AFECTAM O CRESCIMENTO BACTERIANO

� CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES� TEMPERATURA� PH� OXIGÉNIO� ACTIVIDADE DA ÁGUA (aw)

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Psicrófilos: abaixo dos 20 ºCMesófilos: entre 20 e 44 ºCTermófilos: entre 45 e 70 ºCHipertermófilos: entre os 70 e 110 ºC

4 GRUPOS:

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Acidófilos e Alcalófilos

pH

S.Mendo08/09Tolerância ao oxigénio

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� MÉTODOS FÍSICOS E QUÍMICOS DE CONTROLO E DESTRUIÇÃO DE MICRORGANISMOS

� Os MO podem ser necessários ao ser humano e trazer alguns benefícios� Muitos MO são responsáveis por doenças e putrefacção de géneros alimentícios

� Técnicas de assepsia (microbiologia)� Preservação de alimentos

� Prevenção/ tratamento de doenças

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� Esterilização - eliminar todos os MO de um objecto ou habitat

� Desinfecção - inibição, morte ou remoção de MO que podem causar doenças. Geralmente os desinfectantes são de origem química e não implicam necessariamente a remoção de esporos.

� Antiséptico - controlo do crescimento de MO em tecidos vivos, por acção de agentes químicos. Estes compostos inibem temporariamente o crescimento ou matam MO. Adicionalmente, não podem ser tóxicos para o hospedeiro.

ALGUNS TERMOS IMPORTANTES

Germicidas – matam MO patogénicos e não patogénicosBactericidas (fungicidas, viricidas,etc) – se matam MOBacteriostáticos (fungistáticos) – se inibem o crescimento

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Antisépticos e desinfectantes

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� CONDIÇÕES QUE AFECTAM A EFICÁCIA DE UM AGENTE ANTIMICROBIANO

1. Tamanho da população2. Composição da população 3. Concentração do agente antimicrobiano4. Duração da exposição ao agente antimicrobiano5. Condições do local onde ocorre a exposição

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MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLO DE MO

Calor Filtração Radiação UV e ionizante

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A morte celular obedece a um padrão e, à semelhança do que ocorre com o crescimento celular, pode ser exponencial ou logarítmica.

t (min.)

log

nºcé

ls.

D121

� MORTE CELULAR

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� CALOR HÚMIDOAutoclave – para destruição de células de endósporos bacterianos (atmosfera saturada de vapor e sobre pressão, 1atm)

� degradação de ácidos nucleicos� desnaturação de enzimas e outras proteínas

PasteurizaPasteurizaççãoão

63ºC, 30 min.72ºC, 15 seg. (HTST)

140-150ºC, 1-3 seg. (UHT)

TindalizaTindalizaççãoão

90-100ºC, 30 min.3 dias consecutivosIncubações a 37ºC

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� FILTRAÇÃO:

Membranas com poro de 0,2 �m (de acetato de celulose, policarbonato, nitrato de celulose, etc).

Filtração do ar:

câmara de fluxomáscaras cirúrgicas

salas assépticas

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Filtração

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� RADIAÇÃO

�� UVUV- pode ser letal. Não atravessa superfícies de forma eficaz, pelo que é utilizada para a sua esterilização.

�� IonizanteIonizante (radiação Gama do Cobalto 60)- penetra dentro dos objectos, pelo que é utilizada para esterilização de material descartável de plástico. Também é utilizada para esterilização de antibióticos e hormonas.

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Radiação

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MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLO DE MO

� COMPOSTOS FENÓLICOS

� poderosos microbicidas� muito tóxicos� alterações na membrana celular dos MO� bactericidas ou bacteriostáticos (depende da concentração)

� ALCOÓIS

� agentes antisépticos e desinfectantes� coagulação de proteínas � solubilização de lípidos � destruição de membranas celulares� bactericidas ou fungicidas

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� COMPOSTOS HALOGENADOS

� gás ou associado a agentes libertadores de cloro� utilizados como desinfectante de águas de consumo e piscinas� destruição da actividade de proteínas celulares (oxidação dos grupos sulfidrilo e reacções de N- e C- clorinação e descarboxilação)

� IODO

� interacção com enzimas essenciais ou proteínas (reacções de grupos -SH, Iodo -NH aa)

� desinfecção de feridas

� preparação do campo operatório (Betadine- iodo epolivinilpirrolidona)

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� METAIS PESADOS

� inactivação de proteínas celulares� tratamento de pequenas feridas e infecções da pele (mercuriocromo)

� DETERGENTES CATIÓNICOS

� compostos de amónio quaternário � activos contra a maioria das bactérias (excepto Mycobacteriumtuberculolosis e endósporos)� disrupção das membranas e desnaturação de proteínas� baixa toxicidade

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� ALDEÍDOS

Formaldeído- tóxico e letal para todos os micróbios e esporos- bactericida, esporocida e virucida

Glutaraldeído- sol. aq. 2% menos irritante que o Formaldeído- desinfecção de material hospitalar- desnaturação de proteínas e ác. nucleicos

� ÓXIDO DE ETILENO

� gás (temp. ambiente)� microbicida e esporicida� agente alquilante, inactiva enzimas e proteínas� esterilização de material de polietileno ou empacotado em papel