UNIWERSYTET OPOLSKI Wydział Chemii

Katedra Chemii Analitycznej i Ekologicznej

A U T O R E F E R A T z w y k a z e m d o r o b k u n a u k o w e g o

Katalizowane przez cyjanobakterie

przemiany stosowanych przemysłowo

fosfonowych kompleksonów jonów metali

mgr Damian Drzyzga

Praca doktorska wykonana pod kierunkiem

dr hab. Jacka Lipoka, prof. UO

Opole 2017

- 2 -

1. Obszar i cele badań

Fosfor należy do kluczowych pierwiastków biogennych, a jego dostępność dla organizmów

stanowi czynnik limitujący funkcjonowanie większości ekosystemów [1]. W środowisku wodnym

pierwiastek ten występuje najczęściej w formie pochodnych reszty kwasowej HPO42-

(wodorofosforanu V) [2], tworząc związki na +5 stopniu utlenienia. Wbudowany w strukturę molekuł

kluczowych dla funkcjonownia organizmów, jak np. kwasy nukleinowe, fosfolipidy czy fosforanowe

pochodne nukleotydów (np. ATP, ADP, AMP, NADP), pierwiastek ten występuje w formie estrów

(C-O-P) kwasu fosforowego(V). Po dekadach badań roli i znaczenia pochodnych estrowych kwasu

fosforowego(V) w procesach biogeochemicznych [3], zaczęto dostrzegać znaczenie połączeń tego

pierwiastka na +3 stopniu utlenienia, w tym pochodnych kwasów fosfonowych, zawierających

bezpośrednie wiązanie węgiel-fosfor (C-P) [1].

Dwie dekady temu uznanie zdobyła hipoteza, zgodnie z którą stężenie tlenu w pierwotnej

atmosferze naszej planety było znacznie niższe niż obecnie [4], co powodowało, że wśród związków

fosforu występujących w tworzącej się biosferze Ziemi, dominowały kowalencyjne połączenia tego

pierwiastka z węglem (C-P). W miarę upływu czasu, w wyniku rozwoju organizmów

fotoautotroficznych, wzrastało stężenie tlenu cząsteczkowego O2, co prowadziło do coraz

powszechniejszego występowania związków zawierających połączenia węgiel-tlen-fosfor (C-O-P) .

Związki fosfonoorganiczne stanowią obecnie liczną i zróżnicowaną grupę pochodnych

kwasów fosfonowych, których wspólną cechą jest obecność kowalencyjnego połączenia węgla

z fosforem (C-P), odpornego na działanie wielu czynników chemicznych, fizycznych czy

enzymatycznych, działających w warunkach fizjologicznych [5]. Współczesne dane wskazują,

że związki te stanowią około 10% całej puli fosforu obecnego w oceanach [6, 7]. Dlatego, pochodnym

fosfonowym przypisuje się znaczącą rolę w globalnym obiegu biogeochemicznym tego pierwiastka,

wskazując na biodostępność fosfonianów dla różnych grup organizmów [2, 8]. Biogenne pochodzenie

tych połączeń udało się potwierdzić dopiero w 1959 roku. Wówczas to, z komórek pierwotniaków

bytujących w żwaczach owiec udało się wyizolować ciliatynę (kwas 2-aminoetylenofosfonowy;

2-AEP) (Rysunek 1.), która jest składnikiem fosfonolipidów - analogów fosfolipidów budujących

błony komórkowe wielu mikroorganizmów [9].

RYSUNEK 1. Ciliatyna, jako przedstawiciel biogennych związków fosfonowych

Fosfoniany, choć obecne w naszym otoczeniu od miliardów lat, na swoje odkrycie musiały

czekać aż do końca XIX wieku, kiedy w roku 1898 roku August Michaelis rozpoczął prace związane

z syntezą związków zawierających w strukturze bezpośrednie połączenie C-P. Działania te,

z sukcesem rozwinięte na początku XX-stulecia przez Aleksandra E. Arbuzova, położyły podwaliny

- 3 -

pod współczesną chemię związków fosfonoorganicznych, która rozwija się intensywnie od ponad 110

lat [10]. W tym czasie opracowano wiele nowych reakcji, które umożliwiają syntezę połączeń

fosfonoorganicznych, zdobywających rosnące uznanie w globalnej gospodarce.

Pod koniec ubiegłego stulecia, wzrost liczby ludności Ziemi wraz ze wzrostem poziomu życia

jej mieszkańców, znalazł odzwierciedlenie w zmianach obserwowanych w antroposferze naszej

planety. Liczne opracowania wskazują, że tempo rozwoju cywilizacyjnego było, jest i wydaje się,

że nadal będzie skorelowane z produkcją i użyciem związków chemicznych zawierających fosfor [11,

12]. Niemal do końca XX wieku, na skalę wielkotonażową korzystano przede wszystkim

z nieorganicznych - fosforanowych połączeń tego pierwiastka, stosowanych między innymi, jako

nawozy mineralne, dodatki do środków piorących, czyszczących, detergentów czy produktów

wykorzystywanych w przemyśle. Wraz z upływem czasu doprowadziło to do zmian w ekosystemach,

których genezę upatrywano w nadmiernej kumulacji fosforu. W celu przeciwdziałania postępującej

degradacji biocenoz, zaczęto wprowadzać liczne obostrzenia prawne ograniczające przemysłową oraz

domową „konsumpcję” fosforanów.

Niesłabnący popyt na związki fosforu wymusił zatem konieczność poszukiwania substytutów

nieobjętych sankcjami prawnymi. W ten oto sposób w centrum zainteresowania znalazły się pochodne

kwasów fosfonowych – fosfoniany. Związki te okazały się nie tylko doskonałymi zamiennikami

fosforanów, ale wiele z nich, w tym aminoalkilofosfoniany, cechuje szersze spektrum potencjalnych

zastosowań. Między innymi dlatego, że wykazują zdecydowanie silniejsze właściwości

kompleksowania jonów metali w stosunku do swoich karboksylowych odpowiedników, jak na

przykład EDTA (kwas (etylenodiamino)tetraoctowy) czy NTA (kwas nitrilotrioctowy) [13].

RYSUNEK 2. Kwas nitrilotrioctowy oraz jego fosfonowy odpowiednik (kwas

aminotrimetylenofosfonowy), jako przykłady chelatujących analogów.

Związki zawierające wiązanie C-P są też coraz częściej wykorzystywane jako retardanty

palenia w produkcji materiałów ognioodpornych, wypierając przy tym związki zawierające atomy

fluorowców, o potwierdzonym szkodliwym wpływie na środowisko [14, 15]. Fosfoniany

z powodzeniem stosuje się również w medycynie; w terapiach przeciwnowotworowych,

przeciwbakteryjnych, przeciwwirusowych, w tym również jako inhibitory odwrotnej transkryptazy

wirusa HIV-1, w terapiach cukrzycy oraz chorób układu kostnego [16-21]. Wspomnieć należy,

że współczesne rolnictwo, korzysta na skalę globalną, z kilku związków fosfonoorganicznych,

- 4 -

głównie z N-fosfonometylenoglicyny (glifozat), w ograniczaniu występowania roślin konkurujących

o zasoby (chwastów).

Należy zatem spodziewać się rosnącego popytu na pochodne fosfonowe, zwłaszcza

w kontekście zastąpienia nimi używanych wcześniej fosforanów [22]. Niestety, wzrastającej

konsumpcji związków fosfonowych nie towarzyszy wprowadzanie skutecznych metod odzyskiwania

lub usuwania tych substancji ze ścieków przemysłowych i komunalnych, co wraz z powszechnym

zastosowaniem jako herbicydy, prowadzi do niekontrolowanego przedostawania się tych substancji do

środowiska.

W przeciwieństwie do fosforanów, zastosowanie fosfonianów nie było i do tej pory nie jest

obwarowane normami prawnymi, co w dużej mierze wynika z kłopotliwego oznaczania tych

pochodnych w próbkach środowiskowych. Większość znanych i stosowanych procedur oznaczania

fosfonianów wymaga skrajnych warunków, jak wysoka temperatura, czy bezwodne środowisko, albo

wieloetapowego i czasochłonnego przygotowania próbek analitycznych. Warto też zauważyć,

że przeważająca liczba opracowanych metod oznaczeń nie dotyczy próbek o złożonym składzie

matrycy, jak próbki środowiskowe, czy biologiczne. Dlatego też, pomimo powszechnej obecność

związków fosfonowych w środowisku, brakuje efektywnych procedur analitycznych, które

pozwalałyby na oznaczenie tych substancji na poziomie umożliwiającym określenie ich przemian

i losu w ekosystemach wodnych [13]. Zdecydowana większość opracowanych metod analitycznych

ukierunkowanych jest przede wszystkim na oznaczanie N-fosfonometylenoglicyny (glifozatu) oraz

kwasu aminometylenofosfonowego (AMPA) [23], co wynika z wielkotonażowego zastosowania

glifozatu, którego głównym metabolitem rozkładu jest wspomniany AMPA [24].

W przypadku pozostałych stosowanych aminoalkilofosfonianów, wciąż brakuje metod, które

pozwalałyby skutecznie oznaczać te substancje oraz produkty ich transformacji. Wiąże się to z ich

dużą polarnością, trudnością ekstrakcji do rozpuszczalników organicznych, problematycznym

zatężaniem analitów, tendencją do kompleksowania metali oraz dodatkowo brakiem ugrupowania

chromoforowego, co uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie technik spektrofotometrycznych

[25, 26]. Można zatem uznać, że analiza przemian związków fosfonowych wciąż pozostaje

wyzwaniem.

Rosnąca liczba danych wskazuje, że stosowanie aminoalkilofosfonianów, szczególnie

herbicydów i kompleksonów jonów metali, ma związek z procesem eutrofizacji, co wydaje się zbieżne

z nowym podejściem do kwestii przyswajania różnych form fosforu przez organizmy. Do niedawna

powszechne było przekonanie, że jedynymi biodostępnymi formami fosforu są jony fosforanowe

HxPO4(3-x)

: H2PO4-, HPO4

2- i PO4

3-. Taki punkt widzenia związany był ze szczątkową wiedzą o roli

organicznego fosforu, który w wielu środowiskach wodnych stanowi znaczącą pulę tego pierwiastka

[27]. Tymczasem aminofosfoniany zawierające atomy fosforu i azotu, przedostając się do środowiska

wzbogacają pulę pierwiastków biogennych [28], co prowadzi do eutrofizacji wód i może wiązać się

z nadmiernym i niekontrolowanym wzrostem biomasy makro- oraz mikroalg, w tym sinic. Zjawiska

- 5 -

takie nazywa się potocznie zakwitami. Stawy, jeziora i inne zbiorniki wodne dotknięte tym

problemem tracą na swym gospodarczym i turystycznym znaczeniu [29].

Organizmami dominującymi w populacjach tworzących zakwity okazały się cyjanobakterie -

jedne z najstarszych filogenetycznie ziemskich mikroorganizmów. Dzięki przystosowaniom

metabolicznym sinice są organizmami pionierskimi, zdolnymi pozyskiwać substancje odżywcze ze

źródeł często niedostępnych dla innych komponentów biotopów. Wykazano, że przedstawiciele tego

taksonu mogą z sukcesem dynamizować rozwój kolonii, wykorzystując związki fosfonowe [30].

Jednak interakcje pomiędzy fosfonianami i cyjanobakteriami, a szczególnie przemiany będące

wynikiem fizjologicznych przystosowań mikroalg, są w dalszym ciągu słabo poznane.

Dlatego właśnie, w toku badań poprzedzających przygotowanie niniejszej dysertacji,

postanowiono ustalić charakter i dynamikę przemian aminoalkilofosfonowych kompleksonów jonów

metali, zachodzących w obecności słodkowodnych cyjanobakterii. Zważywszy, że interakcje

pomiędzy cyjanobakteriami i aminoalkilofosfonianami obecnymi w środowisku życia tych

mikroorganizmów, są ważnym elementem obiegu fosforu w ekosystemach, poznanie zakresu i istoty

tych procesów, pozwoli między innymi na ich monitorowanie. Warto również podkreślić, że wiedza

dotycząca kierunku i efektywności biokatalitycznych przemian kompleksonów fosfonowych, może

znaleźć interesujące zastosowania w zielonej chemii i biotechnologii.

Mając na uwadze przedstawione powyżej kwestie, w swoich badaniach zwieńczonych

przygotowaniem pracy doktorskiej, za kluczowe uważałem:

(1) Opracowanie odpowiednich procedur analitycznych pozwalających śledzić dynamikę

przemian fosfonianów oraz identyfikować powstające produkty,

(2) Określenie wpływu najpowszechniej stosowanych fosfonowych kompleksonów jonów metali

na wzrost pięciu gatunków słodkowodnych cyjanobakterii,

(3) Ustalenie relacji pomiędzy zawartością poszczególnych nukleotydów adeninowych (ATP,

ADP, AMP) w komórkach cyjanobakterii, a dzięki temu określenie ana- lub katabolicznego

charakteru przemian metabolicznych, zachodzących w obecności testowanych

aminoalkilofosfonianów,

(4) Określenie zakresu odpowiedzi metabolicznej sinic na obecność aminoalkilofosfonianów,

dzięki oznaczeniu produktów biokatalitycznych przemian tych substancji,

(5) Ocenę potencjału biotransformacyjnego sinic wobec fosfonowych kompleksonów jonów

metali, na podstawie przemian katalizowanych przez enzymy obecne w ekstraktach

cytozolowych cyjanobakterii,

(6) Wskazanie najbardziej prawdopodobnych sposobów biotransformacji aminoalkilofosfonianów

przez słodkowodne sinice,

(7) Określenie wpływu testowanych związków fosfonowych na zawartość karotenoidów i

fikobiliprotein, barwników współtworzących (wraz z chlorofilami) centra energetyczne

- 6 -

tylakoidów sinic, absorbujące fale elektromagnetyczne w zakresie światła widzialnego, a

przez to decydujące o efektywności procesu fotosyntezy.

2. Omówienie wyników

Istotnym etapem pierwszej fazy badań był wybór odpowiednich substratów

aminoalkilofosfonowych, które należą do najpowszechniej stosowanych organicznych połączeń

fosforu. Dlatego, poza chemiczną naturą tych substancji, tworzących szereg połączeń o rosnącej

liczbie ugrupowań N-metylenofosfonowych, uwzględniono także zakres i skalę ich zastosowania.

Wytypowane związki, są substancjami aktywnymi licznych preparatów chemicznych stosowanych

globalnie w skali wielkotonażowej, a główne kierunki ich wykorzystania zestawiłem w poniższej

tabeli.

TABELA 1. Związki aminofosfonowe stosowane w badaniach

Lp. Nazwa związki Stosowany

Skrót Struktura Zastosowanie Cyt.

1. N-(fosfonometyleno)glicyna NPMG

Herbicyd totalny działający systemicznie na rośliny

[31, 32]

2. N,N-bis(fosfonometyleno)

glicyna GBMP

Regulator wzrostu roślin; Czynnik kompleksujący; Potencjalny farmaceutyk

[19, 33, 34]

3. Kwas

aminotri(metylenofosfonowy) ATMP

Składnik detergentów; Czynnik kompleksujący; Deflokulant

[35, 36]

4. Kwas heksametylenodiamino-

N,N,N’,N’-tetrakis(metylenofosfonowy)

HDTMP

Deflokulant; Czynnik kompleksujący; Inhibitor powstawania kamienia kotłowego;

[36] Informacje producenta

5. Kwas dietylenotriaminopenta- (metylenofosfonowy)

DTPMP

Czynnik kompleksujący; Inhibitor powstawania kamienia kotłowego;

[22, 36]

- 7 -

Z kolei, pięć gatunków sinic żyjących w ekosystemach słodkowodnych wybrałem bazując

częściowo na wynikach wcześniejszych prac prowadzonych w Katedrze Chemii Analitycznej

i Ekologicznej Wydziału Chemii UO oraz opierając się na informacjach dotyczących środowiska życia

tych prokariotycznych mikroalg (źródła pochodzenia), intensywności rozwoju, zdolności do tworzenia

zakwitów oraz reprezentacji większości wyodrębnionych sekcji taksonomicznych. Dodatkowo,

różnicując pochodzenie mikroorganizmów, starałem się uwzględnić odmienne warunki ekspozycji

linii macierzystych cyjanobakterii na działanie aminofosfonianów. W Tabeli 2 prócz nazw, numeru

gatunku w kolekcji oraz przynależności do sekcji taksonomicznej, podano także pochodzenie

i środowisko życia linii macierzystej badanych mikroorganizmów.

TABELA 2. Testowane gatunki sinic

Nr gatunku Nazwa łacioska Sekcja Pochodzenie Środowisko życia

CCALA 007 Anabaena variabilis

Kützing IV USA, Mississippi słodkowodne

CCALA 049 Chroococcidiopsis

thermalis Geitler II Słowacja, Piestany błota termalne

CCALA 055 Chroococcus minutus

(Kützing) Näegeli I Macedonia, Ohrid

jezioro

(warstwa litoralna)

CCALA 067 Fischerella cf. maior

Gomont V

Szwajcaria

Aargau, Mellingen brak danych

CCALA 129 Nostoc cf. muscorum

C. Agardh IV Polska, Lublin jezioro

Przystępując do realizacji badań sformułowałem hipotezę, która zakładała, że związki

aminoalkilofosfonowe obecne w kulturach sinic, mogą być transportowane do wnętrza komórek i tam

biotransformowane, albo też mogą ulegać przemianom w wyniku działania wydzielonych

zewnątrzkomórkowo niespecyficznych enzymów, w tym fosfataz. Założyłem także, że naturalna liza

części komórek sinic, może skutkować przedostaniem się składników cytozolu (w tym enzymów) do

płynu hodowlanego i co za tym idzie biokatalitycznym kontaktem z fosfonowym substratem.

O przemianach pochodnych fosfonowych w kulturach sinic mogą zatem świadczyć: ubytek związku –

pośrednio sugerujący taki proces, bądź pojawienie się produktów przemian testowanych

aminofosfonianów, bezpośrednio wskazujące na zachodzenie takiego procesu. By móc zweryfikować

te założenia, w pierwszej kolejności zająłem się opracowaniem skutecznej procedury analitycznej,

bazującej na wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), pozwalającej na oznaczenie

aminowych produktów przemian testowanych związków, w stężeniach mikromolowych. Z kolei do

bezpośredniego śledzenia przemian różnych form fosforu obecnych w hodowlach wykorzystałem

magnetyczny rezonans jądrowy; warianty ex vivo oraz in vivo, techniki 31

P NMR. Obecności różnych

- 8 -

form fosforu odpowiadają różne wartości przesunięcia chemicznego odpowiednich sygnałów;

pochodne monofosforanowe identyfikowane są zazwyczaj w zakresie od 0.0 do ok. 5.0 ppm,

natomiast sygnały pochodnych fosfonowych pojawiają się w przedziale od 5 do mniej więcej 30 ppm

[30, 37]. Są to jednak umowne przedziały wartości, których granice znacząco zależą od pH roztworu.

Po przeprowadzeniu serii oznaczeń uznałem, że komplementarne stosowanie obu wspomnianych

metod będzie najbardziej odpowiednim rozwiązaniem, które może doprowadzić do potwierdzenia

przyjętych hipotez badawczych.

Opracowując metodę rozdzielania chromatograficznego wybrano siedem pochodnych

aminowych, które ze względu na strukturę chemiczną wytypowano jako najbardziej prawdopodobne

produkty biokatalitycznego przekształcenia testowanych aminofosfonowych chelatorów jonów metali,

tworząc w ten sposób grupę swoistych wzorców. Związki te to pierwszo- bądź drugorzędowe aminy,

cztery z nich to pochodne fosfonowe, zaś trzy to pochodne alifatyczne. Będąc strukturalnie

fragmentami cząsteczek wyjściowych aminofosfonianów, połączenia te mogą stanowić produkty ich

rozkładu. Obok znanych z literatury produktów biodegradacji fosfonianów, jak kwas

aminometylenofosfonowy (AMPA), czy N-metyloamina (NMA), zaproponowałem powstawanie

kwasu (N-metyloamino)metylenofosfonowego (MAMPA) oraz glifozatu, jako nieopisanych wcześniej

produktów przemian rozbudowanych strukturalnie aminopolifosfonianów. Opisana w literaturze

zdolność sinic do degradacji samego glifozatu, była z kolei przesłanką do włączenia glicyny (Gly) i jej

metylowej pochodnej - sarkozyny (SAR) do grupy prawdopodobnych produktów przemian badanych

kompleksonów. Aby uniknąć interferencji pików tych produktów, z naturalnie występującym

w komórkach wielu mikroorganizmów fosfonianem - ciliatyną (2-AEP), również tę substancję

włączono do wspomnianej grupy wzorców. Zastosowana procedura oznaczeń za pomocą

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), została rozszerzona o przeprowadzenie analitów

w pochodne, z wykorzystaniem chlorku kwasu p-toluenosulfonowego, a następnie zoptymalizowana

poprzez dobór warunków rozdzielania takich jak: temperatura kolumny, natężenie przepływu oraz

skład i pH fazy ruchomej, by rozdzielić wszystkie postulowane produkty przemian w toku jednej

analizy. Chromatogram poniżej (Rysunek 3) prezentuje wynik rozdzielania wspomnianych substancji,

w oparciu o opracowaną metodę. Metodę tę, po uprzedniej walidacji i określeniu zakresu liniowości,

wykorzystano w analizie składu chemicznego płynów pohodowlanych cyjanobakterii, a także

w studiach nad stabilnością aminofosfonianów w pożywkach hodowlanych.

Biorąc pod uwagę poziom detekcji ustalono, że oznaczenie AMPA, NPMG, MAMPA i SAR

możliwe jest w zakresie stężeń nanomolowych - ok. 50 nM, a kolejne trzy związki: 2-AEP, Gly i

NMA, można wykryć w stężeniu około 120 – 130 nM. Warto podkreślić, że opracowana metoda nie

wymaga czasochłonnego przygotowania próbek i co istotne stwarza możliwość określenia dynamiki

przemian substratów aminoalkilofosfonowych w złożonych matrycach – płynach pohodowlanych,

gdzie prócz wysokiego stężenia soli nieorganicznych, obecne są także metabolity wydzielane

zewnątrzkomórkowo i produkty powstające w wyniku lizy komórek.

- 9 -

RYSUNEK 3. Chromatogram przedstawiający rozdzielenie siedmiu związków – potencjalnych

produktów biotransformacji aminoalkilofosfonianów. Oznaczenia wykonano dla 1 mM roztworu

mieszaniny wzorców rozpuszczonych w pożywce po dwutygodniowej hodowli Anabaena variabilis.

Obecność analitów w postaci ich pochodnych tosylowych, monitorowano przy długości fali 240 nm.

Związki eluowane były w następującej kolejności: 1 – AMPA; 2 – 2-AEP; 3 – NPMG; 4 – MAMPA;

5 – Gly; 6 – NMA; 7 – SAR. Na chromatogramie przerywanymi liniami zaznaczono również

parametry analityczne. Dolna linia odnosi się do natężenia przepływu (mL min-1

), natomiast górna

pokazuje zmianę procentowego udziału KH2PO4 w fazie ruchomej, na rzecz składnika organicznego

MeCN w czasie. Pik bez numeru z czasem retencji około 6 min pochodzi od chlorku kwasu

p-toluenosulfonowego.

Wyniki tej części badań zostały zamieszczone w artykule zatytułowanym „Analytical insight

into degradation processes of aminopolyphosphonates as potential factors that induce cyanobacterial

blooms”, który został zaakceptowany do druku przez redakcję czasopisma Environmental Science And

Pollution Research (IF 2.741), gdzie oczekuje na wydanie.

Wykorzystanie opracowanej metody pozwoliło na wskazanie kierunków biokatalitycznych

przemian aminofosfonianów, które w pewnym stopniu zależą od wrażliwości cyjanobakterii wobec

testowanych związków. Prowadząc badania nad wrażliwością mikroalg względem fosfonowych

substratów zauważyłem, że stężenie 0.1 mM wyjątkowo stymuluje wzrost mikroorganizmów, często

rozwijających się efektywniej od kultur kontrolnych (Wykres 1.). Analizując wyniki stwierdziłem,

że związki aminoalkilofosfonowe mogą w określonym zakresie stężeń stymulować wzrost

cyjanobakterii, a po przekroczeniu wartości granicznej mocno hamować rozwój tych

mikroorganizmów. Podkreślić również należy, że efekt ten w większym stopniu zależy od stężenia

ksenobiotyku, niż od gatunku mikroalgi. Nie jest zatem wykluczone, że hamowanie wzrostu kolonii

sinic, wynika z kompleksowania niektórych składników pożywki – głównie jonów metali, albo też jest

skutkiem abiotycznej degradacji substratu i wrażliwości kolonii na obecność powstających w tym

procesie produktów. Warto podkreślić, że stymulacja wzrostu sinic występowała niezależne od tego

czy związek był dla cyjanobakterii jedynym, czy też dodatkowym źródłem fosforu. Odpowiednie,

reprezentatywne wyniki obrazujące omawiane zjawisko przedstawiono dla jednego spośród pięciu

przebadanych związków: N,N-bis(fosfonometyleno)glicyny.

- 10 -

WYKRES 1. Wzrost kultur słodkowodnych cyjanobakterii w pożywkach Bg11 oraz Bg11 -P,

modyfikowanych dodatkiem N,N-bis(fosfonometyleno)glicyny (GBMP), w zakresie stężeń 0,05 -

0,5 mM. Wartości współczynników wzrostu odpowiednich kontroli w podłożu Bg11 -P, z przyczyn

technicznych, zostały przedstawione przy wartości 0,0015 mM stężenia fosfonianu.

Omawiając przemiany GBMP zachodzące w obecności mikroorganizmów warto

przypomnieć, że w kontroli substratowej 0,1 mM roztworu GBMP w pożywce, stwierdzono obecność

MAMPA w stężeniu około 44 µM (Tabela 3.). Obecność tego związku jest wynikiem fizyko-

chemicznej degradacji substratu. Natomiast, w płynach hodowli eksperymentalnych słodkowodnych

sinic w podłożu Bg11, oznaczane stężenia tego produktu były od dwóch, w przypadku Ch. minutus, do

blisko czterech, w kolonii Ch. thermalis, razy wyższe, co oznacza, że mikroalgi przyczyniały się do

bardziej intensywnej transformacji GBMP. W sytuacji gdy glifozyna stanowiła dla badanych

mikroorganizmów jedyne dostępne źródło fosforu (Bg11-P +GBMP), oznaczane stężenia głównego

produktu przemian – MAMPA, wynosiły od 50 do 70 µM, w zależności od gatunku. Korelacja tych

wyników, ze średnim współczynnikiem wzrostu dla stężenia 0,1mM pozwala sądzić, że proces

biotransformacji substratu do metylowej pochodnej AMPA, przebiega nie mniej efektywnie.

Niewykluczone, że organizmy zużywały część powstającego produktu. Niewielkie ilości AMPA,

których obecność stwierdzono w podłożu, mogą być wynikiem degradacji abiotycznej.

- 11 -

TABELA 3. Stężenie produktów przemian N,N-bis(fosfonometylenoglicyny) po 14 dniach hodowli

słodkowodnych sinic w obecności 0,1 mM tego związku.

Substrat Gatunek Pożywka Stężenie produktów (µM)

AMPA 2-AEP NPMG MAMPA GLY NMA SAR

GB

MP

Anabaena variabilis Bg11 4.7± 0.5 - 1.8 ± 0.3 111.5 ± 9.2 - - -

Bg11-P 5.4± 0.3 - 1.2 ± 0.1 67.3 ± 1.8 - - -

Chroococcidiopsis thermalis

Bg11 8.3± 1.1 - 2.3 ± 0.3 155.8 ± 9.8 - - -

Bg11-P 3.7± 1.0 - 1.0 ± 0.3 63.3 ± 8.5 - - -

Chroococcus minutus

Bg11 5.2± 0.3 - 1.5 ± 0.3 82.8 ± 6.8 - - -

Bg11-P 3.0± 1.0 - 1.0 ± 0.1 51.5 ± 1.2 - - -

Fischerella maior

Bg11 6.2± 0.6 - 2.3 ± 0.2 108.6 ± 1.2 - - -

Bg11-P 4.2± 0.1 - 1.2 ± 0.1 65.7 ± 0.7 - - -

Nostoc muscorum

Bg11 9.5± 0.4 - 2.0 ± 0.2 114.5 ± 2.3 1.5±0.1 1.1±0.1 - Bg11-P 5.8± 0.2 - 1.2 ± 0.1 73.2 ± 3.4 - - -

Pożywka Bg11 - związek był dodatkową formą fosforu w pożywce; lub jedynym dostępnym źródłem tego pierwiastka – Bg11-P. ‘-‘ nie stwierdzono obecności; Stężenia podano w µM, jako wartośd średnią trzech niezależnych powtórzeo (n=3) ± S.D..

Eksperymenty ex vivo 31

P NMR ujawniły niezwykle interesującą zależność pomiędzy

obecnością testowanego fosfonianu, a wykorzystaniem nieorganicznego fosforanu (Pi) przez kolonie

cyjanobakterii (Wykres 2). We wszystkich układach eksperymentalnych zanotowano uwalnianie

dodatkowych, znacznych ilości fosforanów do podłoża (wartości – powyżej 100%). Dopiero w drugim

tygodniu obserwowano dynamiczny ubytek nieorganicznych połączeń fosforu. W dwóch

przypadkach: Ch. minutus oraz N. muscorum, po 14 dniach hodowli nie stwierdzono obecności Pi.

Pozostałe trzy testowane gatunki nawet po dwóch tygodniach hodowli korzystały ze znacząco

wzbogaconej puli fosforanów, rosnąc znacznie lepiej.

WYKRES 2. Wykorzystanie fosforu nieorganicznego (Pi), przez słodkowodne cyjanobakterie

rozwijające się bez i w obecności GBMP , ustalone z zastosowaniem techniki ex vivo 31

P NMR.

Wyniki przedstawiono jako procentową zawartość fosforanów odpowiednio w 7 oraz 14 dniu

hodowli, w stosunku do zawartości początkowej traktowanej jako 100%. Słupki obrazują

procentową różnicę zawartości fosforanów pomiędzy hodowlami kontrolnymi - wartości podane

kolorem czerwonym, a koloniami stresowanymi dodatkiem 0,1 mM fosfonianu – kolor niebieski.

Wartość „0” nie oznacza absolutnego braku fosforanu, a jed ynie brak tej substancji w stężeniu

powyżej 80 µM, jako granicy oznaczalności techniką 31

P NMR z wykorzystaniem dostępnego 400

MHz spektroskopu NMR. Wartości wyższe od 100% wskazują na obecność dodatkowej ilości

fosforanów, powstających w wyniku biodegradacji aminofosfonianu.

36 0 0 0

39 0 0 0 0 0

193

117

199

57

146

0

182

136

189

0 0

50

100

150

200

250

A. variabilis Ch. thermalisCh. minutus F. maior N. muscorum

Za

wa

rto

ść f

osf

oru

nie

org

an

iczn

eg

o

Pi

( %

za

wa

rto

ści

po

czą

tko

we

j )

- 12 -

Intensywny wzrost testowanych sinic (przy stężeniu 0,1 mM), przewyższający ten

odpowiadający kontrolom, powstawanie kwasu (N-metyloamino) metylenofosfonowego (MAMPA) –

głównego produktu degradacji GBMP oraz uwalnianie do podłoża znaczących ilości fosforanów

pozwala stwierdzić, że glifozyna ulega biokatalitycznemu przekształceniu przez komórki

cyjanobakterii. Z kolei o użyteczności tej substancji, jako składnika pokarmowego dla badanych

mikroorganizmów może świadczyć wzrost cyjanobakterii w pożywce Bg11-P z dodatkiem glifozyny.

By zwiększyć intensywność metabolizmu, mikroorganizmy muszą pozyskać także dodatkowe ilości

fosforu, którego źródłem mogą być fosfoniany. Warto zwrócić uwagę na rozwój sinic w przypadku

podłoża Bg11-P+GBMP, kiedy jedynie fosfonian mógł być źródłem fosforu, a mikroorganizmy

rozwijały się intensywniej niż w pełnym podłożu (Bg11). Dowodzi to, iż związek ten może być co

najmniej równie użytecznym źródłem fosforu, jak łatwo przyswajalne fosforany nieorganiczne.

Hipotezę tę potwierdzają dane spektroskopowe 31

P NMR, dzięki którym dowiedziono istotnych zmian

w wykorzystaniu Pi w hodowlach z aminoalkilofosfonianami. W kulturach tych stwierdzano obecność

dodatkowej ilości fosforanów, powstających w toku biokatalitycznych przemian testowanych

ksenobiotyków fosfonoorganicznych. Wyniki te, nie przystają do powszechnie akceptowanej hipotezy,

w myśl której mikroorganizmy przyswajają i zużywają fosfoniany jedynie wtedy, gdy nie mają

dostępu do fosforanów.

Chociaż niektóre z testowanych kwasów oligofosfonowych cechowała zdolność do

samorzutnego rozpadu w wyniku oddziaływań z jonami metali przejściowych obecnymi w pożywce,

wyniki przeprowadzonych doświadczeń dowodzą, że te same związki w hodowlach

z mikroorganizmami są degradowane bardziej intensywnie. Wskazuje to na biokonwersję

aminoalkilofosfonianów przez cyjanobakterie.

Na podkreślenie zasługują różnice w oddziaływaniu poszczególnych związków na kolonie

cyjanobakterii. Można przyjąć, że zwiększanie liczby grup metylenofosfonowych w cząsteczce

substratu, począwszy od NPMG przez GBMP, ATMP, HDTMP a na DTPMP kończąc, sprzyja

biotransformacji aminoalkilofosfonianów przez sinice, zwiększa pulę dostępnego fosforu i tym samym

stymuluje wzrost słodkowodnych sinic.

- 13 -

RYSUNEK 4. Uszeregowanie testowanych związków obrazujące ich podatność na biokatalityczne

przekształcenie oraz pozytywne działanie na wzrost sinic. Od lewej do prawej – od najmniej do

najbardziej.

Obecność innej niż standardowa formy fosforu w podłożu, w tym wypadku aminofosfonianu,

może spowodować, że mikroorganizmy obiorą jedną z czterech strategii: (1) zwiększą lub (2)

zmniejszą tempo pobierania Pi, (3) utrzymają przyswajanie fosforanów na niezmienionym poziomie,

albo też (4) ograniczą wykorzystanie standardowej formy fosforu. Ostatnia możliwość wydawała się

najmniej prawdopodobna, szczególnie wobec dowiedzionego istnienia wyspecjalizowanych systemów

transportu fosforanów w komórce [38-40].

Tymczasem omówione wcześniej wyniki jednoznacznie dowiodły, że aminoalkilofosfoniany,

szczególnie w stężeniu 0,1 mM, mogą być użytecznym składnikiem pokarmowym, a dzięki

biokatalitycznym przemianom z wydzieleniem fosforanów, co najmniej tak atrakcyjnym jak

standardowy fosforan. Pomiary ex vivo 31

P NMR dowiodły bowiem, że przemiany przyswajalnych

fosfonianów znacząco wzbogacają pulę dostępnych fosforanów. Niemniej, w dostępnej literaturze, nie

znaleziono danych wyjaśniających to zjawisko, także w odniesieniu do zależności pomiędzy

stężeniem ksenobiotyku fosfonoorganicznego, a wykorzystaniem Pi przez cyjanobakterie. Ponieważ

kwestia przyswajania różnych form fosforu przez sinice jest ważnym elementem biogeochemicznego

cyklu krążenia pierwiastków, w toku badań podjęto próbę przeanalizowania wykorzystania

nieorganicznego fosforu w funkcji stężenia najpowszechniej stosowanego ksenobiotyku

aminoalkilofosfonowego - glifozatu.

Wyniki eksperymentów z zastosowaniem glifozatu jako modelowego aminofosfonianu

dowiodły, że obecność herbicydu wpływa na strategię korzystania z dostępnych form fosforu przez

słodkowodne cyjanobakterie. Obecny razem z fosforanami glifozat jest intensywnie

biotransformowany z uwolnieniem fosforanu, który wzbogaca pulę przyswajalnego fosforu. W takiej

sytuacji staje się równie użytecznym źródłem fosforu jak standardowe fosforany (Pi) (Rysunek 5.B).

Natomiast obecny jako jedyna dostępna forma fosforu (Bg11-P+NMPG), glifozat jest transformowany

- 14 -

mniej dynamicznie (Rysunek 5.C), w miarę potrzeb kolonii rozwijających się nieco wolniej, niż

kolonie w podłożu zawierającym fosforan.

RYSUNEK 5. Strategie wykorzystania N-

(fosfonometyleno)glicyny, jako źródła

przyswajalnego fosforu przez

słodkowodne sinice. Strzałki obrazują

kierunek i dynamikę przemieszczania się

dostępnych dla cyjanobakterii form

fosforu. Panel A – fosforan jest jedynym

dostępnym źródłem fosforu; Panel B –

źródło fosforu stanowią zarówno: fosforan

i glifozat; Panel C – glifozat jest jedynym

dostępnym źródłem fosforu.

Uzyskane wyniki dowiodły

podatności fosfonowych kompleksonów

jonów metali na przemiany katalizowane

przez cyjanobakterie. Potwierdziły również

tezę o stężeniu progowym związku,

w przypadku moich badań wynoszącym

około 0.1 mM, koniecznym do

zainicjowania przemiany. Zebrane

w trakcie omawianych eksperymentów

dane okazały się na tyle interesujące, że znalazły uznanie zespołu redakcyjnego Journal of Applied

Phycology (IF 2.616) gdzie ukazały się w artykule pod tytułem „Glyphosate dose modulates the

uptake of inorganic phosphate by freshwater cyanobacteria”.

Wyniki eksperymentów przeprowadzonych w tej części badań dowiodły, że związki

aminoalkilofosfonowe, obecne w podłożu w stężeniu około 0.1 mM pozytywnie wpływają na rozwój

słodkowodnych sinic. W tej sytuacji naturalną konsekwencją było sprawdzenie, czy i w jaki sposób

testowane związki oddziałują na zmiany zawartości nukleotydów adeninowych: ATP, ADP oraz

AMP, których wzajemne relacje ilościowe obrazują aktualny charakter procesów metabolicznych.

Funkcjonowanie wielu enzymów zależy od relacji ilościowych odpowiednich form

fosforylowanych nukleotydów adeninowych np.: ATP/ADP czy ATP/AMP. Kwestię tę wiąże się

z tzw. „energetyką komórki”, w opisie której nadal użyteczny jest adenylowany ładunek energetyczny

(AEC), wielkość zaproponowana przez Daniela Atkinsona w latach 60 ubiegłego wieku [41, 42]. By

ocenić wpływ fosfonianów na metabolizm sinic, co umożliwiłoby ocenę statusu energetycznego tych

mikroorganizmów, a przez to ich zdolność do inicjacji biokatalitycznych przemian fosfonianów,

konieczne było dobranie sposobu ekstrakcji wspomnianych nukleotydów, a następnie zaadaptowanie

i zoptymalizowanie sposobu ich oznaczania.

- 15 -

W dostępnych opracowaniach naukowych można znaleźć kilka procedur ekstrakcji

nukleotydów adeninowych z komórek mikroorganizmów, jednak na potrzeby omawianych badań

najbardziej korzystne było opracowanie własnej metody z wykorzystaniem kwasu nadchlorowego.

Ilościowe i jakościowe oznaczania nukleotydów adeninowych również wymagało opracowania

stosownej metody – w przypadku niniejszej pracy z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii

cieczowej (HPLC). Chromatogram zamieszczony na rysunku 6 (poniżej), przedstawia przykładowy,

reprezentatywny wynik oznaczania nukleotydów adeninowych: ATP, ADP oraz AMP w matrycy,

którą stanowił ekstrakt pozyskany z kolonii Nostoc muscorum. Przygotowując się do oznaczeń

ilościowych przeprowadzono podstawową walidację zmodyfikowanej metody, wyznaczając zakres jej

liniowości, wartości granic wykrywalności i oznaczalności oraz określono precyzję wykonywanych

oznaczeń. Dla wszystkich trzech oznaczanych nukleotydów adeninowych, zależność pozostawała

liniowa w zakresie stężeń od 0,31 µM do 10 µM.

RYSUNEK 6. Przykładowy chromatogram przedstawiający wyniki oznaczania nukleotydów

adeninowych w ekstrakcie z komórek sinic, w tym przypadku z N. muscorum . Ekstrakt

pozyskano z dwutygodniowej hodowli sinicy rozwijającej się w pożywce Bg11 z dodatkiem 0,1 mM

DTPMP. Obecność analitów potwierdzono stosując metodę dodatku wzorca. Oznaczane z wiązki

eluowane były w następującej kolejności: 1 – ATP; 2 – ADP; 3 – AMP. Przerywanymi liniami

zaznaczono również warunki rozdziału: dolna linia - natężenie przepływu (mL min-1

), górna linia -

zmiana procentowego udziału 50 mM buforu fosforanowego o pH 6.5 w fazie ruchomej, na rzecz

składnika organicznego MeCN , w czasie. Oznaczenia prowadzono przy długości fali 254 nm.

Wyniki oznaczeń dowiodły, że obecność związków aminoalkilofosfonowych znajduje istotne

odzwierciedlenie w statusie energetycznym komórki, gdyż w zależności od gatunku cyjanobakterii

fosfoniany zmieniły relacje pomiędzy procesami anabolicznymi i katabolicznymi zachodzącymi

w komórkach. Za przykład niech posłuży gatunek Chroococcus minutus, który poddany działaniu

fosfonianów w stężeniu 0.1 mM znacząco zmieniał metabolizm, co wyrażało się zamianami wartości

adenylowanego ładunku energetycznego (AEC) w stosunku do kontroli (Wykres 3). Omawiany

gatunek sinic rozwijał się o około 30 % intensywniej w obecności DTPMP, HDTMP, niż

w odpowiedniej kontroli, a w przypadku GBMP o blisko 100% lepiej. Interesujące, że DTPMP blisko

- 16 -

dwukrotnie zwiększył wartość AEC, praktycznie zmieniając metabolizm Ch. minutus – indukując

przejście ze stanu, w którym dominowały procesy kataboliczne do stanu, w którym prym wiodły

procesy anaboliczne. Warto wspomnieć, że DTPMP okazał się substancją najbardziej (spośród

testowanych) podatną na przemiany katalizowane przez sinice. Odmienną sytuację zaobserwowano w

obecności kwasu aminotri(metylenofosfonowego) (ATMP) w podłożu, który mimo istotnego wzrostu

wartości AEC, ograniczył o około 25% wzrost kolonii eksperymentalnej, w relacji do właściwej

kontroli. Zestawienie tych informacji wskazuje, że chociaż nie istnieje prosta zależność pomiędzy

zmianą wartości adenylowanego ładunku energetycznego komórek Ch. minutus, a ich zdolnością do

transformowania i przyswajania testowanych fosfonianów, to jednak zmiana tego parametru dobrze

odzwierciedla aktywację procesów metabolicznych.

WYKRES 3. Adenylowany ładunek

energetyczny (AEC) komórek

Ch. minutus rozwijających się

przez 14 dni w obecności

testowanych

aminoalkilofosfonianów w

pożywce Bg11. Początkowe

stężenie każdego użytego

ksenobiotyku wynosiło 0,1mM.

Wyniki zaprezentowano jako

średnią trzykrotnych oznaczeń ±

S.D. (słupki błędów mieszczą się

pod polem znaczników). Wartość

zmierzoną dla hodowli kontrolnych

oznaczono na wykresie czerwoną

linią ciągłą oraz literą ‘K’.

Biorąc pod uwagę, że utrzymanie stabilnego statusu energetycznego (homeostazy), wymaga

dostępu organizmu do zasobów substratów pokarmowych, zdolności do ich aktywnego transportu

i przetwarzania, jak również transportu niezbędnych jonów [43], można stwierdzić, że obecność

wszystkich testowanych fosfonianów skłoniła mikroorganizmy do podjęcia stosownych działań.

Przeprowadzone badania dowiodły, że trzy spośród pięciu testowanych związków: ATMP, HDTMP i

DTPMP najintensywniej zmieniały metabolizm cyjanobakterii (wyjątkiem był N. muscorum).

Interesującą aktywność wykazał DTPMP, którego obecność często powodowała wzrost wartości AEC,

które przekraczały umowną granicę 0,5, powyżej której obserwuje się intensyfikację procesów

anabolicznych [44]. Można zatem przypuszczać, że to właśnie ten aminoalkilofosfonian jest

związkiem aktywnie utylizowanym przez komórki sinic. Warto podkreślić, że każde zwiększenie

wartości AEC względem organizmów kontrolnych, zwiększa aktywność enzymów typu-U. Enzymy te

odpowiadają za procesy anaboliczne, sprzyjające bardziej intensywnemu wzrostowi kolonii, a

w przypadku obecności czynników ograniczających rozwój organizmów, za zminimalizowanie

negatywnych skutków ich działania.

- 17 -

Zdolność do biotransformacji związków fosfonowych została potwierdzona dla kilku

gatunków sinic, a wyniki sekwencjonowania genomów tych bakterii dowiodły istnienia miejsc

kodujących liczne enzymy hydrolityczne. Jednak procesy przemian, a szczególnie ich dynamika i

charakter pozostają wciąż słabo poznane. Dlatego jednym z celów omawianych badań było stworzenie

swego rodzaju modelu metabolicznego komórki sinicowej, w którym aminoalkilofosfonian oddziałuje

bezpośrednio ze składnikami cytoplazmy odpowiedzialnymi za przemiany biokatalityczne. Konieczne

było zatem opracowanie metody pozyskiwania ekstraktu cytozolowego komórek sinic, który

zachowuje aktywność enzymatyczną, co najmniej przez czas prowadzonych doświadczeń. Kolejnym

wyzwaniem, któremu udało się sprostać był dobór warunków prowadzenia tych eksperymentów.

Opracowaną metodę i wyniki tej części badań obrazują przykładowo biokatalityczne przekształcenia

kwasu DTPMP, przez ekstrakt cytozolowy Anabaena variabilis.

W cząsteczce DTPMP znajduje się pięć grup metylenofosfonowych. Cztery z nich są

względem siebie równocenne, natomiast piąta przyłączona do centralnego atomu azotu i ze względu

na odmienne otoczenie posiada inną wartość przesunięcia chemicznego (Rysunek 7).

RYSUNEK 7. Widmo

31P NMR cytozolowego ekstraktu A. variabilis wykonane bezpośrednio po

dodaniu do niego DTPMP. Końcowe stężenie fosfonianu wynosiło 1 mM. Na rysunku pokazano

także wzór strukturalny cząsteczki substratu z oznaczeniem odpowiednich grup i korespondujących

sygnałów. Stosunek sygnałów wynosił 4:1.

W trakcie 72 godzinnego eksperymentu, ekstrakt cytozolowy z komórek Anabaena variabilis

transformował wyjściowy fosfonian z utworzeniem trzech pochodnych fosforanowych oraz siedmiu

innych substancji zawierających wiązania C-P (Rysunek 8). Na szczególną uwagę zasługuje

oznaczenie wśród powstających produktów N-acylowanej pochodnej AMPA oraz 5'-fosforo-α-D-

rybozyl 1'-(N-acetylaminometylenofosfonianu) (Rib1’ NAcAMPA), z odpowiadającym sygnałem o

- 18 -

wartości przesunięcia chemicznego δ=15.4 ppm (Rysunek 8.). O ile obecność pierwszego

wspomnianego produktu potwierdzono eksperymentalnie, o tyle obecność drugiego związku

zaproponowano w oparciu o dostępne dane literaturowe i wyniki badań komórek Escherichia coli [45,

46]. Obecność tych dwóch związków sugeruje działania kaskady enzymów, które doprowadziły do

degradacji substratu, następnie acylowania produktu i jego przyłączenia do reszty rybozy.

RYSUNEK 8. Widmo

31P NMR cytozolowego ekstraktu A. variabilis wykonane po 72 godzinach od

dodaniu DTPMP. Początkowe stężenie fosfonianu wynosiło 1 mM. Na widmie zaznaczono również

piki odpowiadające zidentyfikowanym (metodą dodatku wzorca) oraz postulowanemu produktowi

przemian.

Obecność w widmie (Rysunek 8) sygnałów rejestrowanych

w zakresie do 5ppm, odpowiadających nieorganicznym połączeniom fosforu, sugeruje częściową

mineralizację substratu. Tego rodzaju połączeń nie wykryto w układach kontrolnych, gdzie ekstrakt

nie był inkubowany z polifosfonianem, co wskazuje że obecność fosforanów jest wynikiem działania

fosfodieesteraz podobnych do tych, kodowanych przez geny phnP [45]

Wykonanie pomiarów 31

P NMR w dobowych odstępach czasu umożliwiło prześledzenie

dynamiki zachodzących przemian, co w połączeniu z analizą danych literaturowych pozwoliło na

zaproponowanie intensywności i kierunków tych procesów w formie graficznej - Rysunek 9.

- 19 -

RYSUNEK 9. Proponowane ścieżki przemian cząsteczki DTPMP przez cytozolowy ekstrakt Anabaena

variabilis. Małymi literami oznaczono wiązania ulegające hydrolizie z uwolnieniem kolejnych związków: 1. Kwas aminometylenofosfonowy, 2. Kwas N-acetylaminometylenofosfonowy, 3. 5'-trifosforo-α-D-rybozyl 1'-

(N-acetamido-metylenofosfonian), 4. 5'-fosforo-α-D-rybozyl 1'-(N-acetylaminometylenofosfonian), 5. 5'-

fosforo-α-D-rybozyl 1,2-cyklofosforan, 6. α-D-rybozyl 1,5-bisfosforan, 7. 5-fosforo-α-D-rybozyl 1-difosforan, 8.

difosforan (PPi), 9. fosforan (Pi), 10. Kwas metylofosfonowy, 11. Kwas N-(metyloamino)bis-

(metylenofosfonowy), 12. Kwas (N-metyloamino)metylenofosfonowy, 13. Kwas iminobis(metylenofosfonowy).

Wyniki uzyskane w trakcie omawianego eksperymentu są dodatkowo interesujące z dwóch

powodów: zdolności organizmów do prowadzenia określonych przemian enzymatycznych,

uzależnionej od dostępu do składników odżywczych, w tym fosforu oraz indukcji takiej aktywności,

która może być efektem specyficznego stresu fizjologicznego. W celu sprawdzenia tego aspektu -

indukowanej zdolności do biotransformacji DTPMP, przeprowadzono szereg doświadczeń

wykorzystując w nich ekstrakty cytozolowe z odpowiednio stresowanych kolonii Anabaena variabilis.

W tym celu kolonie poddano: (i) dwutygodniowemu głodzeniu fosforowemu (Bg11-P), lub (ii)

kolonie rozwijały się dwa tygodnie w obecności 0,1 mM DTPMP jako jedynego źródła fosforu (Bg11-

P+DTPMP), albo (iii) przez okres dwóch tygodni kolonie sinic miały do dyspozycji polifosfonian jako

dodatkowe źródło fosforu (Bg11+DTPMP). Ekstrakty pozyskane ze wszystkich typów kolonii

inkubowano przez 48 godzin w obecności 1 mM DTPMP. We wszystkich przypadkach, w których

- 20 -

mikroorganizmy pozbawiono dostępu do Pi i/lub zapewniono im wcześniejszy kontakt

z polifosfonianem, intensywność przemian substratu wzrastała nawet o ponad 50% (Wykres 4.).

Dowiedziono tym samym, że zdolność do przekształcania aminoalkilofosfonianu może być

indukowana brakiem dostępnego fosforu w podłożu oraz wcześniejszym kontaktem z testowanym

fosfonianem. Wykazano też, że czynniki te wpływają na ogólną efektywność przemian from fosforu

użytecznych dla cyjanobakterii.

WYKRES 4. Intensywność przemian DTPMP przez ekstrakty cytozolowe pozyskane z komórek A.

variabilis rozwijających się w różnych warunkach dostępności form fosforu. Przez 14 dni

komórki sinicy rozwijały się w pożywkach zawierających, bądź nie, fosforany albo/i fosfoniany.

Następnie przez 48 godzin ekstrakty cytozolowe inkubowano z dodatkiem 1 mM DTPMP. Wpływ

stanu/stresu fizjologicznego kolonii na intensywność przemian substratu wyrażono, jako procentowy

(%) ubytek pól powierzchni obu pików testowanego fosfonianu.

Zaprezentowane wyniki demonstrują zdolność komórek kolonii Anabaena variabilis do

katalitycznych przemian, w których polifosfonian – DTPMP ulega, jeśli nie całkowitej, to częściowej

dekompozycji. Wynikiem tego procesu jest powstanie szeregu związków będących różnymi

połączeniami chemicznymi fosforu, a ich obecność, szczególnie AcAMPA, wskazuje potencjalny

kierunek tych przemian. W przypadku E. coli związek ten jest niezbędnym produktem pośrednim

w biotransformacji AMPA przez kompleks enzymatyczny C-P liazy [46]. Dodatkowo obecność

AcAMPA wskazuje na obecność N-acetyltransferazy aminoalkilofosfonianowej, PhnO [47-49].

W przypadku ekstraktu cytozolowego Anabaena variabilis trudno mówić o działaniu kompleksu C-P

liazy, który jako kompleks błonowy, w ekstrakcie cytozolowym raczej traci swe katalityczne

właściwości [5, 48]. Tym bardziej, że aktywacja systemu C-P liazy wymaga braku fosforanów

w podłożu [5, 50]. Natomiast obecność związków takich jak kwas iminobis(metylenofosfonowy)

(IBMPA) oraz kwas (N-metyloamino)-bis(metylenofosfonowy) (MABMP) wśród powstających

- 21 -

produktów, wskazuje na odmienny od opisanych do tej pory przebieg procesów biotransformacji

polifosfonianu. Tezę tę potwierdza także brak przekształceń MPA. Zarówno wyniki wspomnianych

eksperymentów, jak i propozycja ścieżek przemian fosfonowych kompleksonów jonów metali przez

cyjanobakterie zdobyły uznanie redakcji i recenzentów prestiżowego czasopisma Environmental

Microbiology (IF 5.932), na którego łamach zostały opublikowane, w artykule pod tytułem

„Biodegradation of the aminopolyphosphonate DTPMP by the cyanobacterium Anabaena variabilis

proceeds via a C–P lyase-independent pathway”.

Podobne doświadczenia przeprowadzono dla pozostałych związków oceniając ich podatność

na biokatalityczne przekształcenia przez słodkowodne sinice. Interesujące wyniki przyniosła analiza

danych, pod kątem zależności pomiędzy kierunkiem, a efektywnością procesów biotransformacji

fosfonianów, katalizowanych przez ekstrakty z określonych gatunków cyjanobakterii. Wyniki

wskazują, że charakter (kierunek, produkty) przemian zależy od substratu i nie jest specyficzny dla

gatunku cyjanobakterii. Natomiast efektywność tego procesu zależy w większym stopniu od gatunku

mikroorganizmu. Bogaty aparat enzymatyczny słodkowodnych cyjanobakterii okazał się użyteczny

w przekształceniach niektórych związków aminoalkilofosfonowych. Wydajność przekształceń

katalizowanych przez ekstrakty cytozolowe sinic, wydaje się wzrastać wraz z liczbą grup

metylenofosfonowych obecnych w cząsteczce. Wyjątek stanowi HDTMP, który zawiera

sześciowęglowy łańcuch alkilowy, co może zmniejszać jego dostępność substratową. Zatem

obserwowane przemiany zachodzą zgodnie z przedstawionym schematem/sekwencją zdarzeń,

w której kluczową rolę odgrywa struktura fosfonianu. Bezpośrednie działanie enzymatycznego

kompleksu C-P liazy, odpowiedzialnej za rozerwanie wiązania węgiel-fosfor, wydaje się sporne.

Chociaż, obecność AcAMPA, Rib 1’NAcAMPA, a w dwóch przypadkach także Rib 1,2-cP, mogłoby

takiej aktywności dowodzić.

W części pracy poświęconej statusowi energetycznemu komórki wykazano, że związki

fosfonowe mogą stymulować metabolizm cyjanobakterii. Zatem interesującą kwestią stało się

wyjaśnienie, czy może to wynikać z oddziaływania na wytwarzanie barwników związanych

z procesem fotosyntezy jak: karotenoidy czy fikobiliproteiny – związki tak istotne w komórkach

fotoautotrofów.

Wśród testowanych przeze mnie związków znajduje się między innymi N,N-

bis(fosfonometyleno) glicyna (GBMP) która jest skutecznym, kompetencyjnym inhibitorem

karboksylazy fosfo-enolo-pirogronianowej (PEPC, EC 4.1.1.31), względem P-enolo-pirogronianu [33,

51]. Uzyskane wyniki wskazywały, że GBMP skutecznie stymuluje wzrost mikroorganizmów. Efekt

ten obserwowano również, gdy substancja stanowiła jedyne dostępne dla mikroorganizmów źródło

fosforu. Podobnie, choć nieco słabiej działał analog strukturalny - kwas aminotri(metylenofosfonowy).

Jednak dla tego związku brak doniesień literaturowych świadczących o jego inhibicyjnym działaniu

względem enzymów autotrofów. Ocena pozytywnego oddziaływania fosfonianów na kolonie sinic

- 22 -

opierała się na badaniu całkowitej zawartości chlorofilu a - Chl a. Biosyntezę tej grupy barwników

cechuje kilka wspólnych etapów związanych z powstaniem innych, kluczowych w procesie

fotosyntezy układów chromoforowych – fikobilin, które w połączeniu z odpowiednimi białkami

tworzą barwne fikobiliproteiny [52]. Prócz pochłaniania i przekazywania chlorofilom kwantów

światła, fikobiliproteiny (PBP) odgrywają w komórce jeszcze inną, ważną rolę. W momencie

utrudnionego dostępu do źródeł azotu, enzymy kodowane przez gen nblA rozpoczynają degradację

PBP by zapewnić komórce odpowiedni zapas tego pierwiastka [53].

W przeprowadzonych doświadczeniach sprawdzano jak GBMP oraz ATMP, oddziałują na

zawartość fikobilin w komórkach trzech gatunków słodkowodnych sinic: A. variabilis, Ch. thermalis

oraz N. muscorum. Gatunki te, jako diazotrofy, posiadają dodatkowo zdolność asymilacji azotu

atmosferycznego, w momencie deficytu azotu w podłożu [54]. Stwierdzono, że w wyniku działania

ATMP oraz GBMP, udział poszczególnych barwników fikobilinowych w ich całkowitej puli (TBP)

różnił się od odpowiednich kontroli każdego z trzech testowanych gatunków (Wykres 5).

WYKRES 5. Ilościowy udział poszczególnych barwników fikobilinowych w komórkach

cyjanobakterii rozwijających się w różnych warunkach dostępności różnych form fosforu. PC –

fikocyjaniny, APC – allofikocyjaniny, PE – fikoerytryny. Stężenia (mg L-1

) odnoszą się do

względnej zawartości barwników w komórce. Zawartość zmierzona po 14-stu dniach hodowli, a

sinice rosły w następujących pożywkach: Bg11 (0.0), Bg11 -P (0.0-P), Bg11+0.1 mM związku (0.1),

oraz Bg11-P+0.1 mM związku (0.1-P).

Wyniki tej części toku badań, które opublikowano w Journal of Applied Phycology (IF 2.616),

w artykule “The aminophosphonate glyphosine enhances phycobiliproteins yields from selected

- 23 -

cyanobacterial cultures” dowodzą, że szczególnie GBMP, w stężeniu 0.1 mM pozytywnie wpływa na

zawartość sinicowych fikobilin.

Na wyjaśnienie zasługuje także kwestia wpływu testowanych fosfonianów na wytwarzanie

karotenoidów przez sinice. W tym przypadku, w żadnym z przeprowadzonych eksperymentów nie

stwierdzono istotnych różnic w zawartości tych barwnych metabolitów w odniesieniu do

odpowiednich kontroli. Taki wynik sugeruje brak bezpośrednich powiązań pomiędzy procesami

biochemicznymi modyfikowanymi obecnością testowanych fosfonianów i tymi, związanymi

z biosyntezą karotenoidów w komórkach sinic.

3. Podsumowanie

Testowane aminoalkilofosfoniany okazały się podatne na przemiany katalizowane przez

słodkowodne cyjanobakterie należące do gatunków: Anabaena variabilis, Chroococcidiopsis

thermalis, Chroococcus minutus, Fischerella maior oraz Nostoc muscorum. Efektywność i kierunek

tych przemian zależą od kilku czynników. Zasadniczym okazuje się stężenie ksenobiotyków

fosfonowych, gdyż dla większości testowanych gatunków stężenie przekraczające 0,25 mM, czasem

0,5 mM związku, okazywało się letalne. Najbardziej interesujące interakcje pomiędzy fosfonianami

i mikroalgami obserwowano w obecności około 0,1 mM ksenobiotyku, niezależnie od tego czy był

jedynym, czy dodatkowym dostępnym źródłem fosforu w podłożu. Zgodnie z przyjętą hipotezą,

możliwość biotransformacji fosfonowego substratu wydaje się zależeć głównie od struktury

chemicznej tego związku, przede wszystkim od liczby grup aminometylenofosfonowych i ich

rozmieszczenia w przestrzeni. W toku badań wykorzystano pięć gatunków sinic, należących do

odmiennych grup (sekcji) taksonomicznych, co miało na celu ustalenie relacji pomiędzy organizmami

różniącymi się budową, morfologią kolonii, sposobem podziału, czy zamieszkiwanym siedliskiem, a

ich zdolnością do biotransformacji połączeń fosfonowych. Uzyskane wyniki wskazują na istnienie

podobnych strategii przemian testowanych związków. Niewykluczone zatem, że w komórkach

cyjanobakterii mogą być aktywowane ścieżki biotransformacji aminoalkilofosfonianów, istniejące

jako swoisty relikt metaboliczny i pochodzące z okresu, gdy połączenia fosfonoorganiczne były

bardziej rozpowszechnione w biosferze Ziemi.

Śledzenie procesów biokatalitycznych przemian aminoalkilofosfonianów było możliwe dzięki

opracowaniu odpowiednich procedur: (i) oznaczania (na poziomie nanomolowym) produktów

transformacji fosfonianów w hodowlach, z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii

cieczowej, z tworzeniem pochodnych analitów, oraz (ii) pomiarów przemian aminoalkilofosfonianów

zachodzących w cytozolowych ekstraktach kolonii sinic, z zastosowaniem techniki ex vivo 31

P NMR.

Najbardziej interesujące wyniki uzyskano dzięki komplementarnemu wykorzystaniu obu metod i

pozwoliły one na stwierdzenie, że biotransformacje fosfonianów mogą zachodzić na zewnątrz bądź

wewnątrz komórek tworzących kolonie.

- 24 -

Dane pochodzące z wielu eksperymentów przeprowadzonych w toku moich badań dowiodły,

że aminoalkilofosfoniany, w określonych zakresach stężeń, mogą znacząco stymulować wzrost sinic,

ograniczając przy tym wykorzystanie fosforanów dostępnych w podłożu. Wzrost zawartości Pi w

podłożu w trakcie hodowli potwierdza tezę o biodegradacji substratów fosfonowych.

Obecność testowanych ksenobiotyków w podłożu hodowlanym skutkowała też zmianą statusu

energetycznego komórek kolonii eksperymentalnej, w stosunku do odpowiednich kontroli. Niektóre

z przetestowanych związków zwiększały wartość adenylowanego ładunku energetycznego (AEC),

w stosunku do komórek niepoddanych ich działaniu, co sugeruje wzrost udziału procesów

anabolicznych, czego skutkiem był intensywniejszy wzrost kolonii.

Analiza przemian związków fosfonowych na podstawie oznaczeń produktów tych procesów

w płynach hodowlanych (HPLC), jak również poprzez zastosowanie ekstraktów cytozolowych jako

modelu cytoplazmy sinicowej (ex vivo 31

P NMR) wskazuje, że decydującą rolę w kwestii zewnątrz-,

bądź wewnątrzkomórkowej lokalizacji biokatalitycznych transformacji fosfonianów zachodzących

przy udziale badanych mikroalg, odgrywa wielkość cząsteczek i przestrzenne rozlokowanie motywów

fosfonowych. Nie udało się jednak ustalić bezpośredniej korelacji pomiędzy liczbą grup

metylenofosfonowych, a miejscem zachodzenia przemian.

W świetle wyników przeprowadzonych badań można stwierdzić, że stosowane przemysłowo

aminofosfonowe kompleksony jonów metali, mogą stanowić źródło przyswajalnego fosforu dla

słodkowodnych cyjanobakterii. Związki te, jak wskazują odpowiednie wyniki zaprezentowane

w dysertacji, mogą być chętniej przyswajanymi składnikami pokarmowymi, niż fosforany. Ponadto,

pozytywny wpływ na biosyntezę fikobiliprotein - ważnych barwników fotosyntetycznych sinic

wskazuje, że działanie aminoalkilofosfonianów może być wielokierunkowe. Ta sytuacja sprawia, że

obecność tych substancji może znacząco nasilać problem zakwitów zbiorników wodnych.

Wiedza dotycząca przemian pochodnych fosfonowych, katalizowanych przez cyjanobakterie,

stwarza możliwości racjonalnego zastosowania tych procesów do ukierunkowanych transformacji

różnych form fosforu, także tych obecnych w środowisku.

4. Cytowana literatura

[1] Chin JP, McGrath JW, Quinn JP (2016). Microbial transformations in phosphonate biosynthesis and catabolism, and their importance in nutrient cycling. Curr Opin Chem Biol 31:50-57.

[2] Van Mooy BA, Krupke A, Dyhrman ST, Fredricks HF, Frischkorn KR, Ossolinski JE, Repeta DJ, Rouco M, Seewald JD, Sylva SP (2015). Phosphorus cycling. Major role of planktonic phosphate reduction in the marine phosphorus redox cycle. Science 348 (6236):783-785.

[3] McGrath JW, Chin JP, Quinn JP (2013). Organophosphonates revealed: new insights into the microbial metabolism of ancient molecules. Nat Rev Microbiol 11 (6):412-419.

[4] Jia Y, Lu Z, Huang K, Herzberg O, Dunaway-Mariano D (1999). Insight into the Mechanism of Phosphoenolpyruvate Mutase Catalysis Derived from Site-Directed Mutagenesis Studies of Active Site Residues. Biochemistry 38 (43):14165-14173.

- 25 -

[5] Ternan NG, Grath M, J.W., Mullan M, G., Quinn JP (1998). Organophosphonates: occurrence, synthesis and biodegradation by microorganisms. World Journal of Microbiology & Biotechnology 14:635-647.

[6] Kolowith LC, Ingall ED, Benner R (2001). Composition and cycling of marine organic phosphorus. Limnology and Oceanography 46 (2):309-320.

[7] Young CL, Ingall ED (2010). Marine Dissolved Organic Phosphorus Composition: Insights from Samples Recovered Using Combined Electrodialysis/Reverse Osmosis. Aquatic Geochemistry 16 (4):563-574.

[8] Benitez-Nelson C (2015). Ocean chemistry. The missing link in oceanic phosphorus cycling? Science 348 (6236):759-760.

[9] Horiguchi M, Kandatstu M (1959). Isolation of 2-Aminoethane Phosphonic Acid from Rumen Protozoa. Nature 184 (4690):901-902.

[10] Bhatacharya AK, Thyagarman G (1981). The Michaelis-Arbuzov Rearrangement. Chemical Review 81:415-430.

[11] Metson GS, Bennett EM, Elser JJ (2012). The role of diet in phosphorus demand. Environmental Research Letters 7 (4):044043.

[12] Van Vuuren DP, Bouwman AF, Beusen AHW (2010). Phosphorus demand for the 1970–2100 period: A scenario analysis of resource depletion. Global Environmental Change 20 (3):428-439.

[13] Nowack B (2003). Environmental chemistry of phosphonates. Water Res 37 (11):2533-2546. [14] Levchik SV (2006). A Review of Recent Progress in Phosphorus-based Flame Retardants. Journal of Fire

Sciences 24 (5):345-364. [15] Papaspyrides CD, Kiliaris P (2014). Polymer Green Flame Retardants. Elsevier. [16] Romanenko VD, Kukhar VP (2006). Fluorinated phosphonates: synthesis and biomedical application.

Chem Rev 106 (9):3868-3935. [17] Demmer CS, Krogsgaard-Larsen N, Bunch L (2011). Review on modern advances of chemical methods

for the introduction of a phosphonic acid group. Chem Rev 111 (12):7981-8006. [18] Gallant JE, DeJesus E, Arribas JR, Pozniak AL, Gazzard B, Campo RE, Lu B, McColl D, Chuck S, Enejosa J,

Toole JJ, Cheng AK, Study G (2006). Tenofovir DF, emtricitabine, and efavirenz vs. zidovudine, lamivudine, and efavirenz for HIV. N Engl J Med 354 (3):251-260.

[19] Michels AW, Ostrov DA, Zhang L, Nakayama M, Fuse M, McDaniel K, Roep BO, Gottlieb PA, Atkinson MA, Eisenbarth GS (2011). Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol 187 (11):5921-5930.

[20] Kafarski P, Lejczak B (1991). Biological Activity of Aminophosphonic Acids. Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements 63 (1-2):193-215.

[21] Anderson P (2006). Samarium for osteoblastic bone metastases and osteosarcoma. Expert Opin Pharmacother 7 (11):1475-1486.

[22] Jaworska J, Van Genderen-Takken H, Hanstveit A, Plassche E (2002). Environmental risk assessment of phosphonates, used in domestic laundry and cleaning agents in the Netherlands. Chemosphere 47:655-665.

[23] Annett R, Habibi HR, Hontela A (2014). Impact of glyphosate and glyphosate-based herbicides on the freshwater environment. J Appl Toxicol 34 (5):458-479.

[24] Battaglin WA, Meyer MT, Kuivila KM, Dietze JE (2014). Glyphosate and Its Degradation Product AMPA Occur Frequently and Widely in U.S. Soils, Surface Water, Groundwater, and Precipitation. J Am Water Resour As 50 (2):275-290.

[25] Studnik H, Liebsch S, Forlani G, Wieczorek D, Kafarski P, Lipok J (2015). Amino polyphosphonates - chemical features and practical uses, environmental durability and biodegradation. N Biotechnol 32 (1):1-6.

[26] Stalikas CD, Konidari CN (2001). Analytical methods to determine phosphonic and amino acid group-containing pesticides. J Chromatogr A 907:1-19.

[27] Baldwin DS (2013). Organic phosphorus in the aquatic environment. Environmental Chemistry 10 (6):439.

[28] Smith VH (2003). Eutrophication of Freshwater and Coastal Marine Ecosystems. A global problem. Environ Sci Pollut R 10 (2):126-139.

[29] Sharpley A, Wang X (2014). Managing agricultural phosphorus for water quality: lessons from the USA and China. J Environ Sci (China) 26 (9):1770-1782.

[30] Lipok J, Owsiak T, Młynarz P, Forlani G, Kafarski P (2007). Phosphorus NMR as a tool to study mineralization of organophosphonates—The ability of Spirulina spp. to degrade glyphosate. Enzyme Microb Tech 41 (3):286-291.

[31] Koskinen WC, Marek LJ, Hall KE (2016). Analysis of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in water, plant materials and soil. Pest Manag Sci 72 (3):423-432.

- 26 -

[32] Benbrook CM (2016). Trends in glyphosate herbicide use in the United States and globally. Environmental Sciences Europe 28 (3).

[33] Podestá FE, González DH, Andre CS (1987). Glyphosine Inhibits Maize Leaf Phosphoenolpyruvate Carboxylase. Plant and Cell Physiology 28 (2):375-378.

[34] Dusky JA, Kang MS, Glaz B, Miller JD (1985). Response of eight sugarcane cultivars to glyphosine and glyphosate ripeners. Journal of Plant Growth Regulation 4 (1-4):225-235.

[35] Nowack B, Stone AT (2000). Degradation of Nitrilotris(methylenephosphonic Acid) and Related (Amino)Phosphonate Chelating Agents in the Presence of Manganese and Molecular Oxygen. Environ Sci Technol 34 (22):4759-4765.

[36] Lesueur C, Pfeffer M, Fuerhacker M (2005). Photodegradation of phosphonates in water. Chemosphere 59 (5):685-691.

[37] Godinot C, Gaysinski M, Thomas OP, Ferrier-Pages C, Grover R (2016). On the use of 31

P NMR for the quantification of hydrosoluble phosphorus-containing compounds in coral host tissues and cultured zooxanthellae. Sci Rep 6:21760.

[38] Schweitzer B, Simon M (1995). Growth limitation of planktonic bacteria in a large mesotrophic lake. Microb Ecol 30 (1):89-104.

[39] Toolan TJDW, Stuart Findlay (1991). Inorganic phosphorus stimulation of bacterioplankton production in a meso-eutrophic lake. Appl Environ Microbiol 57 (7):2074-2078.

[40] Lin S, Litaker RW, Sunda WG (2016). Phosphorus physiological ecology and molecular mechanisms in marine phytoplankton. J Phycol 52 (1):10-36.

[41] Atkinson DE (1971). Enzymes as Control Elements in Metabolic Regulation, vol 1. The Enzymes. Structure and Control. Academic Press, Inc., New York and London.

[42] Atkinson DE, Walton GM (1967). Adenosine triphosphate conservation in metabolic regulation. Rat liver citrate cleavage enzyme. J Biol Chem 242 (13):3239-3241.

[43] Şengör SS, Ginn TR, Brugato CJ, Gikas P (2013). Anaerobic microbial growth near thermodynamic equilibrium as a function of ATP/ADP cycle: The effect of maintenance energy requirements. Biochemical Engineering Journal 81:65-72.

[44] Hünken M, Karsten U, Wiencke C (2005). Determination of the adenylate energy charge (AEC) as a tool to determine the physiological status of macroalgal tissues after UV exposure. Phycologia 44:249-253.

[45] Hove-Jensen B, McSorley FR, Zechel DL (2011). Physiological role of phnP-specified phosphoribosyl cyclic phosphodiesterase in catabolism of organophosphonic acids by the carbon-phosphorus lyase pathway. J Am Chem Soc 133 (10):3617-3624.

[46] Hove-Jensen B, McSorley FR, Zechel DL (2012). Catabolism and detoxification of 1-aminoalkylphosphonic acids: N-acetylation by the phnO gene product. PLoS One 7 (10):e46416.

[47] Kaneko T (2001). Complete Genomic Sequence of the Filamentous Nitrogen-fixing Cyanobacterium Anabaena sp. Strain PCC 7120. DNA Research 8 (5):205-213.

[48] Hove-Jensen B, Zechel DL, Jochimsen B (2014). Utilization of glyphosate as phosphate source: biochemistry and genetics of bacterial carbon-phosphorus lyase. Microbiol Mol Biol Rev 78 (1):176-197.

[49] Teikari J, Osterholm J, Kopf M, Battchikova N, Wahlsten M, Aro EM, Hess WR, Sivonen K (2015). Transcriptomic and Proteomic Profiling of Anabaena sp. Strain 90 under Inorganic Phosphorus Stress. Appl Environ Microbiol 81 (15):5212-5222.

[50] Wackett LP, Wanner BL, Venditti CP, Walsh CT (1987). Involvement of the phosphate regulon and the psiD locus in carbon-phosphorus lyase activity of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 169 (4):1753-1756.

[51] Croft SM, Arntzen CJ, Vanderhoef LN, Zettinger CS (1974). Inhibition of chloroplast ribosome formation by N,N-bis(phosphonomethyl)glycine. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis 335 (2):211-217.

[52] Stadnichuk IN, Krasilnikov PM, Zlenko DV (2015). Cyanobacterial phycobilisomes and phycobiliproteins. Microbiology 84 (2):101-111.

[53] Baier K, Lehmann H, Stephan DP, Lockau W (2004). NblA is essential for phycobilisome degradation in Anabaena sp. strain PCC 7120 but not for development of functional heterocysts. Microbiology 150 (Pt 8):2739-2749.

[54] Hilton JA, Meeks JC, Zehr JP (2016). Surveying DNA Elements within Functional Genes of Heterocyst-Forming Cyanobacteria. PLoS One 11 (5):e0156034.

- 27 -

5. Wykaz dorobku naukowego

a) Publikacje w czasopismach naukowych

[1] Damian Drzyzga, Giuseppe Forlani, Emilia Niemczyk and Jacek Lipok, The aminophosphonate

glyphosine enhances phycobiliprotein yields from selected cyanobacterial cultures - Journal of

Applied Phycology doi:10.1007/s10811-017-1271-7

[2] Damian Drzyzga and Jacek Lipok, Analytical insight into degradation processes of

aminopolyphosphonates as potential factors that induce cyanobacterial blooms

Environmental Science and Pollution Research doi:10.1007/s11356-017-0068-1

[3] Damian Drzyzga and Jacek Lipok, Glyphosate dose modulates the uptake of inorganic

phosphate by freshwater cyanobacterial –in Journal of Applied Phycology doi:10.1007/s10811-

017-1231-2

[4] Damian Drzyzga , Giuseppe Forlani, Jochen Vermander, Paweł Kafarski, Jacek Lipok, (2017).

Biodegradation of the aminopolyphosphonate DTPMP by the cyanobacterium Anabaena

variabilis proceeds via a C-P lyase-independent pathway. Environmental Microbiology 19

(3):1065-1076

[5] Ewa Kasowska-Żok .,Monika Ostrowska, Hanna Studnik, Lucyna Balcerzak, Beata Żyszka,

Damian Drzyzga., Grzegorz Bazgier, Paweł Kafarski, Jacek Lipok, (2014). The biotechnological

potential of cyanobacteria forming blue-green algal blooms, Chemik, 68 (4): 357-360

b) Rozdziały w monografii :

[1] Damian Drzyzga, Jacek Lipok, „Cyjanobakterie – konserwatywne fotoautotrofy o unikalnych

zdolnościach adaptacyjnych”. [w:] Na pograniczu Chemii i Biologii, pod red. H. Koroniaka, J.

Barciszewskiego, Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznao 2013, XXXI, 385-394

c) Ustne wystąpienia konferencyjne:

[1] Jacek Lipok, Damian Drzyzga. Komplementarne zastosowanie Magnetycznego Rezonansu

Jądrowego 31P NMR i Wysokosprawnej Chromatografii Cieczowej, w badaniach

biotransformacji aminofosfonianów. X Jubileuszowa Konferencja Analityczne Zastosowania

Chromatografii Cieczowej. 20-21 października 2016, Warszawa

[2] Emilia Kazek, Damian Drzyzga, Jacek Lipok. Stymulujący wpływ glifozyny na biosyntezę

fikobiliprotein przez cyjanobakterie. 59 Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa Chemicznego –

19-23 września 2016, Poznao

[3] Jacek Lipok, Damian Drzyzga, Paweł Kafarski. Biodegradation of diethylenetriaminepenta

(methylenephosphonic) acid (DTPMP) by the cell extract of cyanobacterium Anabaena sp., as

the example of sequence-repeated process. International Conference on Phosphorus

Chemistry, 5-10 czerwca 2016, Kazan, (Russia)

- 28 -

[4] Damian Drzyzga, Jochen Vermander, Jacek Lipok. Ukierunkowane przemiany enzymatyczne

kwasu aminopolifosfonowego - DTPMP, katalizowane przez ekstrakt komórkowy sinicy

Anabaena sp. 58. Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa Chemicznego, 21-25 września 2015,

Gdaosk

[5] D. Drzyzga, J. Lipok. The promoting effect of aminophosphonate compounds in formation of

freshwater cyanobacterial blooms. I Międzynarodowe Sympozjum Studentów i Doktorantów

"Biotechnologia Środowiskowa", 21-22 maja 2015, Gliwice

[6] J. Lipok, D. Wieczorek, H. Studnik, D. Drzyzga, P. Kafarski. An in-vivo and ex-vivo NMR Studies

on Biotransformation of Aminophosphonates by Autotrophic and Heterotrophic

Microorganisms. 20th International Conference on Phosphorus Chemistry, 28.06-2.07 2014,

Dublin (Ireland)

[7] Lucyna Balcerzak, Damian Drzyzga, Hanna Studnik, Beata Żyszka, Jacek Lipok. Zdolności

cyjanobakterii do biotransformacji zróżnicowanych strukturalnie związków organicznych. Pitro

VI-IX Targi Wiedzy Technologicznej, 24-25 października 2013, Opole

[8] Damian Drzyzga, Jacek Lipok, Hanna Studnik, Paweł Kafarski. Aktywnośd biologiczna wybranych

kompleksonów aminopolifosfonowych wobec cyjanobakterii, 56 Zjazd Naukowy Polskiego

Towarzystwa Chemicznego oraz Stowarzyszenia Inżynierów i Techników Przemysłu

Chemicznego, 16-20 września 2013, Siedlce

[9] Damian Drzyzga, Jacek Lipok. The ability of selected species of freshwater cyanobacteria to

utilization of phosphonates xenobiotics. XI Seminarium Doktorantów "Na pograniczu chemii i

biologii", 1 - 4 czerwca 2013, Ustroo

[10] Damian Drzyzga, „Przyszłośd mieni się kolorem zielonym” – o możliwościach wykorzystania

cyjanobakterii w procesach biodegradacji polifosfonianów uciążliwych dla środowiska, V

Ogólnopolskie Sympozjum Kół Naukowych – Wiązania Wiedzy, 14-15 grudnia 2012, Opole

[11] Damian Drzyzga, Hanna Studnik, Monika Ostrowska, Grzegorz Bazgier, Jacek Lipok. Potencjał

biotechnologiczny cyjanobakterii, PITRO V-VIII TARGI Wiedzy Technologicznej, 13-14 grudnia

2012 Opole

d) Komunikaty konferencyjne w formie posterów:

[1] Monika Lenartowicz, Damian Drzyzga, Jacek Lipok. Wpływ jonów Ni2+ oraz organicznych

połączeo fosforu na fikobiliproteiny w komórkach Anabaena variabilis. XLI Międzynarodowe

Seminarium Naukowo-Techniczne „Chemistry for Agriculture”, 27 - 30 listopada 2016,

Karpacz

[2] Drzyzga Damian, Lipok Jacek. Zastosowanie HPLC-UV do oznaczania aminowych produktów

biotransformacji aminofosfonianów przez cyjanobakterie. 59 Zjazd Naukowy Polskiego

Towarzystwa Chemicznego – 19-23 września 2016, Poznao

[3] Damian Drzyzga, Jacek Lipok. Structural constraints of N-polyphosphonic substances

influencing their biodegradation by cyanobacterial cell extracts. 17th European Congress on

Biotechnology, 3-6 czerwca 2016 Kraków

[4] Damian Drzyzga, Paweł Kafarski and Jacek Lipok. Glyphosate as a useful source of nutritive

phosphorus for freshwater cyanobacteria - NMR and HPLC study. 13th European Workshop on

Phosphorus Chemistry 2016, 7 – 9 marca 2016, Berlin (Germany)

[5] Damian Drzyzga, Ewa Kasowska-Żok, Paweł Kafarski, Jacek Lipok Biotransformation of

glyphosine as a factor promoting the growth of freshwater cyanobacterium Anabaena sp.. 2nd

Symposium on Biotransformations for pharmaceutical and cosmetic industry, 23-24

- 29 -

października 2014, Warszawa

[6] Damian Drzyzga, H. Studnik, J. Lipok, P. Kafarski, M. Bertazzini, G. Forlani. Biochemical basis for

cyanobacterial sensitivity to glyphosine, 57. Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa

Chemicznego, Częstochowa 14-18 września 2014

[7] Damian Drzyzga, Hanna Studnik, Jacek Lipok, Paweł Kafarski. Biodegradacja kwasu

dietylenotriaminopenta(metyleno-fosfonowego) przez halofilne cyjanobakterie. XXXVII

Międzynarodowe Seminarium Naukowo Techniczne – „Chemistry for Agriculture”, 2-5 grudnia

2012, Karpacz

[8] Jacek Lipok, Damian Drzyzga, Hanna Studnik, Stefan Liebsch, Giusseppe Forlani, Paweł Kafarski.

Możliwości biodegradacji popularnego kompleksonu – kwasu etylenodiamino tetra

(metylenofosfonowego) przez halofilne sinice. 55 Zjazd Polskiego Towarzystwa Chemicznego

oraz Stowarzyszenia Inżynierów i Techników Przemysłu Chemicznego; 16-20 września 2012;

Białystok

[9] Jacek Lipok, Damian Drzyzga, Hanna Studnik, Stefan Liebsch, Giusseppe Forlani, Paweł Kafarski.

Biodegradation of ethylenediamine tetra(methylene phosphonic) acid by halophilic

cyanobacteria. 19th International Conference on Phosphorus Chemistry, 8-12 lipca 2012;

Rotterdam (Netherlands)

e) Udział w realizacji grantów i projektów naukowych :

[1] Wykonawca w grancie finansowanym przez Narodowe Centrum Badao i Rozwoju, pt:

„Pozyskiwanie metabolitów wtórnych z mikroalg i cyjanobakterii w oparciu o zautomatyzowany

system fotobioreaktorów” (Nr PBS3/B8/25/2015). Lata 2015-2017

[2] Wykonawca w grancie finansowanym przez Narodowe Centrum Nauki, pt: „Biodegradacja

ksenobiotyków aminofosfonowych przez cyjanobakterie”, (Nr UMO-2011/01/B/NZ9/04722). Lata

2012-2015

[3] W latach 2012, 2013, 2015, 2016 udział w projektach finansowanych ze środków statutowych dla

młodych naukowców

f) Stypendia

[1] Stypendium Rektora dla najlepszych doktorantów w roku akademickim 2016/2017.

[2] Stypendium doktoranckie w roku akademickim 2015/2016 oraz 2016/2017.

[3] Stypendium doktoranckie z dotacji podmiotowej na dofinansowanie zadao projakościowych

01.01.-31.12.2016 r.

[4] Stypendia doktoranckie – inwestycja w kadrę naukową województwa opolskiego II realizowanego

w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki 2007-2013, 1.10.2014-30.09.2015 r.

[5] Stypendia doktoranckie – inwestycja w kadrę naukową województwa opolskiego realizowanego w

ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki 2007-2013, 1.10.2012-30.09.2014 r.

g) Zagraniczne staże naukowe

[1] Kwiecieo 2014 - lipiec 2014. University of Ferrara, Department of Biology and Evolution, Ferrara

(Włochy)