MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE

SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ

Dr. Fahri ŞAHİN

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı

MKH ÜRETİMİ ve SORUNLAR

Sorunlar

• Örnek alımı• MNH eldesi• Kültüre etme• Tripsinizasyon• Pasaj• Tanımlama / Diferansiyasyon• Etik / Yasal sorunlar

Örnek Alımı

Kemik İliği

Spongioz Kemik

Kortikal Kemik

MNH tabakasıPlazma

Fikol

EritrositFikol

KİA

Nonadheren hücrelerin atılması

Santrifüj

800g 20 Dak

Yıkama

48-72 saat inkübasyon

Taze BY

İnkübasyon

Tripsinizasyon

Tripsin - EDTA

5 dk İnkübasyon

Tripsin blokajı ve yıkama

Tekrar kültür ve tripsinizasyon ile 2-6 pasaj

Serum içeren Media veya PBS

800G 10 dk

FBS

Son yıllara kadar MKH lerin in vitro ekspansiyonu için 10 % FETAL BOVİNE SERUM (FBS) kullanılıyordu

• Virüs, bakteri, prion bulaşı

• İmmün veya lokal inflamatuar reaksiyonlar

• Engrafman yetmezliği, rejeksiyon

Otolog serum kullanımını gündeme getirmiştir

A

B

%1 OS

C

D

%3 OS %10 FBS

%10 OS

Proliferasyon : C > D = B > A Osteojenik Dif. : C +++ > D ++ > B + > A 0Adipojenik Dif. : D +++ > C ++ > B + > A 0

Norbert Stutea et al. Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use. Experimental Hematology 2004 (Hamburg, Germany)

Türler arasında farklılık

• İnsan, sıçan ve tavşanda MKH üretim nispeten kolay

• Farede üretim oldukça sıkıntılıdır

• Farelerin 5-florourasil ile muamelesi

• CD11b’ ye karşı antikor ile immündeplesyon

• BY değişikliği:– DMEM yerine α-MEM

– Düşük glukoz içerikli BY

1. Flowsitometrik değerlendirme

• CD11b, CD31, CD34 ve CD45 negatif

• SH2 (CD105), SH3 veya SH4 (CD73),

CD117 (c-kit), CD90 (Thy-1) ve STRO-1 pozitif

Üretilen MKH’ lerin Kalite KontrolüÜretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü

Üretilen MKH’ lerin Kalite KontrolüÜretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü

2. Diferansiyasyon özelliğinin değerlendirilmesi *

Osteojenik diferansiyasyon

* Kondrojenik diferansiyasyon

* Adipojenik diferansiyasyon

Osteojenik Diferansiyasyon

Alkalen fosfataz aktivitesi

ESM mineralizasyonu von Kossa boyası

Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray)

Kondrojenik Diferansiyasyon

Gümüş mavisi boyası Safranin O boyası

Adipojenik Diferansiyasyon

Lipidden zengin vakuollerin intraselüler birikimi

Oil-Red O boyası

Good Manufacturing Practice

GMP

That is not dead which can eternal lie,And with strange aeons even death may die

Howard Lovecraft

This is not the endThis is not even the beginning of the endBut it is the end of the beginning

Winston Churchill

For Tissue Engineering……