Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

4. Isozymy

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

Isozymová analýza

► Studujeme variabilitu proteinů, resp. jedné jejich podskupiny – enzymů (proteinů katalyzujících biochemické reakce)» variabilita = různá mobilita na ELFO gelu

► Vizualizujeme projevy katalytické aktivity pomocí tzv. histochemického barvení = nedetekujeme přímo molekuly studovaných proteinů

► Známo přes 2000 enzymů

► Pro analýzu používáno řádově několik desítek» v naší laboratoři v současnosti 21 enzymových systémů (někt.

zahrnují více lokusů = různých molekul)

Klasifikace enzymů

► Enzyme Commision number (EC):1. oxidoreduktasy (přenos elektronů, typicky dehydrogenasy)

2. transferasy (přenos určité skupiny – fosfát, hydroxyl, amin,…)

3. lyasy (štěpení vazeb C-C, C-N, C-O)

4. hydrolasy (podskupina předešlé, hydrolytické štěpení)

5. isomerasy (změna geometrické struktury molekuly)

6. ligasy (spojení dvou molekul)

► Podskupiny podle substrátu, přenášené skupiny, apod., každý enzym má 4-místné číslo:» ADH – alcohol dehydrogenase, EC 1.1.1.1

» EST – esterase, EC 3.1.1.-

» http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

Isozymy / allozymy

► Isozymy (isoenzymy) - všechny enzymy (= všechny proužky na gelu), které vizualizujeme pomocí jedné barvící reakce

» stejná metabolická funkce, ale může jít o různé geny

• např. jaderný a chloroplastový

• dva enzymy s podobnou funkcí, které jsou schopny metabolizovat daný substrát

► Allozymy – isozymy, které jsou produkty jednoho genu (lokusu); jednotlivé allozymy přestavují jednotlivé alely

Isozymy / allozymy

Isozymy

Allozymy lokus 3

Allozymy lokus 2

Allozymy lokus 16 alel

DIA, Centaurea

Co vlastně detekujeme ?

► Rozdíl v mobilitě molekuly při elektroforéze:» velikost (v rámci allozymů ale ± stejná)» tvar molekuly (sekundární, terciární a kvartérní struktura)» elektrický náboj

► Předpokládáme, že rozdílná mobilita odráží rozdíly v primární struktuře = pořadí aminokyselin = rozdíly v kódující sekvenci DNA

► Vzhledem k degeneraci gen. kódu se ne všechny bodové mutace projeví změnou struktury proteinu» odhady řádově 20-60%

► Předpoklad selekční neutrality (asi neplatí zcela)

Isozymy / allozymy

Izolace

► Potřeba zachovat enzymatickou aktivitu» ve všech fázích citlivé na teplotu

► Izolace z živé tkáně (~ desítky mg = „středně velký“ list)

► Homogenizace v izolačním pufru» stabilizace pH

» stabilizace proteinů (antioxidanty apod.)

» příp. odstranění nízkomolekulárních inhibitorů

► Centrifugace

► Uchovávání v -80°C

Izolace

6PGDH, Spergularia

pufr 1 pufr 2 pufr 3

► Vliv izolačního pufru

Elektroforéza

► Škrobový gel (horizontální)► Polyakrylamidový gel (vertikální)

► Alkaické pH → záporný náboj většiny aminokyselin → pohyb k anodě (+)

► Velmi citlivá metoda – projeví sejiž změna náboje o jednotku

► Modifikace: gradient pH → isoelectrical focusing (immobilised pH gradient)

Detekce enzymů

► Gel po elektroforéze bezbarvý

► Obsahuje všechny proteiny přítomné v izolátu

► Enzymy detekujeme pomocí tzv. histochemického barvení, tj. detekujeme specifickou katalytickou aktivitu

► Gel vložíme do roztoku se substrátem specifickým pro daný enzym / skupinu enzymů

Detekce enzymů

► Barevná reakce v místě výskytu enzymu v gelu:

► Pozitivní reakcerozpustný substrát → nerozpustný barevný produkt

► Negativní reakcebarevný substrát → bezbarvý produkt

Detekce enzymů

► Barevná reakce v místě výskytu enzymu v gelu:

► Pozitivní reakcerozpustný substrát → nerozpustný barevný produkt

► Negativní reakcebarevný substrát → bezbarvý produkt

► Spřažené reakcesubstrát i produkt bezbarvé, ale přeměna je spojena s dalšími reakcemi (např. oxidace / redukce), jejichž projev lze detekovat

Spřažené reakce

Detekce enzymů

substrát

produkt

rozpustná sůl

Detekce enzymů

► Barevná reakce v místě výskytu enzymu v gelu:

► Pozitivní reakcerozpustný substrát → nerozpustný barevný produkt

► Negativní reakcebarevný substrát → bezbarvý produkt

► Spřažené reakcesubstrát i produkt bezbarvé, ale přeměna je spojena s dalšími reakcemi (oxidace / redukce), jejichž projev lze detekovat

► Enzymová kaskádapřímo nedetekovatelná reakce; přidáme do roztoku další enzym, který dále metabolizuje produkt 1. reakce a návaznou reakce jsme schopni obarvit

Interpretace gelů

► Sada proužků na gelu = zymogram = isozyme pattern

► Porovnání patterns mezi dvěmi vzorky» hodnotíme shodu (např. při identifikaci klonů)

EST, Carex nigra

Interpretace gelů

► Většinou snaha o alelickou interpretaci

Předpoklady:

► rozdíly v mobilitě odrážejí rozdíly v primární struktuře /v sekvenci DNA

► homologie stejně migrujících proužků

► kodominance

Dále nutno znát:

► ploidie (= počet alel)

► kvartérní struktura – z kolika podjednotek se skládá funkční molekula enzymu

Interpretace gelů

Monomerní enzymy

► každý proužek = alela

► teoreticky stejná intenzita proužků – u polyploidů lze dávkování alel odhadnout z intenzity» … ale může to být dost nepřesné

diploid tetraploid

ABAA

BBBB

BCCC

ABCC

BC

LAP, Centaurea DIA, Centaurea

BBBCBCCC

CCCCABBC

ABBCBBBC

ABBB

Interpretace gelů

Dimerní enzymy

► u heterozygotů se 2 alelami jsou 3 proužky

AB

A

BB

A

AA BBA B AB

BB AA AB AA AB AB

1

2

1

► s více alelami složitější pattern

► odchylky od očekávané intenzity mohou prozradit dávkování alel

6-PGDH, Centaurea

AABC

4

21

1

4

4

ABCD

1

6

9

AAAB

Interpretace gelů

Tetramerní enzymy

► u heterozygotů se 2 alelami 5 proužků

1

6

1

4

4

DIA-3, Carex nigra

Interpretace gelů

Problémy při hodnocení gelů

Rozdíly v intenzitě► intenzitu proužků mezi jedinci nelze srovnávat► v rámci jedince může signalizovat poměr alel (u polyploidů)

Nulové alely► alely bez detekovatelného projevu, jedinec chybně skórován

jako homozygot► u monomerů odhalitelné jen kontrolním křížením► většinou nemohou existovat v homozygotním stavu

Interpretace gelů

Problémy při hodnocení gelů

Sekundární proužky► různá mobilita při stejné primární struktuře

» post-translační úpravy

» degradace během zpracování vzorku

Interlokusové (intergenické) proužky► u enzymů z více podjednotek, heterodimery tvořeny produkty

různých lokusů» v živé buňce nejsou (nesetkají se)

» po homogenizaci materiálu při izolaci se setkat mohou

Interpretace gelů

Problémy

6PGDH, Centaurea

lokus 2

lokus 1

BB BB BB AB BC BB BB BB BB BB

AA AA AC AC AC AC AA AB AA AA

sekundární proužek

interlokusový proužek

(skoro) nulová alela 6pdgh-1 c

sekundární proužek

6PGDH, dimerní enzym, diploidi

Vyhodnocování allozymových dat

► Kodominantní data» Pro každý lokus a jedince přítomnost alel

» U polyploidů i počet kopií alel (AAAB vs. AABB vs. ABBB)

» Multilokusové genotypy

» Rovnocennost alel (změna z A na B je stejně pravděpodobná jako z A na C, vzdálenost alel na gelu se neuvažuje)

► Dominantní data» Pouze přítomnost / nepřítomnost alely

» Matice 0 / 1 přes všechny lokusy

» Ztráta informace, ale někdy nelze kodominantní data spolehlivě přečíst (zejména polyploidi)

Optimalizace

► 1. Výběr izolačního pufru» Několik vzorků v různých pufrech, co nejvíce enzymů

» Sledujeme, jak dobře se gely barví a čitelnost proužků

► 2. Výběr enzymových systémů» Izolace ve vybraném pufru

» Vzorky z různých populací

» Vybíráme barvitelné enzymy s vhodnou mírou variability

» Alternativní barvení, modifikace koncentrací,…

► 3. Vlastní analýza» všechny vzorky

» obvykle více enzymů (4-8) → multilokusový genotyp

Porovnání s jinými metodami

Výhody

► cena

► kodominantní charakter

► univerzálnost

► reprodukovatelnost

► menší mutační rychlost (např. proti mikrosatelitům)

► (typ práce: malé riziko kontaminací, velké objemy)

Nevýhody

► živý materiál

► větší množství materiálu

► někdy omezená variabilita

► kódující oblast – ne vždy selekčně neutrální

► jedovatost

► (typ práce:citlivost na teplotu, pH, koncentrace - „chemická práce“)

Identifikace klonů

Košnar Jan et al. 2012, Flora 207: 294–302

► 7 populací Carex nigra po 10 jedincích pro kultivační pokusy

► identifikace klonů → vyloučení pseudoreplikací

► 5 enzymových systémů (6PGDH, AAT, DIA, SOD, EST),6 alelicky hodnotitelných lokusů + celkový pattern u EST

► skórovány jak alely, tak celkové genotypy

Košnar Jan et al. 2012, Flora 207: 294–302, Carex nigra 6pgdh-1 sod-1 aat-2 dia-1 dia-3 est-3

BOR 7 A A C C A BBOR 5 A B A A B ABOR 8 A B A A B ABOR 55 A B A C B ABOR 6 A C A A B ABOR 52 A F C A A ABOR 3 C A A A A ABOR 9 C B A A B EBOR 53 C D A A A BBOR 54 H H A A A A

BAL 43 A B A A A ABAL 45 A B B C A ABAL 46 B B A E C BBAL 50 B B A E C BBAL 49 B B A C C B

Identifikace klonů

Identifikace klonů

Kyncl et al. 2006, Plant Ecology 186: 97-108

► demografie Spartocytisus supranubius na Tenerife

► vývoj populací, ohrožení králíky, …

► isozymy použity ke studiu klonální struktury populace

bíle: unikátní genotypy; šrafovaně: klony

Identifikace klonů

Engloner et al. 2010, Aquatic Botany 92: 1–8► klonální struktura porostu Phragmites australis na Balatonu► porovnání isozymů, RAPD a SSR

► podobné výsledky (pokles diverzity směrem od břehu, velikost klonů, poloha největších klonů)

► 11 isozymových systémů rozlišilo podobný počet genotypů jako 4 SSR lokusy (39 a 37), RAPD nadhodnocují

► …bohužel není jistota, že vzorkypocházely přesně ze stejných rostlin(stejné místo na transektu, ale odběr vrůzných letech)

Hybridizační pokusy

Hardy et al. 2001, Heredity 87: 136-145

► křížení diploidních a tetraploidních chrp z komplexu C. jacea – C. nigra

► rodičovští jedinci vybráni tak, aby se lišili

► ověření původu potomsta (autogamie vs. hybridizace vs. pylová kontaminace)

Hybridizace

Mir et al. 2009, Plant Biol. 11: 213-226

► hybridizace Quercus ilex a Q. suber

► isozymy (3 enz., 18 alel) + cpDNA» frekvence alel

» hybrid index, F-statistiky, GST, linkage disequilibrium

► prokázána obousměrná hybridizace

► velký podíl morfologicky „čistých“jedinců, kteří jsou geneticky hybridi

► regionální rozdíly

Mezidruhové rozdíly, popul. diverzita

Pedersen & Ehlers 2000, Plant Syst. Evol. 223: 173-183► autogamický Epipactis renzii v Dánsku► 9 isozymových systémů

» rozdělení alel do populací, F-statistiky» + data o rozšíření taxonů, repro. systém

► stejné alely jako místní E. helleborine (zatímco jiné druhy kruštíků odlišné)

► některé unikátní alely přítomny u obouv jedné směsné populaci

► velký inbreeding (autogamie) u E. renzii, u E. hell. jen v některých populacích

► recentní vznik z E. helleborine, opakovaně?► přechod k autogamii asi dán selekcí na

extrémním stanovišti (písečné duny)Epipactis renziihttp://www.guenther-blaich.de/

Reprodukční systém

Mandák et al. 2009, Biol. J. Linn Soc. 98: 596-607► Carduus acanthoides► jednoletý ruderál, teoreticky:

» výhodná autogamie

» izolované populace

» nízká vnitro- a vyššímezipopulační variabilita

► 6 enzymových systémů» počet alel, polymorfních lokusů, gen. distance

» F-statistika, mezipopulační diferenciace (GST)

» software TFPGA a FSTAT

► vyšlo to naopak → nízký inbreeding, self-incompatibility, snadné šíření semen,…

Reprodukční systém (parentage analysis)

Friedman & Barrett 2009, New Phytol. 181:489-497► 7 druhů ostřic (jednodomé, ale protogynie)► studován význam samoopylení► isozymy – dva variabilní lokusy, vyhodnocení

v programu MLTR» modelování genotypů a původu potomstva z

genotypů možných rodičů» odhad míry samoopylení / cizosprášení

► …a umělé opylování různým pylem apod.

► samoopylení je překvapivě časté, protogynie nestačí (opylení z jiné lodyhy téhož (geitono-gamie, překryv zralosti tyčinek a prašníků)

► možná pojistka proti nedostatku pylu

Původ polyploidie

Hardy et al. 2000, New Phytol. 146: 281-290Hardy et al. 2001, Heredity 87: 136-145

► původ tetraploidní Centaurea jacea► hybridizace ABCD × CCCC, analýza potomstva, zastoupení

alel v potomstvu (2 test)

► v potomstvu všechny kombinace alel → náhodné párování chromosomů = tetrasomická dědičnost, autopolyploidie» u allopolyploidů (disomická dědičnost) by měly chybět

kombinace alel, které pochází od stejného předka

ad ac bc ad ab bd ad ad cd bc cd bc ab cd bc bc cd bd

Původ polyploidie

Mandáková & Münzbergová 2008, Plant Syst. Evol. 274: 155-170

► Srovnání diploidní a hexaploidní Aster amellus

► Morfologie, rozšíření, isozymy» frekvence alel (alelické, 0/1) » matice genetických vzdáleností →

cluster analysis, PCoA

► Hexaploidi jsou autopolyploidi» podobné alely (specifická a. vzácné)» homozygoti + různé typy vícealelických

heterozygotů, různé dávkování alel» není fixovaná heterozygozyta

► … ale jsou už izolovaní déle

Populační genetika – ochrana / invazky / …

Gibson et al. 2008, Am. J. Bot. 95: 588-596

► porovnání Alnus serrulata (souvislý areál) a A. maritima (fragmentovaný areál)

► ochranářská genetika

► F-statistiky, diferenciace mezi popu-lacemi, odhad gene flow,…

► A. maritima má výrazně větší mezi-populační variabilitu» vznik asi fragmentací areálu

► pro praktickou ochranu třeba mítmateriál z více populací (aby se zachytila celková diverzita druhu)

Geografická variabilita / fylogeografie

Liepelt et al. 2009, Review Paleobot. Palynol. 153: 139-149

► variabilita a šíření Abies alba (mtDNA, cpDNA, isozymy, palynologie)» podobnost populací (software BAPS), počet genotypů

► identifikace nových refugií, které nebyly vidět v mtDNA► postupné genetické ochuzování směrem k severu

… a více podobných (vesměs) starších studií na jiných dřevinách