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Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012

Métodos Físicos de Análise - ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA / VISÍVEL

Prof. Dr. Leonardo LucchettiMestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ

Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – FiocruzDocente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FiocruzDocente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica – Farmanguinhos – Fiocruz

MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE



Diagrama de Energia : a radiação compreendida no UV-vis está entre 200 – 800nm. Abaixo de 200nm praticamente todas as moléculas orgânicas absorvem.

raios cósmicos raios γ

raios X UVno vácuo

UV próximo

Visível IV próximo

IV Microondas

1019 Hz 1015 Hz 1013 Hz

0,1nm 200-400 nm 400-800 nm 2-50 µm

Frequência

λ







Espectrofotometria deAbsor ção Molecular

Região do visível/UV e IVAbsorbânciaTransmitânciaAbsortividadeAbsortividade molar

Espectro de absorção



Espectrofotometria deAbsor ção Molecular

• Aquisição de espectros e/ou quantificação fotométrica– curva-padrão (curva de calibração)– comparação com absorção de solução-padrão



Vantagens e desvantagens

Devido à “pobreza” de informações, espectros de absorção UV-vis tem uso limitado na identificação positiva de substâncias

Escolha do solvente (crítico no UV)

Indicativo de grupos funcionais (proteínas, DNA, substâncias aromáticas, carbonilas etc.)

Grande ferramenta se acoplada à cromatografia



Análise quantitativa

Ampla aplicação em sistemas orgânicos e inorgânicosGrande disponibilidade instrumental e acessível a vários

laboratóriosSensibilidade típica em torno de 10-5 mol/l, podendo atingir até

10-7 mol/lSeletividade relativamente altaBoa exatidão: ~ 1 – 3%Facilidade na obtenção, tratamento e armazenamento dos

dados



Determina ção da concentra ção

Curva de calibra ção– Observação da lei de Beer

– Determinação experimental do ε

Escolha e preparo do branco (referência) é fundamental– Composição da amostra: teor e qualidade dos concomitantes– Presença de equilíbrios secundários

Em casos extremos, a reprodu ção da amostra é praticamente invi ável– A amostra passa a ser usada como referência! � método da

adição de padrão (analito)



A) Banda única de intensidade m édia - baixa ( ε = 100–10.000 M-1cm -1) a λ < 220nm

É geralmente indicativa de uma transição n → σ∗. Aminas, alcoóis, éteres e tióis contam-se entre as estruturas possíveis, desde que os eletrons não ligantes não façam parte de um sistema conjugado. Neste caso, será boa prática procurar bandas N-H, O-H, C-O e S-H no espectro de IV.

Exceção: A transição n → π∗ em grupos –CN aparece nesta região. No entanto, é fraca (ε < 100) e o grupo –CN identifica-se facilmente no IV.

B) Banda única de fraca intensidade ( ε = 10–100 M-1 cm -1) a 250 < λ < 360nm, sem absor ção significativa a λ menor (200 –250nm)

É geralmente indicativa de uma transição n → π∗. Como não há absorção a comprimentos de onda superiores trata-se de um cromóforo simples, tipicamente não conjugado, em geral contendo um átomo de O, N, ou S. Exemplos: C=O, C=N, N=N, -NO2, -CO2R, -CO2H, CONH2. O IV e o RMN são também neste caso excelentes meios de diagnóstico definitivo.

Guia simplificado para an álise de espectros UV



C) Duas bandas de intensidade m édia (ε = 1.000–10.000 M-1 cm -1), ambas com λmax > 200 nm

Esta situação é geralmente indicativa da presença de um sistema aromático. Sefor esse o caso, poderá ser observada uma estrutura mais fina na banda de maiorcomprimento de onda em solventes não polares. Quando os anéis aromáticos sãosubstituídos, a absortividade molar é superior a 10.000, sobretudo se o substituinte aumentar a extensão do sistema conjugado.Nos compostos aromáticos polinucleares (PAHs) e heterocíclicos aparece umaterceira banda a cerca de 200nm.

D) Bandas de intensidade elevada ( ε = 10.000–20.000 M-1cm -1) a λmax > 210nm

Podem corresponder a cetonas α,β-insaturadas, dienos ou polienos. Quanto maisextenso for o sistema conjugado, maior é o comprimento de onda do máximo deabsorção.




E) Cetonas, ácidos, ésteres, amidas e outros compostos simples contendo sistemas π e eletrons não ligantes

Surgem duas bandas de absorção: n → π∗ (λmax > 300nm, intensidade baixa) e π → π∗ (λmax < 250nm, intensidade elevada). Em sistemas conjugados (ex.enonas) a banda π → π∗ sofre um desvio batocrômico e aumenta de intensidade, podendo obscurecer a banda n → π∗.

F) Compostos fortemente corados (i.e., com absor ção no vis ível)

Nestes casos poderá existir um sistema conjugado longo ou um cromóforo policíclico aromático. Os compostos benzenoides podem ser corados se tiverem substituintes com conjugação ao sistema aromático. Os compostos não aromáticos requerem em geral pelo menos 4–5 cromóforos conjugados para ocorrer absorção na zona do visível. No entanto, alguns compostos simples com grupos nitro, azo, nitroso, α-diceto, polibromo e poliiodo podem ser corados.




Procedimento pr ático

Seleção do comprimento de onda– máximo do pico � máxima sensibilidade

– mínimo desvio da lei de Beer � ε ~ constante

Variáveis que influenciam a absorbância– solvente– pH da solução– temperatura– força iônica– presença de interferentes

Manuseio das cubetas (c élulas)– par casado de cubetas (calibração)– limpeza com tecido embebido em metanol grau espectroscópico









Terminologia

Deslocamento batocrômico : para maior λ (influência de solventes ou de um grupo cromóforo ou auxócromo que se junta ou retira à molécula de referência

Deslocamento hipsocrômico : para menor λ

Deslocamento hipercrômico : para maior absorção (função de concentração e espessura da solução)

Deslocamento hipocrômico : para menor absorção (função de concentração e espessura da solução)

Grupos crom óforos : Grupos funcionais que absorvem radiação na faixa de trabalho do UV-VIS.

Grupos aux ócromos : Grupos saturados que, quando ligados a um cromóforo, modificam o comprimento de onda e a intensidade da absorção




Alguns crom óforos


Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados)



Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados)




Regras de Fieser-Woodward (carbonilas conjugadas)



Regras de Fieser-Woodward (cabonilas conjugadas)


Espectrofotometria UV

Produto da interação de matéria e energia

Relação direta e proporcional com a concentração

Estrutura molecular define a frequência de maior absorção



Energia incidente será sempre mais intensa que a emergente, e a atenuação pode ser atribuída a:

- reflexões da interface entre o ar e a parede da cubeta e entre a solução e a parede da cubeta- dispersão por partículas presentes na solução- absorção da energia pelo meio




Absortividade (a): quociente entre absorbância (A) e o produto entre concentração (c), expressa em g/l e caminho ótico (b), expresso em cm

Absortividade molar (E): quociente entre absorbância (A) e produto entre concentração (c), expressa em mol/l e caminho ótico (b), expresso em cm

Extin ção espec ífica (E1%): quociente entre absorbância e produto entre concentração (c), expressa em g/100ml e caminho ótico (b), expresso em cm






Lei de Lambert: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente em relação ao aumento da espessura atravessada

Lei de Beer: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da concentração da solução


Leis da Fotometria


Daí...

Io I



Um pouquinho de f órmulas...

log I o / I = a . b

A = a . c

Io = intensidade da luz incidenteI = intensidade da luz transmitidaa = constante característica da soluçãob = espessura (cm) da camada atravessada pela luz

A = absorbânciaa = constante característica da soluçãoc = concentração da solução atravessada pela luz

A = a . c. l

LAMBERT

BEER

l = caminho ótico LAMBERT-BEER



- Soluções diluídas: 0,4mg/mL ou menos, dependendo do εmáx no λmáx

- Solventes devem ser “transparentes” na faixa de comprimento de onda a ser analisada: não se pode obter o “espectro de diferença” de um solvente que absorve muito pois, nestas condições, a quantidade de luz que atravessa a amostra é mínima


Requisitos para an álises : amostragem


1- Como técnica acoplada ao CLAE (detecção);

2- Análise de tintas, corantes, explosivos, alimentos, bebidas etc;

3- Peritagens e análises in loco;

5- Análise de marcadores biológicos.


Aplica ções do UV/vis em an álises forenses


Instrumenta ção UV-vis


Alguns crom óforos comuns



Alguns crom óforos comuns: alquenos conjugados



Alguns crom óforos comuns: carbonilas conjugadas


Alguns crom óforos comuns: benzenos monossubstitu ídos

Exemplos de espectros de absor ção



Fatores que afetam as propriedades de absor ção de um crom óforo


pHO pH do solvente determina o estado de ionização de cromóforos ionizáveis (protonação e desprotonação pelo H+)

Polaridade (depende da estrutura do cromóforo e do tipo de transição)Para cromóforos polares, é frequente (especialmente se a molécula contém O, N, ou S) que λmáx ocorra para um comprimento de onda menor em solventes polares hidroxílicos (H2O, álcoois) que em solventes não polares.

Efeitos da orienta çãoCaracterísticas geométricas (simetria, organização) frequentemente têm fortes efeitos sobre εmáx. O melhor exemplo é o hipocromismo de ácidos nucléicos.


QUESTÕES DE CONCURSOS




5- Com relação à espectroscopia de absorção no ultravioleta (UV), assinale as alternativas abaixo como CERTO ou ERRADO. (Perito Criminal/ PC/ ES – 2007).

a) A eficiência de absorção de energia da luz para cada cromóforo está relacionada com seu peso molecular.b) Ligações peptídicas absorvem no UV de 300 a 400 nm.c) Os métodos de espectroscopia em UV podem ser empregados na avaliação da estrutura de proteínas.d) A absorção molar de um substrato cromóforo raramente se altera na ligação com a proteína.e) O sistema éxciton está relacionado com a estabilidade de elétrons.

(PERITO CRIMINAL – ENG.QUÍMICA – SSP - 2003



PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006



A espectrometria na região do visível é uma técnica bastante utilizada para análise quantitativa de diversos compostos orgânicos de interesse na área de toxicologia. Indique dentre as alternativas abaixo a que NÃO se refere a essa técnica:a) a espectrometria baseia-se na absorção da radiação pela amostra, absorção esta que é proporcional à concentração; b) para quantificação escolhemos a faixa linear, segundo a lei de Lambert-Beer;c) comprimento de onda selecionado entre 200 e 400nm;d) o comprimento de onda selecionado entre 400 e 750nm;e) no espectrofotômetro a leitura pode ser obtida sob a forma de transmitância ou absorbância.

(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)


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