Upload
truongkhanh
View
223
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
METODICHE TRADIZIONALI
E
TECNOLOGIE INNOVATIVE
IN MICOBATTERIOLOGIA
Anna Camaggi TSLB
S.C. Laboratorio di Microbiologia e Virologia
A. O. U. Maggiore della Carità - Novara
GLaTeLab
Gruppo di Lavoro per lo Sviluppo Prof. Continuo dei Tecnici di Laboratorio
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA….
•ELEVATO LIVELLO DI QUALITA’ DIAGNOSTICA
•TAT
• COSTI
DOTATO: PERSONALE QUALIFICATO, ESPERTO E AGGIORNATO
UTILIZZA: STANDARD DIAGNOSTICI, DI SICUREZZA E ORGANIZZATIVI
METODICHE TRADIZIONALI
E
TECNOLOGIE INNOVATIVE
CARATTERISTICHE GENERALI DEI MICOBATTERI
CLASSIFICAZIONE: Regno Bacteria
Tipo Actinobacteria Classe Actinobacteridae Ordine Actinomycetales Sottordine Corynebacterineae Famiglia Micobacteriaceae
Principali target genetici degli studi tassonomici 16S rDNA 23S rDNA hsp65 ITS rpoB
Sono bacilli immobili, non sporigeni, aerobi obbligati, delle dimensioni di 0.2-0.6 x 1-10 μm, caratterizzati dalla lenta crescita, da una parete ricca di acidi micolici e da un DNA con elevato contenuto di guanina e citosina (60-70%).
ALL’INTERNO DELLE SPECIE RICONOSCIUTE: Specie a crescita rapida 53% Specie a crescita lenta 47% Specie non cromogene 51% Specie scotocromogene 46% Specie fotocromogene 3% Specie patogene 61% Specie isolate esclusivamente dall’ambiente 17% Specie isolate dall’uomo ma non patogene 16% Specie isolate esclusivamente da animali 6%
NUOVE SPECIE!! Oggi..~ 170 NTM
70% negli ultimi 15 anni
(~3 nuove specie ogni anno)
Non dimentichiamo ……
La tubercolosi, che oggi, accanto all’AIDS ed alla
malaria, è una delle malattie più diffuse, va
conosciuta da tutti, specie da coloro che operando
in Sanità nei Paesi ove questa è poco diffusa
l’hanno dimenticata
(F. Mandler – MICOBATTERIOLOGIA CLINICA)
I MICOBATTERI OGGI…
QUINDI…..
M. tuberculosis complex
M. leprae
micobatteri non tubercolari o MNT (o NTM)
Ridotta incidenza di tubercolosi nei paesi industrializzati = Ridotta familiarità e competenza con i micobatteri Aumento della TB farmaco-resistente Aumento del numero di specie patogene alcune delle quali di difficile identificazione Nuova tipologia di paziente: anziano, oncologico, cardiopatico, trapiantato
Differiscono dal M. tuberculosis complex per:
Habitat
Virulenza
Contagiosità
Sensibilità ai farmaci
Essential laboratory tests for tuberculosis control
MMWR – November 4, 2005/ Vol.54 N. RR -12
TEST TAT
Microscopia per BAAR 24 h
Amplificazione per M. tuberculosis complex 48 h
Esame colturale positivo 14 giorni
Identificazione 21 giorni
Test di sensibilità ai farmaci di prima scelta 30 giorni
Test di sensibilità ai farmaci di seconda scelta
28 giorni dalla
richiesta
L’WHO ha approvato attraverso il suo gruppo di consulenza tecnica un
piano globale di azione costantemente aggiornato per fermare la tb
2015
The Global Plan to Stop TB 2006–2015 The Global Plan to Stop TB 2015-2035
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
Preparazione dei campioni….
Dati del Lab. Novara
Poster ESM - Lubecca 2011
Percentage of contaminated samples
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
Esame microscopico Colorazioni
•Ziehl-Nielsen (carbolfucsina a caldo)
•Kinyoun (carbolfucsina a freddo)
•Auramina (fluorescenza)
Ziehl-Neelsen, Kinyoun
Colorazione con Auramina
•Economico
•Eccellente specificità di genere
•Forte correlazione con l’infettività
•Bassa sensibilità (104 ufc)
•Esperienza dell’operatore
•Tempo di osservazione
•Nessuna informazione sulla vitalità nel 2010 l’WHO
consiglia l’utilizzo della
microscopia LED
economica e più sensibile
della microscopia ottica
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
Esame colturale
Osservazione: 60 giorni a 37°C
tempo medio di crescita: 18-25 giorni TERRENI
SOLIDI:
TERRENI
LIQUIDI:
Osservazione: 42 giorni a 37°C
tempo medio di crescita: 5-14 giorni
Sensibilità 10-100 UFC
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
Test di Amplificazione dell’Acido Nucleico - NAATs MMWR2009; 58:7-10
Consentono il simultaneo rilevamento ed identificazione
M. tuberculosis complex direttamente dai campioni clinici
Sono indicati per tutti i pazienti nei quali la TB è fortemente
sospetta, ma non ancora accertata
Non possono sostituire, ma affiancano i metodi convenzionali.
Real-time
Sistema E-MTD LPA HAIN ProbeTec
Metodo TMA LPA SDA
Target rRNA rpoBTUB IS 6110
Lettura
Chemilumine-
scenza
cromogeno Fluorimetria
Automazione Assente ibridizzazione Amplificazione
e lettura
Estrazione Lisi Lisi Lisi
Non Real-time
Sistema Real Art
MTB PCR
MTB Q PCR Alert
COBAS TaqMan
Xpert
MTB/RIF
Metodo qRT-PCR
RT-PCR RT-PCR
H-nested
RT-PCR
Target 16S
rDNA IS 6110
16S rDNA
rpoB (192 bp)
Sonda TaqMan TaqMan TaqMan Molecular
beacon
Automa-zione
Amplific. e lettura
Amplific.
e lettura
Amplific.
e lettura Completa
Estrazione Lisi-
cattura Lisi-
cattura Lisi
Lisi-cattura
Test di amplificazione diretta,
qualche esempio….
Xpert® MTB/RIF
LoD= n°piu basso delle unità formanti colonie (CFU) per campione che possono essere riproducibilmente distinte da campioni negativi con intervallo di confidenza del 95%.
Espettorato diretto: LoD= 131 cfu/ml (IC 95%)
Sedimenti: LoD= 297 cfu/ml (IC 95%)
SENSIBILITA’ ANALITICA
I dati di letteratura su Xpert MTB/RIF sono
numerosi e mostrano la buona performance
del test sia sui campioni respiratori (per i
quali è stato validato dal produttore) che su
quelli extrapolmonari, con una particolare
nota di merito per alcuni materiali
notoriamente ostici, quali liquido cefalo
rachidiano ed asp. gastrico
PERFORMANCE
Circa 2 ore
Sensibilità >102 UFC
AFB
reading
m.o.
samples
TRCReady-
80 reaction
time
+ 12 7’30”
++ 11 5’28”
+++ 17 4’26”
TRC is one of NAAT
・Target nucleic acid is RNA
・Rapid real-time detection
Transcription Reverse transcription Concerted Reaction
TRCReady-80
AFB direct test vs TRCReady-80
TRCReady® -80
TRCR®
MB-Lysis reagent*2
TRCR®
Purification Kit*3 TRCReady® MTB Specimen*1
(MTB)
*1) Decontaminated Specimen (NALC-NaOH treated) *2) TRCR MB-Lysis reagent is the dedicated reagent used for lysis of Mycobacteria *3) TRCR Purification kit is dedicated for purification of RNA from specimen, common reagent.
Circa 50 minuti
TOSOH
The simultaneous detection, Screening of MTB, MDR-TB and XDR-TB on Real-time PCR
Circa 3 ore
Innovative real-time PCR method:
READ (Real Amplicon Detection) PCR
combined with Seegene's proprietary
DPO™ technology (Dual Priming
Oligonucleotide).
TEST MOLECOLARI DIRETTI
DI …”IERI” E DI… “OGGI”
Riproducibilità, sensibilità, specificità e
precisione nettamente aumentate
Riduzione TAT (2-3 ore)
Riduzione delle contaminazioni
Maggiore automazione=standardizzazione
Costi più elevati
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
Test biochimico-colturali
NAP-test (p-nitro-α-acetilammino-β-idrossipropiofenone)
Risultati utili:
>7 giorni
Identificazione, ieri….
INNO LiPA
~6 ORE
SEQUENZIAMENTO
Identificazione, oggi…..
GenoType CM/ AS
~ 5 ORE
anche da campione DK+
COLTURA S/L POSITIVA PER BAAR
Test immunocromatografico
Mtbc vs. NTM
10-15 min.
DNA Probe
ibridiz. fase liquida
SONDE AccuProbe
~ 2 ORE
DNA Probe
Ibrid. fase solida
MICROARRAY
5 ORE
DNA-Probe
Ibridizzazione in fase liquida
Bersaglio: rRNA 16S
Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente dalle colonie
Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA)
Specificità:
M. tuberculosis complex
MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente
M. kansasii
M. gordonae
Limiti:
test a cascata
limitato a poche specie di NTM
Circa 2 ore
L’ANALISI E’ COMPOSTA DA TRE FASI
RILEVAMENTO dei prodotti di amplificazione tramite ibridazione inversa
ESTRAZIONE dell’acido nucleico
AMPLIFICAZIONE
Identificazione contemporanea del genere Mycobacterium e di : •16 diverse specie di micobatteri test INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 •14+16 diverse specie di micobatteri test GenoType® Mycobacterium CM e AS
Risultato utile: < 6 ore dalla positività della coltura
DNA-Probe
Ibridizzazione inversa, fase solida
Sequenziamento
Scelta della regione da sequenziare
16S rDNA
Internal transcribed spacer
23S rDNA
hsp65
rpoB
Sequenziamento
Confronto della sequenza con quelle presenti in un database (chiunque può confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank)
Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame
INNO LiPA
GenoType CM o AS
NEL NOSTRO LAB. DI MICOBATTERIOLOGIA…
COLTURA S/L POSITIVA PER
BAAR
MALDI-TOF MS ID
CONFERMA ID CON SONDE AccuProbe
CONFERMA ID CON DNA STRIP TECHNOLOGY
Le identificazioni con MALDI-TOF sono in fase sperimentale,
devono pertanto essere confermate da test diagnostici validati
Attualmente….
SEQUENZIAMENTO
~ 2 ore da coltura liquida,
1 ora da coltura solida
DATABASE APERTO
Identificazione con MALDI-TOF MS….?
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
METODI FENOTIPICI (valutazione della crescita in terreno solido/liquido in presenza del farmaco):
Costo-efficace
Semplice da eseguire, più complessa da standardizzare
Risultati disponibili in settimane/mesi
METODI MOLECOLARI (identificazione delle mutazioni responsabili di resistenza):
Risultati disponibili in ore
Non richiedono ceppo vitale, indip. da inquinamento del campione
Generalmente costosi
Difficoltà di esecuzione, limitati ad alcuni targets
Test di sensibilità per M. tub. complex
Utilizzando terreni liquidi circa 7-10 giorni dalla positività della coltura
Utilizzando terreni solidi circa 14-18 giorni dalla positività della coltura
Caratteristiche BACTEC
460TB
MGIT 960 VersaTREK BacTAlert
Formato semiautom
atico
automatico automatico automatico
Radiometria SI NO NO NO
Rilevamento 14CO2 fluorimetrico pressometrico colorimetrico
Volume dell'
inoculo (mL)
0,5 0,5 0,5-1,0 0,5
Volume del
terreno (mL)
4 7 12,5 10
Gestione dati NO SI SI SI
Antibiogramma SI SI SI SI *
Tempi medi di
detection (gg.)
11-14 11-13 11-15 13-17
Test di sensibilità fenotipici per MTB disponibili in Italia
* non approvato dalla US-FDA
MGIT utilizzato per eseguire DST:
confronto della crescita dei micobatteri con e senza
l'aggiunta di farmaci. Il sistema usa un algoritmo, basato
sul principio del metodo delle proporzioni, per comparare
le cinetiche di crescita in assenza ed in presenza di
farmaco e per interpretarle in termini di S e di R
Dr. Scarparo
Test di sensibilità fenotipico per MTB e NTM
con microdiluizione in brodo
La microdiluizione in brodo, che
permette la determinazione delle
concentrazioni minime inibenti
(MIC), si esegue utilizzando
piastre microtiter nei cui pozzetti
sono presenti diluizioni per
raddoppio dei singoli antibiotici.
MYCOTB RAPMYCO SLOMYCO
LE RESISTENZE DEL M. tuberculosis complex….
resistenza primaria, quando è già presente nel ceppo
responsabile dell’infezione
resistenza secondaria quando insorge durante la terapia
le resistenze sono dovute esclusivamente a mutazioni
cromosomiche
sono state trovate una o più mutazioni associate alla
resistenza nei confronti dei singoli farmaci anti-TB
Giugno 1998
Microbiology 148, 2967-2973, 2002
Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv J. C. Camus, et al.
+ 82 geni
Nature 393, 537-544, 1998 Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence S. T. Cole, et al.
Geni coinvolti nella resistenza ai
maggiori anti-tuberculari Drug Gene Gene product Mutations
Streptomycin rpsL 12S ribosomal protein Coding region (60%)
rrs 16S rRNA Reg. 530 and reg. 915 (8%)
Isoniazid katG Catalase-peroxidase coding region (cod. 315 - 60-80%)
inhA NADH-dep enoyl-ACP red promoter reg. (Ribosome binding site - 15%); coding region
ndh NADH dehydrogenase coding region
ahpC-OxyR regulon (controls katG and several other genes) promoter region (mutations relatively rare)
Rifampin rpoB RNA pol (β subunit) hot spot region (cod. from 508 to 535 - 98%); N-term region
Ethambutol embB Arabinosyl transferase ERDR (cod. 306 - 70%)
embC Arabinosyl transferase coding region
Ethionamide inhA NADH-dep enoyl-ACP red promoter reg. (Ribosome binding site); coding region
ethA Monooxygenase coding region
ethR Monooxygenase repressor coding region
ndh NADH dehydrogenase coding region
Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase coding region (70%)
Fluoroquinolones gyrA DNA gyrase (sub. A) QRDR (70%)
gyrB DNA gyrase (sub. B) QRDR
Rifabutin rpoB RNA pol (β subunit) coding region
Capreomycin rrs 16S rRNA coding region
tlyA rRNA methyltransferase coding region
Viomycin rrs 16S rRNA coding region
Kanamycin rrs 16S rRNA coding region
Amikacin rrs 16S rRNA coding region
D-Cycloserine alr D-Ala racemase promoter region
Para-salicylic acid thyA Thymidylate synthase coding region
Specificity
Mutations
(control: wt)
Probes repeated at
least twice
Aragón et al. J Antimicrob Chemother (2006) 57:825-831
TB-Biochip oligonucleotide microarray system for
rapid detection of rifampin resistance in
Mycobacterium tuberculosis
Test genotipici per la farmacoresistenza LPAs
Hain
Lifescience
INNO-LiPA-Rif.TB
•ESTRAZIONE dell’acido nucleico
•AMPLIFICAZIONE multiplex mediante primers biotinilati
•RILEVAMENTO dei prodotti di amplificazione tramite
ibridazione inversa
Innogenetics
NEL NOSTRO SETTORE DI
MICOBATTERIOLOGIA…
SPECIMENT SMEAR +
1
DAT MTBC
+
DNA STRIP MDRplus/sl
2
DAT MTBC
-
DNA STRIP CM/AS
Esempio 1:
Paziente forte sospetto tb,
probabile ceppo DR TAT:
48/72 h Esempio 2:
Paziente sospetto tb,
ricoverato,
in isolamento
DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…
Caso: B.M. forte sospetto riattivazione TB in paziente ucraino già trattato per TB, non DR, nel 2013. Xpert MTB/RIF eseguito in giornata, da campione
80-95% dei ceppi resistenti alla RIF risultano essere resistenti anche a INH
1/2
DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…
Caso: B.M. 2^ giornata da campione decontaminato DK negativo, si esegue test genetico molecolare MTBDRplus Si rilevano mutazioni che conferiscono resistenza a rifampicina e isoniazide. MDR o ….?
RMP = R
INH= R
3^ giornata dallo stesso estratto si esegue MTBDRsl
FLQ = R
AG/CP= R
In 3^ giornata il ceppo risulta: XDR
2/2
DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…. Caso: P.R. Paziente indiana, 8° mese di
gravidanza, ricoverata in ginecologia,
sospetto tb, DK neg, DAT (Xpert
MTB/RIF) MTBC+, RIF S
MTBDRplus:
RIF e INH = S
1/2
DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…
Caso: P.R. Dopo 8 giorni MGIT pos, in
9^ giornata ATB MGIT960,
in 13^ sospetto DR, si
ripete test genetico
molecolare MTBDRplus
MTBDRplus: INH = R
Metodo fenotipico: in 19^ ATB MIGIT960 I=R,
2/2
L’ANTIBIOGRAMMA TRADIZIONALE….
SI CONFERMA ESSERE
IL GOLD STANDARD
PER LA RILEVAZIONE
DELLE RESISTENZE IN MTC
In attesa di cosa vedere cosa accadrà con
le tecniche di nuova generazione…. (Next Generation Sequencing) –NGS…
Quindi…….
Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)
Esame microscopico
Esame colturale
Test di amplificazione diretta
Identificazione
Test di sensibilità
Epidemiologia
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA
Epidemiologia molecolare
della tubercolosi…. PERCHE’?
La rapida identificazione di un episodio epidemico di tubercolosi permette
la tempestiva attuazione di adeguate misure di controllo e il rapido inizio di
una corretta terapia antitubercolare.
INOLTRE, CONSENTE…..
COME: Sequenza d’inserzione IS6110
RFLP (Restriction-Fragment-Length Polymorphism)
Spoligotyping (PCR)
MIRU (mycobacterial interspersed repetitive unit) (PCR)
Delezioni genomiche e micro-arrays
Conferma dei sospetti di microepidemie
Valutazione dei sospetti di contaminazione di laboratorio
Valutazione delle recidive di tubercolosi
Screening sistematico e sorveglianza epidemiologica
Patogenesi, virulenza e trasmissibilità
IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA….
•ELEVATO LIVELLO DI QUALITA’ DIAGNOSTICA
•TAT
• COSTI
DOTATO: PERSONALE QUALIFICATO, ESPERTO E AGGIORNATO
UTILIZZA: STANDARD DIAGNOSTICI, DI SICUREZZA E ORGANIZZATIVI
Aggiornamento continuo Monitoraggio continuo delle innovazioni tecnologiche Adeguamento rapido ai cambiamenti
Per saperne di più..
For more information please go to www.who.int/tb <http://who.us8.list-manage.com/track/click?u=f093a7c38a3780cd9504f8d9d&id=c21673c1e5&e=1f55c04a80>
MICOBATTERIOLOGIA
sito con contenuti scientifici relativi ai micobatteri, a cura di Enrico Tortoli
http://mycobactoscana.it/index.html
social network