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Workshop LNR Additivi nei mangimi Istituto Superiore di Sanità
29 - 30 Ottobre 2013
Dott.ssa Marilena Muscarella
METODI ANALITICI PER LA RICERCA DI COCCIDIOSTATICI NEI
MANGIMI E MONITORAGGIO DI CAMPIONI REALI
Progetto di Ricerca corrente IZSPB 01/09
U.O.1 IMS. Responsabile Dott. ssa M. Muscarella IZS della Puglia e della Basilicata
U.O.2 IMS. Responsabile Dott. P. Gallo IZS del Mezzogiorno
U.O.3 IMS Responsabile Dott.ssa M. Gili IZS del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta, CREAA
U.O.1 EMS Responsabile Dott. M. Fiori Istituto Superiore di Sanita’
U.O. 2 EMS Responsabile Dott. ssa C. Palermo Universita’ degli Studi di Foggia – Facolta’ Di Agraria
Coccidiostatici
I Coccidiostatici sono additivi zootecnici usati nei
mangimi medicati per prevenire e curare la coccidiosi,
una malattia contagiosa che colpisce principalmente
specie avicole, ma anche bestiame ed altri animali da
allevamento. E’ la più importante malattia parassitaria
che può colpire le specie avicole*. Manifestazioni
dell’infezione sono diarree emorragiche, febbri,
dimagrimento, anoressia e lesioni delle vie urinarie
* Oswald et al. Food Addit. Contam. (2005)
Da quanto emerso dai documenti dell’EFSA*, durante la
produzione o il mescolamento di mangimi medicati, una
certa quantità di mangime può rimanere nel circuito
produttivo e contaminare altri mangimi.
Questa cross-contamination potrebbe determinare effetti
tossici per gli animali e per la salute pubblica.
* The EFSA Journal (2008) 690, 2-34
Contaminazione dei mangimi
Le proprietà elettrostatiche di alcune molecole possono
rendere difficoltose le operazioni di pulizia dei macchinari
fra una preparazione e l’altra e contaminare le partite di
alimento medicamentoso o mangime. L’ industria
mangimistica ha cercato di porre rimedio a tale problema,
impiegando principi attivi microincapsulati o in forma
granulare anziché polverulenta.
Contaminazione dei mangimi
Nel 2009 sono stati emanati due provvedimenti che
definiscono i limiti di legge per la presenza a dosi sub-
terapeutiche per gli undici coccidiostatici autorizzati dalla
UE come additivi nei mangimi.
Contaminazione dei mangimi
Direttiva 8/2009 (attualmente modificato dal
Regolamento 574/2011)
Regolamento 124/2009
Tali limiti riguardano sostanzialmente
il problema del carry-over dei mangimi.
Contaminazione dei mangimi
Il Regolamento 124/2009 stabilisce tenori massimi per i
residui di coccidiostatici negli alimenti di origine animale
(latte, uova, muscolo). Tali residui possono essere ritrovati
sempre per effetto del carry-over nei mangimi.
Contaminazione dei mangimi
Coccidiostatici
I coccidiostatici, sulla base delle loro caratteristiche
chimiche, sono suddivisi in due gruppi. Il primo gruppo
è costituito dagli ionofori
Coccidiostatici
Il secondo gruppo è costituito dalle molecole non
ionofore
Coccidiostatici Tossicità
Come tutte le sostanze antibatteriche, i coccidiostatici
possono essere un rischio indiretto per la salute umana
perché il loro uso diffuso potrebbe essere responsabile
della promozione di ceppi di batteri resistenti. I
principali segni clinici di intossicazioni acute con
monensin e altri composti ionofori sono debolezza
muscolare e insufficienza del miocardio. Questi sintomi
sono stati osservati nell’uomo, ma anche negli animali.
Coccidiostatici Tossicità
I farmaci più pericolosi sono sicuramente gli antibiotici
ionofori. Intossicazioni acute, talvolta ad esito letale,
sono state riscontrate negli equini (più sensibili) e
praticamente in tutte le specie da reddito. In altri casi
possono comparire forme più lievi dal punto di vista
clinico, ma sufficienti per diminuire la produttività *.
* Carlo Nebbia. 2009 Ed. Edises
Limiti Massimi di
Concentrazione
Contaminazione dei
mangimi
Problematiche legate ai nuovi Regolamenti:
1) Tradizionalmente i livelli di controllo dei farmaci
veterinari nei mangimi si aggiravano intorno a 0.5-1.0
mg/kg. Il Regolamento 574/2011 stabilisce i tenori
massimi per alcuni coccidiostatici dell’ordine dei ppb
(alofuginone, maduramicina, diclazuril).
2) Le molecole di coccidiostatici determinate dai
laboratori IIZZSS negli alimenti/mangimi non
comprendevano tutti gli 11 principi attivi ammessi, ma
solo i coccidiostatici principali (nicarbazina,
robenidina e qualche ionoforo).
Piano Nazionale
Alimentazione Animale
Tecniche Analitiche
Screening: metodo adoperato per rilevare la presenza di una sostanza o di una
classe di sostanze al livello d’interesse. Tali metodi consentono di analizzare un
elevato numero di campioni in tempi brevi
Conferma: metodo che fornisce informazioni complete o complementari atte ad
identificare la sostanza in modo univoco e, se necessario, quantificarla al livello
di interesse.
Tecniche Analitiche
Nell’ambito del controllo ufficiale è necessario la messa a punto di
metodi di screening affidabili per una determinazione rapida e veloce,
supportati da metodiche strumentali sensibili e robuste, indispensabili
per l’analisi di conferma. La combinazione di metodi di screening e di
conferma consente studi di monitoraggio per la valutazione di eventuali
rischi tossicologici.
Metodi di screening Kit Microbiologico
Metodi di conferma
HPLC/DAD
LC/MS/MS
Tecniche Analitiche
I metodi utilizzati nell’ambito di un controllo ufficiale
devono essere sottoposti ad una attività di
valutazione/validazione che ne attesti l’idoneità allo scopo.
A tal fine è di fondamentale importanza la valutazione dei
parametri di prestazione ai livelli di interesse ( limiti di
legge) in accordo al Regolamento 882/2004 /CE e alla
Norma ISO/IEC 17025/2005
Tecniche Analitiche
Metodi di screening Kit Microbiologico
In commercio esiste un kit ELISA specifico per la
determinazione di coccidiostatici ionofori. Non è stato
possibile applicarlo ai nostri scopi analitici per due motivi
principali:
I. Tale Kit e’ stato validato solo per mangimi destinati
all’alimentazione di animali domestici
II. Si tratta di un kit non multi-residuale
Metodi di screening Kit ELISA
Blu = Monensin
Giallo = Lasalocid
Viola = Maduramicina
Verde=Salinomicina/
Narasin
Metodo Microbiologico
Un rapido metodo di screening microbiologico (Premi®Test R-Biopharm
AG) a lettura visiva è stato ottimizzato e validato per la ricerca dei 5
Ionofori (lasalocid, monensin, narasin e salinomicina, maduramicina)
indicati nel PNAA 2012-2014. Questo metodo è basato sulla proliferazione
di spore di Bacillus Stearothermophillus. Le ampolle fornite nel kit
contengono un numero standard di spore di tale microrganismo in un
terreno agarizzato, in cui è presente un indicatore di pH. Dopo aver
aggiunto l’estratto del campione, le ampolle vengono incubate a 64 C: in
assenza di coccidiostatici ionofori, le spore germinate si moltiplicano e
formano un acido che causa un cambiamento di colorazione
dell’indicatore contenuto nell’agar dal viola al giallo.
Metodo Microbiologico
Campione A Campione B Campione di
Controllo
Metodo Microbiologico
Campione A Campione B Campione di
Controllo
POSITIVO!! NEGATIVO
Metodo Microbiologico Preparazione del campione
Triturare e
omogenizzare il
campione Pesare 2.00 g
Aggiungere 10
ml di
acqua e agitare
in vortex
Filtrare
100 μl sono usati
per l’analisi
Metodo Microbiologico Validazione
Numerose metodiche basate su kit microbiologici, presenti
in letteratura, sono state validate in accordo a protocolli
validativi “soggettivi”, non seguendo rigorosi schemi di
validazione.* I requisiti del metodo analitico sono stati
verificati seguendo il regolamento 882/2004/CE e la
Decisione 657/2002/CE per tecniche a lettura visiva.
*S.L. Stead et al. International Dairy Journal 18 (2008) 3–11
Metodo Microbiologico
Specificità
La Decisione 657/2002/CE non fornisce alcun
criterio quantitativo per la valutazione della
specificità di un metodo di screening. Tuttavia, una
percentuale troppo elevata di falsi positivi,
renderebbe il test inutilizzabile nella pratica.
Come criterio generale si può accettare una
percentuale di falsi non conformi (falsi positivi) ≤
10%.
Metodo Microbiologico
Specificità
Ai fini della valutazione di tale performance sono stati analizzati 20
bianchi campione rappresentativi della tipologia di campioni di nostro
interesse in due sedute differenti. Si sono quindi scelti 20 campioni di
mangime per bovini e 20 per specie avicole, ed è stata verificata l’ assenza
di campioni falsi positivi, ovvero significativamente diversi dal controllo
negativo utilizzato per la verifica del saggio.
Metodo Microbiologico
Capacità di rivelazione
(CCβverifica dell’errore beta)
Per la verifica dell’errore β ai livelli di legge sono state effettuate 20 prove
per ogni singola molecola per un numero totale di 200 prove ai livelli di
fortificazione riportati di seguito. Errore beta 5%
Metodo Microbiologico Capacità di rivelazione (CCβverifica
dell’errore beta)
In seguito a queste prove preliminari, sono state effettuate ulteriori prove
per ciascuna coppia di molecole Lasalocid + Monensin e Narasin +
Salinomicina ai livelli di fortificazione riportati in Tabella per verificare la
capacità di rivelazione del metodo nel caso della presenza simultanea di
più molecole. In particolare, per ciascuna coppia di molecole al livello di
fortificazione di interesse, sono state effettuate 2 sedute (20 prove per
ciascuna seduta). In tutti i casi tutti i campioni additivati sono risultati
positivi.
Metodo Microbiologico Robustezza
La robustezza del metodo è stata valutata in condizioni di cambiamenti marcati
studiando la matrice mangime per specie diverse da quelle di validazione (bovina
e avicola). Ai fini della valutazione di tale performance si sono realizzati 4
additivati usando una soluzione mix delle molecole Narasin e Salinomicina al
livello di additivazione 0,7 mg/kg per specie cunicola, e Monensin e Lasalocid al
livello di additivazione 1,25 mg/Kg per specie ovi-caprina e suina. Inoltre, sono
stati realizzati 4 additivati con una soluzione di maduramicina a 0,150 mg/Kg su
mangimi per specie suina e ovi-caprina e 4 additivati a 0,050 mg/Kg per mangimi
per specie cunicola. Tutti i campioni additivati non hanno presentato viraggio al
giallo.
Metodi di Conferma
Metodi strumentali
HPLC/DAD
LC/MS/MS
Metodi di Conferma
Studi di monitoraggio su campioni di matrici di origine animale (uova
e muscolo) hanno riscontrato la maggior positività per le molecole di
Nicarbazina e Robenidina
http://www.izsto.it/attachments/103_5_Galarini.pdf
Nel PNR sono inoltre previste il maggior numero di richieste di analisi
per la ricerca di Nicarbazina e Robenidina
Metodi di Conferma HPLC/DAD
Metodo multimatrice per la ricerca di Nicarbazina
Il metodo ufficiale per la ricerca di Nicarbazina nella matrice mangime
(UNI EN 15782) è stato validato solo ai limiti di concentrazione imposti
per mangimi medicati. Il metodo analitico multi-matrice per la ricerca di
nicarbazina può essere applicato a campioni di mangime, muscolo, fegato
e uova .
Campione di mangime bianco ( in rosso) e fortificato con Nicarbazina ( in nero) a un livello
di 0.5 mg/kg.
Metodi di Conferma HPLC/DAD
Metodo multimatrice per la ricerca di Nicarbazina
Metodi di Conferma HPLC/DAD
Metodo per la ricerca di Robenidina
Il metodo di conferma per la ricerca di robenidina prevede un facile e
veloce procedura di estrazione in fase organica acidificata e rivelazione
strumentale mediante HPLC/DAD. Tale metodo permette di eseguire,
quindi, un alto numero di analisi in un breve tempo
Parametri di validazione
Metodi di Conferma LC/MS/MS
Metodo LC/ESI-MS/MS per la rilevazione di 5 ionofori: lasalocid,
monensin, salinomicina, narasin e maduramicina mediante
rivelazione a trappola ionica (IZS Mezzogiorno)
Metodo LC-MS/MS mediante rivelazione a triplo quadrupolo per la
ricerca di 8 coccidiostatici: nicarbazina, robenidina, diclazuril,
lasalocid, salinomicina, monensin, narasin e maduramicina (IZS
Piemonte)
Metodo UPLC-MS/MS con rivelazione mediante triplo quadrupolo degli
11 coccidiostatici (ISS)
Metodi di Conferma LC/MS/MS
Le diverse metodiche di conferma LC/MS/MS prevedono l’uso di due
diversi analizzatori di massa
Trappola ionica Triplo quadrupolo
Metodi di Conferma LC/MS/MS
Analizzatori
Metodi di Conferma LC/MS/MS
Analizzatori
Quadrupolo Triploquadrupolo
Tempo di volo
Metodi di Conferma LC/MS/MS
Analizzatori
Metodi di Conferma LC/MS/MS
Analizzatori
Metodo di Conferma UPLC/MS/MS
Istituto Superiore di Sanità
Il metodo di Cronly et al. (Analytica Chimica Acta 700:26-33) è l’unica
procedura analitica presente in letteratura che permette di determinare
gli 11 coccidiostatici nei mangimi a livello di carry over con un protocollo
di preparazione e purificazione semplice e rapido.
Il metodo proposto da Cronly et al. è stato ottimizzato e adattato al
sistema UPLC al fine di ridurre notevolmente il tempo della corsa
cromatografica (9 min), requisito indispensabile per effettuare analisi di
screening e conferma di un elevato numero di campioni in tempi brevi.
L’affidabilità del metodo è stata valutata analizzando campioni di
mangimi risultati positivi per coccidiostatici ionofori al metodo di
screening microbiologico e i risultati sono stati confrontati con quelli di
un metodo LC/MS/MS con analizzatore a trappola ionica (IZS ME)
Metodi di Conferma UPLC/MS/MS
Preparazione del campione
Pesare 2,5 g di
mangime
Aggiungere 12ml
acqua deionizzata,
agitare per 15
minuti
Aggiungere 25 ml
acetonitrile
Agitare per 15 minuti
Aggiungere 4 g di
solfato di magnesio
anidro e 2 g di cloruro
di sodio
Agitare per 15 minuti
Centrifugare a 7000
rpm per 5 minuti
Recuperare la fase
organica da 50 ml e
porre in un
congelatore a – 80
°C per 15 minuti
Togliere il campione
dal congelatore e
prelevare 10 ml
dell’estratto,centrifuga
re a 4500 rpm per 10
minuti
analizzare in
UPLC-MS/MS.
.
Metodi di Conferma UPLC/MS/MS Parametri validativi
Monitoraggio di campioni
N. totale = 100 campioni di mangimi
Risultato Monitoraggio
Su un totale di 100 campioni di mangimi analizzati mediante il metodo di
screening microbiologico descritto in questo lavoro di ricerca, 8 campioni
sono risultati positivi e sono stati analizzati con i metodi di conferma
LC/MS/MS mediante analizzatore a triplo quadrupolo e a trappola ionica.
Dall’analisi di conferma, tre campioni sono risultati non conformi, in
accordo ai limiti di legge imposti dal Regolamento 574/2011.
Risultato Monitoraggio
Risultato Monitoraggio
http://www.izsto.it/attachments/103_5_Galarini.pdf ( 19/10/2012)
Risultato Monitoraggio
Su un totale di 165 campioni di mangimi analizzati nel
periodo tra il 2010-2012 mediante il metodo conferma
LC/MS/MS per la ricerca di 11 coccidiostatici, 8 campioni
sono risultati non conformi.
http://www.izsto.it/attachments/103_5_Galarini.pdf
Risultato Monitoraggio
IZS PB
3.0% campioni
Non conformi
IZS UM
3.5% campioni
Non conformi
Conclusioni
I metodi messi a punto si sono dimostrati affidabili per lo screening e la
conferma dei coccidiostatici nei mangimi a seguito di contaminazione
crociata.
La semplicità e sensibilità dei metodi, la velocità dell’analisi ed i risultati
delle procedure di validazione in accordo ai regolamenti comunitari ne
permettono l’utilizzo per il controllo ufficiale.
Ringraziamenti
Ministero della Salute
Unità Operative partecipanti al Progetto di ricerca corrente IZS
PB/01/09 : “Sviluppo e validazione di metodi analitici di conferma per la
ricerca di residui di coccidiostatici negli alimenti ad uso zootecnico e
valutazione del rischio tossicologico”
Dott. Antonio Armentano e Dott.ssa Maria Campaniello
DIVULGAZIONE DEI RISULTATI
Determination of 8 coccidiostats in feed at
cross-contamoination levels by LC/MS/MS :
validation according to Rg. 2004//882//EC.
Massa 2010 6th MS- Pharmaday. Milano, 6-
8october 2010
COMUNICAZIONI A CONVEGNI NAZIONALI/NTERNAZIONALI
Optimization and validation of a multi-matrix
confirmatory method for the determination of
Nicarbazin by HPLC-Diode Array detection
XXIV Congresso Nazionale della Società Chimica
Italiana Lecce 11-16 settembre 2011.
Determination of 11 coccidiostats in feeds by
UPLC-MS/MS
HPLC 2013 Conference Amsterdam
16-20 giugno 2013
Van Gogh Museum Amsterdam- La mietitura,1888
