Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 224, S. 476--482 (1955).

Aus dem Pharmakologischen Institut der Universit~t Heidelberg (Direktor: Prof. Dr. F. EIC~a~OLTZ).

Methodische Untersuchungen zur autoradiographischen Darstellung wasserliislicher Stof~e in der Niere *.

Von H. OSTER, H.-W. KUNDT und R. TAUGNER*%

Mit 4 Textabbfldungen.

(Eingeganyen am 4. November 1954.)

Es ist bisher verschiedentlich versucht worden, die physiologischen Ausscheidungsvorg~nge in der Niere n~her zu lokalisieren. Man ver- wendete dazu u .a . Farbstoffinjektionen (HEID~NHAZN U.a.), Mikro- punktion (RIcHA~DS U. W ~ a ~ , OLIWR U. Mitarb.)i Mikrokryoskopie (Whiz) und Bestimmungen des osmotischen Drucks an Nierenschnitten (ULLRmH u. Mitarb.). Die verfiigbaren Methoden erlaubten jedoch nur die LSsung einzelner lokalisatorischer Probleme.

Weitere Fortschritte sind hier unseres Erachtens yon der Autoradio- graphie zu erwarten. Ihre Verwendung wiirde davon ausgehen, dab sich i.v. injizierte radioaktive Isotope voraussichtlich an den SteUen des Nephrons anreichern, wo sie durch das Tubulusepithel hindurchtreten. Die Frage, ob es sich im einzelnen um Rfiekresorptions- oder Sekretions- prozesse handelt, bzw. ob die Anreicherung yore Tubuluslumen oder yon intertubul~ren Gef~[~en her entsteht, sollte in Kontrollversuchen durch AusschMtung der Filtration zu entscheiden sein, Die Filtration kann dutch Drosselung der Nierenarterie bis zur Unterschreitung des Filtra- tionsdruekes oder durch Ligatur der Ureteren reduziert werden. In jedem Fall w~re die Zeit yon 4er Isotopeninjektion bis zur Entnahme der BTieren so kurz zu w~hlen, dab die Aktiviti~t zum iiberwiegenden Teil noch in der urspriinglichen chemischen Verbindung vorliegt.

Die Autoradiographie ist jedoch bisher zum Studium tubul~rer Transport- bzw. Austauschvorg~nge noch nicht herangezogen worden, wahrscheinlich, well die ilblichen Verfahren zur eiuwandfreien Dar- stellung nierenf~higer, d .h . wasserl6slicher Stoffe beschr~nkter Mole- kfilgrSl~e nieht geeignet sin4. Ihre M~ngel bestehen vor allem in der Elution yon Radioaktivit~t w~hren4 histologischer oder radiographischer Vorarbeiten. Gleichm~Bige Aktivit~tsverluste w~ren durch hShere Isotopengaben bzw. l~ngere Exposition zwar leicht zu kompensieren.

* Herrn Prof. Dr. F. EZCEHOLTZ zum 65. Geburtstag gewidmet. ** Mit Unterstiitzung der ])eutschen Forsehungsgemeinsehaft.

Autoradiographische Darstellung wasserlSslicher Stoffe in der Niere. 477

Es ist jedoch selbst bei geringfiigigen Auswasehungen dami t zu rechnen, dab die Akt iv i t~ t im Verlauf der Vorarbei ten aus einzelnen Nieren-

bezirken selektiv entfern~ wird. Auch Dislokat ionen der Radioakt iv i t~ t , u. a. durch Diffusion, k 6 n n t e n vorkommen und sich an der Niere, wo S t ruk tu ren mi t verschiedenart iger F u n k t i o n nahe be isammen liegen, besonders irreffihrend auswirken. Wi t suchten daher nach kri t ischer Pr i i fung bekann te r Verfahren nach neuen, zuverl~ssigeren Methoden. Mit ihrer Hilfe sollte als erstes - - in For tse tzung fr/iherer Arbei ten yon TAUGNER U. Mitarb. - - die Ausscheidung von trKgerfreiem, P3~-mar- kier tem Ortho- und Glycerophosphat s tudier t werden. Zur Verwendung kamen die Nieren yon R a t t e n oder Ka tzen 5 - -30 rain nach der i.v. In j ek t ion von 1- -3 mC rad ioakt iven Ortho- oder Glycerophosphats.

Experimente l ler Teil.

Von verschiedener Seite sind - - mit dem Ziel m6glichst geringer Aktivitats- verluste - - abjeki~rzte Ver/ahren zur Gewebs/ixierung beschrieben worden. So ermittelten LAMERTON und HARRm bei 2 stfindiger Fixierung mit absolutem Alkohol (gefolgt von Xylol und Paraffin) eine Aktivitatseinbul3e yon nur 15%. HOLT, COWINO und WARREN gelang es, die Elution yon radioaktivem Orthophosphat durch Verkiirzung der Formalin-Alkohol-Fixierung zu reduzieren. Als Einbettungs- mittel verwendeten sie - - nach Entwasserung mit Benzol oder Dioxan - - ebenfalls Paraffin. Aueh das freezing-drying-Verfahren, wo die Paraffineinbettung ohne vorhergehende Fixierung und damit ohne Aktivit~tsverluste erfolgt, steht zur Diskussion (LEBLOND). Wir gingen yon Para//inschnitten aus, die nach den oben aufgefiihrten Methoden 1, aul3erdem nach abgekiirzter Fixierung mit 96--98%igem Alkohol (2 × 6 Std, gefolgt yon 2 × 30 min Benzol) sowie schulmal]iger Behandlung mit steigenden Alkoholkonzentrationen angefertigt waren. Die Sehnitte wurden auf Wasser gestreckt, getroeknet, zum Tell mit Xylol entparaffiniert und sehlieBlich mit einem Strippingfilm 2 versehen. Die Ergebnisse waren nich~ befriedigend: J~hnlich wie bei der nachfolgend beschriebenen Aquaffineinbettung naeh Alkoholfixierung war die Aktivit~t fiber den Rand der Gewebsschnitte hinaus disloziert. In den Versuehen mit Orthophosphat ffihrte aueh die Verwendung yon Fallungsmitteln a nicht zu besseren Resultaten.

Die Einflfisse eines 2. Einbettungsmittels studierten wir am Beispiel yon Aqua/[in ~. Die Gewebsstiieke wurden anfangs nach den Angaben von TIETZ - -

1 Die Versuche mit dem freezing-drying-Verfahren verdanken wir der Freund- lichkeit yon Herrn Priv. Doz. Dr. HASELMA~, Anatomisches Institut der Universi- tat, dem wir aueh ffir verschiedene Ratsehlage verpflichtet sind.

2 Autoradiographie Plates der Fa. Kodak Ltd. London. 3 Bei der Fixierung kamen CaC1 emit Veronalpuffer (vgl. GOMORI), FeC13 oder

PbN03 (in 96%igem Alkohol) sowie Ammoniummolybdat (in Salpetersaure-Pikrin- saure oder Alkohol-Salpetersaure) zur Anwendung. CaC12 mit Veronalpuffer wurde auch vor der Fixierung, wahrend Streekung und Entparaffinierung sowie beim Aufbringen des Strippingfilms erprobt. Die Konzentration der Fallungsmittel wurde stufenweise bis zum Auftreten yon Gewebssehadigungen bzw. bis zur Sat- tigung erhSht.

4 Aquaffin, ein Gemiseh wasserlSslicher Polyathylenglykole, wurde uns freund- lieherweise yon der Fa. Bayer-Leverkusen zur Verfiigung gestellt.

4 7 8 H. OSTER, H . -W . KUNDT u n d R. TAUGNER:

ohne eigent l iehe F ix i e rung - - m i t t ie fgekf ih l tem ~ t h y l e n g l y k o l entw/~ssert. Das his tologische Ergebn i s war dabei i m m e r unbef r ied igend . E rheb l i ehen Gewebszer- s t 6 r u n g e n e n t s p r e e h e n d f anden sicb bei der Au to rad iog raph i e m i t S t r ippingf i lm diffuse Sehw/~rzungen, me i s t fiber den R a n d der Schn i t t e h inaus . E r sa t z der ~ t h y l e n - g lykolen tw/ i sse rung du rch Alkohol f ix ierung f f ihr te zu g u t e n h i s to log ischen Ergeb- nissen. Die r ad iog raph i schen Bilder e n t s p r a c h e n e twa denen n a c h Paraff inein- b e t t u n g (Abb. 1 u. 2) u n d waren offensicht l ich ebenfal ls yon Akt iv i t i i t sver- s eh i ebungen beeinfluBt.

Diese, die Gfil t igkeit der erziel ten Bilder in Frage stel lende Aktivi t /~tsverschie- b u n g geh t n a e h K o n t r o l l v e r s u e h e n m i t ande ren r ad iog raph i s cheu M e t h o d e n h a u p t -

Abb. 1. Aquaffinsehnitt (10 p) aus der Niere einer Katze yon 2 kg in Evipannarkose (90 mg/kg). Das Organ wurde 10 rain naeh i.v. Injektion yon 3 mC tr~tgerfreier H3P320, entnommen. Die Gewebs- stficke (5 × 1--2 mm) befanden sich 2 × 3 Std in 96%igem Alkohol (--20°), 2 Std in Alkohol- Aquaffin (Verh~ltnis ] : 1, etwa 30 ° C) und 5 Std in Aquaffin (47--50 ° C). Das Aquaffin wurde herausgelSst mit einer Mischung yon Aquaffln (1 Tell) und Aqua dest., mit Tllymol ges~tttigt (9 Teile, vgh TIETZ). Strippingfilm-Verfahren, Exposition 3 Wochen. Der unter dem Film befindliehe Schnitt ist schwach mit Lichtgrfin angef~rbt. Man beachte die durch Elution bedingte diffuse

Ausbreitung der radiographisehen Zeichnung fiber den Rand des Schnittes hinaus.

s/~chlich zu L a s t e n des Stripping/Jim. Ver/ahrens. Der St r ippingf i lm wird bekann t l i ch m i t d e m aufgezogenen S chn i t t in W a s s e r au fge fangen . Tro tz u m g e h e n d e r Trock- n u n g im Exs i cca to r f f ih r t - - bei der groBen Oberfl~che des Schn i t t e s - - diese kurze W/ i s se rung zu wesen t l i chen Akt iv i t i~ t sversch iebungen . Selbs t w e n n wir den Strip- p ingf i lm a u f paraf f inha l t ige Schni t te , z. B. au s d e m f reez ing-dry ing-Verfahren , auf- zogen, k a m es zu wesen t l i chen Ak t iv i t~ t sve r lu s t en .

]3iese Feh le r sch ienen du rch V e r w e n d u n g andere r r ad iog raph i sche r Methodeu , z. B. des Mounting-Ver/ahrens, ve rme idba r . A n s t a t t der dabei i ibl ichen S t r eckung a u f W a s s e r w u r d e n die pa ra f f inha l t igen Schn i t t e - - n a c h vors ich t iger G1/~ttung m i t

Autoradiographische Darstellung wasserlSslieher Stoffe in der Niere. 479

Pinseln - - auf den Film i gelegt und bis zum Anschmelzen erw~rmt oder, eventuell naeh Entparaffinierung, durch Auftropfen yon Xylol geglattet. Auch das Verfahren yon HOLT u. Mitarb., wonaeh sich das Strecken erfibrigt, wenn man die Oberfl~tche des Bloekes vor jedem Schnitt mit einer dtinnen Schicht geschmolzenen Paraffins iiberzieht, wurde erprobt. Einige Gewebsschnitte wurden dem Film auBerdem mit einem 2. Objekttri~ger aufgepreBt. Die Ergebnisse waren bei derartigem Vorgehen insofern besser, als die radiographisehe Zeichnung den Rand der Sehnitte nicht fiber- ragte. Im Gegensatz zum Strippingfilm-Verfahren entstanden jedoch meist diffuse, strukturlose Bilder. Da dies aueh ohne Entparaffinierung der Fall war, kSnnte es sich um Folgen yon Fixierung, Entw~tsserung oder Paraffineinbettung handeln. Naeh

Abb. 2. VergrSi3erung des in Abb. 1 gekennzeichneten Abschnittes.

den Erfahrungen yon LEBLOND mit dem freezing-drying-Verfahren bei Zufuhr grSBerer Jodmengen kann schon das Eindringen yon Paraffin an der Sehilddrtise zu diffusen Bildern ffihren. Die von ihm diskutierte Alternative, dab die Aktivit~t mSg- lieherweise schon in vivo gleichmaBig verteilt sei, trifft nach unseren Ergebnissen mit Gefrierschnitten fiir die Anordnung yon pa2 in der Niere nicht zu. Die mit dem Strippingfilm-Verfahren erhaltenen differenzierten Bilder kSnnten allerdings nach den Erfahrungen mit der Mounting-Methode durch selektive Elutionen bedingt sein.

N a c h d iesen e n t t ~ u s c h e n d e n E r g e b n i s s e n k a m e n fi ir die D a r s t e l l u n g

wasser lSs l icher k l e i n m o l e k u l a r e r Stoffe n u r noch Ge/rierschnitte 2 n a c h

1 In Ermangelung geeigneten Filmmaterials wurde aueh hierzu Strippingfilm verwendet, der vorher mit der photographischen Emulsion nach oben aufgezogen und getrocknet worden war.

Gefrierschnitte sind sehon yon ODEBLAD, jedoch bei vorheriger Formalin- Trichloressigs~ure-Fixierung und sp~terer Verwendung w~Briger Medien benfitzt worden,

480 H. OSTER, H . - W . KUNDT llIld 1:~. TAUG~ER:

SCItULTZ-BRAuNS in Frage, die Fixierung, Entwi~sserung und Ein- bettung entbehrlich machen. Als radiographisches Verfahren scheint nur die Kontaktmethode zuverl~ssig. ~¢Vir fingen die Gefrierschnitte 1 anfangs bei Zimmertemperatur an Stelle yon Objekttriigern mit dem Film auf, wo sie durch Auftauen haften blieben. Die radiographischen Bilder waren jedJch, wahrscheinlich infolge dieses Auftauens, meist schollig ver- schmiert. Das Verfahren wurde daher ffir unsere Zwecke dahingehend modifiziert, da[~ die Schnitte in einer Kfihlkammer bei - - 8 bis - - 5 ° C

Abb. 3. Gefriemchnitt aus der Niere einer Ratte yon 100 g, 10 rain nach der i.v. Injektion yon 2 raC tr~gerfreiem, radioaktivem Glycerophosphat. Dieke des Schnitts: 10 t~. Exposition: 3 Wochen. Film- material: Strippingfllm, nach dem Kontaktverfahren "¢erwendet. Keine flfissigen Mediel~, kein Auf- tauen. NEhere Erl~iuterung siehe Text. Die Aufnahme gibt nur die radiographische Zeichnung ohne

Schnitt wieder. ~[an beachte die Anh~ufung der Aktivit~t im Bereieh der Mark-Rinden-Grenze.

hergestellt and ohne jedes Auf tauen b e i - - 2 0 ° zur Exposi t ion gelagert wurden.

Das S t recken erfolgte m i t P i n se l n a u f d e m t iefgeki ih l ten Mik ro tommesse r . An- sehliei3end l eg ten wir die Schn i t t e a u f vorgeki ih l te Objek t t r~ger . Das t rockene F i l m m a t e r i a I ~ntrde m i t W ~ c h e k l 0 , m m e r n d a r a u f befest ig~ u n d 3-~5 W o c h e n spare r g e t r e n n t en twickel t . Die Dar s t e l l ung der zugeh6r igen Gewebssch ich t k a n n a n al ter- n ie rend herges te l l t en , n i ch t zu r Rad iog raph ie v e r w e n d e t e n S c h n i t t e n n a c h den R ich t l in i en y o n SCHULTZ-BRAuNS v o r g e n o m m e n werden .

I n den Abb. 3 u. 4 ist ein Beispiel fiir die Leistungsf~higkeit dieser - - wahrscheinlich opt imalen - - Methode wiedergegeben. Elut ionen kommen

1 W i t v e r w e n d e t e n das neue m i t Messer t i e fk i ih lung a u s g e s t a t t e t e Koh lens~ure - Gefr ie r -Mikro tom CM der F a . C. Jung -He i de l be rg , das s ich s eh r g u t bew~hr te .

Autoradiographisehe Darstellung wasserl6slicher Stoffe in der Niere. 481

als Fehlerquelle nicht in Frage. Auch Dislokationen diirften keine be- deutende Rolle spielen. Die MSglichkeit, dab der Film durch unfixiertes Gewebe beeinfluBt wird (BoYD u. BOARD) kann in Parallelversuchen ohne Isotopeninjekt ion kontrolliert werden. Das Ergebnis ist allerdings, wie auch sonst bei der Kontak tmethode , von dem gleichm~Big engen K o n t a k t zwischen Film und Schnit t abhi~ngig, tier z. B. durch kleine Unebenheiten oder Fal ten gest6rt sein kann.

Abb. 4. VergrSl]erung des in Abb. 3 gekennzeichneten Abschnittes.

Zusammenfassung. Nach kritischer Priifung bek~nnter Verfahren werden Gefrierschnitte

nach SCHULTZ-B~v~S zur autoradiographischen Darstel lung wasser- 16slicher Stoffe in der Niere empfohlen. Die Schnit te sollten zur Ver- meidung des Auftauens in einer Ki ih lkammer hergestellt und fiir die Exposi t ion in der K~lte gelagert werden.

Literatur. BOYD, (~. A., and F. A. BOARD: A preliminary report on histochemography.

Science (Lancaster, Pa.) l l0, 586 (1949). - - GOMORI, G. : Mikrotechnical demon- stration of phosphatase in tissues. Proe. Soc. Exper. Biol. a. ivied. 42, 23 (1939). - - HEIDENHAIN, R.: Versuche fiber den Vorgang der Harnabsonderung. Pfliigers Arch. 9, 1 (1874). - - HOLT, M. W., t¢. F. Cowing and S. WARR~,N: Preparation of radioautographs of tissues without loss of water-soluble pa,. Science (Lancaster, Pa.) 110, 328 (1949) . - LAMERTON, L . F . , and HARRIS: Some autoradiographie studies of non-uniform distribution of radioactive phosphorus in tissues. Brit.

Arch. exper. Path . u. Pharmakol . , Bd. 224. 3 2

482 OSTEa, KUNDT U, TAUG~ER: Autoradiographische Darstellung.

Med. J. 4787, 932 (1951). - - LEBLOND, C. P. : Locating iodine in tissues autoradio- graphically, especially after fixation by freezing and drying. Stain Technol. 1S, 159 (1943). - - ODEBLAD, E.: A technique of Autoradiography. Scand. J. clin. Laborat. Investig. 3, 151 (1951). - - SCHULTZ-BRAuNs, O.: Eine neue Methode des Gefrierschneidens fiir histologische Schnelluntersuchungen. Klin. Wschr. 1981, 113. - - Verbesserungen und Erfahrungen bei der Anwendung der Methode des Gefrier- schneidens unfixierter Gewebe. Zbl. Path. 54, 225 (1932). - - TIETZ, H.: Eine Schnelleinbettungsmethode fiir histologische Pr/~parate mit ,,Synthawachs- gemischen" unter Umgehung der Alkoholstufen, besonders nach Imbibition mit leicht wasser- und lipoidlSslichen Stoffen. Z. wiss. Mikrosk. 61, 129 (1952). - - ULLRICH, K. J. , G. I~IECKER U. H. H. JXRAUSCH (Marburg) : Untersuchungen zum Problem der Harnkonzentrierung und Verdiinnung. Vortrag, gehalten auf dem Physiologen-KongreB in Heidelberg am 16. September 1954. - - WXLKE~, A. M., P .A. BOTT, J . OLIVER and M. C. MAcDowELL: The collection and analysis of fluid from single nephrons of the mammalian kidney. Amer. J. Physiol. 184, 580 (1941). - - WP, AR~¢, J. T., and A. N. RICr~A~DS: Observations on the composition of glomer- rular urine with particular reference to the problem of reabsorption in the renal tubules. Amer. J. Physiol. 71, 209 (1924). - - WIRZ, H. : Der osmotische Druck des Blutes in der Nierenpapille. Helvet. physiol. Acta 11, 20 (1953).

Dr. H. OSTER, Dr. H.-W. KUNDT und Dr. R. TAUGNER,

Heidelberg, Pharmakol. Inst. d. Universit~t.