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Méthodes alternatives à l'expérimentation animale. Expérimentation animale : L'expérimentation animale consiste à analyser le fonctionnement des systèmes biologiques du règne animal à partir d'observations sur un matériel vivant. Peut-on réaliser des expérimentations animales?. - PowerPoint PPT Presentation
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Expérimentation animale : – L'expérimentation animale consiste à
analyser le fonctionnement des systèmes biologiques du règne animal à partir d'observations sur un matériel vivant.
Méthodes alternatives à l'expérimentation animale
Peut-on réaliser des expérimentations animales?
Le chercheur est confronté à la double interrogation morale – Finalités : les finalités ou prolongements des travaux
sont ou non socialement légitimes (transgénèse, OGM, clonage)
» Comité National d’Ethique (pour l’homme)
– Moyens : Ceux ci sont-ils tous acceptables ? » Comité Régional d’Ethique (pour l’animal)» Validité de l’expérience = "manière de faire" » Légitimité de l’expérience (ce qu’elle implique pour l’animal) =
"décision de faire"
Peut-on réaliser des expérimentations animales Ethique
- Validité de l'expérimentation/observation.- Légitimité de l'utilisation d'un être vivant (animal/plantes) :Discontinuité Homme – Animal (Descartes, Kant), Continuité (Darwin) - Quel être vivant? Survie de l'espèce.
Scientifique- Validité d'une expérience faite sur une espèce pour des
interprétations réalisées dans une autre.
- Etude des mécanismes plus simple in vitro.
Economique- Coûts expérimentaux élevés
A-t-on le droit de continuer les EA?A-t-on le droit d’arrêter toutes les EA?
Conditions d’expérimentation Ne sont pas considérés comme expériences
– Animaux invertébrés– Formes embryonnaires de vertébrés ovipares– Observation d’animaux
La pratique de l’expérimentation animale est encadrée par diverses dispositions légales que vous devez connaître : http://ethique.ipbs.fr/sdv/expanim.html
http://www.dossiersdunet.com/spip.php?article33Texte fondateur : directive du Conseil des Communautés européennes, 24 novembre 1986 – Agrément des expérimentateurs– Formation des personnels– Provenance des animaux, transport– Conditions d’expérimenter
Conditions d’expérimentationDirective européenne 1986, décret français 1987 modifié 2001
Les personnes impliquées– Responsable de protocole exp. = Autorisation
d’expérimenter (habilitation 1) durée 5 ans– Collaborateurs : Techniciens = habilitation 2 (def)
Animaliers = habilitation 3 (def) Les animaux
– Pas d’utilisation d’espèces protégées– Espèces expérimentales de sources autorisées– Tenue des registres
Les établissements– Dossier d’agrément à renouveler (agréées par le ministère
de l'Agriculture, via les directions départementales des Services Vétérinaires)
Conditions d’expérimentation– En France, la réglementation repose sur
l'autorisation des chercheurs.
– Certains pays, les projets d'expérimentation doivent faire l'objet d'une autorisation après évaluation par un comité composé à la fois de chercheurs et de personnes n'expérimentant pas sur animaux.
– Double contrainte : autorisation des personnes et autorisation des protocoles (Pays-Bas, Royaume-Uni).
Composition des comités d’éthique
En général, le nombre de membres indiqué est un minimum imposé par la législation.
I. VEISSIER 1999, INRA Prod. Anim., 12, 365
Règle de conduite : les 3 R (Russel et Burch 1959)
La Réduction• Limiter le nombre d'expériences et d'animaux (min.
pour résultats valides)
Le Raffinement• Réduction de la souffrance animale (anesthésie,
euthanasie, méthodes non invasives)
Le Remplacement• Par des espèces moins sensibles ou non vivantes
La responsabilité•Cadre réglementaire (douleur animale, personnels, origine des animaux)
•Comité d’éthique,
Expérimentation animale : qui et sur qui?
http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/site/fr/com/2005/com2005_0007fr01.pdf
Expérimentation animale : qui et sur qui?
http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/site/fr/com/2005/com2005_0007fr01.pdf
Les modèles alternatifs
Remplacement relatif – Aboutit à la mort d'animaux mais sans souffrance
(utilisation de cellules primaires, organes, tissu, embryons, procaryotes...)
Remplacement total– Les expériences ne nécessites plus de tuer des animaux.
(modèles mathématiques, reproduction physico-chimique, lignées cellulaires...)
– Les expériences permettent de faire un premier test, mais dont le résultat est vérifier sur un petit nombre d'animaux. (information, lignées cellulaires...)
Les modèles alternatifs Information : prévient la duplication des expériences.
Modèles mathématiques : prédiction de l'effet biologique.
Techniques physico-chimiques : - rumen artificiel, test d'irritation oculaire
Utilisation de procaryotes et d'embryons :- test de genotoxicité sur Salmonella- effet tératogène
Utilisation d'animaux transgéniques :- création d'animaux (souris, nématodes) portants
des gènes humains.
Les modèles alternatifs Modèles cellulaires
– cellules primaires– lignées immortelles, transformées,– culture de tissue– culture d'organe– anse ligaturée
Domaines d'utilisation Toxicité
– Test d’irritation oculaire– culture d'hépatocyte– culture d'épithélium respiratoire
LE TEST DE DRAIZEconsiste à déposer le produit à tester dans l'œil de plusieurs lapins albinos afin d'analyser les dégâts causés après plusieurs jours (paupière tuméfiée, iris enflammé, cornée ulcérée, œil détruit, mort du sujet).
Mutagénèse - A l'heure actuelle, plus d'une centaine de tests de
mutagenèse in vitro ont été mis au point, une dizaine sont régulièrement utilisés (Salmonella, embryons).
- le test in vitro ne remplace rien, mais joue le rôle d'un filtre préventif permettant de gagner du temps, de l'argent et d'éviter de possibles expériences futures sur animaux.
• Etude de l'infection
LE TEST DE DL50(dose létale 50%) consiste à faire ingérer à un groupe d'animaux des quantités de produit pour que 50% des sujets meurent.
Domaines d'utilisationMédical
-Allergies
Métabolisme– Glande mammaire– Intestin
Production d'anticorps– Polyclonaux, monoclonaux
Coupe histologique d'épiderme reconstruit contenant des cellules de Langerhans et des mélanocytes
Une peau reconstruite, sensible aux rayons ultra-violets et pourvue de cellules immunitaires fonctionnelles. Ce modèle, construit par les chercheurs de l'Oréal dans le cadre d'un projet européen, est un nouvel outil d'étude in vitro de l'allergie.
Production d'anticorps monoclonaux in vitro.
Avant, il était possible d'obtenir in vivo des sérums polyclonaux, mono- ou polyspécifiques.
Définition : Köhler et Milstein 1976– Cellules hybrides qui sont immortelles (plasmocytome)
et qui sécrètent des anticorps (splénocyte, LcB). Obtention
– Immunisation, fusion, sélection, clonage.– Hétérohybridômes, humanisation.– Culture : HAT car le myélome est HGPRT-– RPMI-1640+glu+AcA+SVF+antibiotiques
Etuve CO2 à 37°C
Ascites Lettre Ministérielle du 17 novembre 2005 Inoculation I.P. à des souris syngéniques de l'hybridôme.
Production d'un liquide d'ascite riche en anticorps. Avantages
– Concentration en AC élevée, facilité, peu onéreux
Problèmes– risques de contamination par des virus murins, des
cytokines et des immunoglobulines de l'animal.– Formation de tumeurs chez l'animal, de liquides
d'ascite, perforation de la paroi abdominale.– Interdiction ou limitation de la production d'ascites.
On estime qu'aux Etats-Unis, un million de souris par année sont encore utilisées pour ce type de "production".
Méthodes alternatives : anticorps Peut-on produire in vitro des quantités
d'anticorps suffisantes à un coût raisonnable?
Boites de culture• Faible concentration de cellules et d’anticorps
10-100 µg/ml
Bouteilles agitées par rotation• Faible concentration de cellules, concentration
d’anticorps plus élevée 10-220 µg/ml
Méthodes alternatives : anticorps Pochettes perméables
- Augmentation de la viabilité cellulaire- Augmentation de la concentration en
AC- Diminution des contaminations
O2, CO2 milieu
Cellules+ACLe bio réacteur miniPerm
-Augmentation de la concentration en AC, et en cellules-Augmentation de la pureté (dialyse)
Méthodes alternatives : anticorps Bio réacteur à fibres
creuses- Forte concentration en AC et en cellules (107-108)- viabilité cellulaire élevée sur un mois
Tecnomouse- 5 bio réacteurs en
parallèle
Méthodes alternatives : lignées cellulairesCellules primaires
- Culture de cellules provenant d’un organe ou d’un tissu. Il peut être obtenu par dispersion enzymatique ou par culture d’explants
- Les cellules n’ont subi que peu de modifications- Mélange de cellules, viabilité faible, tuer un animal à chaque fois,
manque de reproductibilité
Lignées mortelles- Obtenues après clonage de cellules primaires (Intestin : macrophages,
fibroblastes, entérocytes, caliciformes, argentaffines, de paneth, M).
- Durée de vie limitée : 20 à 80 passages (stock), croissance faible- Etude sur une population déterminée, bonne reproductibilité- Caractérisées par l’inhibition de contact et la croissance
dépendante d’ancrage
Méthodes alternatives : lignées cellulairesLignées continues : immortelles
- Perte des facteurs responsables de la sénescence : spontanée, induite
- Durée de vie illimitée (> 100 passages), croissance forte, anomalies phénotypiques et génotypiques
- Etude sur une population déterminée, caractérisée, bonne reproductibilité
- Caractérisées par l’inhibition de contact et la croissance dépendante d’ancrage
Méthodes alternatives : lignées cellulaires Lignées continues : faiblement transformées
- Durée de vie illimité (>100 passages), croissance forte, anomalies phénotypiques et génotypiques plus fortes
- Etude sur une population déterminée, caractérisée, bonne reproductibilité- Caractérisées par l’absence d’inhibition de contact et la croissance
indépendante d’ancrage (pas de tumeurs, croissance en agarose)
Lignées continues : fortement transformées- Durée de vie illimité (>100 passages), croissance forte, anomalies
phénotypiques et génotypiques très fortes- Etude sur une population déterminée, caractérisée, bonne reproductibilité
(en fonction du passage)- Caractérisées par l’absence d’inhibition de contact et la croissance
indépendante d’ancrage (induction de tumeurs, croissance en agarose et agar)
Induction de la transformation par des méthodes génétiques et épigénétiques
Les jonctions d’une lignée entérocytaire
Tight jonction Desmosome Desmosome Zonula adherensGap jonction
Hemidesmosome
Polarisation d’une lignée entérocytaire
Sur plastique
Sur membraneporeuse
Micro-villosités
Tight-junction
Hémi-desmosome
Vésicules de secrétion de mucus d’une lignée entérocytaire
Méthodes alternatives : culture de tissus
Chambre de Ussing- 1 animal permet l’utilisation de
plusieurs tissus ou morceaux de tissu
- Proche du in vivo, 3 D, plusieurs types cellulaires
- Faible reproductibilité, viabilité variable
Méthodes alternatives : culture d’organes
Infection d’organes ex vivo- 1 animal par organe utilisé. Diminution de la souffrance
- Conditions proches du in vivo (infection sous flux, tissu entier)
- Grande variabilité des conditions d’infection : temps, vitesse du flux, [O2], addition de molécules, flore…
- Possibilité de faire des comparaisons en parallèles : entérocytes/plaques de Peyer ; jéjunum/caecum
- Possibilité d’identifier les cellules infectées au FACS
- Faible reproductibilité, viabilité cellulaire faible même si viabilité tissulaire
Méthodes alternatives : anses ligaturées 1 animal par organe utilisé (mais plusieurs
anses/organe). Diminution de la souffrance ?
Mise à jeun, anesthésie, incision et extériorisation de l’intestin
- Ligatures (anses), injection des bactéries, (gentamicine)
- Remise en place, suture- Après qq heures, anesthésie, incision et
extériorisation, prélèvement, euthanasie
Méthodes alternatives : modèles cellulaires indispensables pour étudier l’entrée des bactéries dans les cellules
(bactéries Gram +)
(bactéries Gram -)
TTSS entrée (ruffles) cortactine actine bactérie
InlA – E cadhérine entrée cMet actine bactérie
D’après Cossart et Sansonetti 2004 Science, 304: 242
Méthodes alternatives : modélisation de l’intestin
Mc Cormick et col. 1995-2003
Lors de l’infection de l’intestin par STM, il y a une réponse inflammatoire intense liée au recrutement des PMN.
Méthodes alternatives : modélisation de l’intestin
Mc Cormick et col. 1995-2000
IL8
- Migration des PMN :Vaisseaux Sg – lamina propria – coté basal – coté apical
-STM induit la migration trans-épithéliale (Nécessite la synthèse de protéines cellulaires, Survie de Salmonella dans les PMN recrutés).
-Libération d’IL8 coté basal (non impliqué dans la transcytose), synthétisée via NFkB (voie PMA)
-Libération de PEEC coté apical = hepoxilin A3, -La fixation de SipA induit l’activation des PKC
- Un inhibiteur de l’HA3 diminue la migration des PMN in vivo et la pathologie
Hypothèse de la trans migration des PMN au niveau de l’intestin
NFkB
IL-8
IL-8
PMNPMN
SipA
PKC
R?
HepoxillinA3PMN
Conclusions Diminution des expérimentations :
En France le nombre d'animaux de laboratoire est passé de 7 millions à 2,6 millions entre 1980 et 1997. Stabilisation depuis 2000
En recherche : Nécessité d’utiliser au maximum les méthodes in vitro
Complémentarité de l’approche in vivo et in vitro– Dépend de la question posée– Dépend de l’outil d’investigation (micro-arrays,
IVET, pathogénicité…) Connaître les limites de son modèle (LM-souris)
Où l’in vitro est supérieur à l’in vivo
La souris est le modèle de référence pour la virulence de L. monocytogenes L’internaline (InlA) est impliquée dans l’entrée dans les entérocytes in vitro Le récepteur de l’internaline est la E cadhérine Un mutant délété de InlA n’est pas altéré en virulence chez la souris
Spécificité d’hôte• La proline en 16 est responsable de la fixation à la hE-cadhérine• Un mutant InlA est fortement altéré chez la souris exprimant la hE-cadhérine
wt
InlA
Spécificité d’hôte• InlB est impliqué dans l’entrée dans les cellules non-épithéliales in vitro• Les récepteurs de l’internaline sont hepatocyte Growth factor receptor (cMet), le gC1qR/P32 et les glycosaminoglycans (GAG).