Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macular mouse)の 銅 代 謝

岡山大学医学部放射線医学教室(指 導:青 野 要教授)

近 藤 信 太 郎

(昭和62年10足20日 受稿)

Key words: maculer mouse, Menkes kinky hair syndrome,

copper, Metallothionein

序 論

Menkes kinky hair dinease(Menkes病)

は,乳 児早期 の 男児 に発症 し,特 有の 毛髪 異常,

け いれん,筋 緊 張異常 あ るい は進行性 中枢神 経

症状 な どの症 状 を有 し,生 化学 的に は低 セル ロ

プ ラス ミン血,低 銅 血 を特 長 とし,放 置す れば

3歳 こ ろまで に出血 あ るいは感 染 な どの合併 症

に て死 亡 して しま う予 後 不 良 な疾 患 で あ り,

Menkesら1)に よって1962年 最初 に報告 されてい

る. Dasksら2)は 銅不 足 に陥 った動物 の血 管の弾

性 繊維 の変化 や毛 の 異常 に注 目 し,ケ ンメス症

患者の 銅含 量 を調 べ,低 銅 血,低 セ ル ロプ ラス

ミン血 を発 見 した.さ らに放 射銅 の経 ロ投 与後

の64Cuの 血 中濃度 が低 い こ とか ら,腸 管 におけ

る銅吸収 障害 を証 明 した3).ま た,銅 の非経 ロ投

与 に よって も病気 の進行 を止 め る こ とが でき な

い ことか ら,単 な る吸収 障害 だ けで な く輸送 障

害 の存在 す る こ.とも推定 した4).

マ ウスのX染 色体 上の突然 変 異mottledは,

ヘ テ ロ接合 体 の雌 が モザ イ クな毛 色 を呈 す る こ

とか ら名づ け られた. mottled遺 伝子座 には複数

の対 立遣伝 子(multiple alleles)が 知 られ てい

るが,雄 ヘ テロは外 見上 マ ダ ラ状 の毛色 を呈 す

るだけ なのに対 して,雄 のヘ ミ接合 体 は生前致

死 か ら出生 して くる もの まであ って,そ の表 現

は いろい ろで あ る5)～9). Hunt9)はmottledシ リー

ズのC57BL系 由来 のbrindledマ ウス(Mobr/y)

を用 いて銅 欠乏状 態 にあ るこ とを明 らか に し,

ヒ トの メンケ ス症 候群 と同 じ遺 伝的 な銅 輸送 異

常 が原 因 であ るこ と を示 した.

我 国においてもC3Hf系 の 中に 自然突 然変 異に

よ り生 じ,体 の縞模 様 か らmacularと 名づ け ら

れたマウスが1973年Nishimuraに よって報告 さ

れて いる10).こ のmacularマ ウ ス(以 下M1マ

ウス)もbrindledマ ウス と同 じよ うに,ヒ ゲ の

捻 れ,色 素不 足,発 育障 害,中 枢神 経症状 等 を

示すことが明 らかにされている11) 12).ただ, brindled

と異 なるの は ヒ トでの重 要 な初 発症状 であ るけ

いれんがM1マ ウスには出現するのに対 してbrin

dledで は しな い とされて い る点 であ る11) 12).

brindledマ ウスの銅 代謝 につ いて は詳細 な研

究が なされ てお り,肝 臓や 脳等 の 多 くの組 織 で

の銅の 欠乏や 腎臓,小 腸 での銅 の蓄積,こ れ ら

の銅の蓄 積 にMetallothionein(以 下MT)の 誘

導合成が 関係 して い るこ と等が 明 らかに され て

い る13)～23).また,胎 児 での銅欠 乏 には胎盤 で の

銅 の蓄積 や輸 送低下 が関 与 してい るこ とも報告

され てい る15) 21).一 方, M1マ ウ スの銅 代謝 につ

いて は7日 令, 14日 令マ ウスや 成獣 の 腎臓 で の

銅 の蓄積 や肝 臓,脳 で の銅欠乏 とい った事 や放

射 性 同位 元素64Cuを 使 っての腸 管の鋼 の輸 送 障

害がNishimura11)に よって 明 らか に されている

だけ で,そ の詳細 には不 明の点 が 多い.本 論文

においてはM1マ ウスの銅治 療前後 での組 織銅 量

の変化 と肝臓,腎 臓 でのMTの 変 動につ い て研

究 した結 果 につ いて報告 す る.

方 法

実験に使 用 したM1マ ウスは共 同研 究者 である

高知 医科 大学 の 田 博士 が浜 松 医科大 学の 西村

博士 よ り譲渡 された もの を岡 山大 学医 学部放 射

57

58　 近 藤 信 太 郎

線 医 学 教 室 内 の 動 物 飼 育 室 で繁 殖 飼 育 した も の

で あ る.飼 育 条 件 は コ ン ベ ン シ ョナ ル な環 境 下

で室 温22～25℃,明 暗12時 間 サ イ クル で あ り,

飼 料 と して は 固 形(オ リエ ン タ ル 酵 母, MF),

あ る い は 粉 末(日 本 ク レ ア, CE-2)を 使 用 し,

飲 料 水 と して は 水 道 水 を使 用 し た.実 験 に 使 用

した マ ウス として はMlマ ウス としてhemizygote

(Ml/y), homozygote(MI/Ml), heterozygote

(Ml/+),そ し てnormal(+/y,+/+)で あ る.

な お, homozygoteとhemizygoteは 銅 治 療 を施

さ な け れ ば16日 令 までに100%死 亡 す る こ とか ら,

Nishimura11)の 方 法 に 従 が っ て 生 後7日 令 で

CuCl2溶 液 の 皮 下 注 射 を行 っ た(50μg/一 匹).

肝 臓 と腎 臓 のMTの 測 定 はSephadex G-75で

の カ ラ ム ク ロマ トグ ラ フ ィ ー に よ りお こ な った.

7～9日 令 では25～30匹, 8～9週 令 では8～10

匹 か ら調 製 した 腎 臓 あ るいは肝 臓 に, 0.15M KCl,

0.5mM DTT, 20mM Tris/HCI(pH 7.4)を 加

え て ホ モ ジ ネ ー ト(20%w/v)を 調 製 し た,細

胞 可 溶 性 分 画 を得 る た め10万g, 1時 間 の 遠 心

を行 っ た.こ の 可 溶性 分 画(1g湿 重 量 か ら得

ら れ た量)をSephadex G-75 (Pharmahia-LKB

Biotechnology)の カ ラ ム(2.5×90cm)に 乗 せ

て, 50mM Tris/HCI(pH 8.4)で 溶 出 さ し た

(5℃, 20ml/hr).フ ラ ク シ ョ ン コ レ ク タ ー

(Pharmacia-LKB Biotechnology)で6mlづ つ

集 め て,こ の 溶 液 中 の 銅,亜 鉛 量 を 原 子 吸 光 光

度 計 で 測 定 した(Model AA-640-12,島 津 製 作

所).カ ラ ム の キ ャ リプ レ ー シ ョ ン はFerritin

(MW480,000), Bovine serum albumin

(66,000), Superoxide dismutase(32,000),

Cytochrome c(12,000), Metallothionein II

(6,500) (Sigma Chemical Co. LTI).)を 用 い

て 行 っ た. MTに 結 合 した 銅,亜 鉛 量 はMT分

画 に 含 ま れ る総 べ て の 銅,あ る い は 亜 鉛 量 を湿

重 量 あ た りの 量 と して 表 わ した(μgCuあ る い は

μgZn/g wet weight).血 清 の 銅,亜 鉛 量 は

10～15匹 か ら集 め た 血 清 を希 釈 して,原 子 吸 光

光 度 計 で 測 定 し, mlあ た りの 量 と して 表 わ した

(μgCuあ るい は μgZn/ml).組 織 の 銅,亜 鉛 量

は7～10匹 の マ ウ ス か ら分 離 した 組 織 を 同 一 試

料 と して 硝 酸 で 分 解 後,希 釈 して 原 子 吸 光 光 度

計 で 測 定 し,湿 重 量 あ た りの 量 と して 表 わ した

(μgCuあ る い は μgZn/g wet weight).

MT分 画 へ の35Sの 取 り込 み をみ る た め, 35S

cystine(36mCi/mmol, Amersham Corp.)の

10μCiを マ ウス の 腹 腔 内 に投 与 し, 24時 間 後 に 腎

臓 を摘 出 した. 8～10匹 か ら摘 出 した 腎 臓 に0.15

MKCI, 0.5mM DTT, 20mM Tris/HCI

(pH 7.4)を 加 え て ホ モ ジ ネ ー ト(20%w/v)

を 調 製 し, 10万g, 1時 間 の 遠 心 を行 い 細 胞 可

溶 性 分 画 を得 た.こ の 可 溶 性 分 画(1g湿 重 量

か ら得 られ た 量)をSephadex G-75 (2.5×60

cm)に 乗 せ て, 10mM Tris/HCI(pH 8.4)で 溶

出 し, 3mlづ つ 集 め た.こ の 各 分 画 中 の35Sの 放

射 能 を 液 体 シ ン チ レー シ ョン カ ウ ン タ ー(Liqid

Scintillation Spectrometer, Model 700, Pack

ard Instruments)で 測 定 し た.

結 果

正 常, M17日 令 マ ウ ス 組 織 の 銅,亜 鉛 量: M1

マ ウ ス は大 き く二 つ の グ ル ー プ に 分 け る こ と が

で き る.ひ とつ はhemizygote(M1/y)とhom

ozygote(M1/M1)で あ り,も う ひ とつ は, hete-

ozygote(Ml/+)で あ る.前 者 は 銅 投 与 の 治 療

を施 さ な い 限 り16日 令 程 度 ま で に 死 亡 す る こ と

が 知 ら れ て い る11) 12).

正 常, MIマ ウ ス の7日 令 で の 腎 臓,小 腸,肝

臓,脳,脾 臓,血 清 と全 身 の 銅,亜 鉛 量 の 測 定

を 行 っ た. MIの 腎 臓 の 銅 量 はhemizygote+

homozygote群(以 下mutant)共 に 正 常 群

(3.73±0.74μg/g wet weight)に 比 較 して 多

量 の 蓄 積 が 認 め られ た(mutant群: 8.41±1.23

μg/g wet weight, heterozygote群: 11.60±

2.04μg/g wet weight) (Fig. 1-A).同 じ よ う

な 銅 の 蓄 積 は 小 腸 で も 認 め ら れ, mutant群

(17.34±2.58μg/g wet weight)で 正 常 群

(2.88±0.17μg/g wet weight)の 約6倍,

heterozygote群(10.83μg/g±4.78wet

weight)で 約4倍 の 値 を 示 して い た(Fig. 1-B).

しか も,小 腸 で の 銅 の 蓄 積 は,腎 臓 で の 銅 の 蓄

積 がheterozygote群 の 方 がmutant群 よ り 多か

っ た の に 比 べ て,逆 にmutant群 の 方 が 高 くな っ

て い た.

胎 児,新 生 児期 に お い て 肝 臓 の 銅 量 が 高 い こ

とは 良 く知 られ て い るが24) 25),本 研 究 の 結 果 で も,

Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macular mouse)の 銅 代 謝　 59

Fig. 1 Copper and zinc contents in tissues from

7-day-old normal, mutant and heter

ozygote mouse. Pooled tissues or serum

removed from four or eight mice were

used for the experiments. Results are

means •} SD of six pooled tissues or

three pooled serum. Asterisks indicate

values significantly different (P<0.01)

from normal.

60　 近 藤 信 太 郎

正 常 群 の 肝 臓 の 銅 量 は34.07±9 .09μg wet

weightと 高 い値 を示 し て い た.し か し,こ れ に

対 してM1マ ウス で は両 群 と もに顕 著 に 低 い値 を

示 し,し か もmutant群(2.95±0.59μg/g wet

weight)はheterozygote群(5.35±1.77μg/g

wet weight)よ り更 に 低 い 値 とな っ て い た(Fig.

1-C).こ の よ う な組 織 銅 量 の 低 下 は 肝 臓 だ け で

は な く脳,脾 臓 で も認 め られ,肝 臓 の 場 合 と 同

じよ うにmutant群 はheterozygote群 よ り更 に

低 値 を示 し て い た(Fig. 1-D, E).血 清 銅 量 は

mutant群 ぎ正 常 群 の 約 半 分 の 値 を示 してい たが

(0.40±0.03μg/ml normal: 0.20±0.02μg/

ml mutant), heterozygoteで は 大 き い 変 化 は 認

め ら れ な か っ た(0.36±0.02μg/ml heter

ozygote) (Fig. 1-F).ま た,銅 量 に つ い て 全 身

で測 定 した 結 果 で は, M1マ ウ ス の 両 群 と もに 正

常 群 に 比 較 して,や や 低 値 を示 す もの の そ れ ほ

ど低 下 して い な か っ た(Fig. 1-G).こ の よ う に

銅 量 の 変 化 に 対 して, M1マ ウ ス の 組 織 の亜 鉛 量

は正 常 マ ウ ス に 比 較 し て 変 化 して い な か っ た.

以 上 の よ うな結 果 か ら, M1マ ウ ス で は正 常 マ ウ

ス に 比 較 し て生 体 内 で の 銅 の 分 布 が 著 し く変 化

し て い る こ とが 示 唆 さ れ た.

正 常, MIマ ウ ス の1, 7, 19日 令 で の 腎 臓,

肝 臓,脳 の 銅,亜 鉛 量 の 変 動:正 常, M1マ ウ ス

(mutant群)の 腎 臓,肝 臓,脳 の 銅,亜 鉛 量 が

新 生 児 期 の 間 に どの よ うに変 動 す るか 検 討 した.

正 常 マ ウ スの 腎 臓 で は, 1日 令5.37±2.69μg/

g wet weight, 7日 令3.95±0.56μg/g wet

weight, 14日 令425±0.55μg/g wet weightと

大 き な 変 動 は 認 め ら れ な か っ た.一 方, mutant

で は, 1日 令5.32±1.58μg wet weight, 7日

令8.05±0.96, Eg wet weight, 14日 令16.15±

5.26μg wet weightと7, 14日 令 で1日 令 に 比

較 し て 腎 臓 へ の 銅 の 蓄 積 が 認 め ち れ た.こ の

mutantの 腎 臓 の銅 量 を正 常 マ ウ ス と比 較 した場

合, 1日 令 で は 差 は 認 め られ な か っ た が, 7日

令 で は 約2倍 の, 14日 令 で は 約4倍 の 値 と な っ

て い た(Fig. 2-A).一 方,腎 臓 の 亜 鉛 量 に は 正

常, mutantと もに 大 き な 変 動 は 認 め ら れ なか っ

た(Fig. 2-A).こ れ らの 結 果 か らM1マ ウ スへ

の 銅 の 蓄 積 は7日 令 程 度 か ら顕 著 に 成 る と考 え

られ た.

正 常 マ ウ ス の 肝 臓 の 銅 量 は, 1日 令31.51±

4.05μg wet weight, 7日 令31.59±7.55μg wet

weight, 14日 令12.34±1.71μg wet weightと

1, 7日 令 に 比 較 し て14日 令 で減 少 して い た.

Fig. 2 Comparison of renal, hepatic and brain

copper and zinc contents in mutant and

normal mice at different stages of devel

opment. Pooled tissues removed from

5-10 mice were used for the experiments.

Results are means•}SD of five pooled

tissues. Asterisks indicate values signifi

cantly different (p<0.01) from normal.

一 方, mutantの 肝 臓 では, 1日 令2.02±0.38μg/

Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macular mouse)の 銅 代 謝　 61

g wet weight, 7日 令3.00±0.64μg/g wet

weight, 14日 令3.56±0.27μg/g wet weightと

1日 令 か ら14日 令 ま で 大 き な変 動 は 認 め られ な

か っ た.こ のmutantの 肝 臓 の 銅 量 を正 常 マ ウ ス

と比 較 した 場 合, 1, 7日 令 で は 約1/10, 14日

令 で は1/4と 顕 著 に 低 い値 を示 し て い た(Fig. 2

-B) .一 方,肝 臓 の亜 鉛 量 は,銅 量 と異 な り正 常,

mutantと と もに 大 き く変 動 して い なか っ た(Fig.

2-B).こ れ らの 結 果 か らM1マ ウ ス の 肝 臓 の 銅

の 欠 乏 は か な り早 い 発 生 段 階 か ら生 じて い る こ

とが 示 唆 され た.

正 常 マ ウ ス の 脳 の 銅 量 は, 1日 令1.30±0.37

μg/g wet weight, 7日 令1.38±0.24μg/g

wet weight, 14日 令1.52±0.83μg/g wet

weightと14日 令 ま で に 大 き な変 動 は 認 め られ な

か っ た.一 方, mutantの 場 合, 1日 令0.58±0.09

μg/g wet weight, 7日 令0.38±0.06μg/g

wet weight, 14日 令0.56±0.11μg/g wet

weightと 正 常 マ ウ ス と同 様 に 大 き な変 動 は認 め

られ なか った.し か し,そ の値 は各 日令 とも正

常マ ウ スの1/2程 度 であ った(Fig. 2-C).一 方,

脳の亜 鉛量 は正 常マ ウスとM1マ ウスの間に差 は

認め られ なか った(Fig. 2-C).こ れ らの結果 か

らmutantの 脳 の銅 の欠乏 は肝 臓 と同 じように発

生段 階の早 い時期 か ら生 じて い る事が 示唆 され

た.

Table 1 Survival after treatment of mutants at 7

days.

The number of mice injected is follewed by the number of mice that survived the injection to reach 60 days of age.

Table 2 Copper concentrations of tissuse 1, 7 and 56 days after treatment.

All mice were treated with copper at 7 days. Tissue copper concentrations are expressed as ƒÊg/g wet

weight. Results are means•}SD(n=4). * and ** signify significance at 1% and 5% probability levels

respectively for treated/untreated comparisons.

銅投 与に よるM1マ ウスの延 命 と組織 銅量の変

動:前 述 したよ うにM1マ ウスは大 きく二つの グ

ループに分 けるこ とがで き,　hemizygoteとhom

ozygoteは 銅投与 しなけ れば16日 令 程 度 まで に

62　 近 藤 信 太 郎

100%死 亡 す る こ と が 知 ら れ て い る11) 12).

Mshimura11)の 方 法に従が って銅投与 を行 い, 60

日令 での生 存率 の比較 を行 った. 50μgの 銅投 与

を行 っ たグルー プの生 存率 は68%,投 与 しなか

った グルー プ の生 存率 は0%で あ った(Table

1).

銅投 与後, 1, 7, 56日 後 の正常, mutantマ

ウスの 腎臓,肝 臓,脳 の銅,亜 鉛量の 測定 を行

った(Table 2, Table 3).正 常マ ウスで は

銅投 与群 の 腎臓 の銅 量 は, 1日 後 で非 投与群 に

比較 して約2倍 の値 を示 し,湿 重量 あ た り約3

μgの 銅 の蓄積 が認 め られ た. 7日 後 では非 投与

群 と同 じ程 度 に なって いた.一 方, mutantマ ウ

スでは非 投与群 に 比較 して, 1日 後 で約28μg,

7日 後 で23μgの 銅 の蓄積 が認 め られ た.こ の値

は正 常 マ ウスの 腎臓で の銅 投 与に よる銅 の蓄積

量 の8～9倍 に なって いた.

正 常 マ ウスの肝 臓で は,銅 投与1日 後,非 投

与群 に比較 して湿重 量 あた り46μgの 銅の蓄積 が

認 め られ たが,投 与7日 後 では41μgの 蓄 積 が認

め られ た.一 方, mutantの 肝 臓で は,銅 投 与1

8後,非 投与群 に比較 して湿 重量 あた り23μgの

銅 の蓄積 が認 め られ た.こ の値 は正 常 マ ウス で

の 蓄積 量の1/2で あ った,ま た, 7日 後 で は非投

与 群 と同 じレベ ル まで戻 ってい た.正 常 マ ウ ス

の脳 では,銅 投 与1, 7日 後,湿 重量 あ た り0.4

μgの 銅 の蓄積 が一 方, mutantの 脳 では, 1日

後0.7μg, 7日 後1. 1μgと 両 グループ 共にわずか

では あ るが銅 の蓄積 が 認め られ た.以 上の 結果

か ら, M1マ ウスで は投与 され た銅 の肝臓や 腎臓

内 での動 態 は正常 マ ウスに比 較 してか な り異 な

って い る と推 定 され た.

Table 3 Zinc concentrations of tissues 1, 7 and 56 days after treatment.

All mice were treated with copper at 7 days. Tissue zinc concentrations are expressed as ƒÊg/g wet

weight. Results are means•}SD(n=4). * and ** signify significance at 1% and 5% probability levels

respectively for treated/untreated comparisons.

銅投 与後 の 腎臓,肝 臓,脳 の亜 鉛量 につ いて

は 腎臓 と脳 で は顕 著 な変動 は認 め られなか った

が,肝 臓 では正常, mutantと ともに投 与1日 後,

非投与 群 に比較 して,正 常群 で湿重量 あ た り20

μg, M1マ ウスで14μgの 亜鉛 の蓄 積が 認め られ

た.し か し, 7日 後 には非 投与群 の レベ ルに戻

Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macular mouse)の 銅 代 謝　 63

って いた(Table 3).こ の 亜鉛 の蓄積 は銅投 与

に よる肝臓 でのMTの 誘 導に よるもの と推 定 さ

れた.

正常, M1マ ウスの 腎臓 と肝 臓のMT: MTに

つ いては生体 内での亜 鉛,銅 代 謝に 関係 してい

ると考 え られ てお り26) 27),また メンケ ス症候 群の

モデ ルマ ウスであ るbrindledで 詳細 な報 告が さ

れ てい るこ とか ら19) 20) 22) 23), M1マ ウスの 腎臓 と

肝臓 につ いて その測 定 を行 った. 7～8日 令の

正 常マ ウスの腎臓のMT-Cuレ ベルは1.55±0.35

μg/g wet weight, MT-Znレ ベ ルは0.83±0.37

μg/g wet weightと 低 い値 を示 して いたが, M1

マ ウ ス のMT-Cuレ ベ ル はmutant群 では5.17±

1.45μg/g wet weight, heterozygote群 で は

6.14±0.96μg wet weightと 正 常 群 に 比 較 して

有 意 に 高 値 を示 して い た.し か し, MT-Znレ ベ

ル には 差 は 認 め られ なか っ た.ま たこの時, mutant

やheterozygoteの 可 溶 性 分 画 の 銅 量 の 内,

60～70%がMT-Cuと して 占め られて いた(Table

4).

Table 4 Cytosol Cu and Zn, and MT-Cu-Zn ontent of kidney and liver from 7-8 day mice.

Mutant were not treated with copper at 7 days. aCopper and zinc concentrations are expressed as ƒÊg/g

wet weight. Results are means•}SD(n=3).•@* and ** signify significance at 1% and 5% probability leveles

respectively for macular/normal comparisons.

Table 5 Cytosol Cu and Zn, and MT-Cu-Zn content of kidney and liver from 8-9 week mice.

Mutants were treated with copper at 7 days. aCopper and zinc concentrations are expressed an ƒÊg/g wet

weight. Results are means•}SD(n=3). * and ** signify significance at 1% and 5% probability levels

respectively for macular/normal comparisons.

7～8日 令 の正 常 マ ウスの 肝 臓 のMT-Cuレ ベ

ル は8.34±0.86μg/g wet weightと 高 値 を示 し

て い た が, MT-Znは0.54±0.28μg/g wet

weightと 極 め て低 い 値 で あ っ た.一 方, M1マ ウ

64　 近 藤 信 太 郎

ス のMT-Cuレ ベ ル はmutant群 が0.25±0.22

μg/g wet weight, heterozygote群 が1.46±

0.51μg/g wet weightと 極 め て 低 い 値 であ った,

こ の 時, MT-Znレ べ ル は両 群 共 に 正 常 群 よ り高

値 を示 して い た(Table 4).

Fig. 3 Gel filtration chromatography of renal

cytosol of hemizygote, heterozygote and

normal mice.

8～9週 令 の正 常 マ ウ スの 腎臓 のMT-Cu,

MT-Znレ ベ ルは7～8日 令 と同 じように低 い値

を示 して いた。一方, M1マ ウスのmutant群 で

はMT-Cuレ ベ ル は6.06±0.67μg/g wet

weightと7～8日 令 と比較 して変化 して いなか

った が, heterozygote群 では15.62±1.01μg/g

wet weightと 約2.5倍 に増加 して いた.し か し,

肝 臓 のMT-Cu, MT-Znレ ベ ルは3群 と もに低

値 を示 してい た(Table 5).こ れ らの結 果 か ら,

腎臓 に蓄 積 した銅の大 部分 はMTに 結合 した形

で存在 してい る と考 え られた,

MTの 合成 の程 度 を検 討す るため35SのMT分

画 へ の取 り込み を測定 した. 8～9週 令正 常マ

ウス の腎臓 で は取 り込み はほ とん ど認め られ な

い が, M1マ ウ ス の 腎臓 で は, hemizygote群

heterozygote群 と もに正 常群 よ り高 い取 り込み

を示 して いた(Fig. 3).し か も,そ の取 り込み

もhetertzygote群 の方 がhemizygoteよ り多

く, MT-Cuレ ベ ルの傾 向 と一致 して いた(Table

5).こ れ らの結 果か らM1マ ウスの腎 臓ではMT

の 誘導合 成 が起 きて い る事 が示 唆 され た.

考 察

M1マ ウ スは1973年 にNishimuraに よ って報

告 され たマ ウ スでMenkes症 のモ デル動物 とし

ての有 用性 が明 らか に されつつ あ り,中 枢 神 経

の障害 の発 生病 理研 究や銅代 謝 の研 究が な され

て い る11) 12).銅 代 謝 の異 常 に つ い て の報 告 は

Nishimura11)に よって,さ れてお り銅治 療 を施 し

て いな い7, 14日 令 マ ウスの 肝臓や 脳 での銅 量

が低 い こ とや, 7, 14日 令や 成獣 で の腎臓 の

銅の 蓄積 を報告 してい る.ま た, 64Cuの 取 り込

みか ら腸 管の銅 の輸送 障 害 につ いての報 告 も行

ってい る.本 研 究 での報告 で更に 以下 の点 が明

らか に なっ た,

① 7日 令 での比較 で は腎臓 や小 腸以外 での組

織(肝 臓,脳,脾 臓,血 清)の 銅 量は低 値 を示

して いた.し か も,全 身の銅 量 には顕著 な差 は

認 め られな い こ とか ら,生 体 内 で銅が局 在 して

い る と推 定 され た.ま た,亜 鉛量 には 顕著 な変

化 は認 め られなか っ た.

② 腎臓で の銅 の蓄積 は7日 令 では顕 著 であ っ

たが, 1日 令 で は正常 に比較 して有意 の差 は認

め られなか った.

③ 肝臓や脳 で の銅の低 値 は1日 令 で も認め ら

れ た.

④ 銅 投与 後の肝 臓 腎臓,銅 量の変 化 は正常

に比較 して異 なって い た.

⑤ 腎臓に蓄積 した銅 の大部分 はMTに 結合 し

て存在 してい た.ま た,亜 鉛の 結合 は僅 かで あ

った.肝 臓 ではMTレ ベ ルが正 常群 に 比較 して

顕著 に低値 を示 してい た.

Menkes diseaseの モデ ル動 物 としては現在 ま

での ところM1マ ウスを含 める と9種 類 の報告 が

あるが5)～9),この 中 で もbrindled, blothyに つ い

ては詳細 な研 究が され てい る.こ れ らの報告 と

M1マ ウ スでの本 実験 結果 を比較 す ると,腎 臓や

小腸 での 銅 の蓄積 と腎MTの 増 加,肝 臓,脳,

脾 臓,血 清 等で の銅 の欠乏 と多 くの類 似点 が認

め られ た.し か し,腎 臓 での銅 の蓄積 につ い て

はbrindledで は胎 児や1日 令 の段階 か ら認め ら

れ る と報 告 され てい るの に対 して15), M1マ ウス

の今 回の結 果 では1日 令 では有 意の差 は認め ら

れず, 7日 令 で差が認められていた.またbrindled

の報告 で は胎盤 で も銅 の蓄 積 が認め られ る とさ

れて いたが35),結果 に は示 さな いがM1マ ウスで

は蓄積 は認 め られ なか った。この よ うな違 いが,

系統 の違 いに よ るの か,あ るい は他 の原 因 なの

Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macular mouse)の 銅 代 謝　 65

か更 に詳細 な研 究が望 まれ る.

Menkes diseaseやmottled(brindled, bloth

y)そ してmacularマ ウス でのbasic defectは

依然 不明 の ま まであ るが,腎 臓や小 腸 での銅 の

蓄積 や肝 臓 での銅 の欠 乏につ い ては研究 が進 め

られて い る.特 に銅の 蓄積 につ いて は, Menkes

diseaseの 患者やmottledマ ウスからのfibrobal

stやlymphobiastを 用 い て多 くの研究 がな され

てお り,銅 の蓄積 とMTの 誘 導 との関係 が 明 ら

かに されつ つあ る.こ れ らのMenkes cellsは 正

常 の 細胞 に比較 して3～10倍 の銅 を細 胞 内に蓄

積 す る こ と28)～30),そして,こ の 蓄積 した銅 の大

部分 はMTに 結合 した形 で存在す るこ とが知 ら

れ てい る31)～36).これ らのMTの 形で存在 す る過

剰 の銅の蓄 積 を説明す るため に,い くつか の仮

説が考 え られ てい る.こ れ らの仮説 は大別 す る

と二 つに分 け る こ とが で きる.ひ とつ は銅代 謝

が変 化 して,細 胞 内に銅 が蓄積 し,そ の結 果MT

の誘 導合 成が起 きる とい う考 え で37)～39),もうひ

とつ はMTの 合 成の制 御 が変化 して, MTの 誘

導合 成が 生 じ,結 果 と して細 胞 内に銅が蓄 積す

る とい う考 え方 であ る40) 43).ま た, in vivoで の

腎 臓での銅 の蓄 積 についてPackmanら39)は 興味

あ る報告 を して い る,そ れ に よる と,細 胞内(組

織)の 銅 レベ ルが有 意に上 昇 した段階 で もMT

のmRNAレ ベ ルが変 化 してい ないことを示 し,

in vivoで の 腎臓へ の銅 の蓄積 も, Menkes cells

と同 じよ うに 銅代謝 の変 化 が生 じ,そ の結果 腎

臓 の細 胞内へ の銅 の蓄積 が起 こ り, MTが 誘導

され るの ではな いか と推 定 して い る.ま た,銅

の蓄 積につ いてSoneら38)は 銅 の蓄積 には細胞 内

に 存 在 す るMT以 外 の 銅 結 合 蛋 白(Copper

binding protein)が 深 く関係 してい る と推定 し

て いる.こ の蛋 白は細胞 内の各organallaへ 銅 を

輸送 す る働 きを して お りこの蛋 白の機 能 あるい

は発 現が 変化 したため に,細 胞 内での 銅の輸 送

が低 下 し,銅 を要求 す る蛋 白へ の(酵 素等)供

給 が充分 でな くな る一方,細 胞 内での 銅の 濃度

は高 くな るため,結 果 としてMTの 誘 導が生 じ

て いるの では ないか と推 定 して い る.

Menkes diseaseで の もう一つの特徴 である肝

臓 での銅 の欠乏につ いての解 明は64Cuを 用いて,

in vivoや あるいは分 離肝 細胞 を用 いて研究 が さ

れ てい る. brindledマ ウスの分離 肝細胞 は正常

肝細 胞に比 較 して取 り込み のパ ラ メター で あ る

KmやVmaxに は大 きな違 いは認 め られ な いが, 64

Cuの 蓄積 量に減 少が認め られ る としている42)。

また, in vivoの 研 究 では64Cuの 細胞 への取 り込

み は正常 であ るが,非 常に速 く消失 す る ことが

報告 されてい る17).

以上Menkes diseaseで の銅 代謝 異常 を説 明

す るため にい くつかの仮 説が提 出されているが,

銅 の蓄積 と欠乏 とい う相反 す る現 象 を充分 に 説

明す るこ とは で きてお らず今 後, Menkes cells

やM1マ ウス を含め たMenkes diseaseの モデル

マウ スでの詳 細 な研 究が望 まれ る.

結 語

① Menkes症 モデルマ ウスであるMacullarマ

ウスの 腎臓や 小腸 では正 常群 に比較 して銅 の蓄

積 が認 め られたが,他 の組織(肝 臓,脳,脾,

血清)で は顕 著 に低 い値 を示 して いた、

② 腎臓 での銅 の蓄積 は正常群 に比 較 して1日

令で は差 は認め られ なか ったが, 7日 令 では顕

著で あ った.肝 臓 と脳 での銅 の欠乏 は1日 令 か

ら認 め られ た.

③ 銅 投与 後の 肝臓 と腎臓 での銅量 の変化 は正

常群 に比較 して異 なって いた.

④ 腎臓 に蓄 積 した銅 の大部分 はMTに 結合 し

て存 在 してい た.

謝 辞

稿 を終 わ るに当 た り御 懇切 な る御指 導頂 い た

放射 線 医学教室 の青 野要教 授,白 石 則之助 手並

びに教 室の各位 に謝 意 を表 します.ま た,機 器

の使 用 につ き御 配 慮下 さい ま した,麻 酔 蘇生 学

教 室小 坂二度 見教授,並 び に教 室 の各位 に謝 意

を表 します.

文 献

1

. Menkes JH, Alter M, Steigleder GK, Weakley DR and Sung JH: A sex-linked recessive disorder

66　 近 藤 信 太 郎

with retardation of growth, peculiar hair, and focal cerebral and cerebellar degeneration. Pediatrics

(1962) 29, 764-779.

2. Danks DM, Stevens BJ, Campbell PE, Gillespie JM, Walker-Smith J, Blomfield J, and Turner B

: Menkes' kinky-hair syndrome. Lancet (1972) 1, 1100-1103.

3. Danks DM, Cartwright E, Stevens BJ and Towneley RRW: Menkes' kinky hair disease: Further

definition of the defect in copper transport. Science (1973) 179, 1140-1142.

4. Danks DM, Campbell PE, Stevens BJ, Meyne V and Cartwright E: Menkes' kinky hair syndrome

: An inherited defect in copper absorption with widespread effects. Pediatrics (1972) 50, 188-201.

5. Fraser AS, Sobey S and Spicer CC: Mottled, a sex-modified lethel in the house mouse. J Genetics

(1953) 51, 217-221.

6. Phillips RJS Dappled, a new allele at the Mottled locus in the house mouse. Genet Res (1961) 2,

290-295.

7. Russell LB and Saylors GL: Induction of paternal sex chromosome losses by irradiation of mouse

spermatozoa. Genetics (1962) 47, 7-10.

8. Cattanach BM, Pollard CE and Perez JN: Controlling elerents in the mouse X-chromosome: I.

Interaction wiht the X-linked genes Genet Res (1969) 14, 223-235.

9. Hunt DM: Primary defect in copper transport underlies mottled mutants in the mouse. Nature

(1974) 249, 852-854.

10. Nishimura M: A new mutant mouse, macular (M1). Exp Anim (Tokyo) (1975) 24, 185.

11. Nishimura M: Menkes' kinky hair syndrome mutant mouse (macular mouse); in Experimental

Animal Models of Intractable Disease, Kyogoku ed, Soft Science, Inc. Tokyo (1984) pp 158-168.

12. Yamano T, Shimada M, Kawasaki H, Onaga A and Nishimura M: Clinico-pathological study on

macular mutant muose. Acta Neuropathol (Berl) (1987) 72, 256-260.

13. Danks DM: Copper transport and utillisation in Menkes' syndrome and in mottled mice. Inorg

Perspect Biol Med (1977) 1, 73-100.

14. Evans GW and Reis BL: Impaired copper homeostasis in neonatal male and adult female brindbed

(Mobr) mice. J Nutr (1978) 108, 554-560.

15. Camakaris J, Mann JR and Danks DM: Copper metabolism in mottled mouse mutants: Copper

concentration in tissue during development. Biochem J (1979) 180, 597-604.

16. Mann JR, Camakaris J, Danks DM and Walliczek EG: Copper metabolism in mottled mouse

mutants: Copper therapy of brindled (Moll) mice. Biochem J (1979) 180, 605-612.

17. Mann JR, Camakaris J and Danks DM: Copper metabolism in mottled mouse mutants: Distribution

of 54Cu in brindled (Mobr) mice. Biochem J (1979) 180, 613-619.

18. Prins HW and Van den Hamer CJA: Primary biochemical defect in copper metabolism in mice with

a recessive X-linked mutation analogous to Menkes' disease in man. J Inorg Biochem (1979) 10,

19-27.

19. Hunt DM and Port AE: Trace element binding in the copper deficient mottled mutants in the mouse.

Life Sci (1979) 24, 1453-1466.

20. Port AE and Hunt DM: A study of the copper-binding proteins in liver and kidney tissue of neonatal

normal and mottled mutant mice. Biochem J (1979) 183, 721-730.

21. Mann JR, Camakaris J and Danks DM: Copper metabolism in mottled mouse mutants: Defective

placental transfer of 64Cu to foetal brindled (Mobr) mice. Biochem J (1980) 186, 629-631.

22. Prins HW and Van den Hamer CJA: Abnormal copper-thionein synthesis and impaired copper

Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macular mouse)の 銅 代 謝　 67

utilization in mutated brindled mice: Model for Menkes' disease. J Nutr (1980) 110, 151-157.

23. Prohaska JR: Comparison of copper metabolism between brindled mice and dietary copper-deficient

mice using 67Cu. J Nutr (1983) 113, 1212-1220.

24. Mason R, Bakka A, Samarawickrama GP and Webb M: Metabolism of zinc and copper in the

neonate: Accumulation and function of (Zn, Cu) -metallothionein in the liver of the newborn rat.

Br J Nutr (1981) 45, 375-389.

25. Bakka A and Webb M: Metabolism of zinc and copper in the neonate: Changes in the concentrations

and contents of thionein-bound Zn and Cu with age in the livers of the newborn of various mam

malian species. Biochem Pharmacol (1981) 30, 721-725.

26. Cousins RJ: Absorption, transport, and hepatic metaboldsm of copper and zinc: Special reference

to metallothionein and ceruloplasmin. Physiol Rev (1985) 65, 238-309.

27. Bremner I: Involvment of metallothionein in the hepatic metabolism of copper. J Nutr (1987) 117,

19-29.

28. Goka TJ, Stevenson RE, Hefferan PM and Howell RR: Menkes disease: A biochemical abnormality

in cultured human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA (1976) 73, 604-606.

29. Camakaris J, Danks DM, Ackland L, Cartwright E, Borger P and Cotton RGH: Altered copper

metabolism in cultured cells from human Menkes' syndrome and mottled mouse mutants. Biochem

Genet (1980) 18, 117-131.

30. Chan W-Y, Granica AD and Rennert OM: Cell culture studies of Menkes kinky hair disease. Clin

Chim Acta (1978) 88, 495-507.

31. Beratis NG, Price P, LaBadie G and Hirschhorn K: 64Cu metabolism in Menkes and normal cultured

skin fibroblasts. Pediat Res (1978) 12, 699-702.

32. Onishi T, Inubushi H, Tokugawa S, Muramatsu M, Nishikawa K, Suzuki Y and Miyao M

Abnormal copper metaboldsm in Menkes cultured fibroblasts. Eur J Pediatr (1980) 134, 205-210.

33. LaBadie Gu, Beratis NG, Price PM and Hirschhorn K: Studies of the copper-binding proteins in

Menkes and normal cultured skin fibroblast lysates. J Cell Physiol (1981) 106, 173-178.

34. LaBadie GU, Hirschhorn K, Katz S and Beratis NG: Increased copper metallothionein in Menkes

cultured skin fibroblasts. Pediatr Res (1981) 15, 257-261.

35. Bonewitz RF and Howell RR: Synthesis of a metallothionein-like protein in cultured human skin

fibroblasts: Relation to sbnormal copper distribution in Menkes' disease. J Cell Physiol (1981) 106,

339-348.

36. Riordan JR and Jolicoeur-Paquet L: Metallothionein accumulation may account for intracellular

copper retention in Menkes' disease. J Biol Chem (1982) 257, 4639-4645.

37. Packman S, Chin P and O'Toole C: Copper utilization in cultured skin fibroblasts of the mottled

mouse, an animal model for Menkes' kinky hair syndrome. J Inher Metab Dis (1984) 7, 168-170.

38. Sone T, Yamaoka K, Minami Y and Tsunoo H: Induction of metallothionein synthesis in Menkes'

and normal lymphoblastoid cells is controlled by the level of intracellular copper. J Biol Chem

(1978) 262, 5878-5885.

39. Packman S, Palmiter RD, Karin M and O'Tolle C: Metallothionein messenger RNA regulation in

the mottled mouse and Menkes kinky hair syndrome. J Clin Invest (1987) 79, 1338-1342.

40. Schmidt CJ, Hamer DH, and McBride OW: Chromosomal location of human metallothionein genes

: Implications for Menkes' disease. Science (1984) 224, 1104-1106.

41. Leone A, Pavlakis N and Hamer DH: Menkes' disease: Abnormal metallothionein gene regulation

68　 近 藤 信 太 郎

in response to copper. Cell (1985) 40, 301-309.

42. Darwish HM, Hoke JE and Ettinger MJ: Kinetics of Cu (II) transport and accumulation by

hepatocytes from copper-deficient mice and the brindled mouse model of Menkes disease. J Biol

Chem (1983) 258, 13621-13626.

Menkes症 モ デ ル マ ウ ス(Macula rmouse)の 銅 代 謝　 69

Copper metabolism in the macular mutant mouse as

an animal model of Menkes kinky hair disease

Shintaroh KONDOH

Department of Radiation Medicine, Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan

(Director: Prof. K.Aono)

The copper, zinc and metallothionein contents were measurded in various tissues of mutant

(hemizygous and homozygous) macular, heterozygous macular and normal mice. The copper

contents in the kidney and small intestine of 7-day-old mutants and heterozygotes were much

higher than in normal mice, whereas the copper contents in the other tissues (liver, brain

spleen and serum) were low. Renal copper contents of 1-day-old mutants were not different

from contents of normal mice, whereas those of 7-, and 14-day-old mutants were significantly

elevated. Hepatic and brain copper contents were extremely low at all stages compared to

normals. Copper therapy was applide to 7-day-old mutant mice. One day after injection,

hepatic copper contents in mutants increased slightly compared to the normal controls,

whereas renal copper contents increasded greatly. Seven days after injection, hepatic copper

contents in mutants decreased greatly compared to the normal control, whereas the increase

in renal copper contents remained. One and 7 days after injectin, brain copper contents in

mutants and normal mice increasde slightly compared to untreated mice. The renal MT-Cu

contents in 7-and 8-day-old mutants and heterozygotes were significantly greater than that

of normal mice. The marked elevation in renal MT-Cu contents was also observed in 8-and

9-week-old mutants and heterozygotes. In contrast to the kidney, hepatic MT-Cu contents in

7-and 8-day-old mutants and heterozygotes were much lower than in normal mice. In contrast

to copper, no significant differences in zinc levels in any tissue were evident.