Mémoire Présenté - Laboratoire de Biologie Moléculaire ... · de Ouagadougou pour son aide, ... o Au Docteur Céline LANGENDORF, référente Bactériologie à Epicentre Paris,

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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU ---------------

UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE

(UFR/SVT)

Mémoire Présenté

Par : Moumouni Aissatou

Pour l’obtention du Master II

de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées

de l’Université de Ouagadougou

SUR LE THEME:

CARACTERISATION DES GENES DE RESISTANCE AUX QUINOLONES

CHEZ LES ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE

BETALACTAMASES A SPECTRE ELARGI ISOLEES CHEZ LES ENFANTS

DE 6 A 59 MOIS, DANS LA REGION DE MARADI AU NIGER

NNNNNNNNNNIGERNNNIGERNIGER..…………………………………

………………………………………………………..……………

…………………………………………………………………….

………………………………

Soutenu le 11 Novembre 2015 devant le jury composé de :

Président : Pr Aboubakar Sidiki OUATTARA, Professeur Titulaire, Université de

Ouagadougou

Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Dr Serge DIAGBOUGA, Maitre de Recherche, IRSS

Dr Christelle M.W. NADEMBEGA, Maître Assistant, Université de

Ouagadougou

LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

(LABIOGENE)

N° d’Ordre .............................../LABIOGENE

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page i

Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA

De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont

incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences

biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands

progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de

l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités

et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande

majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs

besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait

est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel

pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise

de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous

conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique

moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de

capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents

envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester.

Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a

pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie

moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels

qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en

génétique et biologie moléculaires.

Le master BioGeMA est :

Un Master à dimension sous-régionale

Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie

moléculaires

Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE

Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et

des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des

centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de

recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour

permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève

du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en

place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.

Professeur Jacques SIMPORE

Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et

de Génétique Moléculaire

UFR/SVT - École Doctorale Sciences et

Technologie

Université de Ouagadougou – Burkina Faso

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page ii

DEDICACES

Je dédie ce travail:

A mon défunt Père Moumouni Harouna

A ma Mère Haoua Harouna, pour votre amour, votre confiance, votre soutien, et vos

encouragements.

A mes Frères, Sœurs, Parents et Amis pour votre soutien moral, matériels et pour vos

encouragements.

A tous ceux, qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à l’aboutissement de ce

travail.

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page iii

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au laboratoire d’Epicentre à Maradi au Niger, à l’Hôpital Saint

Camille de Ouagadougou au Burkina Faso (HOSCO) et au Centre de Recherche

Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA).

Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude :

o Au Professeur Jacques SIMPORE, Professeur titulaire, Responsable du Laboratoire

de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE); Coordonnateur du Master

de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA),

Université de Ouagadougou; Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro

Annigoni (CERBA); Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin (USTA);

Membre de l’Académie Nationale des Sciences du Burkina (ANSB), notre Directeur

de Mémoire pour son encadrement et pour son soutien dans la réussite de notre

Master de recherche ;

o Au Professeur Aboubakar Sidiki OUATTARA, Professeur titulaire à l’université de

Ouagadougou, notre président du jury pour avoir accepté de juger notre travail ;

o Au Docteur Serge DIAGBOUGA, Maitre de Recherche à l’Institut de Recherche en

Sciences de la Santé (IRSS), notre co-directeur de mémoire pour avoir accepté de

juger notre travail et pour le temps qu’il a consacré à ce document ;

o Au Docteur Christelle Marie Wendyam NADEMBEGA, Maître Assistant, Université

de Ouagadougou pour son aide, son soutien et pour avoir accepté de juger notre

travail ;

o Au Docteur Florencia DJIGMA, assistante à l’Université de Ouagadougou pour son

encadrement et ses conseils si précieux tout au long de ce master ;

o Au Docteur Céline LANGENDORF, référente Bactériologie à Epicentre Paris,

France, pour sa collaboration, son aide, son soutien ;

o Au Docteur Metuor Dabire Amana, Docteur en Biologie Moléculaire option

Enzymologie , Laboratoire de Biologie et de Génétique moléculaire (LABIOGENE),

pour son soutien et son aide ;

o A Epicentre de m’avoir donné l’autorisation de travailler sur les souches résistantes

aux bétalactamases isolées, pendant l’étude ancillaire ;

o A tous les doctorants du CERBA/LABIOGENE pour leur participation à la réalisation

de ce travail ; particulièrement OUATTARA Abdoul Karim pour son aide ;

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page iv

o Au personnel du laboratoire d’Epicentre, d’HOSCO et du CERBA pour leur bonne

collaboration ;

o A toute la promotion du Master 2014, particulièrement Zongo Arsène pour son aide;

o A tous nos enseignants du Master BioGéMA pour leur encadrement de qualité;

o A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) pour le soutien

financier du master BioGéMA à travers le programme PACER2 ;

o A toute autre personne qui de près ou de loin a participé à la réalisation et à la qualité

de notre travail ;

o A mes parents, frères et sœurs pour leurs soutiens et encouragements

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page v

RESUME

Objectifs : L’objectif de cette étude était de décrire les gènes plasmidiques de résistance aux

quinolones chez E.coli et Klebsiella spp productrices de bétalactamase à spectre élargi

(BLSE) isolées chez les enfants de 6 à 59 mois inclus dans une étude menée par le centre de

recherche « Epicentre » dans la région de Maradi au Niger.

Méthodologie : 78 souches d’entérobactéries productrices de BLSE et résistantes aux

quinolones nous ont été fournies par le laboratoire de l’EPICENTRE Maradi-Niger. La

sélection des souches a été effectuée en fonction des couleurs des colonies sur milieu de

culture chromagar-BLSE: roses, et bleues suspectant respectivement E. Coli et Klebsiella.

L’identification a été confirmée par la galérie API 20E. La recherche des gènes qnr et aac(6’)

a été effectuée respectivement par PCR multiplex et simplex au CERBA/LABIOGENE,

Université de Ouagadougou, Burkina Faso

Résultats : 5,1 % des souches (03 E. coli et 01 Klebsiella pneumoniae) présentaient une

résistance au qnrA; le gène qnrB a été retrouvé chez 11 souches (02 E.coli, 02 Klebsiella

oxytoca et 07 Klebsiella pneumoniae) soit 14,1 % ; 27 souches (34,6 %) dont 23 E. coli et 04

Klebsiella pneumoniae ont montré une résistance au qnrS ; le gène aac(6’) était présent chez

53 souches (38 E. coli, 2 K. oxytoca et 13 K. pneumoniae) soit 67,9 %. Les souches BLSE

contenant le gène aac(6’) sont les plus nombreuses. La résistance associée aux quinolones

dans le cas de BLSE a été observée dans 88,46 % (69/78) soit 22 % de l’ensemble des

souches de Klebsiella. Aucune des souches résistantes aux bétalactamases n’héberge à la fois

les gènes qnrA, qnrB et qnrS mais il existe une association des gènes de résistance BLSE, qnr

et aac(6’) chez 26 souches répartis comme suit 12 E.coli, 02 Klebsiella oxytoca et 12

Klebsiella pneumoniae. Parmi les 21 souches (16 E. coli, 04 Klebsiella pneumoniae et 01

Klebsiella oxytoca) sensibles à l’acide nalidixique mais résistante aux fluoroquinolones (soit

26,9 %), on observe la présence du gène qnrA chez 01 souche, le gène qnrB est retrouvé chez

03 souches, 16 souches présentent une résistance au qnrS, 09 souches montrent une résistance

au gène aac(6’).

Conclusion : Nous avons obtenu des données sur les génotypes des déterminants qnr et sur

leur proportion chez les enfants dans la région de Maradi, au Niger. Nous avons aussi eu une

idée sur la répartition de ces gènes en fonction des espèces étudiées.

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page vi

Mots clés : Entérobactéries ; bétalactamases à spectre élargi, quinolones ; Klebsiella spp ; E.

coli

Abstract

Aim : the aim of this study is to describe the plasmid resistance to quinolone of wide

spectrum betalactamases producing E. coli and Klebsiella spp isolated from 6 to 59 months

children included in a study conducted by the research center ‘Epicentre ’at Maradi in Niger

Republic.

Methodology: 78 strains of ESBL producing E. coli and Klebsiella spp resistant to the

quinolone group were provided by the Epicentre laboratory of Maradi-Niger. The strain

selection was based on the colony color on the medium Chromagar ESBL: pink and blue

suspecting E. coli and Klebsiella respectively. The identification was confirmed the ‘’galerie

20E’’. The search for qnr and aac (6’) genes was carried out respectively by PCR multiplex

and simplex.

Results: 5.1 % of strains (3 E. coli and 1 Klebsiella pneumonia) were resistant to qnrA; the

qnrB gene was found in 11 strains (2 E.coli, 2 Klebsiella oxytoca et 7 Klebsiella pneumoniae)

making 14.1 % ; 27 strains (34,6 %) among which 23 E. coli and 4 Klebsiella showed a

resistance to qnrS; the and aac (6’) gene was present in 53 strains (67.9 %). The ESBL strains

containing the aac (6’) gene were the most important. The resistance to quinolone associated

with ESBL was observed in 88.46 % (69/78) making 22 % the whole Klebsiella strains.

None of the ESBL strains carried simultaneously qnrA, qnrB and qnrS genes but there may

be and association of ESBL, qnr and aac(6’) genes in the 26 strains as follow: 12 E. coli, 2

Klebsiella oxytoca and 12 Klebsiella pneumoniae.

Among the 21 strains (16 E. coli, 4 K. pneumoniae and 1K. oxytoca) sensible to nalidixic acid

but resistant to fluoroquinolones making 26.9 %, we noticed the presence of qnrA gene in

one (1) strain; the qnrB gene was found in 3 strains; the qnrS gene was found in 16 strains

and finally 9 strains showed a resistance to aac(6’) gene.

Conclusion: we have obtained data concerning the genotype of QNR determinant and their

proportion in Maradi region in Niger republic and we’ve gotten an idea on the repartition of

these genes based on the species studied.

Key words: Enterobacteria; wide spectrum betalactamase; quinolone, Klebsiella spp;

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page vii

TABLE DES MATIERES

Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ..................................................................................................... i

DEDICACES ............................................................................................................................................................. ii

REMERCIEMENTS ..................................................................................................................................................iii

RESUME ................................................................................................................................................................... v

ABSTRACT ............................................................................................................................................................... vi

TABLE DES MATIERES ........................................................................................................................................ vii

LISTE DES FIGURES .............................................................................................................................................. x

LISTE DES TABLEAUX ...........................................................................................................................................x

LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................................................. xii

INTRODUCTION ...................................................................................................................................................... i

I. Revue Bibliographie .......................................................................................................................................... 3

I.1 Généralités sur les bactéries.............................................................................................................................. 3

I.1.1 Définition ................................................................................................................................................... 3

I.1.2 Morphologie .............................................................................................................................................. 3

I.1.3 Matériel génétique ..................................................................................................................................... 4

I.1.4 Paroi cellulaire ........................................................................................................................................... 5

I-2. Les entérobactéries .......................................................................................................................................... 5

I-2-1 Définition .................................................................................................................................................. 5

I-2-2 Historique .................................................................................................................................................. 6

I-2-3 Epidémiologie ........................................................................................................................................... 7

I.2.4 Les groupes d'entérobactéries .................................................................................................................... 7

I.2.5 Les caractères généraux et biochimiques................................................................................................... 8

I.2.6 Identification .............................................................................................................................................. 9

I.3 Antibiotiques .................................................................................................................................................. 10

I.3.1 Généralités ............................................................................................................................................... 10

I.3.1.1 Définition .............................................................................................................................................. 10

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page viii

I.3.1.2 Historique ............................................................................................................................................. 10

I.3.1.3 Bêta-lactamines..................................................................................................................................... 12

I.3.1.4 les quinolones ...................................................................................................................................... 13

I.4 Résistance bactérienne aux antibiotiques ....................................................................................................... 15

I.4.1 Résistance aux β-lactamines .................................................................................................................... 16

I.4.2 Résistance aux quinolones ....................................................................................................................... 17

II. Objectifs de l’étude ............................................................................................................................................. 19

II.1 Objectif principal ........................................................................................................................................... 19

II-2 Objectifs spécifiques .................................................................................................................................... 19

III Matériel et méthodes .......................................................................................................................................... 20

III.1 Cadre de l’étude ........................................................................................................................................... 20

III.2 Type et période d’étude ............................................................................................................................... 21

III.3 Echantillonnage ............................................................................................................................................ 21

III.3.1 - Mode de sélection ............................................................................................................................... 22

III.3.2 - Critère d’inclusion .............................................................................................................................. 22

III.3.3 -Critères d’exclusion ............................................................................................................................. 22

III.4 Matériel ........................................................................................................................................................ 23

III.4.1 Réactifs ................................................................................................................................................. 23

III.4.2 Appareillage .......................................................................................................................................... 23

III.4.3 Autres matériels .................................................................................................................................... 23

III.5 Méthodes ...................................................................................................................................................... 23

III.5.1 Confirmation de l’identité des souches ................................................................................................. 23

III.5.2. Sensibilité aux antibiotiques ................................................................................................................ 23

III.5.3 Condition de cultures des souches ........................................................................................................ 24

III.5.4 Extraction des ADNs ............................................................................................................................ 24

III.5.5 Amplification des gènes de quinolones................................................................................................. 24

III.5.6 Electrophorèse sur gel d’agarose .......................................................................................................... 26

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page ix

III.5.7 Analyse des données ............................................................................................................................. 27

III.5.8 Considérations éthiques ........................................................................................................................ 27

IV Résultats .............................................................................................................................................................. 28

IV.1 Caractéristiques et répartition des souches d’entérobactéries en fonction des espèces

bactériennes.......................................................................................................................................................... 28

IV.2 Répartition des gènes en fonction de l’espèce ............................................................................................. 28

IV.3 Répartition de l’association des gènes en fonction des espèces bactériennes .............................................. 29

IV.4 Répartition de gènes chez les souches sensibles à l’acide nalidixique et résistantes aux

fluoroquinolones .................................................................................................................................................. 29

IV.5 Caractérisation des gènes codant pour la résistance aux quinolones .......................................................... 30

V. Discussion ........................................................................................................................................................... 37

Conclusion ............................................................................................................................................................... 39

PERSPECTIVES ..................................................................................................................................................... 39

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................................. 40

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page x

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Les trois types de bactéries ......................................................................................................................... 4

Figure 2: Structure d’une bactérie .............................................................................................................................. 5

Figure 3: Structure des quinolones, A : noyau commun, B : acide nalidixique, C : fluoroquinolone. .................... 14

Figure 4: Inactivation enzymatique de l’antibiotique .............................................................................................. 16

Figure 5: Mécanisme d’action des quinolones (Dentan, 2015) ................................................................................ 18

Figure 6: Gel d’agarose des produits PCR des gènes qnrA et qnrB qnrS ................................................................ 36

Figure 7: Gel d’agarose des produits PCR du gène aac(6’)-Ib. ............................................................................... 36

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Protocoles de PCR du gène qnr ............................................................................................................. 25

Tableau II: Séquences des amorces utilisées au niveau de cette étude .................................................................... 26

Tableau III: Répartition des souches d’entérobactéries en fonction de l’espèce ..................................................... 28

Tableau IV: Répartition des gènes en fonction de l’espèce bactérienne .................................................................. 28

Tableau V: Répartition de l’association des gènes en fonction des espèces bactériennes ....................................... 29

Tableau VI : Répartition de gènes chez les souches sensibles à l’acide nalidixique et résistantes aux

fluoroquinolones ...................................................................................................................................................... 29

Tableau VII: Données des antibiogrammes et résultats de la PCR .......................................................................... 31

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page xi

LISTE DES ABREVIATIONS

BLSE : Bétalactamase à Spectre Elargi

Qnr : Quinolone resistant

PCR : Polymerase Chain Reaction

CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni

LABIOGENE : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique

E : Escherichia

K : Klebsiella

Aac : Aminoglycoside acétyl-transférase

Cr : Ciprofloxacine résistant

Β : Béta

CTX : Cefotaxime

OXA : Oxacilline

ADN : Acide désoxyribonucléique

µl : Microlitre

mm : Millimètre

% : Pourcentage

C : Degré Celsius

GC : Guanine – cytosine

Cint : Concentration interne

Cext : Concentration externe

Zn : Zinc

HOSCO : Hôpital Saint Camille de Ouagadougou

MSF : Médecins Sans Frontières

OMS : Organisation Mondial de la Santé

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page xii

C3G : Céphalosporine troisième génération

MH : Muller-Hinton

LB : Luria-Bertani

TCS : Trypticase Soja

CA-SFM : Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie

CIP : Collecte de l’Institut Pasteur

H : Heure

UV : Ultra-violet

Pb : Paire de base

CCNE : Comité Consultatif National d’Ethique

PM : Poids Moléculaire

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

INTRODUCTION

Mémoire Master II/BioGeMA/2014-2015/Moumouni Aissatou Page 1

INTRODUCTION

La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique, en particulier dans

les pays où l'utilisation des antibiotiques n’est souvent pas contrôlée (Pons et al, 2014).

Les antibiotiques sont des substances chimiques élaborées par des micro-organismes capables

d'inhiber la multiplication (action bactériostatique) ou de tuer (action bactéricide) les

bactéries. Il existe de nombreux antibiotiques, qui peuvent être classés en familles selon leurs

modes d’action ou leur structure moléculaire. Parmi ceux-ci, les bêta-lactamines (les

pénames, les pénèmes, les céphèmes, les monobactames et les oxapènames) inhibent la

synthèse de la paroi bactérienne et les quinolones (quinolones et fluoroquinolones.)

empêchent la réplication de l'ADN bactérien en bloquant l'ADN gyrase ou topoisomérase II.

Au cours de la dernière décennie, il a été observé une augmentation importante de la

résistance des entérobactéries aux antibactériens et surtout l’émergence des bactéries

multirésistantes par hyperproduction de céphalosporinase ou production de bétalactamase à

spectre élargie (BLSE) ou encore de carbapénèmases (Bradford, 2001b, Rodriguez-villalobos

and Struelens, 2006).

Découvertes au début des années 1980 (Ambler, 1980), les BLSE constituent une grande

famille très hétérogène d’enzymes bactériennes appartenant à la classe A ou D de la

classification d’Ambler (Ambler, 1980, Hall and Barlow, 2005). Elles sont soit induites par

des plasmides soit dérivées de mutations ponctuelles dans la séquence génétique codant pour

le site actif des β-lactamases (Vora and Auckenthaler, 2009). Les gènes de types TEM, SHV,

CTX-M, OXA ont été décrits dans plusieurs études en Europe (Giraud-Morin and Fosse,

2008) et en Afrique (Pitout et al, 1998 ; Woerther et al, 2011).

Le développement des quinolones à partir de l’acide nalidixique a débuté en 1962 (Takahashi

et al, 2003). Le premier gène plasmidique de résistance aux quinolones (qnr) a été découvert

en 1994 isolé d’une Klebsiella pneumoniae à Birmingham, Alabama et rapportée en 1998

(Martınez-Martınez et al, 1998). Depuis la découverte du gène de résistance plasmidique

(qnr) aux quinolones, un grand nombre d'allèles qnr ont été découvertes sur des plasmides ou

le chromosome bactérien (Nordmann and Poirel, 2005 ; Robicsek et al, 2006). Les gènes qnr

d’origine plasmidique comprennent actuellement cinq familles, qnrA, qnrB, qnrC, qnrD et

qnrS, différentes l'une de l'autre (Jacoby et al, 2008). En effet les mécanismes de résistance

bactérienne contre les quinolones proviennent généralement de mutations de l'ADN gyrase

(topoisomérase II) ou la topoisomérase IV, ou à partir de l'expression d'efflux de pompes

agissant seul ou en combinaison avec des taux réduits d'expression de porines de la


membrane externe. (Piddock et al, 1999 ; Oethinger et al, 2000 ; Wang et al, 2001 ; Oktem et

al, 2008). Récemment, un nouveau mécanisme de résistance transférable aux quinolones a été

signalé : il s’agit de la variante aac(6') qui code pour une aminoglycoside acétyltransférase

conférant une sensibilité réduite à la ciprofloxacine et norfloxacine par N-acétylation de

l’amine pipérazinyle (Robicsek et al, 2006).

Des études antérieures ont montré que les souches de qnr-positif expriment fréquemment des

BLSE, tels que CTX-M-15 et SHV-12(Jacoby et al, 2006 ; Robicsek et al, 2006).

Les quinolones et les β-lactamines sont largement utilisés en tant que antibiotiques à large

spectre pour traiter diverses infections bactériennes (Oktem et al, 2008). Cette utilisation

intensive des antibiotiques en médecine humaine et vétérinaire, mais aussi comme

supplément alimentaire (Martel and Chaslus-Dancla, 2001) a sélectionné les bactéries

possédant des mécanismes de résistance naturelles ou ayant la capacité de les acquérir

(Schwarz and Chaslus-Dancla, 2001).

Bien que de nombreux isolats d’entérobactéries positif en qnrA, qnrB ou qnrS aient été

signalés en Europe (Oktem et al, 2008), au Niger les différents types de gènes de résistance

aux quinolones circulants sont inconnus. Ainsi la problématique se rapporte à la

caractérisation moléculaire des gènes plasmidiques codant pour la résistance aux quinolones

au sein d’enterobactéries productrices de bétalactamase à spectre élargi afin d’identifier les

déterminants qnr et les gènes aac (6´) qui y circulent.

Le choix s’est porté sur les gènes plasmidiques de résistance car ils ont beaucoup plus

d’intérêt scientifique du point de vue épidémiologique du fait de l’importance de la

transmission inter-espèce. Généralement les résistances liées aux plasmides sont toujours

associées c'est-à-dire le plasmide porte le plus souvent plusieurs gènes de résistance à la fois.

Cette étude va situer du point de vue moléculaire, les gènes plasmidiques de résistance aux

quinolones qui circulent au Niger et qui sont plus répandus du fait de leur transfert facile

entre bactéries. Elle sera une contribution à la mise en place d’une meilleure surveillance du

point de vue épidémiologique et la mise en évidence des nouvelles résistances.

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE


I. Revue Bibliographie

I.1 Généralités sur les bactéries

I.1.1.Définition

La bactérie est une cellule procaryote (dépourvue d’un véritable noyau) : absence de

membrane nucléaire, chromosome unique en général.

La bactérie possède une paroi rigide faite d’un constituant spécifique : peptidoglycane ou

mureine (les bactéries, 2014).

Leur classification est fondée sur les caractères :

- morphologiques,

- tinctoriaux,

- biochimiques,

- antigéniques,

- génétiques.

I.1.2 Morphologie

Une bactérie, est un micro-organisme (organisme de très petite taille) unicellulaire (formé

d’une seule cellule). En fait, une bactérie est une entité complète, entourée d’une paroi

cellulaire complexe, et possédant à l’intérieur de cette paroi, dans son cytoplasme, toute la

machinerie nécessaire à son autonomie structurale et fonctionnelle. Les bactéries sont des

organismes procaryotes, c’est-à-dire qu’ils ne contiennent pas de noyau. Le matériel

génétique n’est pas séparé du reste du cytoplasme. Ce dernier contient également des

ribosomes nécessaires à la fabrication des protéines suite à l’interprétation du message

contenu dans le code génétique, ainsi que divers organites responsables du maintien des

fonctions métaboliques de base indispensables à la survie cellulaire. La taille des bactéries

peut varier mais elle est généralement de l’ordre du micromètre. Les bactéries peuvent être de

différentes formes : bacilles ou bâtonnets (de forme allongée), coques (de forme arrondie) et

spiralée. La figure (1) montre les trois types de bactéries : des bacilles (orange), des coques

(vert) et des spirilles (jaune) (Acar et al, 1998)


Figure 1: les trois types de bactéries

Source : http://www.denniskunkel.com/default.asp

I.1.3-Matériel génétique

Les bactéries contiennent un seul chromosome qui se présente sous la forme d’un long

filament d’ADN pelotonné sur lui-même. L’ADN (acide désoxyribonucléique) est ce qu’on

appelle « l’alphabet génétique ». Cette expression signifie que c’est dans l’ADN que toute

l’information nécessaire à la construction et au fonctionnement d’un organisme est contenue,

un peu comme l’alphabet avec lequel on peut former tous les mots. La figure (2) est un

exemple d’une cellule procaryote. On ne peut y voir de noyau. On remarque cependant que

l’ADN se trouve à l’intérieur de la membrane cytoplasmique, elle-même entourée de la paroi

cellulaire plus rigide qui assure l’intégrité structurale de la bactérie (Acar et al, 1998).

http://www.denniskunkel.com/default.asp


Figure 2: structure d’une bactérie

Source : www.nirgal.net/ori_intro.html

I.1.4- Paroi cellulaire

On peut distinguer deux grandes classes de bactéries, caractérisées par une architecture

distincte de la paroi cellulaire qui les entoure. Ainsi, chez les bactéries Gram(+), la paroi

cellulaire est constituée principalement de peptidoglycane. C’est la couche principale.

L’épaisseur de cette couche est beaucoup plus importante que pour les bactéries à Gram

négatif, chez les bactéries à Gram(-), la paroi cellulaire est constituée de trois couches. Les

deux premières couches, les plus externes, sont composées de phospholipides et de protéines.

Elles forment la membrane externe. Sous cette membrane se trouve la troisième couche de la

paroi, constituée d’un mince feuillet de peptidoglycane, qui ressemble beaucoup au

peptidoglycane de la bactérie à Gram positif, sauf que la nature de son lien peptidique n’est

pas le même. La paroi peut être identifiée à l’aide de la coloration de Gram (Acar et al,

1998).

I-2. Les entérobactéries

I-2-1 Définition

Les entérobactéries sont des bacilles à Gram négatif, le plus souvent courts (1 à 6 µl), droits,

immobiles ou mobiles par une ciliature péritriche (rares, exceptions) de culture aisée, aéro-

anaérobies facultatifs, fermentaires, oxydase négative, catalase positive (rares, exceptions),

nitrate réductase positive (rares, exceptions) (Bidet et Bingen, 2007).


Les entérobactéries sont retrouvées partout dans le sol, dans l'eau, et surtout dans l'intestin de

l'homme et des animaux. Elles comprennent un nombre très élevé de genres et d'espèces.

Leur abondance dans l'intestin, leur mobilité, la rapidité de leur multiplication, l'acquisition

fréquente de mécanismes de résistance aux antibiotiques expliquent qu'elles soient les

bactéries les plus souvent impliquées en pathologie infectieuse humaine, surtout en milieu

hospitalier.

Outre une résistance naturelle aux antibiotiques actifs sur les germes à Gram positif

(pénicillines, macrolides), les entérobactéries présentent fréquemment une résistance acquise

aux antibiotiques à large spectre. Cette résistance est souvent conditionnée par la présence de

plasmides porteurs de déterminants de résistances multiples et transférables à d'autres

bactéries à Gram négatif (Delmée, 2004).

I-2-2 Historique

La période de naissance de la famille des Enterobacteriaceae se situe entre 1937 lorsque Otto

RAHN proposa le genre Enterobacter pour regrouper les microorganismes présentant des

propriétés biochimiques et morphologiques communes et parmi lesquelles on trouvait déjà

des noms tels que Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Serratia ou Shigella.

Deux années après cette description qui concernait 112 espèces, ce nombre fut ramené à 67.

Avec les travaux de Don Brenner et de Patrick Grimont (Jean Freney et al, 2007), cette

famille a connu un essor et beaucoup de nouveaux genres et espèces furent découverts.

En 1972, Edwards et Ewing rapportaient 11 genres et 26 espèces dans la famille des

Enterobacteriaceae.

En 1985, Farmer et al décrivaient 22 genres comprenant 69 espèces et 29 groupes entériques

(Farmer et al, 1985).

Aujourd’hui, plus de 40 genres différents et près de 200 espèces ont été décrits depuis la

Serratia découverte par Bartelomeo Bizio en 1983 jusqu’aux derniers genres Samsonia en

2001 et Dickeya en 2004. (Jean Freney et al, 2007).


I-2-3 Epidémiologie

Les entérobactéries représentent la première cause d’infection des voies urinaires. Elles font

partie des bactéries les plus souvent isolées dans les hémocultures : Environ 35 % des

bactériémies d’origine nosocomiale et plus de 50 % des bactériémies d’origine

communautaire, recensées en France en 2002 étaient dues à des entérobactéries.

Dix à 35 % des entérobactéries nosocomiales sont capables de développer des résistances à

plusieurs familles d’antibiotiques par production de béta-lactamases à spectre large.

Cependant, depuis quelques années, ces entérobactéries multirésistantes ont également pu

être isolées en dehors de l’hôpital : en 2006, elles représentaient moins de 5 % des

entérobactéries communautaires (E. Pilly, 21ème édition, 2008).

Partout dans le monde, on constate des fréquences élevées de résistances aux quinolones.

Chez les entérobactéries d’origine communautaires et nosocomiales, le taux est supérieur à

50 %, particulièrement en Asie. Cependant, cette résistance est plus fréquente chez les

entérobactéries résistantes aux C3G (Dalhoff, 2012).

En Afrique, le rapport de l’OMS fait état de lacunes majeures dans le suivi de la résistance

aux antibiotiques, des données n’étant fournies que dans un nombre limité de pays. Bien qu’il

ne soit pas possible d’évaluer la véritable ampleur du problème, compte tenu du manque de

données, celles dont on dispose sont inquiétantes (Premier rapport de l’OMS sur la résistance

aux antibiotiques à Genève : une menace grave d’ampleur mondiale, 2014).

Au Niger, nous n’avons trouvé aucune donnée par rapport aux enterobactéries productrices

de béta-lactamases à spectre élargi résistantes aux quinolones.

I.2.4 Les groupes d'entérobactéries

On peut schématiquement subdiviser l'ensemble des entérobactéries en deux groupes :

- d’une part les entérobactéries qui font partie des flores fécales commensales habituelles de

l'homme et des animaux; ce groupe comprend principalement Escherichia coli, Klebsiella,

Enterobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Serratia, Citrobacter...


- d'autre part les espèces pathogènes pour l'intestin, dont l'ingestion provoque une infection

intestinale (Salmonella enteritidis, Yersinia, Shigella et certaines souches d'E.coli dites

"pathogènes") ou un syndrome septicémique (Salmonella typhi) (Delmée, 2004).

I.2.5 Les caractères généraux et biochimiques

La plupart des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae partagent les

caractères généraux suivants :

Ce sont des bacilles à Gram négatif, ne formant pas de spores ;

Lorsqu’elles sont mobiles (Klebsiella, Shigella et Yersinia pestis sont immobiles), ces

bactéries présentent une ciliature péritriche ;

Elles se développent aussi bien en aérobiose qu’en anaérobiose sur des milieux «

ordinaires » (Janda et Abbott, 2006). La température optimale de croissance est

généralement de 35 à 37 °C à l’exception des Yersinia (30 à 37 °C), des Pantoea et

des Erwinia (27 à 30 °C);

L’aspect général des colonies de ces bactéries sur gélose nutritive est florissant,

colonie de 1 à 3 mm de diamètre généralement bombées, lisses et brillantes (excepté

pour Shigella, Yersinia, certaines espèces de Salmonella, Proteus);

Le plus souvent, ces colonies sont opaques et blanchâtres, mais il en est de plus

transparentes telles les Salmonella et celles présentant des pigments rouge et jaune

respectivement chez les Serratia et les Erwinia.

Les Klebsiella forment des colonies souvent très muqueuses, larges et luisantes (Denis

et al, 2007).

La famille des Enterobacteriaceae partage les caractères biochimiques suivants :

Elles utilisent le D-glucose et les sucres par fermentation plutôt que par oxydation

souvent avec production de gaz ;

Les entérobactéries sont catalase-positives (à l’exception de Shigella dysenteriae

sérotype 1) et oxydase-négatives ;

Elles réduisent les nitrates en nitrites (à l’exception de certaines souches d’Erwinia et

de très rares mutants)


Elles contiennent un antigène commun et possèdent un GC % compris entre 39 et 59

% (Janda et Abbott, 2006)

I.2.6 Identification

L’identification par des techniques issues de la biologie moléculaire n’est pas encore à la

portée de tous les laboratoires. Cependant, la recherche des caractères généraux et

biochimiques de la famille demeurent les moyens d’identification couramment mis en œuvre

(Denis et al, 2007).

C’est dans le domaine des Enterobacteriaceae que l’évolution technologique a été la plus

importante en bactériologie médicale. L’ère des galeries d’identification en tubes est quasi

révolue en pratique quotidienne pour faire place à celles des systèmes prêts à l’emploi.

Quelques remarques doivent néanmoins être apportées quant à l’utilisation de ces systèmes

prêts à l’emploi :

- Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi ;

- Les caractères déterminés n’ont de signification que confrontés aux tableaux fournis

par le fabricant.

Bien souvent d’ailleurs, le principe d’identification proposé est établi à partir d’une méthode

probabiliste qui consiste à traduire numériquement la séquence des caractères positifs trouvés

et à confronter le profil trouvé au catalogue des profils recensés par le fabricant. Globalement

plus de 90 % des souches sont correctement identifiées d’emblée par ces systèmes prêts à

l’emploi.

Les difficultés surgissent quand le profil numérique ne figure pas dans le catalogue ou

conduit à une discrimination insuffisante entre plusieurs espèces ou genres. (Denis et al,

2007).


I.3 Antibiotiques

I.3.1 Généralités

I.3.1.1 Définition

Un antibiotique (du grec anti : contre, et bios : la vie) est une substance d'origine naturelle ou

synthétique, ayant la capacité d'arrêter la multiplication des bactéries, mais également d'autres

agents infectieux. Certains sont également capables de détruire les microbes (regroupe tous

les organismes microscopiques ne possédant qu'une seule cellule : virus, bactéries,

champignons).

Les antibiotiques, contrairement aux antiseptiques, agissent sur les bactéries en inhibant des

fonctions physiologiques précises telles que la synthèse de la paroi (β-lactamines,

glycopeptides, fosfomycine), la réplication/transcription de l’ADN (fluoroquinolones,

rifampicine, sulfamides, triméthoprime), la synthèse protéique (aminosides, tétracyclines,

macrolides et apparentés, chloramphénicol) ou encore la respiration cellulaire (polymixines).

Pour exercer leur action, ils doivent se lier à des cibles moléculaires spécifiques le plus

souvent intracellulaires.

Des facteurs complexes déterminent l’activité intrinsèque d’un antibiotique sur une espèce

donnée, notamment l’affinité de l’inhibiteur pour sa cible, le nombre de molécules cibles à

inactiver et, enfin la concentration de l’inhibiteur au voisinage de la cible (Cint). Ce dernier

paramètre dépend évidemment de la concentration du produit dans le milieu où se trouve la

bactérie (Cext), mais également d’autres éléments comme le niveau de perméabilité des

membranes à l’agent considéré (diffusion simple ou transport actif), l’existence éventuelle de

mécanismes d’inactivation ou d’activation, ou encore la présence de systèmes d’efflux actif

naturels pouvant s’opposer à son accumulation intracellulaire. (Plesiat, 2012).

I.3.1.2 Historique

Toutes les découvertes médicales effectuées au cours du XXe siècle sont importantes.

Néanmoins l'antibiotique, dans la mesure où il a fait reculer le taux de mortalité en permettant

de guérir certaines maladies infectieuses, est sans doute le médicament dont la découverte a

http://www.vulgaris-medical.com/encyclopedie-medicale/pyogene-pyogenie


le plus bouleversé la médecine et la démographie. Bien entendu, ces maladies n'ont pas

disparu et sont encore la principale cause de mortalité. Généralement, quand on pense aux

antibiotiques et à leur histoire, le premier nom qui vient à l'esprit est celui du britannique

Alexander Fleming. Pourtant, à partir de 1874, Roberts, puis Tyndall (en 1876), Pasteur et de

Joubert (en 1877), enfin Duchesne (en 1897-1898), amorcent la découverte de Sir Alexander

Fleming par leurs réflexions sur la question des produits susceptibles d'entraver la

multiplication des germes comme les moisissures (qui sont des champignons microscopiques

se développant à l'humidité sur des milieux organiques).

En fait, l'histoire des antibiotiques commence en 1929, date à laquelle on constate qu'une

moisissure se développant naturellement sur des fruits ou des fromages empêche la

prolifération du bacille de la diphtérie et de celui du charbon dans les boîtes où l'on cultive

ces microbes, en laboratoire. On baptise le liquide de culture de cette moisissure Penicillium

notatum, et on constate qu'elle n'est pas toxique pour la souris à laquelle on l'injecte. Malgré

tout, cette découverte n'attire pas vraiment l'attention des chercheurs et reste sans lendemain.

(http://www.vulgaris-medical.com/encyclopedie-medicale/antibiotique-generalites, 2015).

En 1935, l'Allemand Domagk reprend les idées d'Ehrlich sur l'effet anti-infectieux de certains

colorants qu'il avait mis au point en 1905, en se servant d'un colorant pour traiter certaines

infections par une bactérie appelée streptocoque. Le Français J. Tréfouël et sa femme, à

l'Institut Pasteur, montrent que le produit actif appartient à une famille appelée sulfamide. A

partir de là, et pendant une quinzaine d'années, cette variété de médicaments sera employée

contre les germes, reléguant du même coup à une seconde place les moisissures et autres

produits susceptibles de posséder des capacités antibiotiques. Ce n'est qu'en 1939 que le

français R. Dubos découvre qu'une bactérie appelée Bacillus brevis est capable de produire

une substance empêchant la multiplication de certaines bactéries. Grâce à un système de

coloration qualifiée de «gram +» (d'après une méthode de coloration due au biologiste danois

Hans Gram), il met en évidence cette bactérie. Cependant, le premier antibiotique identifié fut

la pénicilline découverte par hasard (Fleming, 1929). Ce premier antibiotique a ouvert une

voie nouvelle dans la lutte contre de nombreuses maladies qui étaient considérées comme

incurables auparavant. Suite à la découverte de la pénicilline, de nombreuses autres

générations d’antibiotiques (nature synthétique) ont vu le jour et continuent d’apparaître dans

le but de combattre. (Plesiat, 2012) Leur nombre deviendra tel qu'il faudra établir

http://www.vulgaris-medical.com/encyclopedie-medicale/antibiotique-generalites


progressivement des règles de prescription que l'on appelle antibiothérapie

(http://www.vulgaris-medical.com/encyclopedie-medicale/antibiotique-generalites, 2015).

I.3.1.3 Bêta-lactamines

Les β-lactamines sont des antibiotiques qui possèdent un noyau β-lactame qui est la partie

efficace de la molécule. Des variations au niveau de la chaîne latérale permettent de modifier

les propriétés de la molécule antibiotique. Par exemple, une modification des chaînes

latérales entraîne une résistance aux acides (suc gastrique) et permet l'administration de

l'antibiotique par voie orale. Les β-lactamines ou antibiotiques à noyau β-lactame sont une

large classe d'antibiotiques qui comprennent les pénames, les pénèmes, les céphèmes, les

monobactames et les oxapènames, bref, toute substance qui contient un noyau β-lactame dans

sa structure moléculaire (Glupczynski et al, 2002).

Du fait de leur diversité, faible toxicité, activité bactéricide et large spectre d’action, les β-

lactamines sont parmi les antibiotiques les plus utilisés dans le traitement des infections

causées par les Enterobacteriaceae. L’efficacité des β-lactamines dépend d’au moins trois

facteurs : la quantité d’antibiotique au contact de la cible, l’affinité de l’antibiotique pour la

cible et la production de β-lactamase inactivant l’antibiotique.

Ces facteurs sont responsables, soit d’une résistance naturelle (intrinsèque), et donc présents

chez toutes les souches de l’espèce, soit d’une résistance acquise par certaines souches, suite

à l’apparition de mutations ou à l’acquisition de matériel génétique tels que des plasmides,

des transposons ou des intégrons. Pour chaque espèce, on distingue donc un «phénotype

sauvage» de résistance aux β-lactamines ou un «phénotype sensible» et des phénotypes de

résistance acquise ou «phénotypes résistants». La résistance peut s’exprimer à bas niveau in

vitro pour certaines molécules mais être responsables d’échecs thérapeutiques. La

connaissance des phénotypes de résistance permet :

d’établir la liste des β-lactamines à étudier en routine,

de contrôler la cohérence entre l’identification et le phénotype de résistance

de pallier les imperfections des tests de sensibilité in vitro par l’application de règles

de lecture interprétative,

de guider le choix thérapeutique (Bonnet, 2012).



I.3.1.4 les quinolones

Les quinolones sont des composés antibactériens de synthèse qui dérivent d'acides

carboxyliques hétérocycliques diversement substitués. Toutes les quinolones actuelles

présentent une structure bicyclique, avec un azote en position 1, un carboxylate en position 3

et un carbonyle en position 4. Les quinolones dont le chef de file, l’acide nalidixique, a été

décrit en 1962 par Lesher et al. (Hiramatsu et al, 1997). Cependant, l’acide nalidixique fut la

première quinolone à être introduite pour un usage clinique au début des années soixante

(Ball, 2000).

Les quinolones (Figure 3-B) sont réparties en deux groupes : les quinolones (spectre utile

limité aux entérobactéries) et les fluoroquinolones (Figure 3-C), quinolones comportant un

atome de fluor en position 6 (antibiotiques à spectre large dont l’activité intrinsèque est très

supérieure à celle des premières quinolones) (Hiramatsu et al, 1997). L'apparition sur le

marché dans les années 1980 de la norfloxacine, ofloxacine, ciprofloxacine, péfloxacine et

loméfloxacine a permis aux fluoroquinolones de devenir des antibiotiques de référence pour

de nombreuses infections.

La présence d'une fonction acide carboxylique en position 3, et un cycle pyridone dont la

fonction aminée en position 1 est substituée par une chaine aliphatique ou par un cycle sont

indispensables à l'activité antibiotique, tandis que l'addition d'un fluor en 6 et d'un cycle

diamine en 7 accroit très significativement l'activité par rapport aux dérivés originaux (acide

nalidixique).

Lorsqu’elles ont diffusé dans le cytoplasme, les quinolones exercent une inhibition sélective

de la synthèse de l’ADN bactérien en agissant sur deux enzymes impliquées dans cette

synthèse, l’ADN topo-isomérase de type II ou ADN gyrase et l’ADN topo-isomérase IV

(Hiramatsu et al, 1997). Elles ont une diffusion tissulaire et cellulaire excellente,

Les fluoroquinolones sont rapidement bactéricides, elles présentent aussi un effet

postantibiotique important et prolongé.

Les quinolones sont des antibactériens puissants, massivement utilisées pour le traitement

d’une grande variété d’infections bactériennes chez l’homme.


A : Noyau commun (Dentan, 2015)

B C

Fluor: augmentation de l’activité antibactérienne et

élargissement du spectre !

Figure 3: Structure des quinolones, A : noyau commun, B : acide nalidixique, C :

fluoroquinolone.

Fluoroquinolone


I.4 Résistance bactérienne aux antibiotiques

Le phénotype observé à l’antibiogramme n’est rien d’autre que la somme des effets liés au

contenu génétique de la souche étudiée. Comme la sensibilité ou la résistance aux

antibiotiques est génétiquement définie, l’émergence et la diffusion de la résistance chez les

bactéries n’est pas étonnante étant donné leur extraordinaire flexibilité génétique. La

résistance aux antibiotiques peut être naturelle ou acquise. La résistance naturelle est

déterminée dès le début du développement d’un antibiotique et ne pose pas de problème en

pratique clinique. Aussi, les bactéries peuvent acquérir la résistance via des mutations dans

les gènes endogènes, l’acquisition de gènes de résistance exogènes ou des mutations dans les

gènes acquis (Rice, 2012). Cependant, la résistance aux antibiotiques résulte principalement

de l’acquisition de gènes de résistance exogènes. Les progrès importants en génétique ont

permis de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les bactéries échangent des

séquences d’ADN. Pendant de nombreuses années, il était convenu que les échangent

génétiques se faisaient uniquement à partir de structures bien connues : les plasmides et les

transposons. Ces éléments portant le plus souvent des déterminants de résistance aux

antibiotiques étaient en effet facilement caractérisables au laboratoire. L’avènement de

l’analyse génomique comparative a permis de montrer que ces vecteurs de résistance et leurs

mécanismes de transfert étaient probablement mineurs et, qu’en réalité, les échanges

génétiques entre bactéries étaient le plus souvent complexes. Ainsi, pendant des années, il

était admis que certaines souches de E. coli pouvaient être responsables d’infections urinaires

et d’autres de diarrhées. Désormais, il est évident que ces différences sont génétiquement

déterminées par l’acquisition de différents ilôts de pathogénicité de grande taille qui portent

les déterminants responsables de chacun des processus pathologiques (Welch et al, 2002).

Sans surprise les bactéries peuvent utiliser des associations de déterminants génétiques pour

évoluer vers la résistance dans des situations où les mutations ponctuelles par elles-mêmes ne

confèrent pas des niveaux de résistance suffisamment élevés sélectionnables in vivo.

L’utilisation de mécanismes auxiliaires afin d’amplifier la résistance aux fluoroquinolones

associée aux mutations dans les gènes des topoisomérases est un bon exemple. Chez les

bactéries à Gram négatif, les fluoroquinolones ont pour cible primaire l’ADN gyrase et pour

cible secondaire la topoisomérase IV (Hooper, 2001).


I.4.1 Résistance aux β-lactamines

La production d’enzyme inactivatrice (Figure 4) est le principal mécanisme de

résistance des entérobactéries aux β-lactamines. Le processus repose sur un résidu

sérine actif chez les enzymes les plus fréquentes ou sur un ion métallique Zn2+. Dans

les deux cas, l’inactivation des β-lactamines est due à l’ouverture du cycle β-lactame

au niveau de la liaison amide, selon une réaction d’hydrolyse suite à l’activation d’une

molécule d’eau (Bonnet, 2012).

Inactivation enzymatique de l’antibiotique

Bêta-lactamines / Béta-lactamases (Archambaud, 2009)

Figure 4: Inactivation enzymatique de l’antibiotique


I.4.2 Résistance aux quinolones

Pendant plus de 30 ans, les mécanismes de résistance aux quinolones connus avaient un

support chromosomique. Depuis 1998, des déterminants d’origine plasmidique ont été

découverts (Nordmann al, 2007 ; Andremont et al, 2006).

Les quinolones ont pour cible les topoisomérases de type II, ADN gyrase et topoisomérase IV

(Figure 5). Les deux grands mécanismes responsables de la résistance aux quinolones sont

l’altération de la cible avec des mutations dans les gènes des topoisomérases et l’efflux.

Ainsi, La résistance aux quinolones peut être facilitée par l’acquisition des gènes. Par

exemple, les gènes qnr, codant des protéines qui protègent les topoisomérases de l’action des

quinolones, peuvent supplémenter la résistance. Cependant plusieurs types de gènes qnr ont

été décrits (qnrA, qnrB, qnrC, qnrD et qnrS) avec différents variants. Le niveau de résistance

aux quinolones peut aussi être augmenté par l’acquisition du gène aac(6’)-Ib-cr codant pour

un variant d’une enzyme inactivatrice des aminosides qui acétyle spécifiquement la

ciprofloxacine (Rice. 2012).

L’utilisation abusive des quinolones, a conduit à l’apparition d’une résistance augmentée à

ces antibiotiques.

Chez les bactéries à Gram négatif, les mécanismes de résistance acquise par :

- mutations chromosomiques, induisent l’imperméabilité de la paroi ;

- support plasmidique, induit la protection des topoisomérases de liaison à fluoroquinolone

(ADN bactérien) et l’acétylation des quinolones donc l’inactivation enzymatique (aac(6’)-lb-

cr enzyme) (Dentan, 2015) .

Qu

in

ol

on

es


Figure 5: Mécanisme d’action des quinolones (Dentan, 2015)

Quinolones


II. Objectifs de l’étude

II.1 Objectif principal

Décrire les gènes plasmidiques de résistance aux quinolones chez les E.coli et Klebsiella spp

productrices de bétalactamase à spectre élargi isolées chez les enfants de 6 à 59 mois inclus

dans une étude menée par le centre de recherche « Epicentre » dans la région de Maradi au

Niger.

II-2 Objectifs spécifiques

Déterminer la proportion respective de chaque gène de résistance aux quinolones chez

les bactéries productrices de BLSE ;

Rechercher les gènes de résistance aux quinolones chez les souches sensibles à l’acide

nalidixique mais résistante aux fluoroquinolones sur l’antibiogramme standard, par

des techniques approfondies (PCR).

MATERIEL ET METHODES


III Matériel et méthodes

III.1 Cadre de l’étude

La collecte de nos échantillons a été effectuée au laboratoire du centre de Recherche

Epicentre à Maradi, au Niger, l’identification des souches a été confirmée par Galerie

API20E au laboratoire de l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO). Les analyses

moléculaires ont été réalisées au Laboratoire de Biologie moléculaire et de Génétique

(LABIOGENE) au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA).

EPICENTRE est une association à but non lucratif créée par Médecins Sans Frontières

(MSF) en 1986 qui mène des activités de recherche et de formation sur les programmes de

MSF ainsi que dans ses propres centres de recherche au Niger et en Ouganda. Epicentre est

un centre collaborateur de l’OMS.

CERBA/LABIOGENE, relève du district sanitaire de Bogodogo. Créé par la délégation

Camillienne, ce centre a pour missions premières la formation et la promotion de jeunes

chercheurs en particulier dans le domaine biomoléculaire où il dispose d’un plateau technique

moderne (appareils de PCR en temps réel, HPLC, séquenceur, etc.). Les activités de

recherche s’articulent autour de plusieurs axes principaux. Le premier axe qui concerne la

recherche fondamentale et les sciences du génome se décompose en sous-axes sur les

pathologies génétiques (hémoglobinopathies, ostéoporose, déficiences génétiques), les

marqueurs de résistance génétique (résistance bactérienne aux antimicrobiens), le diagnostic

moléculaire de diverses pathologies en particulier des pathologies émergentes (VIH, HPV,

VHC, VHB) ainsi que sur la vaccinologie. Le deuxième axe fait intervenir des études de la

médecine traditionnelle (travaux sur des recettes traditionnelles fournies par des tradi-

praticiens). Les deux derniers axes comprennent la recherche clinique (suivi biologique et

clinique des personnes vivant avec le VIH, activités portant sur la PTME, expérimentations

pharmaco-cliniques) et la recherche en nutrition (réhabilitation nutritionnelle des enfants

malnutris).


III.2 Type et période d’étude

Il s’agit d’une étude rétrospective descriptive réalisée sur diverses espèces d’entérobactéries

productrices de BLSE et résistantes aux quinolones, isolées de selles d’enfants de 6 à 59 mois

inclus dans un essai clinique mené par Epicentre dans la région de Maradi au Niger, entre

Février et Novembre 2013. Les analyses moléculaires ont été effectuées au

CERBA/LABIOGENE, Université de Ouagadougou, Burkina Faso entre Juillet et Aout 2015.

III.3 Echantillonnage

Epicentre a mené un essai clinique randomisé dont l’objectif était d’évaluer l’effet de

l’utilisation systématique de l’amoxicilline pour le traitement en ambulatoire des enfants

sévèrement malnutris sans complication versus placebo à Maradi au Niger de 2012 à 2013.

Une étude ancillaire a également été menée sur un sous-échantillon d’enfants inclus dans

l’étude générale afin de décrire l’émergence des résistances aux C3G dans la flore intestinale.

Durant les visites régulières à l’inclusion dans l’étude, au 7ème et au 28ème jour, les enfants

sélectionnés dans l’étude ancillaire ont fourni un échantillon de selles (écouvillon ou selle en

pot) prélevé sur les sites et conservés à température de +4 ºC jusqu’à leur acheminement au

laboratoire d’Epicentre.

Tous les échantillons de selles collectés dans le cadre de cette étude ancillaire ont été

transportés au laboratoire Epicentre de Maradi sous condition de température de +4 ºC le

jour même pour analyse bactériologique. Dans ce laboratoire, la présence de BLSE a été

déterminée par la mise en culture sur le milieu chromagar BLSE qui est un milieu sélectif. Ce

milieu a permis d’isoler les colonies roses, bleues foncées, blanches suspectant

respectivement E. coli, Klebsiella et Salmonella. Une colonie de chaque espèce a été placé

dans un tube contenant un milieu de conservation et stocké à +4 ºC.

Les souches ont été collectées sur les 04 sites de l’étude (Madarounfa, Gabi, Dan-issa et

Tofa) du centre de recherche Epicentre à Maradi dans la période allant du 18 février au 11

Novembre 2013 pour les trois premiers sites et Juillet 2013 pour le site de Tofa.

Des études approfondies sur les différents isolats récoltés ont été réalisées au laboratoire de

biologie moléculaire CERBA (Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro

Annigoni)/LABIOGENE (laboratoire de biologie moléculaire et de génétique) du

département de Biochimie-Microbiologie situé dans l’Unité de Formation et de Recherche en

Science de la Vie et de la Terre (URF/SVT) à l’Université de Ouagadougou.


Soixante dix huit (78) souches d’entérobactéries productrices de BLSE et résistantes aux

quinolones nous ont été fournies par le laboratoire de l’EPICENTRE Maradi-Niger. Ces

souches sont issues des prélèvements de selles provenant des enfants de six (06) à cinquante-

neuf (59) mois inclus dans l’étude Epicentre entre Février et Novembre 2013.

III.3.1 - Mode de sélection

A partir de la base de données de l’étude ancillaire nous avions sélectionné de façon aléatoire

en respectant la proportion de la répartition de la population d’étude les 78 souches en

fonction de la couleur des colonies : roses, et bleues suspectant respectivement E. coli, et

Klebsiella.

III.3.2 - Critère d’inclusion

Les souches bactériennes inclus dans cette étude répondent aux critères d’inclusion suivants:

- Isolées d’un prélèvement de selles au moment de l’inclusion des enfants dans l’étude

générale;

- Collectées entre le 18 février et le 11Novembre 2013;

- BLSE isolées et conservées au laboratoire d’Epicentre à Maradi;

- Repoussent sur Hektoen;

- Résistantes aux quinolones et aux fluoroquinolones selon l’antibiogramme standard

du laboratoire de l’Epicentre à Maradi;

- Les souches de couleur ne concordant pas aux deux espèces cités ont été remplacés

par une liste randomisée;

- Les souches sensibles à l’acide nalidixique mais résistantes aux fluoroquinolones sur

l’antibiogramme standard.

III.3.3 -Critères d’exclusion

Les souches isolées dans des prélèvements collectés à la semaine 01 et 04 du suivi n’ont pas

été inclues dans l’étude.


III.4 Matériel

III.4.1 Réactifs

Les amorces et le Master Mix universel, KIT.

III.4.2 Appareillage

La PCR a été réalisée à l’aide du Thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Applied

Biosystems, Courtabœuf, France).

III.4.3 Autres matériels

D’autres matériels ont été utilisés à savoir les milieux de culture, la galérie API 20E, les

micropipettes, le vortex, les cônes ou embouts, des incubateurs, une centrifugeuse, une hotte

de sécurité, des tubes stériles, des congélateurs, et divers autres matériels de laboratoire.

III.5 Méthodes

III.5.1 Confirmation de l’identité des souches

Après repiquage sur milieu Hektoen, l’identification des souches a été confirmée par la

galerie API 20E au laboratoire de l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO).

III.5.2. Sensibilité aux antibiotiques

La sensibilité aux antibiotiques a été déterminée par antibiogramme qui a été réalisé par la

méthode de diffusion en milieu gélosé de Muller-Hinton (MH) selon les recommandations du

CA-SFM 2013 (Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie

(microbiologie 2013).

Les soixante-dix-huit (78) isolats (E. coli, Klebsiella) ont été testés par le laboratoire

d’Epicentre pour leur sensibilité à 16 antibiotiques appartenant à 05 familles. Les familles

d’antibiotiques utilisées sont les suivantes : les bétalactamines (Amoxicilline, Amoxicilline +

Acide clavulanique, Tircarcilline Cefalotine, Cefoxitine, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefipime,

Imipenème, Ertapenème), les quinolones (Acide nalidixique, Ofloxacine), les aminosides

(Amikacine, Gentamicine) les cyclines (Tétracycline) et les sulfamides (Cotrimoxazole).

E.coli CIP 7624 a été utilisé comme souche de référence.


III.5.3 Condition de cultures des souches

Pour les identifications et les purifications, les bactéries ont été repiquées sur des milieux

Chromagar Orientation et Hektoen en boites de pétri et incubées à 37 ºC pendant 24h .Pour

les extractions des ADN,

les bactéries ont été cultivées dans un bouillon de culture Luria-Bertani (LB) tamponné à pH

7 et incubées à 37 ºC pendant 24h.

III.5.4 Extraction des ADNs

Les souches conservées sur milieu Leminor ont été repiquées sur milieu TCS puis incubées à

37 °C pendant 24h. Quelques colonies bactériennes issues de cette culture ont été ensuite

cultivées dans 2 ml de bouillon de culture Luria-Bertani (LB) tamponné à pH 7 et incubées à

37 ºC pendant 24h.

Les culots bactériens obtenus par centrifugation à 10000 tours par minute pendant 5 minutes

à la centrifugeuse (eppendorf Centrifuge 5417C) ont été mis en suspension par 500 µl de

tampon phosphate 100Mm pH 7 puis porter à 100 °C (eau bouillante) pendant 15 minutes et

centrifugés à 10000 tours par minute pendant 10 minutes. Les surnageants recueillis ont été

mis en suspension dans 250 µl d’alcool absolu et laissés à température ambiante pendant 5

minutes ensuite centrifugés à 10000 tours par minute pendant 10 minutes ; les surnageants

ont été rejetés et les culots ont été recueillis.

Les culots obtenus ont été mis en suspension dans 1000 µl d’alcool 75 °C, vortexés puis

centrifugés à 5000 tours pendant 5 minutes. Les lavages ont été effectués deux fois et le culot

recueilli a été séché pendant 24h sous hotte couverte de papier essuie-tout. L’ADN est repris

dans 100 µl d’eau distillé stérile puis conservé à -80 °C.

III.5.5 Amplification des gènes de quinolones

La PCR a été réalisée dans un volume réactionnel de 50 µl. Deux programmes

d’amplification ont été utilisés pour la recherche des quatre gènes (Tableau I) (Dallenne et al,

2010 ; Robicsek et al, and Park et al, 2006). Les gènes qnrA, qnrB et qnrS ont été amplifiés

par PCR multiplex.

Les gènes aac (6´) ont été amplifiés par PCR simplex (Park et al, 2006).


Tableau I : Protocoles de PCR du gène qnr

Condition/durée

Paramètres qnrA qnrB qnrS aac

Dénaturation initiale 94 °C/10 mn 94 °C/10 mn 94 °C/10 mn 94 °C/10 mn

Dénaturation 94 °C/45 s 94 °C/45 s 94 °C/45 s 94 °C/45 s

Appariement 53 °C/45 s 53 °C/45 s 53 °C/45 s 55 °C/45 s

Elongation 72 °C/1 mn 72 °C/1 mn 72 °C/1 mn 72 °C/45 s

Elongation Finale 72 °C/7 mn 72 °C/7 mn 72 °C/7 mn 72 °C/7 mn

Nombre de cycles 32 32 32 34

Les séquences des amorces utilisées au niveau de cette étude ont été mentionnées dans le

tableau II. Ces amorces ont été fournies par la maison ABI. L’amplification a été effectuée à

l’aide du thermocycleur GeneAmp 9700 PCR system de Applied Biosystems.


Tableau II: Séquences des amorces utilisées au niveau de cette étude

Gènes recherchés Séquences des amorces (5'-3') paires de bases références

qnrA for 5′-ATTTCTCACGCCAGGATTTG 516 ( Robicsek et al, 2006)

Rev 5′-GATCGGCAAAGGTTAGGTCA

qnrB For 5′-GATCGTGAAAGCCAGAAAGG 469 ( Robicsek et al, 2006)

Rev 5′-ACGATGCCTGGTAGTTGTCC

qnrS For 5′-ACGACATTCGTCAACTGCAA 417 (Robicsek et al, 2006)

Rev 5′-TAAATTGGCACCCTGTAGGC

aac(6) For 5′-TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA 482 ( Park et al, 2006)

Rev 5′-CTCGAATGCCTGGCGTGTTT

III.5.6 Electrophorèse sur gel d’agarose

Les fragments d’ADN amplifiés par PCR étaient séparés par électrophorèse sur un gel

d’agarose à 2 % préparé dans une solution de tris base - borate – EDTA 1X et contenant 16 µl

de bromure d’éthidium. La migration s’est réalisée sous une tension de 100 volts (V) pendant

1H.

Le tampon de migration utilisé a été le Tris base- borate – EDTA 1X. La migration a été

suivie grâce à une solution de dépôt (bleu de charge) ajoutée à la solution d’ADN à environ

20 % du volume. Les tailles des différents fragments ont été déterminées en déposant à côté

des puits contenant l’ADN des marqueurs de masses moléculaires. Ces fragments étaient

ensuite visualisés sous lumière UV. Des fragments d’ADN de 516 paires de base (pb) étaient

obtenus en cas de présence de qnrA, de 482 paires de base en cas de présence de aac(6’) , de

469 paires de base en cas de présence de qnrB et de 417 paires de base en cas de présence de

qnrS.


III.5.7 Analyse des données

Les données ont été traitées à l’aide du logiciel SPSS Statistics 21.0.

III.5.8 Considérations éthiques

Cette étude a obtenu l’accord du comité Consultatif National d’Ethique du Niger (CCNE),

notamment pour le transfert des souches du laboratoire d’Epicentre de Maradi, Niger au

laboratoire de biologie moléculaire CERBA/LABIOGENE, Ouagadougou, Burkina-Faso.

RESULTATS


IV Résultats

IV.1 Caractéristiques et répartition des souches d’entérobactéries en fonction des

espèces bactériennes

Cette étude a concerné 78 souches d’entérobactéries productrices de béta-lactamases à

spectre élargi et résistantes aux quinolones selon les résultats de l’antibiogramme réalisés par

le laboratoire Epicentre à Maradi, au Niger. L’âge des participants variait de 06 à 59 mois.

Dans la flore intestinale, E. coli constituait l’espèce prédominante avec un pourcentage de

80,8 %, suivie de Klebsiella pneumoniae (16,7 %). Le taux de l’espèce Klebsiella oxytoca

était de 2,6 % (Tableau III).

Tableau III: Répartition des souches d’entérobactéries en fonction de l’espèce

Espèces bactériennes

Nombre Pourcentage (%)

E.coli

63

80,8

K.oxytoca

2

2,6

k.pneumoniae

13

16,7

Total

78 100

IV.2 Répartition des gènes en fonction de l’espèce

La majorité des isolats hébergent le gène aac(6’) soit 67,9 % (53/78) ( Tableau IV).

Tableau IV: Répartition des gènes en fonction de l’espèce bactérienne

Gènes

Nom des souches

qnrA qnrB qnrS Aac(6’)

E.coli 3 2 23 38

K.oxytoca 0 2 0 2

K.pneumoniae 1 7 4 13

TOTAL (%) 04 (5,1 %) 11 (14,1 %) 27 (34,6

%) 53 (67,9 %)


IV.3 Répartition de l’association des gènes en fonction des espèces bactériennes

La résistance associée aux quinolones dans le cas de BLSE a été observée dans 88,46 %

(69/78) soit 22 % de l’ensemble des souches de Klebsiella. Aucune des souches résistantes

aux béta-lactamases n’héberge à la fois les gènes qnrA, qnrB et qnrS mais il existe une

association des gènes de résistance BLSE, qnr et aac(6’) chez 26 souches (33,32 %) répartis

comme suit 12 E. coli, 02 Klebsiella oxytoca et 12 Klebsiella pneumoniae ( Tableau V).

Tableau V: Répartition de l’association des gènes en fonction des espèces bactériennes

Espèces bactériennes

Association Qnr-BLSE-aac Pourcentage ( % )

E.coli

12 15,38

K.oxytoca

2 2,56

k.pneumoniae

12 15,38

Total 26 33, 32

IV.4 Répartition de gènes chez les souches sensibles à l’acide nalidixique et résistantes

aux fluoroquinolones

Parmi les 21 souches (16 E. coli, 04 K. pneumoniae et 01 K. oxytoca) sensibles à l’acide

nalidixique mais résistante aux fluoroquinolones soit 26,9 %, on observe la présence du gène

qnrA chez 01 souche, le gène qnrB est retrouvé chez 03 souches, 16 souches présentent une

résistance au qnrS, 09 souches montrent une résistance au gène aac(6’) (Tableau VI).

Tableau VI : Répartition de gènes chez les souches sensibles à l’acide nalidixique et

résistantes aux fluoroquinolones

Gènes

Nom des souches

qnrA qnrB qnrS Aac(6’)

E.coli 0 0 15 4

K.oxytoca 0 1 0 1

K.pneumoniae 1 2 1 4

TOTAL 01 03 16 09


IV.5 Caractérisation des gènes codant pour la résistance aux quinolones

Les ADN des 57 souches répondant positives à la résistance aux quinolones et de 21 souches

sensibles aux quinolones mais résistantes aux fluoroquinolones ont été soumis à la technique

de PCR pour la recherche du type de gène qnr et aac(6’) en utilisant les amorces spécifiques

pour qnrA, qnrB, qnrS et aac(6’). L’examen des produits PCR après électrophorèse sur gel

d’agarose a permis de noter que 69 isolats se sont révélés porteurs d’au moins un des gènes

recherchés et 09 isolats ne portent aucun des gènes recherchés. 26 isolats hébergent à la fois

le gène qnr et aac(6’), 04 isolats hébergent le gène qnrA, 11 isolats hébergent le gène qnrB,

27 isolats hébergent le gène qnrS, 53 isolats hébergent le gène aac(6’)

(Tableau VII)


Tableau VII: Données des antibiogrammes et Résultats de la PCR

Age(mois) sexe Nom souche AMX TIC CF FOX TE AMC CTX fep IMP CAZ ETP NA OFX GM AN SXT qnr A qnr B qnr S aac(6)

9 M

E.coli R R R S R R R R S R S R R R S R neg neg neg pos

6 M

E.coli N R R S R I R R S R S R R R S R neg neg neg pos

11 F

E.coli R R R S R I R I S R S S R S S R neg neg pos pos

7 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R R S R neg pos neg pos

20 F

E.coli R R R S R S R R S R S S R S S R neg neg pos neg

9 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R R S R neg neg neg pos

29 M

E.coli R R R S R S R R S R S S R S S R neg neg pos pos

7 M

E.coli R R R S R S R R S R S R R R S R neg neg neg pos

26 F


22 F


30 M

E.coli R R R S R I R R S R S R R S S R neg neg pos pos

19 F

E.coli R R R S R S R R S R S R R S S R pos neg neg pos

11 M

E.coli N R R S R S R R S R S R R S S R neg neg pos neg

14 F


29 M

E.coli R R R S R S R I S R S S R S S R neg neg pos neg

19 M

E.coli R R R S R I R R S R S R R S S R neg neg neg neg

12 M

k.pneumoniae R R R S R I R R S R S I R R I R neg pos neg pos


19 M

k.pneumoniae R R R S S I R R S R S S R S S R pos neg neg pos

20 F

k.pneumoniae R R R S R I R R S R S S R S S R neg pos neg pos

25 M

k.oxytoca R R R S R I R I S R S S R R S R neg pos neg pos

6 M

k.pneumoniae R R R S R R R R S R S I R R S R neg pos neg pos

18 F

K.oxytoca R R R S R S R R S R S I R R S R neg pos neg pos

29 F

k.pneumoniae R R R S R I R R S R S S R R S R neg pos neg pos

7 F k.pneumoniae R R R S R I R R S R S R R R S R neg pos neg pos

11 M

E.coli R R R S R S R R S R S R R S S R neg neg neg pos

7 F

E.coli R R R S I S R R S R S I R I I I neg neg pos neg

10 M

E.coli R R R S R S R R S R S R R S S R neg neg neg neg

13 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R I S R neg neg neg neg

16 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R R S R neg pos neg pos

16 M


13 M

E.coli R R R S R S R I S R S R R R S R neg neg neg pos

15 F


6 F

E.coli R R R S R R R R S R S R R R I R neg neg neg pos

8 F


24 F


6 F

E.coli R R R I R I R R S R S R R R S R neg neg neg pos


9 F

E.coli R R R S S I R R S R S R R R S R neg neg neg pos

29 M


9 M


8 M

E.coli R R R S R S R R S R S R R R S R neg neg neg neg

7 F


32 M


34 M


24 F


23 M


6 M

E.coli R R R S R S R R S R S S R S S S neg neg neg pos

10 F


12 F


8 M

E.coli R R R S R I R R S R S R R S S R neg neg neg pos

22 F

E.coli R R R S R S R R S R S S R S S S neg neg pos neg

24 M


18 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R R S R neg neg pos neg

14 M

E.coli R R R S R R R R S R S R R R S R neg neg neg pos

8 M

E.coli N R R S R S R R S R S R R S S R neg neg pos pos

7 F

E.coli R R R S R S R R S R S R R R S R neg neg neg neg


11 F


22 F

k.pneumoniae R R R S R I R I S R S I R R S R neg neg pos pos

32 M

k.pneumoniae R R R S R I R R S R S R R R S R neg neg pos pos

12 F

k.pneumoniae R R R S S I R R S R S R R R S R neg neg neg pos

24 M

k.pneumoniae N R R S R I R R S R S I R R S R neg neg pos pos

8 M

k.pneumoniae N R R S R I R R S R S R R R S R neg pos neg pos

34 M

k.pneumoniae R R R S S I R R R R S S R R S R neg neg pos pos

22 F

k.pneumoniae R R R S R S R R S R S I R S S R neg pos neg pos

21 F


7 F

E.coli R R R R R R R R S R S R R S S R neg neg neg pos

6 M

E.coli R R R S R S R R S R S R R R I R neg neg neg neg

12 M

E.coli R R R S R S R S S R S S R S S R neg neg pos neg

6 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R S S R pos neg neg pos

22 F

E.coli R R R S R I R I S R S I R S S R neg neg pos neg

21 M

E.coli R R R R R R R I S R S R R R S R neg neg neg pos

22 M

E.coli R R R S R I R R S R S I R I I R neg neg pos pos

6 F

E.coli R R R S R I R R S R S R R R S R neg neg neg neg

9 M

E.coli R R R S R I R R S R S I R I S R neg neg pos pos

12 M

E.coli R R R S R I R I S R S S R S S R neg neg pos pos


11 M


11 M


22 M

E.coli R R R S R I R R S R S R R S S R pos neg neg pos

24 M


NB: les qnr A-B-S sont les gènes plasmidiques de resistance aux quinolones ; aac(6’) est le gène de resistance aux fluoroquinolone ; Légende : Neg : négatif ; Pos : positif


Des amplicons de 516 paires de base (pb) étaient obtenus en cas de présence de qnrA, de 469

paires de base en cas de présence de qnrB et de 417 paires de base en cas de présence de qnrS

( Figure 6) et des amplicons de 482 paires de base étaient obtenus en cas de présence de

aac(6’) (Figure 7)

Figure 6: Gel d’agarose des produits PCR des, qnrB et qnrS qnrA

PM: Marqueur de taille (100pb); 1,2,4,8: Souches qnr(S+); 3,15: Souches qnr(A+); 5,6,7,9:

Souches qnr (B+)

Figure 7: Gel d’agarose des produits PCR du aac(6’)-Ib.

PM: Marqueur de taille (100pb) ; 1 à 15 : Souches aac(6’) (+)

1 2 3 1 4 5 6 7 8 9 15 PM

500pb

1 15

500 pb

PM

DISCUSSION


V. Discussion

Selon la présente étude les gènes qnr et aac(6’) ont une prévalence de 88,45 %, avec une

prédominance du variant aac(6’) (67,9 %), suivi du qnrS (34,6 %) ,de qnrB (14,1 %) et

qnrA (5,1 %).

Ces fréquences sont supérieures à celles rapportée en Turquie, où la prévalence de gènes de

résistance à médiation plasmidique de déterminantes quinolones a été rapportée à 30 % des

souches (Mammeri et al, 2005 ; Corkill et al, 2005) et le gène qnrA a été retrouvé chez 6,3 %

(Mehmet et al, 2008).

Par ailleurs, il existe une fréquente association entre les déterminants géniques de type qnr et

ceux des BLSE, ce qui souligne la possibilité d’une co-sélection de ces deux mécanismes de

résistance plasmidique (Lavilla et al, 2008).

Une étude menée en Espagne a évalué la prévalence des gènes qnr chez 305 souches

d’entérobactéries productrices de BLSE (Lavilla et al, 2008). Les résultats de cette étude ont

révélé une prévalence de

4,9 % de l’association « qnr–BLSE » Une autre étude menée en Côte d’Ivoire a évalué la

prévalence des gènes qnr chez 151 souches d’entérobactéries productrices de BLSE

(Guessennd et al, 2007). La prévalence de l’association « qnr-BLSE » au cours de cette étude

était de 27 % en moyenne pour l’ensemble des entérobactéries alors que dans notre étude, 23

souches multirésistantes ont été identifiées (BLSE + résistance aux qnr).

Ces souches représentent 29,49 % (23/78). Cela pourrait s’expliquer par la petite taille de

notre échantillon.

Aux états unis, (Park et al, 2006) ont rapporté que les gènes responsables de la résistance aux

quinolones (qnr) ont été trouvés chez les entérobactéries ; la même étude révèle la prévalence

de l’allèle du gène aac(6’) de 14%. Cette donnée est confirmée par (Karah.N et al, 2010) en

Tunisie alors que dans notre étude le gène aac(6’) est majoritaire avec une prévalence de 67,9

% .

Dans notre étude, la distribution de la variante aac(6’) diffère entre les espèces. Elle est

détectée le plus souvent chez les E. coli suivies des K. pneumoniae, donnée confirmée par

l’étude de Park et al, 2006.


Bien que la variante de gène aac(6’) n’a pas été signalée jusqu’en 2006, elle était déjà

présente dans plus de la moitié des isolats multirésistants de E. coli à Shanghai, en Chine, en

2000 et 2001 ( Wang et al, 2003).

Les différents antibiogrammes des espèces étudiés suggèrent que la diffusion de l'aac (6’) -

Ib-Cr ne se produit pas à travers la propagation clonale ou la propagation d'un plasmide

unique. La diversité des plasmides sur laquelle circule ce gène n’est pas encore connue, mais

sa présence dans une cassette d'intégrons (Casin et al, 1998 ; Robicsek et al, 2006) suggère

qu'il pourrait être largement mobile parmi les plasmides.

L’association des gènes de résistance qnr et aac(6’) confère un haut niveau de resistance aux

bactéries. Notre étude révèle l’existence d’une association des gènes de résistance qnr et

aac(6’) chez 26 souches répartis comme suit 12 E. coli, 2 Klebsiella oxytoca et 12 Klebsiella

pneumoniae mais ces données sont différentes de celles rapportées par (Robicsek et al, 2006 ;

Wang et al, 2003) où il n’existe aucune association entre l’aac(6’) et les gènes qnr.

Les résultats de la sensibilité à l’acide nalidixique et résistante aux fluoroquinolones ont

montré en général que les bactéries présentent un taux de résistance aux antibiotiques. En

effet, 21 souches (16 E. coli, 04 K. pneumoniae et 01 K.oxytoca) sensibles à l’acide

nalidixique mais résistante aux fluoroquinolones ont révélés la présence des gènes

plasmidiques de résistance aux quinolones avec une prévalence de 26,9 %. Cependant, on

observe la présence du gène qnrA chez 01 souche, le gène qnrB est retrouvé chez 03 souches,

16 souches présentent une résistance au qnrS, 09 souches montrent une résistance au gène

aac(6’).

Une des limites de notre étude est que nous n’avons pas disposé des informations sur les CMI

des antibiotiques ciblés comme par exemple les céphalosporines de 3ème génération

(ceftazidime, cefotaxime), les quinolones (acide nalidixique) et fluoroquinolones (ofloxacine

et ciprofloxacine) pouvant confirmer la résistance de ces antibiotiques avant la PCR.

Une autre limite à notre étude est le manque des caractéristiques moléculaires des gènes de

résistance aux béta-lactamases, nous nous sommes contentés seulement de l’aspect

phénotypique révélé par l’antibiogramme classique.

Malgré ces limites, les résultats de la présente étude nous paraissent importants et pertinents

en termes de recherche sur les gènes qnr, aac(6’) en santé publique.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES


Conclusion

Les bactéries ont accès à un nombre important d’éléments génétiques pour développer la

résistance aux antibiotiques auxquels elles sont confrontées. Si la résistance ne peut être

acquise par mutation(s) de gènes domestiques, les nombreuses possibilités de transfert

d’information génétique dont les bactéries sont pourvues leur permettent d’acquérir la

résistance à partir d’autres espèces. L’utilisation fréquente des antibiotiques à l’hôpital et

dans la communauté est responsable d’une pression de sélection permanente favorisant

l’émergence de la résistance parmi les souches cliniques, la multi-résistance est le plus

souvent le résultat d’une accumulation régulière de gènes exogènes.

Les résultats de notre étude nous ont permis de révéler les types de gènes plasmidiques de

résistance aux quinolones circulant dans les milieux pédiatriques de notre pays, cela nous

permettra aussi d’envisager à l’image d’autres pays un réseau de surveillance de gènes de

résistance aux quinolones.

Cependant, la caractérisation des gènes de résistance aux quinolones nous a permis une

meilleure compréhension de la transmission inter-espèce et la mise en évidence des nouvelles

résistances.

Perspectives

Améliorer la détection des bas niveaux de résistance avant qu’ils n’aient un impact clinique

pourrait aider à prévenir les résistances de plus haut niveau.

Promouvoir l’instauration d’une surveillance épidémiologique afin de vérifier la validité des

protocoles thérapeutiques de première intention et de proposer d’éventuelles mesures

adaptatives.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES


REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

CA-SFM, Comité d’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie, 2013.

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Documents

Mémoire Présenté - Laboratoire de Biologie Moléculaire ... · de Ouagadougou pour son aide, ... o Au Docteur Céline LANGENDORF, référente Bactériologie à Epicentre Paris,