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MEMOIRE D’HABILITATION A DIRIGER DES RECHERCHES
DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité : Ecologie Microbienne
Présenté par
Jean-François GHIGLIONE
BIODIVERSITE BACTERIENNE EN MILIEU PELAGIQUE Influence des facteurs environnementaux et rôle dans le cycle du carbone
Soutenue le 5 Juin 2012
Devant le jury composé de :
Duran Robert, Professeur, Université de Pau Rapporteur
Godon Jean-Jacques, Directeur de Recherches, INRA Narbonne Rapporteur
Sime-Ngando Télesphore, Directeur de Recherches, Clermont-Ferrand Rapporteur
Blain Stéphane, Professeur, Université Paris 6 Examinateur
Grémare Antoine, Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur
Sempere Richard, Directeur de recherches, Université de Marseille Examinateur
2
3
PLAN DU MANUSCRIT
-Soutien à la recherche et remerciements
-Introduction générale
-Chapitre 1- Facteurs environnementaux qui structurent la distribution spatiale et temporelle de la
diversité bactérienne des fractions totales et métaboliquement actives en milieu pélagique.
1.1. Variations spatiales et temporelles de la diversité bactérienne en milieu pélagique
1.1.1. Exemples en Mer Méditerranée Nord Occidentale
1.1.2. Exemples en zones polaires Arctique et Antarctique
1.1.3. Prise en compte de la diversité des bactéries métaboliquement actives
1.2. Influence relative des paramètres environnementaux sur la structuration des communautés
bactériennes dans différents conditions environnementales
1.2.1. Changements saisonniers en milieu côtier
1.2.2. Stratification estivale en milieu hauturier
-Chapitre 2- Rôle de la diversité des bactéries libres et attachées aux particules dans le cycle
biogéochimique du carbone en milieu pélagique
2.1. Changements rapides de diversité bactérienne en condition de bloom printanier et
influence sur la reminéralisation de la matière organique dissoute et particulaire en milieu
hauturier
2.2. Contribution des bactéries métaboliquement actives à la diversité des bactéries attachées
aux particules en milieu hauturier
2.3. Rôle de la diversité des bactéries attachées aux particules dans la transformation de la
matière organique en milieu estuarien
2.4. Influence des paramètres environnementaux sur la distribution de la diversité des
bactéries attachées aux particules en milieu lagunaire
-Chapitre 3- Rôle de la diversité bactérienne dans la régulation des processus de biodégradation
des hydrocarbures pétroliers en milieu marin pélagique
3.1. Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes pélagiques côtières
marines en condition naturelle
3.1.1. Evaluation in situ de l’influence relative des HAP comparée à d’autres paramètres
physicochimiques sur la structure des communautés bactériennes en milieu côtier
3.1.2. Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de
pétrole et à la biostimulation.
3.2. Contrôle de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes par les ressources (bottom-up)
et par la prédation (top-down)
3.3. Exemple d’identification de la diversité associée à une fonction par l’utilisation de
marquage par des isotopes stables : cas des bactéries dégradant les HAP
4
-Projets de recherches :
-Projet 1 : Rôle de la diversité microbienne dans la régulation de la transformation de la
matière organique dissoute et particulaire lors d’épisodes de convection et de cascades d’eaux
denses en Mer Méditerranée
-Projet 2 : Etudes écotoxicologiques des eaux littorales
-Références bibliographiques
-Annexes:
-Annexe 1 : Curriculum Vitae
-Annexe 2 : Diffusion du travail
-Annexe 3 : Trois publications significatives
5
Soutien à la recherche et remerciements
Les recherches qui vont vous être présentées dans ce manuscrit n’auraient pu voir le jour sans
mon implication active dans de nombreux programmes scientifiques nationaux et
internationaux. Ces programmes m’ont apporté le soutien financier pour les importants moyens
nécessaires à une recherche pluridisciplinaire utilisant des technologies dites « de nouvelles
générations ». Ils ont été également un moyen de partager des connaissances avec de nombreux
collègues permanents et non-permanents de la recherche institutionnelle et privée. Ils m’ont
permis enfin d’acquérir une expérience de terrain en participant à 11 campagnes
océanographiques (235 jours de mission en mer) avec des moyens à la mer exceptionnels.
Je tiens également à remercier les différents directeurs d’unité de l’UMR 7621 qui se sont
succédés durant ces dix dernières années : Antoine Grémare, Jean-Marc Guarini, Stéphane
Blain ainsi que tous les membres de cette unité.
6
Mes collaborateurs principaux durant ces dix années de recherche au CNRS ont été Alison
Murray (Université de Réno, EU), Madeleine Goutx et France van Wambecke (MIO-
Marseille), Régis Grimaud (IPREM-Univ. Pau), Hervé Gueuné (Sté CORRODYS), Daniel
Delille, Fabien Joux, Pascal Conan et Mireille Pujo-Pay (LOMIC).
Ces travaux ont également été l’occasion d’assurer l’encadrement de plusieurs étudiants ainsi
qu’une étroite collaboration avec plusieurs post-doctorants, que je profite pour remercier ici:
Mes remerciements vont également à ma famille et à mes amis. Une pensée particulière pour
mes parents, ma sœur et mon frère qui ont cru en moi, qui m’ont toujours soutenu et me
soutiennent encore. Merci aussi à la formation de Master Océano qui m’a permis de
rencontrer ma femme Mylène « pour le meilleur et pour le meilleur » et merci à ma fille Péma
qui découvre avec bonheur les joies de la Mer.
7
Introduction générale
8
L’Ecologie
microbienne
marine : une
science
relativement
récente…
… dont
l’évolution
conceptuelle est
dépendante de la
levée de verrous
méthodologiques.
Les révolutions
successives de
l’étude de la
diversité
microbienne
Mon recrutement en Sept. 2001 s’est effectué sur un poste thématique Science
de la Vie/ Science de l’Univers (SDV/SDU) intitulé «Influence de la
biodiversité dans la régulation des cycles biogéochimiques». Cette
problématique reste encore d’actualité dans le domaine de l’Ecologie
microbienne marine, qui est une science relativement récente. C’est en effet au
milieu des années 1970 que Lawrence Pomeroy (1974) a suggéré pour la
première fois le rôle central joué par une chaîne alimentaire planctonique dans
les cycles biogéochimiques océaniques, incluant le petit phytoplancton, les
bactéries et les protistes. Le concept de « boucle microbienne », séparant le
compartiment microbiologique de la chaîne alimentaire linéaire pélagique, n’est
apparu qu’en 1983 (Azam et al. 1983, Ducklow et al. 1983). Du fait de leur
petite taille invisible à l’œil, l’étude des microorganismes a toujours été
dépendante de la levée de verrous méthodologiques. Il fallut attendre 1985 pour
qu’une nouvelle révolution soit annoncée par « the great plate count anomaly ».
En utilisant le comptage direct en microscopie par épifluorescence, Staley et
Konopka (1985) montraient qu’au lieu de centaines ou milliers de bactéries par
millilitre d’eau de mer obtenues par comptage sur milieu de culture solide, il
s’agissait plutôt de millions de bactéries par millilitre d’eau de mer, ce qui
élevait les bactéries au rang des organismes les plus abondant des Océans (après
les virus). C’est également en 1985 que Dave Kirchman développa une mesure
d’activité bactérienne encore classiquement utilisée de nos jours. Cette méthode
fondée sur l’incorporation de leucine radioactive permet de mesurer le taux de
production de protéine par les bactéries marines. Elle permit d’estimer que 20 à
50% de la production primaire transitait par le compartiment bactérien,
confirmant le rôle essentiel joué par les bactéries dans la reminéralisation la
matière organique en milieu pélagique (Cho & Azam 1990).
Jusque dans les années 1990, la diversité des espèces bactériennes était
considérée comme une « boîte noire » par les écologistes microbiens. La « plate
count anomaly» suggérait que moins de 0.1% des bactéries était cultivable. Mes
premiers travaux de recherche en DEA (master 2) s’intéressaient à la diversité
des bactéries cultivables, et ils faisaient partie des multiples preuves mettant en
évidence que le morphotype des colonies, généralement utilisé comme critère
préliminaire pour distinguer différentes espèces sur milieu de culture solide,
9
Du cultivable à
l’ARNr 16S…
n’était pas un critère discriminant pour la majorité des morphotypes rencontrés
en milieu marin (Lebaron et al. 1998). Même si de nouvelles méthodes de
culture dites par « dilution-extinction » augmentent la représentativité des
bactéries cultivables (Connon & Giovannoni 2002), les méthodes de culture
restent très laborieuses et inadaptées à l’étude de la biodiversité bactérienne
marine.
Une révolution de la vision de la diversité bactérienne et du monde vivant en
général est apparue avec les travaux de Woese (1987) qui, par une analyse
comparative des séquences des gènes ARNr 16S et 18S, décrivit 3 domaines du
vivant: Bacteria, Eucarya et Archaea. Le domaine bactérien y était divisé en 12
phyla (ou « divisions », ou « règnes ») sur une base phylogénétique où un
phylum consiste en deux ou plusieurs séquences ARNr 16S monophylétiques et
non affiliées à tout autre groupe d’un autre phylum. Ces travaux ont été le point
de départ d’une description exponentielle de nouvelles espèces bactériennes à
partir de méthodes moléculaires utilisant les propriétés de l’ARNr 16S,
outrepassant du même coup le problème de la faible représentativité des
bactéries cultivables. De manière empirique, la définition de l’espèce
bactérienne a été fixée à une homologie de 97% de l’ARNr 16S entre deux
individus de la même espèce, correspondant à une hybridation de 70% de leur
ADN génomique (Stackebrandt and Göbel 1994). La première description de la
diversité bactérienne en milieu marin pélagique utilisant les propriétés de
l’ARNr 16S montra un nombre très important de séquences non reliées aux
séquences d’organismes cultivés (Giovannoni et al. 1990). Un nouveau clade,
SAR11, découvert dans le cadre de cette étude sera postérieurement identifié
comme le groupe le plus abondant dans tous les Océans du Monde (Giovannoni
et Rappé. 2000).
Durant les 20 dernières années, le développement de nouveaux outils de la
biologie moléculaire a permis de nettes avancées dans l’étude de la diversité
bactérienne en milieu marin. Il existe à ce jour une large palette de
méthodologies à l’usage des Ecologistes microbiens, utilisables selon le champ
d’investigation envisagé a priori, chaque méthode ne répondant pas à toutes les
questions. En milieu marin, les techniques les plus couramment utilisées sont
les méthodes non-destructives reposant sur des observations microscopiques
10
Une grande
palette de
techniques
d’analyses de
l’ARNr 16S
(Fluorescent In Situ Hybridization - FISH) et des méthodes destructives
reposant sur l’extraction des acides nucléiques et l’amplification du gène
ARNr16S par PCR (polymerase chain reaction). Les produits PCR sont alors
directement séparés par des méthodes d’empreintes moléculaires (DGGE, CE-
SSCP, T-RFLP, ARISA, LH-PCR) ou en construisant des banques de clones qui
sont séquencés selon la technique de Sanger (1977). La description de ces
techniques a fait l’objet de plusieurs revues, soulignant leurs avantages et
inconvénients (Ranjard et al. 2000, Dorigo et al. 2005, Smalla et al. 2007). Mon
recrutement en 2001 se situait dans cette nouvelle vague utilisant les
« développements récents de la biologie moléculaire » qui devaient permettre
d’évaluer le rôle de la biodiversité microbienne dans le « fonctionnement des
écosystèmes ».
Figure 1 : Arbre phylogénétique basé sur le maximum de vraisemblance du domaine des bactéries. Les
phyla sont distingués par la couleur de leur branche et les noms d’espèces indiquées en rouge sont
référencés à la GEBA (Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea) (Wu et al. 2009) .
11
La récente
révolution de
l’analyse de la
diversité
bactérienne par
pyroséquençage.
L’étude de la
biodiversité
bactérienne : un
prérequis pour
de nombreuses
questions
d’Ecologie
microbienne
La limitation du nombre de clones analysés par la technique de Sanger a été
récemment résolue par les méthodes d’extension cyclique dont le
pyroséquençage fait partie. Avec la levée de cette limitation, nous sommes en
train d’assister à une révolution de notre façon d’analyser la diversité
bactérienne, qui devrait propulser le pyroséquençage comme méthode de choix
dans un avenir proche. Le pyroséquençage 454 est une technique peu onéreuse
comparée au coût par base séquencée par la méthode de Sanger et cette
technique a d’ores et déjà changé le potentiel d’investigation de la génomique
en général (Margulies 2005). Le pyroséquençage utilise les acides nucléiques
extraits et ne nécessite pas d’étape de clonage. Il consiste à détecter en temps
réel le pyrophosphate (PPi) produit lors de l’incorporation de nucléotides durant
la synthèse de l’ADN [(DNA)n + dNTP -> (DNA)n+1 + PPi ]. Sogin et al. (2006)
ont été les premiers auteurs à adapter le pyroséquençage à l’analyse de la
diversité bactérienne et à faire le premier pas dans ce qu’ils ont nommé la « rare
biosphere » (les espèces rares). Dans cette étude, plus de 118 000 séquences a
été générées à partir d’un seul passage en pyroséquençage, plus qu’aucune étude
jamais réalisée jusqu’alors avec la technique de séquençage de Sanger. Le
Chapitre 1 de ce manuscrit montrera comment mes travaux contribuent
actuellement à redéfinir certaines notions de biogéographie des communautés
bactériennes marines grâce à l’utilisation de cette méthode dite « de nouvelle
génération ».
Au-delà de la description de nouvelles espèces ayant des propriétés
remarquables, notre habilité à mesurer la diversité bactérienne est un prérequis
pour l’étude systématique de la biogéographie, du suivi de l'évolution spatio-
temporelle des populations d'une communauté, pour comparer les structures de
plusieurs communautés, ou encore relier des modifications de la structure d'une
communauté avec différents descripteurs du milieu, comme la productivité ou la
quantité d'un polluant. Le compartiment microbien joue un rôle clé dans la
régulation des contraintes que subit l'écosystème marin face à l'action directe ou
indirecte des activités humaines ou des phénomènes climatiques naturels. Il
constitue aujourd’hui un compartiment biologique incontournable dans la
compréhension du milieu marin et de sa réaction aux perturbations
anthropiques.
12
Comment relier
la biodiversité
bactérienne à la
régulation des
cycles
biogéochimiques?
Comme je l’ai souligné plus haut, mon recrutement posait la question de
l’«Influence de la biodiversité dans la régulation des cycles biogéochimiques».
Les récentes avancées de la biologie moléculaire nous permettent aujourd’hui
d’accéder à une vision de plus en plus précise de la très grande biodiversité
bactérienne, qui n’était considérée que comme une « boîte noire » dans les
années 1990. En Janvier 2012, on dénombrait 2.110.258 séquences ADNr 16S
différentes alignées et annotées appartenant aux domaines des Bacteria (95%
des séquences) et Archaea (5% des séquences) sur le site du ribosomal database
project (http://rdp.cme.msu.edu/). Néanmoins, moins de 15% des séquences
disponible dans les bases de données appartiennent à des bactéries cultivées, ce
qui pose le problème de la connexion entre la structure des communautés
bactériennes et leur fonction écologique. La relation entre la biodiversité
bactérienne et son rôle dans la régulation des cycles biogéochimiques n’est pas
triviale. Nous verrons tout au long de ce manuscrit les différentes directions que
j’ai choisi de prendre pour apporter des éléments de réponse à cette question.
La question de l’«influence de la biodiversité dans la régulation des cycles
biogéochimiques » a en effet constitué la ligne directrice des recherches que j’ai
menées depuis un peu plus de dix ans de carrière au CNRS. J’ai organisé ce
manuscrit autour de trois questions :
CHAPITRE 1 - Comment les facteurs environnementaux contribuent-ils à
structurer la distribution spatiale et temporelle de la diversité bactérienne des
fractions totales et métaboliquement actives en milieu pélagique ?
Ce chapitre abordera des notions de biogéographie de la diversité des bactéries
marines et décrira comment les paramètres environnementaux peuvent
expliquer les tendances de la répartition spatiale et temporelle des communautés
bactériennes que j’ai observées en milieu marin pélagique côtier et hauturier,
mais aussi en milieu lagunaire et lacustre.
CHAPITRE 2 - Quel est le rôle de la diversité des bactéries libres et attachées
aux particules dans le cycle biogéochimique du carbone en milieu pélagique ?
Ce chapitre propose différents exemples reliant les nouvelles connaissances de
la diversité bactérienne aux variations du taux de reminéralisation de la matière
organique dissoute et particulaire en milieu pélagique côtier et hauturier.
13
CHAPITRE 3 - Quel est le rôle de la diversité bactérienne dans les processus de
bioremédiation des hydrocarbures pétroliers en milieu pélagique ?
Ce dernier chapitre s’intéresse à la fois à l’impact des contraintes
environnementales de plus en plus fortes auxquelles ont à faire face les
communautés bactériennes en milieu littoral, mais aussi au rôle de la diversité
des bactéries hydrocarbonoclastes dans le « service rendu par les
microorganismes » en stimulant leurs capacités de bioremédiation
d’écosystèmes pollués. Il propose enfin de nouvelles pistes d’investigation dans
ce domaine.
14
15
Chapitre 1
Facteurs environnementaux qui structurent la distribution spatiale
et temporelle de la diversité bactérienne des fractions totales et
métaboliquement actives en milieu pélagique
16
1.1. Variations spatiales et temporelles de la diversité bactérienne en milieu pélagique
1.1.1. Exemples en Mer Méditerranée Nord Occidentale.
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
-PNEC ART5 (2002): Programme National Environnement Côtier
(PI : Ghiglione JF)
-IFB-OBSDIV (2005): Observatoire de la diversité microbiologique
(PI : Ghiglione JF & Lebaron P)
- Europe BASICS (2002-2005): Bacterial single-cell approaches to the relationship between diversity and
function in the Sea (PI : Gasol JM)
-PROOF PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle
par les organismes HEtérotrophes à petite échelle de temps (PI Andersen V et Goutx M)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Ghiglione et al. 2005 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)
Ghiglione et al. 2008 Biogeosciences (IF 3.45)
Rodriguez-Blanco et al. 2009 FEMS Microbiology Ecology (IF 3.35)
Lami et al. 2009 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)
Ducklow et al. 2011 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)
L’émergence des
« Observatoires
Microbiologiques »
Les stations d’Observations sont des outils essentiels pour comprendre les
facteurs qui contrôlent les communautés biologiques et pour suivre et prédire
leur évolution lorsqu’ils sont soumis à des changements environnementaux. Il
existe à l’heure actuelle une émergence d’Observatoires Microbiologiques
dans la communauté internationale qui ont pour objectif (i) d’explorer la
biodiversité des microorganismes, d’appréhender les facteurs qui contrôlent
leurs changements et (ii) d’utiliser la veille microbiologique comme indicatrice
de perturbations environnementales à court ou long terme. En association avec
l’initiative SOMLIT (Service d’Observation en Milieu LITtoral –
http://somlit.epoc.u-bordeaux1.fr/fr/), la Station d’Observation du Laboratoire
Arago (SOLA) a été mise en place au début de l'année 1997 en Baie de
Banyuls sur Mer (plateau continental du Golfe du Lion) et fixée par 27 m de
profondeur. C’est à partir de mon recrutement en 2001 que ce site a été choisi
comme Observatoire Microbiologique et pérennisé à l’aide de différents
programmes que j’ai coordonné ou auxquels j’ai participé (programmes
nationaux financés par le PNEC et l’IFB et programme Européen BASICS).
Le caractère dynamique du milieu pélagique marin impose que toute étude
traduisant la structure des communautés bactériennes utilise une stratégie
d'échantillonnage adaptée à l'échelle de variation considérée, tant spatiale que
17
Stratégie
d’échantillonnage
de la diversité
bactérienne en
milieu marin :
nécessité d’outils
hautement
résolutifs et
hautement
reproductibles
temporelle. Cette question fondamentale pour l’analyse du compartiment
bactérien n’a été que très rarement explorée. Si plusieurs études ont été
publiées sur les variations spatio-temporelles des communautés bactériennes
dans différentes mers du globe, différents auteurs soulignent en effet que le
choix de la taille des échantillons et l’évaluation précise de leur
représentativité à différentes échelles spatiales et temporelles ne sont que
rarement mentionnées (Murray et al. 1998 ; Schauer et al. 2000).
Pour aborder cette question, il est essentiel de disposer d'outils d’observation
hautement résolutifs et hautement reproductibles. Les empreintes moléculaires
répondent à cette attente en donnant une image de la structure des
communautés bactériennes et en permettant de comparer rapidement un grand
nombre d’échantillons à moindre coût. La plupart des techniques d’empreintes
moléculaires utilisent la dissimilarité des séquences de l’ARNr 16S entre les
espèces bactériennes. Par exemple, la DGGE (denaturing gradient gel
electrophoresis) a longtemps été majoritairement utilisée pour l’analyse des
communautés bactériennes et pour l’identification de ribotypes d’intérêt par
excision des bandes du gel puis clonage et séquençage (Muyzer et al. 1993,
Muyzer et Smalla 1998). Néanmoins, cette technique présente l’inconvénient
d’une faible reproductibilité entre les gels, limitant la comparaison à un
nombre réduit d’échantillons (20 maximum). Des techniques reposant sur
l’électrophorèse capillaire ont émergés plus récemment pour permettre la
comparaison fiable d’un nombre théoriquement infini d’échantillons. C’est le
cas de la T-RFLP (Terminal - Restriction Fragment Length Polymorphism) qui
fut largement utilisée dans de nombreux environnements (Avaniss-Aghajani et
al. 1994, Liu et al. 1997, Osborn et al. 2000), mais qui montre un nombre de
pics (ribotypes) par échantillons souvent insuffisant en milieu marin. La
technique d’ARISA (Amplified Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) génère
beaucoup plus de pics puisqu’elle utilise les variations au niveau de la sous-
espèce de la région intergénique entre l’ARNr 16S et 23S (Intergenic Spacer,
ITS), mais pose le problème du niveau taxonomique étudié. Avec l’aide de
l’équipe d’Ecologie Microbienne du Laboratoire de Biotechnologie de
l'Environnement de l’INRA de Narbonne, j’ai transposé la technique de CE-
SSCP (capillary electrophoresis – single strand conformation polymorphism)
jusque-là mise au point pour le milieu tellurique et les boues activées (Lee et
18
La CE-SSCP: une
technique
d’empreinte
moléculaire de
choix pour
l’analyse de la
structure des
communautés
bactériennes en
milieu pélagique
al. 1996 ; Godon et al. 1997) à l’analyse de la structure des communautés
bactériennes marines. Cette approche s’est avérée très reproductible et
particulièrement bien adaptée pour l’analyse de la structure des communautés
du milieu pélagique marin (Ghiglione et al. 2005). Comme pour les autres
techniques d’empreintes moléculaires, nous avons pu vérifier que
l’identification taxonomique des pics de profils CE-SSCP est réalisable
(Rodriguez-Blanco et al. 2009, Lami et al. 2009) (Figure 2).
Figure 2 : Assignation des pics CE-SSCP
(en haut) par une banque de clones effectuée
sur le même échantillon (à gauche). Pour
chaque pic CE-SSCP, le ou les clones
présentant la même migration
électrophorétique sont indiqués, ainsi que le
pourcentage du clone le plus fréquemment
rencontré sous ce pic. ND : pic dont l’identité
n’a pas pu être déterminé.
19
Echelles de
variations spatiales
et temporelles des
communautés
bactériennes
Récemment, nous avons comparé cette technique avec la DGGE, la T-RFLP et
la LH-PCR (Length Heterogeneity PCR, qui utilise la variation naturelle de
taille de l’ADNr 16S) sur les mêmes échantillons. Ces travaux ont montré que
la CE-SSCP détectait plus de groupes phylogénétiques, présentait une
meilleure résolution en terme de pics détectés et était moins affectée par la co-
migration de plusieurs séquences sous un même pic ou par la production de
plusieurs pic par une même espèce (Ducklow et al. 2011). Des résultats
similaires ont été observés lors d’une comparaison entre la DGGE et la CE-
SSCP dans un écosystème minier (Hong et al. 2007), suggérant que la CE-
SSCP soit effectivement un outil d’observation hautement résolutif et
hautement reproductible de choix pour l’analyse d’un grand nombre
d’échantillons.
En milieu marin, nous avons montré que la taille optimale de l’échantillon
d’eau de mer à prélever pour obtenir une représentativité suffisante de la
diversité bactérienne était d’au moins 3.107 cellules (environ 50 mL) pour la
CE-SSCP.
L’échelle de variation spatiale des communautés bactériennes a été abordée à
la fois à partir d’un échantillonnage aléatoire de 200m autour de la station
d’Observation côtière SOLA, et à partir un transect de 33km de la station
SOLA vers le large. Nous avons observé que la structure des communautés
bactériennes ne variait pas dans un rayon de 3,7km autour de la station
d’Observation SOLA, avec des variations significatives observées seulement à
partir de 9.3 km au large de cette station.
L’étude des échelles de variation temporelle à la station d’Observation SOLA
durant l’année 2002-2003 a montré que la structure des communautés varie à
l’échelle du mois, alors qu’elle reste identique à l’échelle de la semaine, du
jour, ou de l’heure (Ghiglione et al. 2005). Quatre banques de clones ont été
réalisées à partir de l’analyse de 650 clones (en moyenne 160 clones analysés
par saison). Les -Proteobactéries, les -Proteobactéries, les Bacteroidetes et
les Cyanobactéries sont les groupes dominants retrouvés au long de l’année,
mais leur proportion relative montre une saisonnalité marquée. Par exemple,
les -Proteobactéries sont plus abondant à la saison chaude et les populations
majoritaires de ce groupe, SAR11 et Roseobacter, montrent une évolution
20
Les stations
d’Observations en
milieu hauturier
MOLA et
DYFAMED :
stratification
verticale des
communautés
bactériennes
opposée dans le temps (R=-0,93). Un résultat original de cette étude a été de
montrer qu’un tiers de la richesse bactérienne était associée à une
microdiversité des grands groupes phylogénétiques rencontrés, qui évoluent
très significativement entre les saisons.
Ces résultats ont été pionniers par la robustesse de leur échantillonnage et ils
ont permis d’envisager différentes échelles spatiales et temporelles selon la
question posée. Par exemple, nous avons proposé un échantillonnage mensuel
pour suivre les effets de changements environnementaux à long terme
(changements climatique), alors qu’un échantillonnage hebdomadaire serait
plus adéquat pour le suivi de l’effet d’événements à court terme (bloom
phytoplanctonique, crue, pollution localisée,…). Ces résultats ont été
confirmés par d’autres travaux postérieurs à cette étude menés sur d’autres
Observatoires Microbiens (Fuhrman et al. 2006, Alonso-Saez et al. 2007,
Gilbert et al. 2009).
Une autre station d’Observation a été créée au large de Banyuls sur mer à
l’initiative de Philippe Lebaron (Directeur du Laboratoire Arago). Cette station
hauturière (profondeur max. 1000m) nommée Microbial Observatory of the
Laboratoire Arago (MOLA) vient renforcer la mission d’Observation du
Laboratoire Arago initiée avec la station côtière SOLA (Figure 3). Nous avons
pu montrer que la structure des communautés bactériennes à la station
hauturière MOLA est très différente de celle de la station côtière SOLA dont
elle est distante de 33 km. Par contre, la structure des communautés varie très
peu le long d’un transect de 98 km au large de la station MOLA (Rodriguez-
Blanco et al. 2009). Ces travaux ont également permis de mettre en évidence
une stratification verticale de la structure des communautés très marquée au
large, alors qu’elle n’était peu ou pas visible sur le plateau continental. Ces
résultats sont en accord avec les observations menées dans d’autres milieux
hauturiers, tels que dans les Océans Atlantiques et Pacifiques (Lee & Fuhrman
1991), en mer Méditerranée (Acinas et al. 1997, Moeseneder et al. 2001) et
dans l’Océan Austral (Murray et al. 1998).
21
Figure 3 : Localisation des stations d’observations en Mer Méditerranée étudiées dans le cadre
des travaux présentés. Les stations SOLA (Station d’Observation du Laboratoire Arago) et
MOLA (Microbial Observatory of the Laboratoire Arago) sont situées à l’Ouest du Golfe du
Lion au large de Banyuls sur mer. La station DYFAMED (DYnamique des Flux
Atmosphériques en MEDiterranée) est située en Mer Ligure entre Nice et la Corse.
D’autres travaux nous ont également permis d’observer une stratification
verticale très marquée à la station d’Observation hauturière située en Mer
Ligure, entre Nice et la Corse : la station DYFAMED (DYnamique des Flux
Atmosphériques en MEDiterranée) (Figure 3). Un échantillonnage intensif
durant un mois (Sept.- Oct. 2004) en condition de stratification estivale a été
réalisé lors de la campagne océanographique DYNAPROC II dans le cadre du
programme PROOF-PECHE. Ce suivi haute fréquence a révélé une différence
très nette entre la structure des communautés de surface (0-40m), proche du
maximum de chlorophylle et en dessous (80-150) et dans le mésopélagique
(200-1000) (Figure 4) (Ghiglione et al. 2008).
MOLA
SOLA
DYFAMED
22
1.1.2. Variations spatiales et temporelles de la diversité bactérienne des milieux pélagiques en
zones polaires Arctique et Antarctique
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
-Année polaire internationale (2007-2008) Polar Observatories of Microbial Biodiversity in
Antarctic and Sub-Antarctic zones (PI JF Ghiglione)
-National Science Foundation-CAML (2007-2010): Census of Aquatic Marine Life
(PI AE Murray)
-IPEV-MICROBIOKER (2005-2007): Impact écologique des hydrocarbures sur la boucle
micobienne en Antarctique (PI Delille D)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Ghiglione & Murray 2012 Environmental Microbiology (IF 5.54)
Ghiglione et al. en préparation soumission PNAS (IF 9.77)
1.1.2.1. Etude des changements saisonniers de diversité bactérienne dans l’Océan
Austral par une approche de pyroséquençage 454.
Si le clonage/séquençage était considéré comme la technique de choix pour
analyser la diversité taxonomique et phylogénétique bactérienne d’un
échantillon marin jusqu’en 2005, sa représentativité reste néanmoins sujette à
Figure 4. A gauche: profils de la communauté bactérienne par
CE-SSCP à différentes profondeurs.
A droite: Analyse en MDS (MultiDimensional Scaling) de la
similarité (Bray Curtis) des profils CE-SSCP échantillonnés à
différents temps et profondeurs à la station d’Observation
DYFAMED. La répartition des profondeurs est organisée en 3
groupes: 0-40m (Δ) , 60-150m (Ο) et 200-1000m (■).
A-5
A-20
A-40
A-60
A-80 A-150
A-200
A-400
A-700
A-1000
B-5 B-20
B-40 B-60
B-80
B-150
B-400
B-500 B-700 B-1000
C-5
C-20
C-40
C-60 C-80 C-150 C-200
C-400
C-500
C-700
C-1000
D-5
D-20
D-40
D-60 D-80
D-150
D-200
D-400 D-500 D-700
Stress: 0.14
23
Le
pyroséquençage :
une nouvelle
révolution de
l’étude de la
diversité
bactérienne.
Une
collaboration
entre les bases
polaires française
(Kerguelen) et
américaine
(Palmer)
caution. En effet, cette technique reste lourde et même si le coût d’analyse a
largement diminué ces dernières années, la plupart des travaux utilisant cette
approche se sont limités à l’analyse de quelques centaines de clones par
échantillon. Si on considère que la diversité bactérienne contenue dans 1 litre
d’eau de mer atteint en moyenne plus de 2 000 espèces, on se rend compte que
200 clones ne donnent qu’une faible représentation de la diversité des espèces
présentes (moins de 1%). De nouvelles techniques de séquençage ont permis de
lever ce verrou méthodologique et d’offrir aux écologistes microbiens un outil
très puissant pour l’analyse de la diversité bactérienne dont ils ne disposaient pas
jusqu’alors. Depuis les 5 dernières années, le coût du séquençage de l’ADN a
diminué de manière dramatique avec l’avancée de la technologie de séquençage
de type MPS (Massively Parallel Sequencing) (Margulies et al., 2005; Rogers
and Venter, 2005). Le Pyroséquenceur 454 de la société Roche a été utilisé pour
la première fois en Ecologie microbienne par Huber et al. (2007) et depuis, des
équipes du monde entier utilisent cette technologie. Nous avons utilisé cette
technologie en collaborant avec une équipe américaine du Desert Research
Institute (Réno, NV, USA) dans le cadre de l’année polaire internationale. C’est
dans le cadre du programme NSF-CAML coordonné par A.L. Murray que nous
avons pu accéder à la plateforme de pyroséquençage du Marine Biological
Laboratory in Woods Hole (MA, USA). Le prélèvement mensuel des
échantillons durant l’année 2007 a été effectué dans le cadre du programme
IPEV-MICROBIOKER.
Nous avons analysé plus de 160 000 séquences d’ARNr 16S (chiffre à comparer
aux 200 séquences généralement analysées par clonage/séquençage) obtenues à
partir d’échantillons sélectionnés lors d’un suivi mensuel organisé durant une
année à deux stations d’Observation côtières en zones Antarctique (Palmer, US)
et Sub-Antarctique (Kerguelen, FR). Le traitement du nombre considérable de
séquences a été rendu possible grâce au récent développement de la plateforme
d’analyse “Visualization and Analysis of Microbial Population Structures”
(VAMPS) du Josephine Bay Paul Center. Cette collaboration franco-américaine
nous a permis d’observer que la diversité bactérienne des zones Antarctique et
Sub-Antarctique étaient très différentes, avec notamment une disparité
importante de la distribution des séquences majoritaires de
24
Différence
importante de la
diversité
bactérienne de
l’Océan
Antarctique entre
les saisons
estivales et
hivernales avec
une richesse plus
importante du
bacterioplancton
en hiver
Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria et Bacteriodetes. Couplé à des
méthodes d’empreintes moléculaires classiques (CE-SSCP et DGGE), nous
avons observé des changements de structure de communautés très important
entre les deux saisons présentes à ces latitudes, avec une richesse des espèces
bactériennes plus importante en hiver, surtout à la station Antarctique PALMER.
Aux deux stations, plusieurs groupes abondants tels que les Rhodobacteraceae,
Gammaproteobacteria et Bacteriodetes montrent des variations importantes dans
leur abondance et leur composition (Ghiglione et Murray, 2012).
Dans cette étude, nous avons également trouvé des tendances similaires lorsque
nous avons comparé les résultats obtenus par les techniques CE-SSCP, DGGE et
pyroséquençage 454, suggérant que les empreintes moléculaires, lorsqu’elles
prennent en compte la présence et l’intensité des pics ou bandes, reflètent bien la
structure de la communauté totale (contrairement à l’idée répandue de leur
limitation par le faible nombre de pics ou bandes détectées).
(A)
(B)
Figure 5. (A) Courbe d’accumulation des données de pyroséquençage montrant l’effort
d’échantillonnage de la diversité, estimée entre 58 et 68% de la diversité totale selon les
échantillons. La richesse en espèces bactériennes est plus importante en hiver dans ces zones
polaires.
(B) Comparaison des dendrogrammes UPGMA obtenus à partir des données de pyroséquençage
ou d’empreintes moléculaires (DGGE et CE-SSCP) montrant des organisations très similaires
entre les techniques.
25
1.1.2.2. Biogéographie des communautés bactériennes pélagiques du pôle nord au pôle
sud
Figure 6. Carte globale indiquant la localisation des échantillons prélevés en Antarctique (à gauche) et en
Arctique (à droite). Les coordonnées des échantillons est disponible sur le site
http://vamps.mbl.edu/mapper/index.php.
Les zones
polaires pour
étudier la
biogéographie
des bactéries
marines
Les régions polaires Arctiques et Antarctiques offrent une opportunité unique de
tester les facteurs qui influencent la biogéographie des communautés
microbiennes marines puisqu’elles représentent à la fois une situation extrême
de séparation géographique tout en partageant des pressions de sélection
similaires. A notre connaissance, ce travail présente la comparaison la plus
globale jamais réalisée de la diversité du bactérioplancton entre les Océans
polaires Arctique et Antarctique en utilisant une analyse standardisée de données
de pyroséquençage de la région V6 de l’ARNr 16S. Cet effort inclus également
des microbiomes échantillonnés à de plus basses latitudes pour proposer une
perspective globale, portant l’analyse à 837 844 séquences.
De manière surprenante, nous avons observé une différence claire entre les
microbiomes des Océans polaires Arctique et Antarctique : 78.0% des OTUs ont
été trouvées dans l’Océan Antarctique et pas dans l’Arctique, et inversement
70.4% des OTUs ont été trouvées en Arctique et pas dans l’Océan Antarctique.
26
Spéciation
sympatrique des
communautés de
la zone
euphotique et
spéciation
allopatrique des
communautés
méso- et
benthypélagiques
Pas d’évidence de
gradient
latitudinal de la
richesse
bactérienne
Même si les bactéries des Océans des deux pôles étaient plus proches entre elles
comparées à celles présentes à de plus faibles latitudes, les analyses comparant
des échantillons provenant de la côte ou du large, de différentes profondeurs et
de différentes saisons démontrent que les communautés bactériennes des Océans
polaires Arctique et Antarctique sont toujours différentes. Les communautés
bactériennes Arctique et Antarctique échantillonnées dans des zones côtières
étaient plus différentes entre elles que celles des zones hauturières. Inversement,
les communautés méso- et bathypélagiques étaient moins différentes entre les
pôles et avec les échantillons des océans profonds prélevés à de plus faibles
latitudes (Figure 7). Ces résultats nous amènent à proposer que le
bacterioplancton de surface est plus influencé par les conditions
environnementales contemporaines, telles que la lumière, la variabilité des
ressources et du climat (spéciation sympatrique), alors que les communautés
profondes sont structurées par la balance entre une isolation historiquement plus
longue et une connectivité via la circulation océanique (spéciation allopatrique).
Contrairement à d’autres études antérieures, nous n’avons pas pu mettre en
évidence de gradient latitudinal de la richesse du bactérioplancton. Ce résultat
soutient la thèse selon laquelle la taille des organismes influence le degré
d’importance du gradient latitudinal sur l’alpha-diversité (Fenchel & Finlay,
2004). En effet, les petits organismes ne sont pas soumis aux mêmes contraintes
que les organismes de plus grande taille dont la richesse diminue avec la
latitude, ce qui expliquerait la répartition cosmopolite des protozoaires (Fokin,
2000), des diatomées (Hillebrand and Azovsky 2001) et de la meiofaune (Giere
1993).
Ce travail a permis d’identifier les groupes bactériens majeurs présents en milieu
côtier et hauturier en surface et en milieu profond, et propose une base solide
pour la compréhension de la biogéographie du bactérioplancton pélagique.
27
Figure 7. Dendrogramme UPGMA basé sur la dissimilarité de Bray Curtis des séquences V6 du gène ARNr 16S
d’échantillons pélagiques prélevés en Arctique (bleu), en Antarctique (rouge) et en Mer Mediterranée, dans les
Océans Pacifique et Atlantique (gris). Le nom des échantillons est codé par région océanique_code de la base de
donnée VAMPS_côtier (C) ou hautuirer (O)_profondeur en mètres. Les régions océaniques de l’Océan
Antarctique (SO) sont Amundsen Sea (AS), Antarctic Peninsula (AP), Kerguelen Islands (KI), Ross Sea (RS),
Weddell Sea (WS) et celles de l’Océan Arctique (AO) sont Baffin Bay (BB), Beaufort Sea (BS), Chukchi Sea
(CS), East Siberian Sea (ES), Franklin Bay (FB).
Les groupes de dissimilarité ont été nommés Summer Antarctic coastal (A), Summer Arctic coastal (B), Winter
Antarctic coastal (C), Winter Arctic coastal (D), Kerguelen Islands coastal (E), Summer Antarctic open ocean
(F) , Summer Arctic open ocean (G), Summer Western Arctic deep (H), Summer Western Arctic Deep (I),
Summer Eastern Arctic and Antarctic Deep (J) and Mid-latitude large cluster (K).
28
1.1.3. Prise en compte des bactéries métaboliquement actives dans l’étude de la structure des
communautés bactériennes
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
-IFB-OBSDIV (2005): Observatoire de la diversité microbiologique
(PI : Ghiglione JF & Lebaron P)
- Europe BASICS (2002-2005): Bacterial single-cell approaches to the relationship between diversity and
function in the Sea (PI : Gasol JM)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Rodriguez-Blanco et al. 2009 FEMS Microbiology Ecology (IF 3.35)
Lami et al. 2009 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)
L’ARNr 16S
comme marqueur
de l’activité
métabolique des
bactéries
Si l’émergence des techniques d’empreintes moléculaires a conduit à une
meilleure compréhension de la structuration des populations bactériennes dans
les écosystèmes côtiers et hauturiers, le lien entre la structure des communautés
bactériennes et l’activité des populations reste encore très peu documenté.
Différents auteurs ont souligné la possible utilisation de l’ARNr 16S comme
marqueur de l’activité des bactéries, puisqu’il intervient dans la structure des
ribosomes impliqués dans la machinerie cellulaire de synthèse des protéines
(Poulsen et al. 1993, Moeseneder et al. 2001, Trousselier et al. 2002).
L’optimisation de la technique CE-SSCP pour l’analyse simultanée des ADNr
16S et des ARNr 16S nous a alors permis d’accéder à l’analyse couplée de la
structure des communautés bactériennes totales et métaboliquement actives
(Figure 8).
Un nouveau suivi annuel (2003-2004) réalisé à la station côtière SOLA a montré
que les structures des communautés bactériennes totales vs. métaboliquement
actives étaient soumises aux mêmes variations saisonnières. Une analyse
détaillée des ribotypes présents dans les deux fractions montrent généralement
que le nombre de ribotypes présents au niveau de l’ADNr 16S est toujours plus
élevé que celui de l’ARNr 16S, suggérant que de nombreuses espèces
bactériennes sont présentes mais peu actives dans l’écosystème (Lami et al.
2009).
Les ribotypes présents au niveau ARNr16S sont majoritairement (97% )
représentés au niveau de l’ADNr16S. Il existe de rares cas (3%) de ribotypes
bactériens contenant des ARNr16S qui ne sont pas détectés en ADNr16S,
suggérant que certains ribotypes puissent être faiblement abondants mais
29
Comparaison des
communautés
totales vs.
métaboliquement
actives
suffisamment actifs pour apparaître parmi les ribotypes actifs dominants. Ces
résultats suggèrent que les membres d’une communauté bactérienne peuvent
avoir une activité plus ou moins élevée que leur abondance relative l’aurait
suggéré.
Figure 8. Profils CE-SSCP des ADNr16S et des ARNr 16S bactériens extraits d’un
échantillon naturel. Présence/absence des ribotypes et de leur activité.
En couplant l’analyse par empreinte moléculaire et celle de banques de clones, il
nous a été possible de faire l’assignation des pics CE-SSCP des fractions ADNr
et ARNr 16S (voir Figure 2) par les clones correspondant avec une efficacité de
86,7% de la surface totale du profil. Cette assignation nous a permis de montrer
que les différences observées entre présence et activité des populations de la
communauté étaient également très visibles pour les ribotypes dominants tels
que Roseobacter, Synechococcus, SAR 11 ou SAR116 et variaient tout au long
de l’année (Figure 9). Des études antérieures avaient effectivement montré qu’il
n’existe pas de relation linéaire entre l’abondance relative de certains taxa et leur
contribution à la production de biomasse (Cottrell & Kirchman 2004).
Les empreintes moléculaires utilisant l’ADNr 16S décrivent relativement bien la
dynamique de la structure des communautés bactériennes, alors que les
empreintes moléculaires utilisant l’ARNr 16S permettent la détection des
populations actives, a priori plus sensibles aux changements environnementaux.
La détection de variations significatives entres les empreintes moléculaires
utilisant l’ADNr 16S et l’ARNr 16S suggèrent que tous les membres de la
communauté ne participent pas de manière équivalente dans le flux de carbone
en milieu côtier. Ces résultats soulignent le besoin de réévaluer certaines
hypothèses utilisées dans les modèles des cycles biogéochimiques qui considère
Ribotype + Activité +
Profil ADNr 16S
Profil ARNr 16S
Ribotype - Activité +
Ribotype + Activité -
30
Assignation des
pics CE-SSCP
métaboliquement
actifs
Comparaison
ADN / ARN pour
une meilleure
compréhension
du rôle
fonctionnel de
certaines
populations
que tous les membres des communautés procaryotes contribuent de manière
égale au flux de matière et d’énergie (Alonso-Saez & Gasol, 2007) quelle que
soit la saison de l’année.
Figure 9. Dynamique des quatre phylotypes ADNr et ARNr 16S dominants sur les
profils CE-SSCP durant le suivi mensuel de l’année 2003-2004 à la station SOLA et
variation du ratio de la surface des pics pour ces phylotypes dominants, respectivement
Roseobacter, Synechococcus, SAR11 and SAR116.
A la station hauturière MOLA et à deux stations plus au large, les différences les
plus importantes entre la structure des communautés bactériennes présentes et
actives ont été observées aux profondeurs où la production bactérienne était la
plus importante, i.e. à la surface et au maximum de chlorophylle (Rodriguez-
Blanco et al. 2009). L’assignation des pics CE-SSCP à une banque de clones a
permis de montré que SAR11 était le groupe le plus abondant en surface alors
que les -Proteobacteria l’étaient au maximum de chlorophylle, sur la base de
leur ADNr16S. Par contre, leur activité métabolique s’est montrée relativement
plus faible que d’autres groupes à ces profondeurs. Le cas inverse a été observé
pour le groupe Prochloroccocus qui présentait une très forte activité en surface
et au maximum de chlorophylle (estimée par l’ARNr16S) que n’aurait laissé
prévoir son abondance relative (estimée par l’ADNr16S). Ces travaux soulignent
à nouveau l’importance de la combinaison des approches basées sur l’ADNr 16S
et l’ARNr 16S pour une meilleure compréhension du rôle fonctionnel de
certaines populations bactériennes in situ.
31
1.2. Détermination de l’influence relative des paramètres biotiques et abiotiques dans la
structuration des communautés bactériennes
Introduction aux
statistiques
multivariées
directes
Etudes
pionnières en
Ecologie
microbienne
marine
Les statistiques multivariées directes proposent un panel varié permettant de
décrire les facteurs environnementaux qui contrôlent les changements de
structure de communauté. Ces techniques sont très utilisées par les écologistes
des organismes supérieurs, mais très rarement par les écologistes microbiens.
Les jeux de données sont souvent explorés via des analyses multivariées
indirectes dites « exploratoires » en composante principale (ACP) ou
hiérarchiques par groupement (voir les dendrogrammes issus de ce type
d’analyse dans le chapitre 1.1). Les analyses dites « hypothético-déductives » de
type analyses des redondances (RDA) ou analyse canonique des
correspondances (CCA) proposent un pouvoir explicatif statistique des liens
entre les changements de diversité et les variables environnementales (Ter
Braak, 1986). Leur utilisation en Ecologie microbienne a certainement été
retardée par le faible pouvoir résolutif des anciennes approches de la diversité
bactériennes basées sur la culture des cellules (Staley & Konopka 1985) et par la
limitation des techniques moléculaires de clonage séquençage à faible débit qui
réduit le nombre d’échantillons analysés. Le développement récent de
techniques à haut débit, tels que la CE-SSCP, la T-RFLP, l’ARISA, permettant
l’analyse de la structure des communautés microbiennes d’un grand nombre
d’échantillons a ouvert la porte à l’utilisation des outils statistiques multivariés
directs. A l’heure actuelle, très peu de littérature existe sur l’emploi de tels
outils, et nous avons été pionniers de leur utilisation en milieu marin pour
l’analyse des facteurs environnementaux qui influencent la diversité du
bactérioplancton. Ce type d’analyse requiert un investissement de terrain et la
participation à des programmes scientifiques pluridisciplinaires permettant la
compilation d’un nombre suffisant de paramètres environnementaux mesurés
par différentes équipes scientifiques lors de mission en mer ou à des stations
d’Observation. Nous avons proposé ce type d’analyse dans des programmes
scientifiques menés en milieu côtier (Lami et al. 2009), hauturier (Ghiglione et
al. 2008), estuarien (Ghiglione et al. en préparation) et lacustre (Berjeb et al.
2011a et 2011b). Dans un souci de concision, j’ai choisi de ne présenter que les
résultats relatifs aux milieux côtiers et hauturiers dans ce manuscrit.
32
1.2.1. Quels sont les facteurs qui déterminent les changements saisonniers de la structure des
communautés bactériennes en milieu côtier ?
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
- Europe BASICS (2002-2005): Bacterial single-cell approaches to the relationship between diversity
and function in the Sea (PI : Gasol JM)
- UVECO (2003-2006) Induction of microbial community responses and dissolved organic matter
transformations by UltraViolet radiations in marine ECOsytems (PI F. Joux et R. Sempéré)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Lami et al. 2009 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)
Abbouddi et al. 2008 Microbial Ecology (IF 2.89)
Joux et al. en préparation
Déterminants
environnementaux
des changements
saisonniers des
communautés en
milieu côtier
Modèles
statistiques de
l’influence des
paramètres
environnementaux
sur la diversité
bactérienne
Des travaux antérieurs (Ghiglione et al. 2005) ainsi que des travaux plus récents
de la littérature (Fuhrman et al. 2006, Gilbert et al. 2012) ont montré qu’un
caractère récurrent des changements de la structure des communautés
bactérienne en milieu côtier était les changements saisonniers. Dans ce travail,
nous avons vérifié ces premiers résultats en les complétant par une meilleure
prise en compte de la fraction métaboliquement active (comparaison ADN et
ARN) et par l’identification phylogénétique des ribotypes évoluant tout au long
de l’année par couplage de la CE-SSCP au clonage/séquençage (voir §1.1.3).
Ces travaux ont été effectués dans le cadre du programme européen BASICS et
par le concours du réseau SOMLIT. Plusieurs phylotypes de la fraction active
diffèrent de la fraction totale, suggérant qu’une partie des membres de la
communauté présente une forte activité sans pour autant être un acteur
abondant dans la communauté. Cette différence inclus des ribotypes dominants
tel que les groupes Roseobacter, Synechococcus, SAR11 and SAR116.
L’analyse multivariée montre qu’un réseau complexe de paramètres
environnementaux incluant la température, la salinité, les sels nutritifs et la
chlorophylle a concourent pour expliquer une part importante (environ 60%)
des changements de structure de communauté totale (ADN) et active (ARN)
(Figure 10) (Lami et al. 2009). Ces modèles statistiques montrent également
qu’une proportion non négligeable de la variation des structures de
communautés n’est pas expliquée par les paramètres environnementaux
mesurés. Des travaux ultérieurs devront prendre en compte la limitation par les
prédateurs (« top-down » control) tels que les virus, les flagellés et les ciliés.
33
Figure 10. Diagramme d’ordination de l’analyse canonique de correspondence (CCA) des
empreintes CE-SSCP sur la base de l’ADNr 16S (A) et de l’ARNr 16S (B). Les groupes
affichés en pointillé sont ceux correspondant aux groupes obtenus par l’analyse multivariée
indirecte et non contrainte réalisée en amont sur les mêmes échantillons, montrant une
répartition de la structure des communautés en fonction des 4 saisons. Les triangles indiquent la
position des phylotypes dominants sur les deux axes. Roseo: Roseobacter, Syn: Synechococcus.
D’autres résultats concernant l’effet des radiations UV sur la structuration des
communautés bactériennes en milieu côtier ont été menés dans le cadre du
programme PROOF-UVECO. Ils ont permis de montrer en condition contrôlée
que les radiations UV induisaient des changements de la structure associés à
des changements de l’activité des communautés bactériennes (Joux et al. en
préparation). Néanmoins, les conditions expérimentales ne nous ont pas permis
de dissocier l’importance relative de l’impact direct des UV sur les organismes
ou de l’impact indirect des UV via la photo-transformation de la matière
organique pour expliquer les changements observés. Pour évaluer l’importance
34
Effets directs et
indirects des
radiations UV sur
la structure des
communautés
bactériennes
de la photo-transformation de la matière organique par les radiations UV dans
la structuration des communautés microbiennes et leur activité, nous avons
conduit différentes expérience à la station d’Observation SOLA (Baie de
Banyuls sur mer) et dans deux étangs (Leucate et Canet). Ces écosystèmes se
distinguent par leur concentration en matière organique dissoute (DOM) et en
matière organique dissoute chromophore (CDOM) (valeurs plus faible pour la
station SOLA < Leucate < Canet). Après exposition à la lumière solaire ou sans
lumière (contrôle) pendant une journée, ces eaux débarrassées de leur contenu
biologique (filtration à 0.2 µm) ont été inoculées par leur communauté
bactérienne originelle. La phototransformation de la DOM a eu des effets
contrastés sur la production et la respiration bactérienne, résultant en une
augmentation de l’efficacité de croissance pour les eaux côtières oligotrophes
(120%) et en une diminution pour les eaux lagunaires (20 à 40%), par
comparaison à ce qui était observé dans les traitements maintenus au noir. Nous
avons également observé que la croissance bactérienne sur la DOM irradiée par
l’exposition à la lumière était associée à des changements important de la
structure de la communauté bactérienne totale et active pour les trois
environnements, et ceci par comparaison aux bactéries utilisant la DOM non-
irradiée (Fig. 11) (Abboudi et al. 2008).
Figure 11. A gauche : Localisation des sites d’échantillonnage en milieu marin côtier (SOLA)
et lagunaire (Canet et Leucate). A droite : Dendrogramme UPGMA relatif aux différences
entre les empreintes moléculaires CE-SSCP ADNr16s et ARNr 16S des échantillons contrôle
(C), sans lumière (DK), avec lumière PAR (PAR) et avec lumière solaire (FS) aux stations
SOLA, Canet et Leucate.
Nous avons pu déterminer que ces changements étaient essentiellement liés à
une photo-transformation de la DOM par les radiations UV dans le cas de
16S rDNA 16S rRNA
C
PAR
FS
DK
C
DK
PAR
FS
LEUCATE
SOLA
C
DK
PAR
FS
CANET
0.02 0.
04 0.06 0.
08 0.1 0.
12 0.14 0.
02 0.04 0.
06 0.08 0.
1
C
PAR
FS
DK
C
DK
PAR
FS
C
DK
PAR
FS Mediterranean
Sea
France
SOLA
Canet
Leucate
35
l’étang le plus eutrophique et pour la station oligotrophe côtière, et plutôt par
les radiations photosynthétiquement actifs (PAR) dans l’étang mésotrophe. Ces
résultats indiquent que la photo-transformation de la DOM altère
significativement à la fois la structure des communautés et le métabolisme des
bactéries pour une variété d’eaux de surface en condition estivale en Mer
Méditerranée Nord Occidentale (Figure 11) (Abbouddi et al. 2008). Afin de
pouvoir généraliser ces résultats à une échelle annuelle, des travaux similaires
sont actuellement en cours pour évaluer l’importance des changements
saisonniers de la structure des communautés discutés, mais aussi de l’intensité
de lumineuse et de la qualité et de la concentration du DOM.
1.2.2. Quels sont les facteurs qui déterminent la stratification verticale de la structure des
communautés bactériennes en milieu hauturier ?
Support programmatique relatifs à cette partie:
-PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle par les organismes
HEtérotrophes à petite échelle de temps (PI Andersen V et Goutx M)
Diffusion du travail relative à cette partie : Ghiglione et al. 2008 (Biogeosciences IF 3.45)
Goutx et al. 2009 (Biogeosciences IF 3.45)
Bourguet et al. 2009 (Deep Sea Research II IF 1.03)
Van Wambecke et al. 2009 (Biogeosciences IF 3.45)
- Pulido-Villena et al. 2012 dans “Life in the Mediterranean Sea: a look at habitat changes”
Déterminants
environnementaux
de la structuration
verticale des
communautés en
milieu hauturier
Nos travaux antérieurs (Ghiglione et al. 2007) ainsi que d’autres travaux de la
littérature (Rieman et al. 1999, Moeseneder et al. 2001) ont montré que lorsque
la colonne d’eau n’est pas trop perturbée par des courant d’advection
horizontale la diversité bactérienne en milieu hauturier était structurée
verticalement de manière très caractéristique en relation avec le maximum
profond de chlorophylle (DCM). Au cours de la troisième campagne du
programme national PROOF-PECHE, un échantillonnage journalier a été
réalisé sur un mois (Sept.-Oct. 2004) à la station d’observation JGOFS-
DYFAMED (campagne DYNAPROC II). L’analyse de la structure des
communautés bactérienne a été suivie dans la colonne d’eau, de la surface
jusqu’à 1000 mètres de profondeur. L’analyse multivariée indirecte et non
36
Action synergique
de plusieurs
paramètres
physico-
chimiques, et rôle
particulier de la
qualité de la
matière organique
et de la diversité
phytoplanctonique
Etude en bioessais
pour préciser le
contrôle par les
ressources
(« bottom-up »
control) de la
structure des
communautés à
différentes
profondeurs
contrainte des données CE-SSCP lors de cette campagne ont confirmé la
répartition verticale de la structure des communautés bactériennes qui est resté
stable durant le mois d’échantillonnage en trois couches réparties en surface (0-
20m), dans ou juste sous le maximum profond de chlorophylle (60-150m) de
chlorophylle, et dans la zone mésopélagique (200-1000m) (Figure 4). L’analyse
multivariée directe et contrainte par les paramètres environnementaux a permis
de montrer que plusieurs paramètres agissaient en synergie pour expliquer la
répartition verticale de la structure de communauté dans la colonne d’eau. Les
paramètres physico-chimiques tels que le phosphate, le nitrate, la salinité et à
un moindre niveau la température, la lumière, l’oxygène et le carbone
organique dissous agissent en synergie pour expliquer plus de 45.8% des
changements dans la colonne d’eau (Figure 12). L’analyse des marqueurs
lipidiques de la qualité de la matière organiques expliquent à eux seuls 22.4%
de la variabilité (notamment les lipides d’origine chloroplastique). Dans la zone
euphotique, nous avons pu monter des relations avec la diversité du
phytoplancton, expliquant 44.5% de la répartition des communautés
bactériennes entre la surface et 150m (Ghiglione et al. 2008). Ces travaux ont
légitimé l’importance de la mesure de la fraction lipidique (proxy de la qualité
de la matière organique) comme variable explicative à prendre en compte dans
la structuration des communautés bactériennes capable dans la colonne d’eau.
En me rapprochant de l’analyse des données de la chimie analytique des lipides
en étroite collaboration avec le LMGEM de Marseille, nous avons pu montrer
également des corrélations fortes entre ce paramètre et les activités bactériennes
(Goutx et al. 2009, Bourguet et al. 2009).
L’effet du contrôle par les ressources (« bottom-up » control) a été précisé lors
de cette campagne par des tests de facteurs limitant l’activité bactérienne durant
la période d’échantillonnage (Sept-Oct 2004). Durant la campagne, la limitation
de l’activité bactérienne est passée d’une co-limitation en azote et phosphore à
une limitation en phosphore seule. Le résultat majeur de ce travail a été de
montrer que les différences de facteurs limitant en surface (5m : co-limitation
N-P puis P seul) et en profondeur (80m : limitation par le carbone labile) avait
une influence importante sur les changements de structure de communauté. Les
deux communautés (5m et 80m) réagissent rapidement (24h) aux changements
de concentration en nutriments par des changements drastiques des populations
37
totales (ADN) et métaboliquement actives (ARN), résultant en des
changements important d’activité bactérienne. Ces résultats viennent conforter
les hypothèses proposées par l’analyse multivariée (voir résultats présentés ci-
dessus) et illustrent l’effet du contrôle des communautés et de l’activité des
communautés bactériennes par les ressources en milieu épipélagique de la
Méditerranée Nord Occidentale (Van Wambecke et al. 2009).
Figure 12. Analyse canonique de correspondance (CCA) de la structure des communautés
bactériennes des échantillons de la colonne d’eau (0-1000m) en utilisant les paramètres
physico-chimiques (à gauche), des marqueurs lipidiques de la qualité de la matière organique
(au milieu) et la diversité pigmentaire phytoplanctonique (à droite). Les flèches indiquent la
direction de valeurs croissantes de la variable considérée. La longueur des flèches indique le
degré de corrélation avec les axes. La position relative de l’échantillon avec les flèches est
interprétée en projetant les points sur la flèche et indique à quel point la structure des
communautés d’un échantillon est influencée par le paramètre environnemental décrit par la
flèche. Les différents groupes d’échantillons révélés par l’analyse multivariée indirecte et non
contrainte (0-20m, 60-150m and 200-1000m) sont indiqués par des symboles différents.
38
39
Chapitre 2
Rôle de la diversité et de l’activité des bactéries libres et attachées
aux particules dans le cycle biogéochimique du carbone en milieu
marin côtier et hauturier
40
2.1. Rôle sous-estimé des bactéries attachées aux particules dans la transformation de la
matière organique en milieu hauturier en condition de bloom printanier
Support programmatique relatifs à cette partie:
-PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle
par les organismes HEtérotrophes à petite échelle de temps (PI Andersen V et Goutx M)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Ghiglione et al. 2007 (Microbial Ecology, IF 2.89)
Mével et al. 2009 (Biogeosciences IF 3.45)
Quel est le rôle
des bactéries
attachées dans la
transformation
de la matière
organique en
milieu hauturier?
L’étude des stocks et des flux de carbone ainsi que leur transfert au sein des
réseaux trophiques sont des questions fondamentales pour la compréhension du
fonctionnement des écosystèmes océaniques. Le programme national PROOF-
PECHE avait pour objectif de décrire les mécanismes de contrôles impliqués
dans la production et l’exportation du carbone au sein de la colonne d’eau en
Mer Méditerranée Nord Occidentale. Deux premières campagnes en mer ont été
effectuées en Mars et Juin 2003 (PROPECHE 1 et 2) à la station d’observation
hauturière JGOFS-DYFAMED (au large de Nice et de la Corse; 2350 m
profondeur maximale). Cette station est reconnue pour ne présenter que très peu
de phénomène d’advection horizontale, et constitue donc un modèle d’étude des
transferts verticaux au sein de la colonne d’eau. Ces deux campagnes nous ont
permis de distinguer le devenir de la matière organique et son transfert dans la
chaîne trophique dans deux conditions contrastées de bloom printanier
(condition mésotrophique) et de stratification estivale (condition
oligotrophique), caractérisés par une production primaire dix fois plus
importante et une biomasse zooplanctonique maximale au printemps par rapport
à l’été (Figure 13).
Une attention particulière a été portée sur le rôle du compartiment bactérien dans
le transfert de la matière organique dissoute et particulaire dans la colonne
d’eau. Si le rôle des bactéries dans la reminéralisation de la matière organique
dissoute est assez bien documenté, peu de travaux reflètent leur rôle dans la
transformation de la matière organique particulaire. Le but de ces travaux était à
la fois (i) de comparer les flux de carbone dissous et particulaire qui transitent
par le compartiment bactérien en conditions mésotrophes (printemps) et
41
En condition
mésotrophe, plus
de 80% de la
production
bactérienne totale
est assurée par
les bactéries
attachées aux
particules la nuit.
oligotrophes (été) et (ii) d’évaluer l’influence de la diversité des bactéries libres
et des bactéries attachées aux particules dans ces flux.
Les communautés bactériennes attachées aux particules sont apparues très
différentes de celles des bactéries libres à la fois en termes de structure des
communautés, d’abondance et d’activités.
Le résultat le plus important de ce travail a été de montrer des changements
nycthéméraux très prononcés de l’activité des bactéries attachées dans la couche
supérieure de la colonne d’eau, avec une activité beaucoup plus importante en
condition nocturne. En condition mésotrophe (printemps), la contribution des
bactéries attachées à l’activité bactérienne totale augmente de 10% le jour à plus
de 80% la nuit dans la couche supérieure (Figure 13). Ces changements rapides
ont pu être reliés à un apport massif de matière organique particulaire d’origine
zooplanctonique qui migre la nuit pour se nourrir du phytoplancton, très
abondant au printemps dans la couche supérieure (Ghiglione et al. 2007).
Figure 13:
(A gauche) Evolution verticale de la fluorescence durant les périodes de bloom
printannier (campagne PROPECHE 1) et de stratification estivale (campagne
PROPECHE 2).
(A droite) Variation nycthémérale de l’activité bactérienne totale et du pourcentage
d’activité des bactéries attachées durant les campagnes PROPECHE 1 (en haut) et
PROPECHE 2 (en bas).
Cette forte activité des bactéries attachées aux particules n’a pas été retrouvée
lors d’un suivi haute fréquence de 1 mois (Sept-Oct 2004) en condition de
42
stratification estivale lors de la campagne océanographique DYNAPROC II.
Néanmoins, des variations rapides de la contribution de la fraction attachée (de
18 à 63% en quelques jours) ont pu être observées en surface (Figure 14) (Mével
et al. 2009).
(A)
(B)
Figure 14.
(A) Variation de la contribution des bactéries attachées à la production bactérienne
totale entre 0 et 1000m entre le jour (□) et la nuit (■) durant la campagne. Les jours
juliens sont indiqués pour chaque profil: 18/09=JD 262; 19/09=JD 263; 26/09=JD 270;
04/10=JD 279; 05/10=JD 280; 12/10=JD 286.
(B) Abondance, production et activité spécifique des bactéries totales et attachées aux
particules à 5m de profondeur. TBA=total bacterial abundance, TBP=total bacterial
production, TSA=total specific activity, Att. BA=relative attached bacterial abundance
on the TBA, Att. BP=relative attached bacterial production on the TBP, Att.
SA=relative attached bacterial specific activity on the TSA.
43
La régulation de ces flux de carbone par la diversité bactérienne a été abordée
par la technique d’empreinte moléculaire (CE-SSCP pour Capillary
Electrophoresis-Single Strand Conformation Polymorphism). Cette technique
hautement reproductible nous a permis de comparer un grand nombre
d’échantillons et de suivre l’évolution de la structure de ces communautés à
petite échelle de temps (jour/nuit) et à l’échelle saisonnière (printemps/été). Si la
structure des communautés est différente entre les bactéries libres et attachées,
de nombreux ribotypes (environ 36%, n=32) sont communs aux deux fractions,
suggérant un échange rapide entre ces fractions (Figure 15). En condition
mésotrophe, nous avons pu montrer qu’un changement rapide de la structure des
communautés entre le jour et la nuit pouvait expliquer l’augmentation
spectaculaire de l’activité des bactéries attachées observée pendant la nuit dans
la couche de surface. Ces résultats renforcent le rôle de la diversité bactérienne
dans le recyclage du carbone organique particulaire des Océans et souligne
l’importance de la variabilité nycthémérale dans ces processus (Ghiglione et al.
2007).
Figure 15: Dendrogramme UPGMA représentant le pourcentage de similarité des profils CE-SSCP des
communautés bactériennes libres et attachées aux particules à différentes profondeurs (0-1000m), le
jour (D) et la nuit (N) entre le printemps et l’été. Le nombre pics par échantillons est indiqué entre
parenthèses.
44
2.2. Diversité des bactéries totales et actives en relation avec leur état libre et attaché aux
particules
Support programmatique relatifs à cette partie:
-PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle
par les organismes HEtérotrophes à petite échelle de temps (PI Andersen V et Goutx M)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Ghiglione et al. 2009 (FEMS Microbiology Letters, IF 2.04)
Quelle est
l’activité de
chacune des
espèces attachées
aux particules ?
Nos précédents résultats exposés ci-dessus ont montré que la diversité des
bactéries attachées aux particules était moins élevée que celle des bactéries
libres, ce qui résulte en une structure des communautés différente entre les deux
communautés. De manière originale, nous avons pu préciser qu’un grand
nombre de ribotypes attachés aux particules était néanmoins identique à celle
des bactéries libres. Contrairement à certaines suppositions de la littérature, ces
résultats suggèrent que s’il existe une compétition sur les particules (diminution
de la diversité sur les particules), les bactéries qui vivent sur les particules sont
plutôt « généralistes » (elles sont capables de vivre à la fois sur les particules et à
l’état libre) que « spécialistes » dans la colonisation des particules.
Les résultats précédents ont également montré que l’activité des bactéries
attachées aux particules était jusqu’alors sous-estimée, pouvant aller jusqu’à
83% de la reminéralisation totale de la matière organique par les bactéries. La
question de l’activité de chacune des espèces qui composent la communauté des
bactéries attachées restait ouverte. Pour répondre à cette question, nous avons
organisé une campagne d’échantillonnage à la station fixe MOLA (Microbial
Observatory of Laboratoire Arago), située à 35 km au large de Banyuls sur mer
(42°28’300 N, 03°15’500 E, profondeur 1000m) en Juillet 2005 dans le cadre du
programme PECHE. La structure des communautés totale et métaboliquement
active des bactéries libres et attachées aux particules a été abordée par
l’utilisation de la technique d’empreinte moléculaire CE-SSCP (capillary
electrophoresis single strand conformation polymorphism) des gènes ADNr 16S
et ARNr 16S.
Nos résultats ont tout d’abord confirmé que la diversité des bactéries libres et
45
attachées présente un haut degré de similarité dans la zone productive (entre 52
et 69% de des ribotypes ADNr 16S sont présent dans les deux fractions dans les
100 premiers mètres), confirmant un échange rapide entre ces communautés.
Néanmoins, les résultats basés sur l’ARNr 16S ont montré que seules certaines
de ces espèces sont adaptées pour exploiter cet habitat. En effet, un grand
pourcentage d’espèces étaient présentes au niveau ADNr 16S mais pas au niveau
de l’ARNr 16S, pour les deux fractions (Figure 16). Ces résultats suggèrent que
même si la colonisation et le détachement des bactéries aux particules est
ubiquiste, l’utilisation des sources de carbone présentes sur les particules
apparaît être faite par un petit nombre d’espèces bactériennes spécialisées dans
l’exploitation d’un tel microenvironnement (Ghiglione et al. 2009).
Figure 16. Pourcentage d’OTUs communs entre les fractions libres et attachées aux particules
(■), seulement sur la fraction libre ( ), ou seulement sur la fraction attachée (□) selon les
empreintes moléculaires CE-SSCP basés sur le gène ADNr16S (A) ou sur l’expression du gène
ADNr16S (B).
0 20 40 60 80 100
-10
-30
-50
-80
-100
-150
0 20 40 60 80 100
-10
-30
-50
-80
-100
-150
(A) (B)
46
2.3. Rôle des bactéries attachées aux particules dans la transformation de la matière
organique en milieu estuarien et influence des paramètres environnementaux sur leur
distribution
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
-PNEC-BIOPRHOFI (2004-2005): Biogeochemical processes in Rhone diluted mesoscale structure
(PI JJ Naudin)
-ANR-CHACCRA (2006-2009): Climate and Human-induced Alterations in Carbon Cycling at the
River-SeA connection (PI C. Rabouille)
-ANR-MALINA (2008-2011): Impact des changements climatiques sur la biodiversité microbienne et
les flux biogéochimiques dans l’Océan Arctique (PI. M. Babin)
Diffusion du travail relative à cette partie : -Ghiglione et al. (en préparation)
–Böttjer et al. (en préparation)
-Ortega et al. (en préparation)
Le rôle clé joué
par les apports
nutritifs des
fleuves dans le
cycle du carbone
en milieu marin
Le milieu estuarien situé à l’interface entre le continent et l’océan est un milieu
riche et diversifié dont les écosystèmes très productifs sont maintenus par les
apports nutritifs continentaux. Ces apports déterminent le rôle du milieu côtier
dans le cycle du carbone global. En effet, les apports de carbone particulaire ou
dissous qui peuvent être minéralisés représentent une source de CO2 vers
l’atmosphère alors que les organismes qui vont fixer du carbone qui sera enfoui
avec le carbone terrigène représentent un puits de CO2. L’équilibre entre ces
sources et puits de CO2 contraint la teneur en dioxyde de carbone
atmosphérique. Au niveau du plateau continental (la partie distale de la zone
côtière), on considère que la mer Méditerranée joue le rôle de puit de CO2
d’environ 0.4 PgC an-1
. En revanche, le comportement des zones littorales et
notamment de celles situées au débouché des fleuves est beaucoup moins bien
contraint au niveau global comme au niveau local. La complexité des
phénomènes mis en jeu (source et puits intrinsèquement liés) et les variations
temporelles des apports dissous et particulaires rendent les bilans très difficiles à
établir. Des premiers résultats semblent indiquer que la zone littorale jouerait un
rôle de source de CO2 aussi fort que le rôle de puit de CO2 du plateau
continental. Le rôle essentiel joué par les bactéries dans la reminéralisation de la
matière organique (jusqu’à 50% eq. de la production primaire) n’est plus à
démontrer, soulignant son rôle incontestable dans les bilans de carbone. La
question du rôle des acteurs de cette reminéralisation, c’est-à-dire la diversité
bactérienne, est encore très peu investie. Cette question a été abordée dans le
47
Rôle des
bactéries
attachées dans
la
transformation
de la matière
organique en
milieu estuarien
Suivi de lentilles
d’eaux dessalées
du Rhône
cadre du programme ANR-CHACCRA qui s’est intéressé aux bilans de carbone
dans l’estuaire du Rhône. Le Rhône est une des sources majeures d’eau douce et
de particules terrigènes en Méditerranée (flux de MO entre 2 et 20 Mt.an-1
; en
moyenne 5 Mt.an-1
, eq. à 80%de la charge particulaire du Golfe du Lion).
De manière générale, si le rôle des bactéries dans la transformation de la matière
organique dissoute (MOD) est relativement bien documenté, la reminéralisation
de la matière organique particulaire (MOP) peut être parfois sous-estimée
(Ghiglione et al. 2007, §2.1.). En général, la contribution des bactéries utilisant
le DOC (bactéries libres) à la production bactérienne totale est supérieure à celle
des bactéries utilisant le POC (bactéries attachées aux particules). En milieu
marin, les bactéries attachées contribuent généralement à moins de 30% de
l’activité bactérienne totale, alors que ce pourcentage peut être supérieur à 50%
en milieu estuarien (Simon et al. 2002). Le rôle de la diversité des bactéries dans
ces processus est encore très peu connu. En milieu estuarien, la diversité
microbienne est abondante, du fait de la rencontre d’espèces d’origines
fluviatiles et marines. La compréhension des facteurs qui influencent la diversité
bactérienne et leur activité est déterminante pour la compréhension de ce
système dynamique complexe.
A partir d’un échantillonnage lagrangien effectué dans le panache du Rhône,
nous avons montré que la structure des communautés bactériennes attachées aux
particules est très différente de la fraction libre dans tout le panache du Rhône
(Figure 17). Dans cette zone de mélange entre les eaux du Rhône et les eaux
côtières, seule une faible proportion de la diversité totale a été retrouvée comme
étant métaboliquement active. Ces populations sont contraintes par la salinité, la
concentration en Chla, la température, les sels nutritifs (N et P) et le carbone
organique particulaire. De manière très intéressante, nous avons pu montrer que
dans la zone proche de l’embouchure, les bactéries attachées aux particules
présentaient une très forte activité, et qu’elles étaient responsables de la plupart
de l’activité bactérienne totale (plus de 90% de l’activité totale dans cette zone –
Figure 17). Ces résultats apportent un regard nouveau sur le rôle sous-estimé
des bactéries attachées aux particules dans le cycle biogéochimique du carbone
en milieu estuarien.
48
Figure 17.
En haut : Analyse en groupement (UPGMA) de la structure des communautés bactériennes totale
(ADN) et active (ARN) libre (free) ou attachées (att) aux particules dans l’embouchure du Rhône.
A gauche: Diagramme d’ordination de l’analyse canonique de correspondance (CCA) des
empreintes moléculaires en association différentes variables environnementales (Salinité, Chl a,
Temperature, Phosphates et azote dissous totaux, Carbone organique particulaire).
A droite : Contribution (en %) de la fraction attachée aux particules dans l’activité bactérienne
totale observé aux stations proches de l’embouchure (symboles vides) ou dans une zone plus
distale de l’embouchure (symboles pleins).
49
Figure 18 : Stratégie d’échantillonnage des lentilles d’eaux dessalées en Mai 2006
(Campagne Bioprhofi)
Des travaux antérieurs menés par notre équipe ont montré que des structures
sous forme de lentilles d’eau dessalées issues de l'interaction entre le panache
du Rhône et les conditions météorologiques, pouvaient être transférées jusqu'au
large de Barcelone. Ces structures dessalées, détachées du panache proprement
dit, sont plus riches en particules et en éléments chimiques dissous que l'eau
marine environnante. Des travaux précédents ont montré qu’elles peuvent
constituer des masses d’eau de plus de 1000 km² (15x20 milles) et de près de
20m d'épaisseur dans sa partie centrale (isohaline 37), et constituer un volume
total équivalent à 4 jours du débit du Rhône, soit ~5.3 109 m
3.
Deux lentilles d’eaux dessalées ont été suivies lors d’une campagne organisée
en Mai 2006 (campagne Bioprhofi – Figure 18). Dans un premier temps, nous
avons pu démontrer qu’il existe une activité de reminéralisation de la MO
beaucoup plus importante dans la lentille d’eau que dans une eau marine (120
Référence marine
2ème
trajectoire 19 au 23 Mai 2006
(début(CTD88) , milieu(CTD130) et fin(CTD171))
1ère
trajectoire 16 au 18 Mai 2006
(début(CTD26) et fin(CTD68))
Rhone discharge
50
pmol leu l-1
h-1
dans la lentille contre 40 pmol leu l-1
h-1
dans l’eau sous-jacente
ou dans un échantillon d’eau de mer témoin). Nous avons également pu mettre
en évidence que la fraction attachée aux particules pouvait contribuer
jusqu'à 80% de la production bactérienne totale dans ces eaux. Cette
activité de reminéralisation de la MO par les bactéries attachées est plus
importante pour les eaux dessalées plus âgées, suggérant une cinétique plus
longue de réponse de ces communautés et/ou une évolution de la structure des
communautés associées. Des travaux complémentaires ont permis de montrer
que ces changements d’activités bactériennes attachées aux particules étaient
associés à des changements rapides de leur diversité (Figure 19). Ces résultats
renforcent le rôle de la diversité bactérienne dans le recyclage du carbone
organique particulaire des Océans.
Figure 19: Evolution de la structure des communautés bactériennes libre (F) et
attachées (A) aux particules entre le début et la fin de la lentille 1 (à gauche) et le
début, le milieu et la fin de la lentille 2 (à droite) échantillonné en Mai 2006.
51
Chapitre 3
Rôle du compartiment bactérien dans la régulation des
processus de biodégradation des hydrocarbures pétroliers
en milieu marin pélagique
52
Importance
des bactéries
dans la
dégradation
des
hydrocarbures
pétrolier :
« service
rendu par les
écosystèmes »
Expérience de
l’UMR7621
dans la
bioremédiation
des HCP
Si le rôle des bactéries est essentiel dans les cycles biogéochimiques en milieu
marin, elles jouent un rôle également très important dans la réaction des
écosystèmes aux impacts anthropiques. En terme quantitatif, le pétrole brut est un
des polluants organiques les plus répandus dans les environnements côtiers du fait
de la concentration importante des activités humaines dans ces zones (stockage,
transport, activités industrielles) (Head et Swannel, 1999). Les catastrophes
pétrolières, telles que l’accident récent de la plateforme pétrolière dans le Golfe du
Mexique (record historique de pollution pétrolière en mer avec plus de 700 000
tonnes de pétrole), marquent invariablement l’attention du public et incitent les
organismes décideurs à réfléchir sur le problème de détection et de lutte contre les
pollutions chroniques ou accidentelles par les hydrocarbures pétroliers (HCP). La
biodégradation par les microorganismes est indéniablement le processus le plus
abouti dans l’élimination des polluants d’origine pétrolière (Atlas 1981). Même s’il
est relativement lent, ce processus permet une dégradation quasi-complète
(transformation en CO2) des hydrocarbures. Les bactéries semblent qualitativement
et quantitativement les plus efficaces dans cette fonction (Figure 20) (Prince 2005).
Ce processus naturel a pour nom la bioremédiation.
Notre UMR a une expérience de plus de 20 ans sur le thème de la
bioremédiation des hydrocarbures pétroliers (voir publications de Daniel Delille
depuis 1990). Les travaux étaient essentiellement orientés sur les moyens de
résoudre des problèmes de pollution par les HCP en environnement Antarctique.
Des découvertes importantes ont permis notamment une amélioration de la
bioremédiation lors de la pollution par l’Exxon Valdez (180 000 tonnes de pétrole
déversés) sur la côte de l’Alaska, grâce à l’utilisation de l’Inipol EAP22 (mis au
point par les équipes d'Elf Aquitaine) précédemment testé par nos équipes en
environnement polaire (Antarctique). Néanmoins, le rôle de la diversité
bactérienne dans la régulation de l’activité de bioremédiation, en prenant en
compte les facteurs de contrôle par les ressources (« bottom-up ») et de contrôle
par la prédation (« top-down ») n’était pas encore abordés.
Dans ce chapitre sont rapportées des études concernant:
-l’impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes pélagiques
côtières marines en condition naturelle. Cette évaluation a été menée (i) à partir
d’études in situ de l’influence relative des HAP comparée à d’autres paramètres
53
physicochimiques sur la structure des communautés bactériennes en milieu côtier
et (ii) en abordant l’impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des
bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
- le contrôle de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes par les ressources
(bottom-up) et par la prédation (top-down)
- un exemple d’identification de la diversité associée à une la dégradation des HAP
par l’utilisation de marquage par des isotopes stables
Figure 20 : Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole
en milieu pélagique marin. Les bactéries marines contribuent largement aux processus de
bioremédiation des pétroles.
Dans ce chapitre, nous soulignons l’importance de la prise en compte de la limitation par les
ressources (« top-down ») et par la lyse virale et la prédation par les protozoaires (« bottom-
up ») qui régulent les activités de bioremédiation bactériennes.
54
3.1. Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes pélagiques côtières
marines en condition naturelle
Supports programmatiques relatifs à cette partie: -ANR-INDHYC (2005-2008): Indicateurs biologiques et chimiques de présence, biotoxicité et biodégradabilité
des hydrocarbures pétroliers (HCP) en milieu aquatique continental et côtier
(PI : Ghiglione JF)
-EUROPE-COMMODE (2003-2006): Communities of Marine Micro-organisms for Oil Degradation
(PI Yakimov M)
-EC2CO IBISCUS (2009-2010): Indicateurs biologiques et chimiques de contaminations urbaines en
milieu marin (PI Goutx M)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Delille et al. (2009) Polar Biology (IF 1.51)
Rodriguez-Blanco et al. (2011) Environmental pollution (IF 3.62)
Sauret et al. (1) En correction Marine Environmental Research
Sauret et al. (2) En préparation
Des rejets insidieux
responsables de
contaminations
récurrentes aussi
importantes que les
catastrophes
pétrolières
Si les accidents pétroliers captent l’attention du public et des scientifiques
sur le problème de la réponse des écosystèmes marins aux forçages
anthropiques, la pression d’usage très élevée sur le littoral conduit à une
pollution récurrente plus insidieuse qui est beaucoup moins bien prise en
compte par les études scientifiques. Le littoral Méditerranéen est notamment
le siège d’une pollution récurrente inquiétante par les hydrocarbures pétroliers
puisque le quart des rejets pétroliers mondiaux (environ 80 000 tonnes an-1
)
concernent cette mer quasi-fermée dont le taux de renouvellement des eaux
est de 90 ans. Ce chiffre équivaut à une quantité de pétrole cumulée
équivalente à environ 11 catastrophes du Prestige par an.
La plupart des travaux s’attachant à comprendre la réponse des
microorganismes aux pollutions pétrolières se cantonnent généralement à une
reconstitution plus ou moins fidèle de catastrophes pétrolières en milieu
contrôlé (microcosme ou mésocosme). Ces études ont permis de mettre en
évidence un impact important et rapide des fortes concentrations de pétrole
sur les communautés microbiennes. On assiste en général à une baisse de la
richesse spécifique des communautés bactériennes et à un changement des
espèces dominantes au profit des bactéries « hydrocarbonoclastes »,
avantagées sélectivement par la nouvelle source de matière organique et
particulièrement bien adaptées à la présence de certains hydrocarbures
toxiques. A un premier consortium bactérien capable de métaboliser les
molécules les plus simples succède plusieurs autres consortiums capables de
dégrader des molécules de plus en plus complexes (par exemple les
55
Un rôle évident de
la diversité
bactérienne dans la
régulation de la
dégradation des
pétroles
hydrocarbures aromatiques polycycliques HAP). Cela se traduit par une
alternance de différents groupes bactériens qui se poursuit jusqu’à
l’élimination quasi-complète des hydrocarbures. Ce travaux soulignent ainsi
l’influence de la diversité bactérienne dans la régulation de l’activité de
dégradation des hydrocarbures pétroliers en milieu pélagique (voir par
exemple la revue de Head et al., 2006).
Néanmoins, la plupart de ces travaux réalisés simulant des catastrophes
pétrolières en condition contrôlée ne prennent pas en compte les rejets plus
insidieux, avec des concentrations de polluants plus faibles mais rejetés
régulièrement, qui constituent des écosystèmes pollués chroniquement. Les
travaux rapportés dans ce chapitre visent à (i) évaluer l’influence relative des
HAP comparée à d’autres paramètres physicochimiques sur la structure des
communautés bactériennes en milieu côtier et (ii) à évaluer l’importance de
l’impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport
de pétrole et à la biostimulation.
3.1.1. Evaluation in situ de l’influence relative des HAP comparée à d’autres
paramètres physicochimiques sur la structure des communautés bactériennes
en milieu côtier
Dans le cadre du programme EC2CO-IBISCUS, nous avons mené
plusieurs campagnes en conditions estivale et hivernale dans 5 sites de la Baie
de Marseille présentant des degrés et des origines de pollutions différentes
(Figure 21).
Figure 21. Stratégie d’échantillonnage reposant sur des transects de 2km à partir de l’intérieur
de 3 ports (Port de Bouc (complexe pétrochimique de Fos-sur-mer), Vieux Port et Saumaty
56
Mise en évidence de
l’importance
relative du polluant
HAP dans la
structuration des
communautés
microbiennes en
milieu côtier
anthropisé
(trafic maritime intense l’été)) et de l’émissaire des eaux usées de Marseille (Cortiou). La
station d’Observation SOFCOM du réseau SOMLIT a également été échantillonnée comme
référence côtière.
Cette étude en milieu naturel a permis de mettre en évidence un changement
de la structure des communautés bactériennes le long du transect de 2km à
partir des ports, associé à un gradient de concentration de HAP. Nous avons
pu montrer que ce changement de communauté avait une influence directe sur
l’abondance des populations hydrocarbonoclastes, révélées par PCR
quantitative et par nombre le plus probable (NPP). Il était néanmoins
important de relativiser l’importance des HAP par rapport à d’autres
paramètres physicochimiques. Si les HAP à eux seuls ne permettent pas
d’expliquer les changements de structure de communauté, ils y contribuent de
manière significative en synergie avec d’autres paramètres tels que la
température, la salinité, le DOC et les sources d’azote et de phosphore. A
notre connaissance, cette étude montrant statistiquement l’importance relative
d’un polluant dans la structuration des communautés in situ ne trouve pas
d’équivalent dans la littérature (Sauret et al. en préparation).
Figure 24. (A gauche) Exemple de dendrogramme UPGMA de la similarité Bray Curtis des
profils CE-SSCP lors du transect de 2km du port de Saumaty qui présente un gradient de
concentration d’hydrocarbure aromatique polycycliques (HAP) – concentration maximale
observée = 10 g l-1
(A droite) Analyse canonique de correspondance révélant l’importance relative des HAP
parmi d’autres paramètres environnementaux pour expliquer les variations de structure de
communauté métaboliquement active (RNA) observées lors de transects aux stations
échantillonnées.
[HAP]
57
La biostimulation
des bactéries
hydrocarbonoclastes
L’hypothèse d’une
meilleure efficacité
de biodégradation
des pétroles dans
des milieux
chroniquement
pollués.
3.1.2. Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à
l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Différents travaux ont permis de mettre en évidence l’importance de certains
paramètres environnementaux dans les processus de dégradation des pétroles,
et notamment l’importance de la limitation en éléments nutritifs (azote et
phosphore essentiellement) et de la biodisponibilité du pétrole à l’attaque
bactérienne (présence d’agent tensio-actifs avec des propriétés de surfactants,
d’émulsifiants ou de dispersants) (voir par exemple la revue de Head et al.
2006). Ces travaux ont permis d’améliorer le « service rendu par les
microorganismes » dans le cas de pollutions pétrolières par la biostimulation
qui consiste en l’ajout de sels nutritifs et de tensio-actifs qui « stimulent »
l’action des bactéries hydrocarbonoclastes (voir par exemple nos articles
Delille et al. 2009, Rodriguez-Blanco et al. 2011).
Différents travaux suggèrent que la présence de pollution récurrente pourrait
également avoir un effet non négligeable sur la biodégradation des
hydrocarbures. L’hypothèse repose sur une biodégradation plus efficace dans
un écosystème chroniquement pollué par rapport à un écosystème non pollué,
du fait de la sélection d’espèces spécialisées dans la dégradation des pétroles.
Néanmoins, si cette hypothèse est souvent citée dans la littérature, elle n’avait
jamais été testée à notre connaissance.
Dans le cadre du programme européen COMMODE, nous avons simulé une
pollution par du pétrole brut sur des communautés bactériennes de deux sites;
un site chroniquement pollué (Baie d’Elefsina –Mer Egée, complexe
pétrochimique) et un site non pollué (Baie d’ Anavyssos). Lors du
prélèvement, les concentrations en hydrocarbures totaux étaient de 0.0014
ppm pour Anavyssos et de 0.171 ppm pour Elefsina. Comme le suggérait
notre hypothèse de départ, nous avons montré que l’addition de 100 ppm de
pétrole brut avait un effet plus visible sur les bactéries originaires du site non
pollué que sur le site pollué. La comparaison des populations totales (ADNr
16S) et actives (ARNr 16S) nous a permis de monter une augmentation de
certaines espèces métaboliquement actives et une inactivation d’autres
espèces sensibles au pétrole, d’autant plus visible dans le site non soumis à
des pollutions chroniques. Par contre, nous avons montré que la
58
biostimulation par ajout de nutriments et d’émulsifiants était aussi efficace
dans les deux sites. Indépendamment de l’historique de pollution du site, la
biostimulation provoque une sélection rapide de différentes communautés
métaboliquement actives qui dégradent le pétrole de manière aussi efficace.
Ces résultats montrent que si la récurrence des pollutions rend les
communautés bactériennes autochtones moins sensibles à un apport de
polluant, elle ne favorise pas la dégradation des pétroles en condition de
biostimulation (Sauret et al. en correction).
Figure 25: Dendrogrammes UPGMA des profils CE-SSCP de l’ADNr 16S et de l’ARNr 16S à
différents temps d’incubation des eaux chroniquement polluées (POLL) ou non polluées (OLIG) avec
le pétrole (0, 65, 93, 134h) en présence ou en absence de pétrole et en condition de biostimulation ou
non (ajout de nutriments ou d’émulsifiants).
59
3.2. Contrôle de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes par les ressources (« bottom-
up » et par la prédation (« top-down »)
Support programmatique relatif à cette partie: -ANR-INDHYC (2005-2008): Indicateurs biologiques et chimiques de présence, biotoxicité et biodégradabilité
des hydrocarbures pétroliers (HCP) en milieu aquatique continental et côtier
(PI : Ghiglione JF)
-EUROPE-COMMODE (2003-2006): Communities of Marine Micro-organisms for Oil Degradation
(PI Yakimov M)
-EC2CO IBISCUS (2009-2010): Indicateurs biologiques et chimiques de contaminations urbaines en
milieu marin (PI Goutx M)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Sauret et al. (3) En préparation
Peu d’études
prennent en
compte les
phénomènes de
prédation et de
lyse virale
Mise au point
d’une
expérience
originale pour
la mesure du
pur « top-
down »
Comme nous l’avons vu précédemment, différents facteurs environnementaux
influencent la diversité et l’activité de dégradation des pétroles en milieu marin. Les
facteurs environnementaux jusqu’alors mis en évidence sont essentiellement la limitation
par les ressources (le contrôle « bottom-up »). Néanmoins, comme nous l’avons souligné
dans le paragraphe 3.1., ces facteurs n’expliquent qu’une partie des changements de
communautés. Nous avons montré notamment que la récurrence des pollutions en
expliquent une autre partie (voir paragraphe 3.2). Peu d’études prennent en compte les
phénomènes de prédation et de lyse virale (contrôle « top-down »).
Pour estimer l’effet exclusif du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures
et s’affranchir du contrôle « bottom-up », nous avons imaginé une expérience originale
simulant un apport de pétrole dans le cadre d’une biostimulation très contrôlée. Un
échantillon de la station d’Observation SOLA, habituellement peu soumis aux pollutions
pétrolières, a été mis en présence de pétrole (diesel) dans des conditions non-limitantes en
sels nutritifs maintenues tout au long de l’expérience (15 jours). En comparaison avec un
bac non pollué, l’analyse de l’évolution de la structure des communautés bactériennes
ainsi que leur activité en période de forte prédation et lyse virale avait pour objectif de
déterminer l’effet négatif ou positif du « top-down » sur la biodégradation des
hydrocarbures. Ainsi nous avons pu révéler un contrôle de type « top-down » largement
dominé par les virus ayant pour effet d’importants remaniements des communautés
bactériennes à la fois en termes de biomasse et de structure. Nous avons utilisé la
résolution d’un pyroséquençage massif pour identifier les espèces bactériennes stimulées
par l’apport de pétrole puis sensibles ou résistantes à la prédation par les protozoaires ou
la lyse virale. Certaines groupes bactériens se sont ainsi révélés particulièrement sensibles
60
Changement de
communautés
induit lors du
cycle proie-
prédateur
à la prédation et/ou la lyse virale comme le genre Vibrio, alors que d’autres au contraire
comme Percisivirga, Oleispira et Methylophaga, s’avérèrent résistantes, révélant leur rôle
central dans la dégradation du pétrole dans nos conditions (Figure 26). Finalement la forte
influence des virus n’a pas provoqué de diminution dans la biodégradation des
hydrocarbures par les bactéries puisque la pression de prédation a induit un regain
d’activité globale chez celle-ci. Ce résultat original souligne l’importance de prendre en
compte non seulement le compartiment bactérien mais aussi la boucle microbienne dans
son ensemble pour mieux comprendre le processus de biodégradation des hydrocarbures.
Figure 26 : Evolution de la structure de la communauté par CE-SSCP (en haut) et de la diversité
taxonomique bactérienne par pyroséquençage (au milieu) en relation avec le cycle proie-prédateur
(en bas) dans une expérience de biostimulation après ajout de pétrole. Deux phases distinctes
apparaissent autour du pic d’abondance bactérien.
61
3.3. Exemple d’identification de la diversité associée à une fonction par l’utilisation de
marquage par des isotopes stables : cas des bactéries dégradant les HAP
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
-ANR-INDHYC (2005-2008): Indicateurs biologiques et chimiques de présence, biotoxicité et
biodégradabilité des hydrocarbures pétroliers (HCP) en milieu aquatique
continental et côtier (PI : Ghiglione JF)
-EUROPE-COMMODE (2003-2006): Communities of Marine Micro-organisms for Oil Degradation
(PI Yakimov M)
-IPEV-MICROBIOKER (2005-2007): Impact écologique des hydrocarbures sur la boucle
microbienne en Antarctique (PI Delille D)
-EC2CO IBISCUS (2009-2010): Indicateurs biologiques et chimiques de contaminations urbaines en
milieu marin (PI Goutx M)
-Ingénierie Ecologique (2009-2010) Indicateurs microbiologiques de contamination par les HAP
(PI : Ghiglione JF)
Diffusion du travail relative à cette partie :
Rodriguez-Blanco et al. (2010) Int J Syst Evol Microbiol (IF 2.38)
Sauret et Ghiglione (2012) Springer Publishers
Sauret et al. (4) En préparation
Relation
diversité-
fonction : un
enjeu de
l’Ecologie
microbienne
Si les méthodes d’inventaire de la diversité et des changements de structure des
communautés bactériennes a largement évolué depuis les années 1990 jusqu’à nos
jours, elles ne permettent que très rarement de relier la présence de certaines
espèces à une ou plusieurs fonctions. La relation diversité-fonction est un enjeu
majeur de l’Ecologie microbienne. Chez les bactéries, la plupart des fonctions ne
sont pas associées à des groupes phylogénétiques (il existe néanmoins de rares cas
comme par exemple des bactéries nitrifiantes ou sulfato-réductrices). La relation
entre la diversité (sur la base du gène ADNr16S) et la fonction (répartie sur tout le
reste du chromosome) est un des enjeux de la génomique environnementale qui
n’en est aujourd’hui qu’à ses balbutiements.
Actuellement, les bactéries hydrocarbonoclastes sont généralement identifiées
de deux manières :
- soit les bactéries hydrocarbonoclastes sont identifiées en utilisant des milieux
de culture avec comme seule source de carbone un ou plusieurs hydrocarbures.
Voir par exemple notre article qui décrit un nouveau genre bactérien
Gallaecimonas pentaromativorans gen. nov., sp. nov. isolé des sédiments
contaminés par l’accident du Prestige en Galice (Espagne) capable de se
développer sur des HAP de 4 à 5 cycles comme seule source de carbone (dont le
62
Des méthodes
actuellement
peu fiables
DNA-stable
isotope
probing
pyrène et le benzo[a]pyrène) (Rodriguez-Blanco et al. 2010). Dans le cadre du
programme ANR INDHYC (PI JF Ghiglione), nous avons annoté le génome
complet de la bactérie Marinobacter hydrocarbonoclasticus sp17 (séquençage
réalisé par le Génoscope) isolée d’un sédiment chroniquement pollué par le pétrole.
Cette souche présente des caractéristiques remarquables : ubiquiste et halotolérante
(0,08 à 3,5M NaCl), capable de dégrader les alcanes récalcitrants à longue chaîne (C8 à
C40), synthétise un osmoprotectant l’ectoïne et présente la capacité de former des biofilms
spécifiquement à l’interface entre l’eau et les composés organiques hydrophobes tels que
les hydrocarbures (Grimaud et al. 2012). Nous travaillons actuellement sur une puce
d’expression de cette bactérie, en étroite collaboration avec l’équipe environnement
et microbiologie (UMR 5254) de l’Université de Pau. Si ces travaux sur des
modèles bactériens sont essentiels pour identifier les gènes impliqués dans les
processus de dégradation des hydrocarbures, l’approche cultivable reste inadaptée
pour l’étude de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes, puisqu’elle ne
représente qu’une très faible fraction de la communauté hydrocarbonoclaste totale.
- soit on étudie la diversité bactérienne totale sur la base de l’ARNr16S et on
associe la présence de certaines OTUs à la disparition de certains composés
pétroliers en condition contrôlée. Evidemment, même si ces études sont associées à
analyses dites « hypothético-déductives » de type analyses des redondances (RDA)
ou analyse canonique des correspondances (CCA), elles ne permettent pas
d’identifier les bactéries hydrocarbonoclastes de manière fiable.
Une des méthodes privilégiées pour aborder spécifiquement cette question est
depuis quelques années le marquage de l’ADN des communautés bactériennes
d’intérêt par des isotopes stables ou « DNA-Stable Isotope Probing » (DNA-SIP).
Cette technique a été mise au point et employée dans les études en milieu tellurique
depuis une dizaine d’années (Hanson et al. 1999). Paradoxalement, elle a été très
peu utilisée pour l’étude des communautés bactériennes marines du fait de la
difficulté d’appliquer la technique en milieu liquide. Nous avons mis en place une
première étude de DNA-SIP en milieu marin pour l’identification des bactéries
phénanthrène-dégradantes (une molécule indicatrice de HAP, particulièrement
surveillée par l’agence de protection environnementale) (Figure 27).
63
Cycloclasticus
sp., un
exemple
d’espèce rare
qui peut
devenir
dominante
lorsque les
conditions lui
deviennent
favorables
Figure 27. Schéma de la méthode de DNA-stable isotope probing mis en place pour
l’identification des espèces utilisant le phénanthrène. L’eau de mer est incubée pendant 2
jours avec du phénanthrène marqué au 13
C de sorte que l’ADN des cellules ayant utilisé ce
substrat soit marqué au 13
C et soit séparé de l’ADN naturel 12
C par un gradient de densité
au Chlorure de Césium. Les ADN lourds et légers peuvent ensuite être séquencés pour
identifier les espèces ayant utilisé le substrat marqué.
L’expérience de DNA-SIP a été réalisée sur trois échantillons naturels ayant des
niveaux de pollutions pétrolières différents (station d’Observation SOLA de
Banyuls sur mer, station d’Observation SOMLIT de Marseille et un échantillon
prélevé à la sortie d’une raffinerie pétrolière de Fos sur mer). L’analyse des
fractions d’ADN enrichies en 13
C-Phénanthrène a montré que quelle que soit
l’origine de l’échantillon, Cycloclasticus sp. était toujours largement majoritaire. Il
est intéressant de noter que Cycloclasticus sp. n’était pas détectable dans les
échantillons naturels par la technique de pyroséquençage, ce qui renforce
l’importance des espèces rares (fraction de la diversité qui représente moins de
0.001% de la diversité totale) qui agissent comme une banque d’espèces (« seed
bank ») et peuvent devenir dominantes lorsque les conditions leur deviennent
favorables. D’autres espèces moins dominantes (moins de 1% de la diversité
trouvée dans la fraction 13
C) sont spécifiques de chaque environnement
échantillonné. L’analyse de la fraction 12
C a permis d’identifier également un
certain nombre d’espèces tolérantes, telle que le genre Glaciecola sp. qui aurait pu
être identifié comme une bactérie capable de dégrader le phénanthrène par une
approche classique hypothético-déductive. Ce genre a en effet été retrouvé dans
différents environnements pollués par des HAP, et notre étude montre qu’il s’agit
d’une espèce opportuniste des milieux pollués qui ne dégrade pas les HAP.
64
Figure 28 : Identification taxonomique de la contribution relative des OTUs présentes
dans les échantillons naturels et dans les fractions marquées au 12
C et au 13
C après deux
jours d’incubation avec du phénanthrène marqué au 13
C.
65
PROJETS DE RECHERCHE
66
La plupart des projets que je développe ou auxquels je participe dans l’UMR7621 LOMIC
s’inscrivent dans la continuité des projets pour lesquels j’ai présenté les premiers résultats dans
le rapport d’activités. J’ai choisi de vous présenter deux projets financés par différents
programmes qui reflètent les deux thématiques prioritaires que j’ai menées de front depuis
plusieurs années et qui vont encore occuper mes recherches dans les prochaines années.
Projet 1 : Rôle de la diversité microbienne dans la régulation de la transformation de la
matière organique dissoute et particulaire lors d’épisodes de convection et de cascades
d’eaux denses en Mer Méditerranée
Supports programmatiques relatifs à cette partie:
Europe HERMIONE-MerMeX CASCADE (2010-2012) – Hotspot Ecosystem Research and
Man’s impact on European Seas (PI X. Durrieu-Demadron) ANR MerMeX-DeWEX (2012-2014)- Impacts des formations d'eau dense sur les écosystèmes
pélagiques Méditerranéens (PI P. Conan) soumis
La Méditerranée
Nord Occidentale
pour étudier les
effets des
changements
climatiques :
programmes
HyMeX et
MerMeX
Comme nous avons pu le voir précédemment, la compréhension du rôle de la
biodiversité bactérienne dans la régulation des flux de carbone dans les Océans
nécessite une approche intégrée des processus biotiques et abiotiques dans
l’écosystème étudié. La participation à des campagnes Océanographiques
multidisciplinaire d’envergure est indispensable pour répondre à cette question.
Deux régions océaniques du monde sont maintenant connues comme
particulièrement sensibles au changement climatique : l’Océan Arctique et la
Méditerranée (Giorgi 2006, IPCC 2007). La Méditerranée doit sa sensibilité à
deux facteurs essentiels : sa structure "fermée" par des seuils de faible
profondeur et un temps de résidence des eaux types de l’ordre de 100 ans,
nettement plus faible que le temps de résidence des eaux de l’océan mondial
(plusieurs milliers d’années). En Méditerranée nord-occidentale, la présence de
convection, moteur de la circulation thermohaline du bassin occidental pourrait
être remise en cause ou au moins significativement réduite sous l’impact de ces
changements. Cela en fait une zone d’intérêt primordial et définit les priorités
des projets HyMeX et MerMeX.
Le phénomène de cascade sous-marine, ou plongées d’eau dense, est un courant
de gravité, où l’eau dense, généralement formée par refroidissement des eaux
67
Le phénomène de
cascades sous-
marines entraîne
des quantités
importantes de
matière
organique
dissoute et
particulaire dans
les eaux
profondes
peu profondes du plateau continental, déborde au niveau de la rupture de pente
et s’écoule le long du talus continental jusqu’à leur niveau d'équilibre
hydrostatique. Ce courant de fond produit un échange irréversible d’eau du
plateau vers le bassin (Figure 29). Ce phénomène, recensé dans plus de 70 sites
à travers le monde, contribue à la ventilation des eaux intermédiaires et
profondes des océans et a un impact important sur les cycles biogéochimiques
en entraînant des quantités importantes de matières minérales et organiques,
dissoutes et particulaire (Ivanov et al., 2004). Des estimations suggèrent que les
quantités de carbone organique à la fois sous forme dissoute et particulaire,
transportées par les plongées d’eau dense pendant l’hiver 2005, dépasse
l’exportation moyenne de carbone par convection estimée pour la mer Ligure
(Sanchez et al., 2009).
Figure 29 : A gauche : Représentation schématique des processus de cascading et de
convection (flèches rouges) dans le golfe de Lion en relation avec les principaux
forçages (flèches jaunes = vents, flèches bleues = hydrodynamisme dont le courant nord
méditerranéen). La région du Cap de Creus et son canyon adjacent est la principale zone
d'exportation des eaux denses formées pendant l’hiver sur le plateau continental du
Golfe du Lion (Méditerranée Nord Occidentale).
A droite : Schéma de la plongée des eaux dense le long de la pente continentale
(facilitation par les canyons) et des mélanges verticaux au sein de la cellule de
convection. Ces processus hivernaux sont provoqués par le refroidissement des eaux de
surface, conjugué à l’augmentation de la salinité suite à l’évaporation engendrée par de
forts vents (mistral et tramontane).
Dans le programme européen HERMIONE, une campagne intitulée CASCADE
(CAscading, Surge, Convection, Advection and Downwelling Events) a été
réalisée en Mars 2011. Cette campagne avait pour objectif de caractériser
l'impact des plongées d'eaux denses sur les échanges côte-large de matière, en
particulier de carbone et de contaminants, et sur les perturbations
68
Importance des
microorganismes
dans la
transformation
de la MOD et de
la MOP
transportée dans
les cascades
d’eaux denses
environnementales des écosystèmes profonds, en particulier au niveau des
canyons sous-marins. Des phénomènes de cascade d’eau dense et de convection
ont pu être clairement caractérisés lors de cette campagne. Notre objectif
particulier était d’estimer le rôle de la diversité des microorganismes libres et
attachés aux particules dans la régulation des taux de reminéralisation de la
matière organique dissoute (MOD) et particulaire (MOP) lors de phénomènes de
plongées d’eaux denses. Cet objectif sera également suivi dans le cadre du
programme DEWEX financé par MERMEX (Etude du rôle de la formation
d'eau profonde dans les bilans et la composition chimique de la matière en
Méditérranée), dont les campagnes sont prévues en Février 2013 (période de
formation des eaux denses) et Avril 2013 (période de bloom printannier). Je co-
encadre actuellement une étudiante en thèse (Tatiana Severin 2011-2013) sur ce
sujet.
Projet 2 : Etude écotoxicologique des eaux littorales Supports programmatiques relatifs à cette partie:
EUROPE-AAMP-VERMEILLECOTOX (2012-2013) Etude pluridisciplinaire et spatio-
temporelle des apports de contaminants et de la qualité
Ecotoxicologique sur le littoral de la côte Vermeille (PI JF Ghiglione)
EC2CO-BERTOX (2010-2012) Etude Ecotoxicologique de l’Etang de Berre
(PI O. Radakovitch)
L’Ecotoxicologie
au service de la
protection des
milieux aquatiques
Enjeu écologique et sociétal majeur de ce début de siècle, la protection et la
restauration des milieux aquatiques font l’objet d’évolutions réglementaires
volontaristes, portées au niveau européen par la directive cadre sur l’eau
(DCE) de 2000 pour la surveillance de la qualité des masses d’eau, ou la
règlementation REACH de 2005 sur les substances chimiques. Ces enjeux de
gestion exigent une compréhension accrue du devenir et des impacts des
substances au sein des écosystèmes aquatiques, base de l’Ecotoxicologie
(Lascombe et al. 2008). L’Ecotoxicologie est la science qui étudie le
comportement et les effets toxiques d’agents d’origines anthropiques sur les
écosystèmes. Elle est une discipline phare de la directive cadre stratégie pour
le milieu marin 2008/56/CE, dont le prolongement à l’échelle nationale se
trouve dans le Grenelle de la mer (Livre Bleu, 2009).
Suite au récent rapport du groupe de travail sur la stratégie nationale de
69
Le programme
VERMEILLECOTOX
(PI : JF Ghiglione)
fédérateur des
compétences des
trois UMR de
l’OOB (Banyuls),
du CAMP
(Perpignan) et du
MIO (Marseille)
La Côte Vermeille
comme site atelier
de la qualité
écotoxicologique
des eaux littorales
dans le nouveau
Parc Marin du
Golfe du Lion
recherche en Toxicologie et Ecotoxicologie (2010), j’ai pris un rôle actif dans
le Pôle Tox-Ecotox Sud-Est qui a été créé en 2011. De cette concertation est
né en Mars 2012 le programme VERMEILLECOTOX (PI : JF Ghiglione), qui
est financé par la communauté européenne et l’Agence des Aires Marines
Protégées. Ce programme est fédérateur des compétences des trois UMR de
l’Observatoire Océanologique de Banyuls (LOMIC, BIOM, LECOB), du
CAMP (Centre d’Analyse Méditerranée de Perpignan) et du MIO (Centre
d’Océanologie de Marseille).
L’objectif général de ce projet est de fournir des outils d’évaluation du risque
lié aux apports de contaminants (chimiques, biologiques et nutriments)
déversés sur la côte Vermeille pour définir des mesures de gestion durable de
diminution des risques adaptées à une échelle locale (Figure 30). Il propose de
compléter localement les travaux réalisés dans le cadre de la campagne DCE
2012 sur le district « Rhône et côtiers Méditerranéens »:
(i) en définissant la Côte Vermeille comme un site atelier pour réaliser un
échantillonnage intensif permettant de mieux prendre en compte les
particularités locales de la zone. Dans ce site classé de « qualité écologique et
chimique moyenne » par la dernière campagne DCE menée en 2009, ce projet
propose un échantillonnage mensuel ou plus ponctuel en fonction
d’événements remarquables locaux (changements d’usages – période de
traitement des vignes, de carénage de bateaux, afflux touristique – ou
événements remarquables, crues) de plus de 100 échantillons collectés aux
stations de la DCE mais aussi à 2 stations d’épurations, à l’embouchure de 2
rivières et dans 2 ports. Un tel suivi spatial et temporel garantit une meilleure
prise en compte des usages locaux, des apports de contaminants et de la qualité
écologique du milieu.
(ii) en apportant des outils complémentaires permettant d’obtenir une
information cohérente sur l’état Ecotoxicologique du milieu. Ce projet propose
de mettre en place des outils d’évaluation de l’exposition aux contaminants,
des outils d’évaluation du danger et des outils d’évaluation des effets qui
permettront un meilleur diagnostic des risques et donc une meilleure définition
des mesures de gestion à engager pour les réduire à court et à long terme. Ce
projet a été intégré dans une politique nationale sur la qualité des eaux de
70
rejets en mer menée par l’Agence des Aires Marines Protégées et dans une
politique au niveau Européen par la DCE et le Fond Européen pour la Pêche.
Cette action suivie localement par le Parc Marin du Golfe du Lion assure une
prise en compte des résultats de ce projet pour l’élaboration de mesures de
gestion locales.
Figure 30. Schéma de stratégie de réduction les risques proposé dans le programme
VERMEILLECOTOX à partir d’outils de diagnostics reposant sur les mesures d’exposition, de danger
et d’effets sur le milieu.
Programme
BERTOX :
étude de la qualité
écotoxicologique de
l’Etang de Berre
Une approche similaire est utilisée dans l’Etang de Berre dans le programme
EC2CO-BERTOX (PI : O. Radakovitch). Deuxième bassin industriel de
France, le complexe lagunaire de Berre et a été soumis à trois grands forçages:
un apport important de métaux lourds et d’hydrocarbures, une modification de
son hydrologie suite aux apports depuis 1966 d’eaux douces et limons par un
canal EDF et une eutrophisation parfois importante induite par des apports de
sels nutritifs. Ces forçages ont entraîné une altération complète de
l’écosystème et une diminution drastique des espèces : poissons,
phanérogames et macrofaune benthique. Le programme BERTOX vise à
71
améliorer la connaissance des liens entre contaminants, dynamiques
biogéochimiques des sédiments et impacts sur la macro- et microfaune
benthique ainsi que les herbiers par une approche de terrain intégrant les
échelles spatio-temporelles de sédiments côtiers. Développé sur deux sites
d’une lagune Méditerranéenne impactée dès les années 1950 par des apports
de contaminants et sur un site de contrôle donnant accès au pool régional
d’espèces (ainsi qu’à une des dernières zones de développement de Zostera
noltii) ce programme a pour objectifs de:
1) Définir, grâce à un suivi saisonnier, les interactions entre les dynamiques
des communautés macrofaunistiques et microbiennes du sédiment ainsi que les
herbiers, les facteurs physico-chimiques des eaux porales (oxygène, redox, pH,
nutriments, ETM) et les gradients verticaux de sédimentation et de
bioturbation.
2) Préciser l’influence de contaminants présents dans le sédiment (HAPs,
PCBs, ETM) sur ces interactions et dynamiques en étudiant : 1) l’influence de
la diversité taxonomique et fonctionnelle des microorganismes sur la
biodisponibilité et la toxicité des sédiments 2) la santé et l’aptitude (fitness)
d’espèces sentinelles de la macrofaune ; 3) la spéciation et disponibilité de ces
contaminants ; 4) l’évolution de différents biomarqueurs de dommage et de
défense et 5) l’activité génotoxique des sédiments.
72
73
Références bibliographiques
citées dans le document
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77
ANNEXES
78
ANNEXE 1- CURRICULUM VITAE
GHIGLIONE Jean-François
Chargé de Recherche 1ère
classe (prise de fonction Sept. 2001, promotion CR1 Nov. 2006,
échelon 6)
Né le 19/06/1971 à Nice (06)
Marié, un enfant
Adresse : Observatoire Océanologique de Banyuls - Laboratoire Arago – Université Paris 6 -
Laboratoire d’Océanographie Microbienne UMR7621 - 66651 Banyuls-sur-mer cedex, France
Tél.: (33) 4 68 88 73 16; Fax: (33) 4 68 88 73 98; Courriel: [email protected]
___________________________________________________________________________
1.1. Diplômes universitaires
1992 DEUG Biologie, Université Paris 6
1994 Licence de Biochimie, Université Paris 6
1995 Maîtrise de Biochimie, Université Paris 6 mention assez bien
1996 DEA Ecologie Microbienne, Université de Lyon I major de promotion
2000 Doctorat Ecologie Microbienne, Université Lyon I mention très honorable
1.2. Stages pré- et post-doctoraux
Stage pré-doctoral (Master 2): 6 mois (1996) Observatoire Océanologique de Banyuls –
Université Paris 6 – Dirigé par P. Lebaron
Stage post-doctoral : 1 an (2000-2001) Bourse européenne Marie-Curie – Financement des
recherches dans le cadre du programme Européen MATBIOPOL - Université de Jérusalem
(Israël) – Dirigé par Y. Cohen
1.3. Encadrement d’étudiants et de jeunes chercheurs
Co-direction de 3 thèses (1) Rodriguez-Blanco Arturo – Financement : bourse ministérielle – Université Paris 6.
Soutenue le 25 Mai 2009, à Banyuls sur mer (directeur D. Delille, co-directeur JF
Ghiglione)
(2) Sauret Caroline – Financement: bourse docteur-ingénieur du CNRS. Soutenue le 15
Décembre 2011, à Banyuls sur mer (directeur D. Delille, co-directeur JF Ghiglione)
(3) Severin Tatiana - Financement : bourse ministérielle – Université Paris 6. Début de
thèse Septembre 2011 (directeur P. Conan, co-directeur JF Ghiglione)
Encadrement ou co-encadrement de 5 post-doctorants :
(1) Bottjer D – Financement ANR-CHACCRA, 18 mois (2008-2009)
(2) Miranda-Tello E – Financement Université El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR)
Mexique, 4 mois (2009)
(3) Ortega E – Financement ANR-MALINA, 24 mois (2009-2011)
(4) Sauret C – Financement DGA, 11 mois (2012)
(5) A recruter – Financement EUROPE 12 mois (2013)
Encadrement de 9 stages de Master 1 et 2, BTS, ou Ecole d’ingénieur: (1) Emonet Sébastien – Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2001)
79
(2) Persohn Cécile – Stage de 2ème
année de technicien supérieur de la mer CNAM (2002)
(3) Lami Raphaël – Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2004)
(4) Denkwitz Léa - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2005)
(5) Auffrey Marc - Stage de Master 1 - Université Paris 6 (2006)
(6) Sauret Caroline - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2008)
(7) Krieger Jean-Philippe – Stage de 2ème
année école d’ingénieur AgroParisTech (2009)
(8) Dumas Chloé - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2010)
(9) Agab M - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2011)
1.4. Responsabilités de recherche, activité d’enseignement et responsabilités
administratives :
Responsabilités de recherche :
- Responsable de l’équipe Qualité écologique des eaux littorales de l’UMR 7621 de 2004 à
2009.
-Coordinateur de 5 projets nationaux (dont un projet ANR et un cofinancement Européen) et
de 1 projet international.
-Participation à 18 projets nationaux (dont 4 projets ANR) et à 7 projets internationaux (dont
4 projets Européens) avec un total de 235 jours de mission en mer (11 campagnes
océanographiques)
-Organisateur du Symposium on single-cell analysis of planktonic microbes (2005)
-Organisateur du stage de formation à l’habilitation de chef de plongée scientifique du CNRS
(2005)
-Participation à 5 jurys de thèse (Horry H, Coulon F, Pineau S, Duflos M, Berjeb L)
-Travaux d'expertise pour l’AERES, l'ANR et pour d'autres programmes nationaux (INSU-
EC2C0, Ministère Ecologie-LITEAU).
-Travaux d’expertise pour des revues scientifiques de rang A (Aquatic Microbial Ecology,
Microbial Ecology, Molecular Ecology, Marine Ecology Progress Series, Microbial
Biotechnology) – avis sur plus de 15 articles scientifiques
Activités d’enseignement:
1996-1999 Monitorat de l'Enseignement Supérieur, Université Lyon I (192 heures éq. TD)
1999-2000 Attaché Temporaire de l'Enseignement Supérieur, Université Lyon I (192 heures
éq. TD)
2001-2011 Cours, TP, TD d’Ecologie microbienne et de Biologie moléculaire pour des
étudiants de master 1 et 2 de l’Université Paris 6 et de l’Université de Perpignan
(~110 heures éq. TD (~10 heures par an depuis 2001)
Responsabilités administratives:
- Membre élu au conseil d'administration (collège B) de l'Observatoire Océanologique de
Banyuls, Université Paris 6, conseil de l'UFR 938 de 2005 à 2008
- Correspondant formation du CNRS de 2003 à 2007
80
81
ANNEXE 2- DIFFUSION DU TRAVAIL
1. Articles scientifiques à comité de lecture (rang A)
1.1. Rapport de citations selon Web of Knowledge (http://apps.webofknowledge.com):
-Nombre total de publication trouvée sur Web of Knowledge : 27 (2 articles sont en cours
de publication).
-Nombre total de citation : 243
-Moyenne des citations par article : 9.35
-h-index : 10
1.2. Liste des articles publiés ou sous presse.
29 articles publiés dont 8 en premier auteur, 9 en deuxième auteur et 4 en dernier auteur.
Pour chaque revue, le facteur d’impact (IF) est indiqué entre parenthèses
(facteur d’impact moyen= 2.96).
1. Lebaron P, Ghiglione JF, Fajon C, Batailler N, Normand P (1998) Phenotypic and
genetic diversity within a colony morphotype. FEMS Microbiology Letters (IF 2.27), 160:
137-143.
2. Clays-Josserand A, Ghiglione JF, Philippot L, Lemanceau P, Lensi R (1999) Effect of
soil type and plant species on the fluorescent pseudomonads nitrate dissimilating community.
Plant and Soil (IF 1.99), 209: 275-282.
3. Ghiglione JF, Philippot L, Normand P, Lensi R, Potier P (1999) Disruption of narG, the
gene encoding the catalytic subunit of the respiratory nitrate reductase A, also affects nitrite
respiration in Pseudomonas fluorescens YT101. Journal of Bacteriology (IF 3.64), 181:
5099-5102.
4. Ghiglione JF, Gourbière F, Potier P, Philippot L, Lensi R (2000) Role of the respiratory
nitrate reductase in ability of Pseudomonas fluorescens YT101 to colonize the rhizosphere of
maize. Applied and Environmental Microbiology (IF 3.80), 66: 4012-4016.
5. Ghiglione JF, Richaume A, Philippot L, Lensi R (2002) Relative involvement of nitrate
and nitrite reduction in the competitiveness of Pseudomonas fluorescens in the rhizosphere of
maize under non-limiting nitrate conditions. FEMS Microbiology Ecology (IF 3.34), 39:
121-127.
82
6. Ghiglione JF, Larcher M, Lebaron P. (2005) Spatial and temporal variation scales of
bacterioplankton community structure in NW Mediterranean Sea. Aquatic Microbial
Ecology (IF 2.38), 40:229-240.
7. Ghiglione JF, Mevel G, Pujo-Pay M, Mousseau L, Lebaron P and Goutx M (2007) Diel
and seasonal variations in abundance, activity, and community structure of particle-attached
and free-living bacteria in NW Mediterranean Sea. Microbial Ecology (IF 2.89), 54:217-231
8. Abboudi M, Jeffrey WH, Ghiglione JF, Pujo-Pay M, Oriol L, Sempéré R, Charrière B,
Joux F (2008) Effects of photochemical transformations of dissolved organic matter on
bacterial metabolism and diversity in three contrasting coastal sites in the Nothwestern
Meditteranean Sea. Microbial Ecology (IF 2.89), 55: 344-357
9. Mével G, Vernet M, Goutx M and Ghiglione JF (2008) Seasonal to hour variation scales
in abundance and production of total and particle-attached bacteria in the open NW
Mediterranean Sea (0–1000 m). Biogeosciences (IF 3.45), 5, 1573-1586
10. Ghiglione JF, Palacios C, Marty JC, Mével G, Labrune C, Conan P, Pujo-Pay M, Garcia
N and Goutx M (2008) Role of environmental factors for the vertical distribution (0-1000 m)
of marine bacterial communities in the NW Mediterranean Sea. Biogeosciences (IF 3.45), 5:
1751-1764.
11. Rodriguez-Blanco A, Ghiglione JF, Catala P, Casamayor EO, Lebaron P (2009) Spatial
comparison of total vs. active bacterial populations by coupling genetic fingerprinting and
clone library analyses in NW Mediterranean Sea. FEMS Microbiol Ecol (IF 3.35) 67: 30–42
12. Lami R, Ghiglione JF, Desdevises Y, West NJ, Lebaron P (2009) Annual patterns of
presence and activity of marine bacteria monitored by 16S rDNA–16S rRNA fingerprints in
the coastal NW Mediterranean Sea. Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38) 54:199-210
13. Van Wambeke F, Ghiglione JF, Nedoma J, Mével G, Raimbault P (2009) Bottom up
effects on bacterioplankton growth and composition during summer-autumn transition in the
open NW Mediterranean Sea. Biogeosciences (IF 3.45), 6: 705–720.
14. Goutx M., Guigue C., Aritio D., Ghiglione J.F., Pujo-Pay M., Raybaud V., Duflos M.,
and Prieur L. (2009) Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the
Ligurian sea (NW Mediterranean). Biogeosciences (IF 3.45), 6: 1229-1246.
15. Bourguet N, Goutx M, Ghiglione JF, Pujo-Pay M, Mevel G, Momzikoff A, Mousseau L,
Guigue C, Garcia N, Raimbault P, Pete R, Oriol L and Lefèvre D (2009) Lipid biomarkers
and bacterial lipase activities as indicators of organic matter and bacterial dynamics in
contrasted regimes at the DYFAMED site, NW Mediterranean. Deep Sea Research II (IF
2.17), 56, 1454–1469.
16. Ghiglione JF, Conan P, Pujo-Pay M (2009) Diversity of total and active free-living vs.
particle-attached bacteria in the euphotic zone of the NW Mediterranean Sea. FEMS
Microbiology Letters (IF 2.27), 299: 9–21.
17. Delille D., Pelletier E, Duval A, Rodríguez-Blanco A, Ghiglione
JF (2009) Effects of
nutrient and temperature on degradation of petroleum hydrocarbons in subAntarctic
seawater. Polar Biology (IF 1.51) 32:1521–1528.
18. Rodríguez-Blanco A, Vetion G, Escande ML, Delille D,
Ghiglione
JF (2010)
Gallaecimonas pentaromativorans gen. nov., sp. nov., a novel bacterium carrying 16S rDNA
heterogeneity able to degrade high-molecular-weigh polycyclic aromatic hydrocarbons.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IF 2.38) 60: 504–509.
83
19. Rodríguez-Blanco A, Antoine V, Pelletier E, Delille D, Ghiglione
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diesel oil pollution in NW Mediterranean Sea. Environmental pollution (IF 3.62), 158: 663–
673.
20. Robinson C, Steinberg DK, Anderson TR, Aristegui J, Carlson CA, Frost JR, Ghiglione
JF, Robison BH, Tamburini C, Tanaka T, Wishner KF, Zhang J (2010) Mesopelagic zone
ecology and biogeochemistry – a synthesis. Deep Sea Research Part II (IF 2.17), 57: 1504-
1518.
21. Berdjeb L, Ghiglione JF, Domaizon I, Jacquet S (2011) A two-year assessment of the
main environmental factors driving the free-living bacterial community structure in Lake
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prokaryotic activity limitation by nitrogen in the Western Arctic Ocean during summer.
Polar Biology (IF 1.51) 35:785–794
27. Ghiglione JF & Murray A (2012) Pronounced summer to winter differences and higher
wintertime richness in coastal sub-Antarctic and Antarctic marine bacterioplankton
Environmental Microbiology (IF 4.91) 14:617-629
28. Marty F, Ghiglione JF, Paisse S, Gueuné H, Quillet L, van Loosdrechta MCM and
Muyzer G (2012) Evaluation and optimization of nucleic acid extraction methods for the
molecular analysis of bacterial communities associated with corroded carbon steel.
Biofouling (IF 3.33), In press
29. Grimaud R, Ghiglione JF, Cagnon C, Lauga B, Vaysse PJ, Rodriguez-Blanco A,
Mangenot S, Cruveiller S, Barbe V, Duran R, Wu LF, Talla E, Bonin P, and Michotey V
(2012) Genome sequence of the marine bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus SP17
which forms biofilms on hydrophobic organic compounds Journal of Bacteriology (IF 3.72)
in press
84
2- Chapitres d’ouvrages
3 chapitres d’ouvrages internationaux
1. Lebaron P, Fajon C, Ghiglione JF, Batailler N, Cauwet G (1996) Diversity and metabolic
properties of aggregate-attached vs free-living heterotrophic culturable cells in marine
bacterial assemblages in the North Adriatic Sea. In : Hopkins, Artegiani, Cauwet, Degobbis,
Malej (Eds). Ecosystem Research Reports Series - The Adriatic Sea -EU/Environment,
Brussels, 1998, 289-296.
2. Pulido-Villena E, Ghiglione JF, Ortega-Retuerta E, Zohary T and Van-Wambeke F
Bacterial activity and community composition in the Mediterranean Sea – a review. In Life in
the Mediterranean Sea: A look at habitat changes. Nova Science Publishers, Inc., accepted
https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=21851
3. Sauret C & Ghiglione JF. Monitoring of oil-degrading bacteria by stable isotope probing.
In Comprehensive Handbook (or Practical Guide) of ecotoxicological terms (Férard, J.F. and
Blaise, C., editors). Springer Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
3- Congrès nationaux et internationaux
28 présentations à des congrès internationaux et 10 présentations à des congrès nationaux.
Seules les présentations à des congrès internationaux sont présentées ici:
Congrès internationaux :
1. Third national meeting of Israeli Microbial Ecologists, Mars 2001. Jerusalem
(Israël) J.F. Ghiglione, D. Eisenstadt, I. Primor, E. Meshorer, Z. Aizenshtat, and Y. Cohen.
Role of hypersaline microbial mat in the bioremediation of oil pollution.
2. 37th CIESM congress proceedings –7 to 11th
, June 2004 – Barcelona (Spain) J.F.
Ghiglione, M. Larcher, S. Emonet, P. Lebaron. Spatial and temporal scales for the monitoring
of bacterial community structure in coastal ecosystems. Oral communication
3. European Geosciences Union (EGU), General Assembly, 24-29 April 2005,
Vienna (Autriche) Goutx M., N. Bourguet, J.F. Ghiglione, M. Pujo-Pay, G. Mevel, A.
Momzikoff, P. Raimbault, Lefèvre, V. Andersen, 2005. Bacterial activities and community
structure interactions with organic matter dynamics at diel scale and during seasonal
stratification in the NW Mediterranean. CD Geophysical Research Abstracts. Vol 7, 2005.
4. The 9th Symposium on Aquatic Microbial Ecology – SAME 9 –21-26th August
2005 – Helsinki (Finland) J.F. Ghiglione, G. Mevel, M. Pujo-Pay, P. Lebaron, M. Goutx. Diel
and seasonal variations in abundance, production and community structure of free-living and
particle-attached bacteria in NW Mediterranean water column (0-1000m). Poster.
5. The 9th Symposium on Aquatic Microbial Ecology – SAME 9 – August 21-26th
October 2005 – Helsinki (Finland) J.F. Ghiglione, M. Larcher, R. Lami, P. Lebaron. Spatial
and temporal scales for the monitoring of bacterial community structure in NW
Mediterranean Sea. Poster
6. International Society for Microbial Ecology (ISME-11). 17-22 Août 2006. Vienne,
Autriche.Rodriguez-Blanco A., Thouand G., Delille D., J.F. Ghiglione. Bacterial biosensors
for the monitoring of polycyclic aromatic hydrocarbons in estuarine and marine
environments. Poster
85
7. 38th CIESM Congress - Istanbul, Turkey, 9-13 April 2007. J.F. Ghiglione, G.
Mevel, M. Pujo-Pay, P. Lebaron, M. Goutx. Diel and seasonal variations in abundance,
activity and community structure of particle-attached and free-living bacteria in NW
Mediterranean Sea (0-1000m). Oral communication
8. 38th CIESM Congress - Istanbul, Turkey, 9-13 April 2007. Abboudi M, Jeffrey
WH, Ghiglione JF, Pujo-Pay M, Oriol L, Sempéré R, Charrière B, Joux F (2007) Effects of
photochemical transformations of dissolved organic matter on bacterial metabolism and
diversity in three contrasting coastal sites in the Nothwestern Meditteranean Sea. Oral
communication
9. The 10th Symposium on Aquatic Microbial Ecology – SAME 10 –01-07th
September 2007 – Faro (Portugal). J.F. Ghiglione, Mevel G, Pujo-Pay M, Goutx M. Role of
particle-attached bacteria in the microbial loop: example of the NW Mediterranean Sea. Oral
communication
10. International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems
(ISMOS) 17 - 18th September 2007-Essex-United Kingdom Rodriguez-Blanco A, Thouand
G, Delille D, Ghiglione JF. Bacterial biosensors for the monitoring of polycyclic aromatic
hydrocarbons in estuarine and marine environments. Poster
11. Corrosion science-2007-(Japon) Pineau S, Ghiglione JF, Quillet L, Caplat C,
Refait P. Relationship between diversity of bacterial biofilmes and marine corrosion of
carbons teel in harbour environments. Poster
12. Census of Antarctic Marine Life (CAML) Final Symposium 18-20 May 2009,
Genoa, Italy Murray A.E.,. Bacterioplankton community composition over the annual cycle at
Kerguelen and Ghiglione J.F Anvers Islands and descriptions of polar-specific
Gammaproteobacteria clades.
13. Aquatic Sciences Meeting ASLO, 25-30 January 2009 in Nice, France Ghiglione
J.F., Palacios C., Marty J.C., Labrune C., Conan P., Pujo-Pay M., and Goutx M.
Environmental factors explaining the vertical distribution (0-1000 m) of marine bacterial
communities in the NW Mediterranean Sea
14. Aquatic Sciences Meeting ASLO, 25-30 January 2009 in Nice, France Böttjer D, P
Conan, ML Escande, JF Ghiglione, F Joux, JJ Naudin and M Pujo-Pay. Viral effect on
primary and bacterial secondary production in the Rhône River plume (North-western
Mediterranean Sea)
15. UK Polar Network Arctic Marine Sciences Workshop 12-13 Octobre 2009 –
Plymouth, united Kingdom Ortega-Retuerta, E, Joux F, Jeffrey WH, Ghiglione JF, Intertaglia
L, Lebaron P. Patterns of microbial activity and diversity in the Beaufort Sea (Western Arctic
Ocean).
16. Third International Conference on Environmental, Industrial and Applied
Microbiology 2009 - Lisbon (Portugal), 2-4 December 2009. Sauret C, Christaki U,
Hatzianestis I, Ghiglione JF. Influence of predation by flagellates on the bacterial response to
crude oil input in unpolluted oligotrophic and chronically oil-polluted mesotrophic
Mediterranean sites
17. CAML Final Symposium, Genoa Italy, May 2009. Murray, AE, JF Ghiglione,
Bacterioplankton community composition over the annual cycle at Kerguelen and Anvers
Islands.
18. Workshop “The microbial view of biogeochemical cycles” - Banyuls-sur-Mer
(France) 19-21 May 2010 Ghiglione JF & Murray AE. Comparison of massively parallel
deep sequencing and molecular profiling to evaluate the seasonal changes in Sub-Antarctic
and Antarctic marine bacterioplankton communities
19. International Society for Microbial Ecology (ISME-11) 22-27 August 2010 -
Seattle, WA, USA Paisse S, Ghiglione JF, Gueune H, Marty F, Muyzer G and Quillet L.
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Dynamics of bacterial consortia and Sulphate-Reducing Microorganisms associated to ALWC
products in marine port structures.
20. TECHNO-Ocean Network, Kobé (Japon), 14-16 October 2010. Goutx M., Guigue
C., Sauret C., Ghiglione JF. and M. Tedetti. New observation tools (fluorescence sensors) for
monitoring pollutants in marine areas submitted to urban inputs.
21. ASLO Aquatic Sciences Meeting (San Juan, Puerto Rico · USA) 13-18 February
2011 Ortega-Retuerta E, Joux F, Jeffrey WH, Ghiglione JF. Procaryotic heterotrophic activity
and diversity in the Western Arctic Ocean : patterns and controlling factors
22. 4th Congress of European Microbiologists, FEMS 2011 (Geneva, Switzerland)
June 26-30, 2011. Sauret C, Bottjer D, Tallarmin A, Guigue C, Conan P, Pujo-Pay M, Goutx
M, Ghiglione JF Evaluation of pure top-down control (heterotrophic nanoflagellates and viral
predations) on biostimulated diesel-degrading bacterial community.
23. UNR -Molecular Biosciences Symposium. Reno NV, November, 2011. Murray AE
& Ghiglione JF. Metagenome and metaproteome analysis reveal distinct diffferences in
carbon cycling pathways of marine bacterioplankton in coastal Antarctic waters between polar
summer and winter.
24. Microbes: Ecology and Biogeochemistry Symposium, Barcelona, Sept 2011.
Murray, AE, JF Ghiglione, P Galand, T Pommier, C Pedros-Alio, E Maas. A comparison of
Southern and Arctic Ocean bacterioplankton - are the poles still apart after pyrotag analysis?
25. Ocean Sciences Meeting 19-24 February 2012, in Salt Lake City, Utah, USA.
Ortega-Retuerta E, Joux F, Jeffrey WH, Ghiglione JF. Exploring bacterioplankton diversity in
the Canadian Arctic: patterns of bacterial communities from the Mackensie River to the
Beaufort Sea
26. 3rd Microbial Sulfur Metabolism workshop, Noordwijkerhout from April 15-18th,
2012 Florence Marty, Sandrine Païsse, JF Ghiglione, Hervé Gueuné, Laurent Quillet, Mark
van Loosdrecht and Gerard Muyzer Sulfate-reducing and sulfur-oxidizing bacteria dominate
ALWC deposits of marine harbour structures
28. Ross Sea Workshop. San Diego, CA March, 2012. Murray, AE, JF Ghiglione, J
Grzymski, T Williams, H Ducklow, R Cavicchioli, T Pommier, C Pedros-Alio, P Galand, E
Maas. Southern Ocean bacterioplankton: Modulators and indicators of ecosystem function.
87
ANNEXE 3- SELECTION DE TROIS ARTICLES SCIENTIFIQUES
J’ai choisi trois articles significatifs des trois chapitres présentés dans le rapport d’activité:
Article relatif au chapitre 1: Ghiglione JF & Murray A (2012) Pronounced summer to
winter differences and higher wintertime richness in coastal sub-Antarctic and Antarctic
marine bacterioplankton Environmental Microbiology (IF 4.91), 14:617-629.
Article relatif au chapitre 2: Ghiglione JF, Conan P, Pujo-Pay M (2009) Diversity of total
and active free-living vs. particle-attached bacteria in the euphotic zone of the NW
Mediterranean Sea. FEMS Microbiology Letters (IF 2.27), 299: 9–21.
Article relatif au chapitre 3: Rodríguez-Blanco A, Antoine V, Pelletier E, Delille D,
Ghiglione JF (2010) Effects of temperature and fertilization on total vs. active bacterial
communities exposed to crude and diesel oil pollution in NW Mediterranean Sea.
Environmental pollution (IF 3.62), 158: 663–673.
88
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Résumé
Mon recrutement au CNRS en Sept. 2001 a été effectué sur un poste thématique SDV/SDU
intitulé « Influence de la biodiversité dans la régulation des cycles biogéochimiques ». Cette
problématique reste encore d’actualité et elle constitue un des enjeux majeurs de l’Ecologie
microbienne marine. Les microorganismes, du fait de leur caractère ubiquiste et de leurs
activités métaboliques extrêmement variées, sont à la fois impliqués dans l'épuration de
certains composés toxiques d'origine anthropique, mais aussi de manière plus générale et à
plus grande échelle dans la régulation des différents cycles biogéochimiques. Par voie de
conséquence, le compartiment microbien joue un rôle clé dans la régulation des contraintes
que subit l'écosystème marin face à l'action directe ou indirecte des activités humaines ou des
phénomènes climatiques naturels.
Mes travaux ont porté essentiellement sur l’influence de la biodiversité bactérienne dans la
régulation du cycle du carbone à la fois dans des conditions naturelles et dans le cadre
d’écosystèmes perturbés par des polluants chimiques (hydrocarbures pétroliers).
Les points forts de mes activités durant un peu plus de dix années de recherche au CNRS
ont été :
- d’adapter différentes avancées techniques de la biologie moléculaire (empreinte
moléculaire CE-SSCP et pyroséquençage) pour l’étude de la diversité des communautés
bactériennes totales (ADN) et métaboliquement actives (ARN) en milieu pélagique,
- de définir les échelles spatiales et temporelles de variations de la diversité bactérienne en
milieu côtier et hauturier,
- d’identifier les facteurs environnementaux (« top-down » et « bottom-up ») responsables
des changements de diversité bactérienne en milieu aquatique par le couplage d’outils
moléculaires et d’analyses statistiques multivariées,
- d’améliorer notre compréhension du rôle de la diversité et de l’activité des bactéries
attachées aux particules dans la régulation des flux de carbone dissous et particulaires en
milieu côtier et hauturier,
- d’améliorer notre vision de la diversité associée à une fonction (ici la fonction de
dégradation des hydrocarbures) en adaptant au milieu marin l’outil de DNA-stable isotope
probing couplé aux nouvelles techniques de pyroséquençage,
- d’évaluer l’importance des changements de diversité dans la régulation de l’activité de
biodégradation des pétroles par les bactéries et dans leur bioremédiation.
Ces travaux ont été soutenus par ma participation active à 18 programmes nationaux, 7
programmes internationaux (coordination de 4 programmes nationaux et 2 programmes
internationaux) et 11 campagnes océanographiques (235 jours de mission en mer). Ils ont été
l’occasion de l’encadrement de 9 étudiants de niveau technicien à master, du co-encadrement
de 3 doctorants et de 5 post-doctorants et de la participation à 5 jurys de thèses de doctorat. Ils
ont été valorisés par la publication de 29 articles scientifiques de rang A, 3 chapitres
d’ouvrages, 10 présentations à des congrès nationaux et 28 présentations à des congrès
internationaux (co-organisateur d’un congrès international).