MEDIOS DE CULTIVOSLos componentes de los medios de cultivo son de naturaleza química, desempeñan un rol esencial en los procesosporque requerimientos del crecimiento formación de productos suministrar energía para la síntesis de metabolitos y mantenimiento celular.

CAROLINA VITA

Diseño y optimizaciónDiseño y optimización de medios de cultivo de medios de cultivo

OptimizaciónOptimización de la expresión de la expresión celular:celular:

Producción de algún producto Producción de algún producto Aumento de producción de biomasa Aumento de producción de biomasa Mejorar la velocidad o rendimiento Mejorar la velocidad o rendimiento

de algún productode algún producto

Efectores que intervienen en el Efectores que intervienen en el crecimiento y formación de crecimiento y formación de

productosproductosEfectores intracelulares : Efectores intracelulares :

información genética que posee el información genética que posee el MO.MO.

Puede ser modificada por el agregado o Puede ser modificada por el agregado o extracción de genes.extracción de genes.

Efectores extracelularesEfectores extracelulares son los son los factores del entorno que pueden factores del entorno que pueden modificar la expresión:modificar la expresión:

físicosfísicos y y químicosquímicos

Efectores extracelularesEfectores extracelulares FisicoquímicosFisicoquímicos

Relacionados con las Relacionados con las

características del sistema de cultivocaracterísticas del sistema de cultivo

AgitaciónAgitación AeraciónAeración formación de formación de

espumaespuma nutrientes del nutrientes del

medio de cultivomedio de cultivo

pHpH presión osmóticapresión osmótica estado redoxestado redox parámetros físicos parámetros físicos

como T y Pcomo T y P

Categorias de nutrientesCategorias de nutrientes

Macronutrientes [ g/l ]Representados por: fuentes de C, N, S, P, K y

Mg; Micronutrientes o elementos trazas

[mg/l o µg/l]Representados por: sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn

y Co Factores de crecimiento componentes orgánicos suministrados en [] no son sintetizados ni metabolizados por las

células, son incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas, aa, ácidos grasos no saturados, etc..

Clasificacion de mediosClasificacion de medios

Por naturaleza química de los componentes,

1. medios sintéticos o medios químicamente definidos

2. medios complejos en cuya composición son sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc.químicamente indefinidas y de composición variable.

Diseño

Finalidad: elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos

Debe tener en cuenta:

los requerimientos nutricionales del MO la disponibilidad real de los

componentes

Requerimientos nutricionales

Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular

Autotrófico: MO que obtienen el carbono del C02 (algas y algunas bacterias)

heterotróficos: necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono

Otro factor esencial es el 02( aerobico o anaerobico)

Las fuentes de carbono cumplen también el rol de

ser fuente de energía.

Requerimientos nutricionales

Fuentes de nitrógeno

De naturaleza inorgánica u orgánica.

Es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular.

Requerimientos nutricionales

otros macronutrientes como el P y el S son suministradosen forma de P04 H y S04 (o aminoácidos azufrados).

El P se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares.

El S es asimilado para la síntesis de aa azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.

Requerimientos nutricionales

K y Mg son esenciales

Una parte importante del K está unida al RNA El ión K actua como coenzima y

probablemente actúa como catión en la estructura aniónica de varios componentes celulares.

El ión Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo.

K y Mg se incorporan como sales de fosfato y sulfato.

Requerimientos nutricionales

los micronutrientes se distinguen 2 categorías1. frecuentemente esenciales para el

crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b)

2. raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo,

Sn, e I. A veces es difícil demostrar un

requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en

suficiente cantidad como impureza de los componentes principales.

Disponibilidad de los componentes

Los nutrientes además de estar presentes Los nutrientes además de estar presentes en el medio de de cultivo, deben estar en el medio de de cultivo, deben estar disueltos disueltos para estar para estar disponiblesdisponibles para para ser usados por la célula.ser usados por la célula.

¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR ¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES?DISPONIBLES?

la esterilización por calor. Se debe tener la esterilización por calor. Se debe tener en cuenta la T, tiempo de calentamiento, en cuenta la T, tiempo de calentamiento, pH del medio pH del medio

reacciones entre componentes antes, reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilizacióndurante o después de la esterilización

Disponibilidad de los componentes

Es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgánicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y

el ion metálico considerado

Importante: [ ] libre del ión

Modificación de la calidad nutricional de un medio de

cultivo durante la esterilización

Los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes

A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.

Modificación de la calidad nutricional del medio por la

esterilización Los aa y factores de crecimiento son muy

lábiles al calor. puede sufrir descomposición.

se recomienda esterilizarlas por filtración. Las sales de NH4 + se deben autoclavar a

pH 7 o menor se volatiliza.

La esterilizacion por calor depende también de la T, duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación.

Los Los HPO4HPO4 utilizados como fuente de P y buffer utilizados como fuente de P y buffer deben esterilizarse separados de las sales dedeben esterilizarse separados de las sales de Mg, con Na, K y NH4Mg, con Na, K y NH4

NaMgPO4NaMgPO4NH4MgPO4NH4MgPO4 poseen baja poseen baja

solubilidadsolubilidad KMgPO4KMgPO4

Los PO4 deben esterilizarse Los PO4 deben esterilizarse separadamenteseparadamente

de las sales de Mg y NH4de las sales de Mg y NH4

Los Los azúcaresazúcares pueden descomponerse por la pueden descomponerse por la acción del calor en presencia de sales acción del calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos.inorgánicas y compuestos amínicos.

sales, H+sales, H+sacarosa sacarosa hidrolizahidroliza

Los grupos Los grupos carbonilos de los azúcarescarbonilos de los azúcares con los con los grupos amino de las proteínasgrupos amino de las proteínas, aminoácidos, , aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible.carbohidratos y N amínico disponible.

azúcares reductores + -NH2azúcares reductores + -NH2 condensacióncondensación

Los Los carbohidratos se deben esterilizar por carbohidratos se deben esterilizar por separado de los compuestos nitrogenados separado de los compuestos nitrogenados

orgánicos.orgánicos.

Disponibilidad de los Disponibilidad de los nutrientesnutrientes

Es aconsejable entonces, esterilizar los Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en componentes de los medios de cultivo en fracciones separadasfracciones separadas::

Fracción 1Fracción 1: : Fte. de C, micronutrientes, salesFte. de C, micronutrientes, sales de Mg, de Mg, Ca, etc.Ca, etc.

Fracción 2:Fracción 2: Fte. de NFte. de N en caso que se en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtración, o en caso de que reaccione con la por filtración, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente.separadamente.

Fracción 3:Fracción 3: Vitaminas y factores de crecimientoVitaminas y factores de crecimiento. . Se Se preparan soluciones 1000 veces mas preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtración.concentradas y se esterilizan por filtración.

Fracción 4Fracción 4: : Fosfatos,Fosfatos, se esterilizan por calor. se esterilizan por calor.

Materias primas fundamentales

Los componentes empleados en la industrias:

costo disponibilidadestabilidad en su composición químicael costo de los nutrientes representa

entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación

Materias primas fundamentales

Las fuentes de carbono pueden 1. Hidratos de carbono como glucosa o

dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina;

2.Alcoholes como el glicerol y manitol3. Hidrocarburos como hexadecano,

octadecano y otros.

Materias primas fundamentales

Las fuentes de nitrógeno Inorgánica: amoníaco o sales de amonio. Las orgánicas están representadas por

varios productos, como ser:1. Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que

son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol,etc..

Materias primas fundamentales

2. Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior

3. Extracto de levadura, que puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura,

4. Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada

5. "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del maíz se utiliza como componente esencial de los medios para la producción de antibióticos y enzimas.

Diseño, Formulación, Diseño, Formulación, Optimización de medios de Optimización de medios de

cultivocultivo DiseñoDiseño: Elección de los componentes : Elección de los componentes

necesarios para lograr el crecimiento y la necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productosformación de productos

FormulaciónFormulación: Proporciones, : Proporciones, concentraciones de cada componente.concentraciones de cada componente.

OptimizaciónOptimización: Encontrar la mejor : Encontrar la mejor formulación para lograr el objetivo (máx formulación para lograr el objetivo (máx biomasa, producto, etc.)biomasa, producto, etc.)

Formulación

La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios

establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas.

Optimización

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los medios de cultivo.

Podemos mencionar las siguientes:1. Existencia de limitaciones nutricionales ocultas

(microelementos y factores de crecimiento)2. Uso de medios con exceso respecto de los

requerimientos nutricionales del mo que pueden causar inhibición del crecimiento.

3. Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.

4. Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.

Optimización

La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se varía la [] del componente a ensayar manteniéndose constante las [] de los demás.

Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados.

se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la [] de biomasa obtenida.