Medicina Legal

LA INVESTIGACIN BIOLGICA DE LA PATERNIDAD

Gloria Vallejo de TorresInstituto de Toxicologa y de Ciencias Forenses. Departamento de Madrid

NDICE: 1. INTRODUCCIN: Bases mdico legales. 2. APLICACIONES DE LA INVESTIGACIN BIOLGICA DE LA PATERNIDAD EN LA PERICIA FORENSE. 3. REQUISITOS PARA LA TOMA DE MUESTRAS EN LAS ACCIONES DE FILIACIN. 4. MARCADORES GENTICOS UTILIZADOS EN LAS ACCIONES DE FILIACIN. 4.1. Los polimorfismos de ADN 4.2. Los polimorfismos de VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) mediante la hibridacin con sondas UniLocus (SLP). 4.3. Los polimorfismos de STR (Short Tandem Repeats) por tcnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction). 5. VALORACIN DE LA PRUEBA BIOLGICA. 5.1. Exclusin de paternidad. 5.2. No exclusin de paternidad. 5.3. Mutaciones o inconsistencias genticas. 6. VALORACIN ESTADSTICA: TEOREMA DE BAYES Y PARMETROS ESTADSTICOS. 6.1. La probabilidad de paternidad. 6.2. ndice de paternidad. 6.3. Probabilidad de exclusin a priori. 7. AVUNCULAR INDEX O INDICE FAMILIAR. 8. LA POBLACIN DE REFERENCIA EN LA INVESTIGACIN DE PATERNIDAD. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

1. INTRODUCCIN: BASES

MEDICO-LEGALES

El gran desarrollo de la tecnologa del ADN en las ltimas dos dcadas ha proporcionado a las Ciencias Forenses grandes xitos en el terreno de la identificacin gentica humana. Es indiscutible que la Investigacin Biolgica de la Paternidad (IBP), prueba clsica para todos los laboratorios de Gentica Forense, ha experimentado indiscutibles progresos, satisfaciendo cada vez ms y mejor las necesidades de nuestra compleja sociedad. Las bases legales de la determinacin legal de la filiacin ante los tribunales o impugnacin de la filiacin legalmente determinada ante ellos, tienen su desarrollo en nuestro Cdigo Civil, que se sustenta en nuestra Constitucin, as como en la reciente Ley de Enjuiciamiento Civil 1/2002. 3966


El laboratorio de Biologa del Instituto Nacional de Toxicologa y de Ciencias Forenses, desde la modificacin del Cdigo Civil en 1981 viene realizando de forma rutinaria este tipo de investigaciones, pudiendo considerar por tanto a este Centro, como uno de los laboratorios del territorio espaol con ms experiencia en este campo. El Cdigo Civil hasta 1981 impeda el reconocimiento de los hijos extramatrimoniales, y la impugnacin de la paternidad slo se poda hacer en casos excepcionales y regulados con extraordinaria rigidez. Sin embargo, los derechos forales cataln y navarro reconocan la investigacin libre de la paternidad mediante todo tipo de pruebas. En el terreno de la filiacin, como en cualquier otro, el Derecho no debe servir ms que a la justicia, y si sta quiere evitar juicios oscuros y sentencias injustas, debe apoyarse en los datos que la ciencia le brinda en su momento presente. Hoy da, el Cdigo Civil, tras la reforma de la ley de 13 de mayo de 1981, en su nueva redaccin trata por igual al hombre y a la mujer, y en ambos casos contrae el compromiso de buscar la verdad biolgica. El Cdigo Civil espaol sigue una redaccin similar a los nuevos cdigos latinos (francs e italiano), es decir, de predominio del reconocimiento sobre la verdad biolgica demostrada por cualquier medio de prueba. El Cdigo Civil en sus artculos 127 a 130 da una serie de normas relativas a las acciones de filiacin, las cuales desarrollan l articulo 39,2., de la Constitucin donde establece: 1. Los poderes pblicos aseguran la proteccin social, econmica y jurdica de la familia. 2. Los poderes pblicos aseguran, asimismo, la proteccin integral de los hijos, iguales stos ante la ley con independencia de su filiacin y de las madres, cualesquiera que sea su estado civil. La Ley posibilitar la investigacin de la paternidad. El artculo 127 del Cdigo Civil dice textualmente: En los juicios sobre filiacin ser admisible la investigacin de la paternidad y de la maternidad, mediante toda clase de pruebas, incluidas las biolgicas. El juez no admitir la demanda si con ella no se presenta un principio de prueba de los hechos en que se funde. La admisibilidad de la investigacin de la paternidad o maternidad alcanza tanto a la filiacin matrimonial como a la no matrimonial. 3967

GLORIA VALLEJO DE TORRES

El artculo 129 establece que las acciones que correspondan al hijo menor de edad o incapaz podrn ser ejercitadas indistintamente por su representante legal o por el Ministerio Fiscal. El artculo 130 dispone que a la muerte del actor sus herederos podrn continuar las acciones ya entabladas. Los procesos de filiacin, paternidad y maternidad se sustanciarn por los trmites del juicio verbal, segn prev el articulo 753, captulo I, Ttulo I del libro IV de los procesos especiales de la Ley de Enjuiciamiento Civil 1/2002 (LEC). El artculo 767.4 de la LEC establece que la negativa injustificada a someterse a la prueba biolgica de paternidad o maternidad permitir al tribunal declarar la filiacin reclamada, siempre que existan otros indicios de la paternidad o maternidad y la prueba de sta no se haya obtenido por otros medios. El presente articulo ha recogido como norma lo que la jurisprudencia dada por el Tribunal Constitucional con fecha de 19 de enero de 1994 ya consider, entendiendo que debe prevalecer el derecho a la investigacin de la verdad biolgica para el nio y la madre sobre los derechos a la intimidad y el honor del presunto padre.

2. APLICACIONES

DE LA INVESTIGACIN BIOLGICA DE LA PATERNIDAD EN LA PERICIA FORENSE

Entendiendo como investigacin biolgica de la paternidad (IBP), una serie de pruebas biolgicas destinadas a realizar una identificacin, podemos clasificar estas investigaciones en: 2.1 Acciones de filiacin. El propsito de la prueba biolgica es realizar la identificacin de uno de los progenitores (demostrar la paternidad y/o la maternidad). El estudio de filiacin se podr realizar: 2.1.1 hijo. Estudiando al presunto padre, madre biolgica y supuesto

2.1.2 Estudiando al presunto padre y al supuesto hijo. La madre biolgica est ausente (fallecida, declarada en rebelda, etc.). 2.1.3 Casos especiales: el presunto padre est fallecido. Las posibilidades de estudio se pueden clasificar de la siguiente manera. 3968


2.1.3.1 Anlisis de IBP mediante el estudio de sus familiares directos, por orden de preferencia comentamos las distintas posibilidades: Estudiando a los abuelos paternos, madre biolgica y supuesto hijo: en este caso determinaremos si uno de los posibles hijos varones de esa pareja podra ser el padre biolgico del supuesto hijo. Estudiando a la madre e hijos legales (dos o ms) del presunto padre fallecido, la madre biolgica y el supuesto hijo: en este anlisis se tratar de deducir el genotipo del padre legal, para establecer o no, a continuacin su compatibilidad gentica con el hijo biolgico. Estudiando a los hermanos legales (dos o ms) del presunto padre fallecido, la madre biolgica y el supuesto hijo: en este supuesto trataremos de deducir el patrimonio gentico de los padres biolgicos del fallecido (abuelos), para posteriormente determinar si uno de sus posibles hijos es compatible con la paternidad biolgica del hijo en litigio. Es importante comentar que en los supuestos anteriormente expuestos no se puede realizar la identificacin directa del presunto progenitor fallecido, solo podremos inferir si los padres del fallecido o el progenitor de los hijos legales del fallecido pueden tener descendencia con compatibilidad gentica para la paternidad cuestionada. El grado de fiabilidad de la prueba vendr determinado por el n de marcadores, que en el anlisis de sus familiares directos, nos permita deducir los posibles alelos paternos. La experiencia de nuestro laboratorio en este tipo de pruebas es altamente positiva, debido al gran nmero de marcadores genticos de que dispone. 2.1.3.2 Estudiando los restos seos (huesos largos, piezas dentales) del presunto padre fallecido, procedentes de su exhumacin, la madre biolgica y el supuesto hijo. 2.1.3.3 Estudiando muestras clnicas (tejidos de biopsias) que pudieran existir en centros mdicos o muestras del entorno familiar (sobres, sellos, maquinillas de afeitar, etc.) pertenecientes al presunto padre fallecido, la madre biolgica y el supuesto hijo. 2.1.4 Investigacin biolgica con restos fetales o investigacin prenatal de la paternidad El propsito de la prueba es identificar a los padres biolgicos (paternidad y/o maternidad) o bien identificar al sospechoso de una violacin. 2.1.4.1 Estudiando los restos fetales procedentes de abortos o infanticidios y supuestos padres biolgicos. 3969


2.1.4.2 Estudiando el liquido amnitico o los restos fetales procedentes del aborto, madre biolgica y al sospechoso de la violacin. 2.2 Identificacin de restos cadavricos. La identificacin de los restos cadavricos procedentes de los accidentes de trafico, grandes catstrofes, personas desaparecidas, etc. constituye un tipo de anlisis muy solicitado en el laboratorio de Biologa forense desde que se incorporaron las tcnicas del ADN a la pericia forense. Los estudios de IBP as como los estudios de parentesco mediante el anlisis de ADN mitocondrial (ADNmt) y/o los marcadores STRs del Cromosoma Y, sern las herramientas necesarias para resolver estas identificaciones. Se estudiaran la sangre, msculo, huesos, o piezas dentales del fallecido y a sus familiares, bien a sus padres biolgicos (paternidad y/o maternidad) o a sus hijos biolgicos (paternidad reversa) en el caso de que se practiquen estudios de IBP o bien a los familiares que mantengan la lnea materna (ADNmt) o lnea paterna (STRs de cromosoma Y) en el caso de los estudios de parentesco.

3. REQUISITOS

PARA LA TOMA DE MUESTRAS EN LAS ACCIONES DE FILIACIN

Los laboratorios de Gentica Forense consideran que, la toma de muestras para proceder al estudio de una IBP, es el inicio de la prueba pericial en la cual se deben cumplir algunos requisitos fundamentales sin los cuales la prueba podra carecer de valor ante los tribunales, bien por defecto de forma o por posibles errores cientfico-tcnicos que la invalidaran. A continuacin los enumeramos y desarrollamos de forma muy resumida. 1. Tipos de muestras. Las muestras biolgicas para estudio sern por orden de preferencia: Sangre, clulas del epitelio bucal o pelo, siempre que esto sea posible, pudiendo analizar cualquier otra muestra si fuese necesario (restos fetales, msculos, restos seos, piezas dentales). Se puede practicar la toma de muestras en el Centro previa citacin, o bien ser remitida desde el juzgado solicitante. Se realizar una extraccin venosa de 3-5 ml de sangre con EDTA como anticoagulante a cada una de las personas interesadas. La muestra de clulas del epitelio bucal se realizar con barrido o cepillado en 3970


forma circular por la parte interior de las mejillas con hisopos de algodn estriles. La toma de pelos (de 15-20 cabellos arrancados con raz) ser realizada mediante pinzas y durante la manipulacin se usaran guantes, que introduciremos en una bolsa o sobre de papel que ser cerrado y/o precintado. Los restos seos se limpiaran de putrlago, se seleccionar si es posible un hueso largo, preferiblemente un fmur. La toma de piezas dentales, si es posible al menos 4 molares, seleccionando aquellos que estn bien conservados. 2. Identificacin y verificacin de las personas que participan en la prueba y etiquetado de las muestras.

La identificacin de las personas citadas para la realizacin de la prueba se realizara bien por el personal del juzgado solicitante o bien en nuestro Centro, comprobando su documentacin y registrando su huella dactilar. Los tubos o botes contenedores de las muestras biolgicas estarn perfectamente etiquetadas, anotando las iniciales de los interesados, haciendo referencia al nmero de caso ( Juicio Verbal o n interno del centro), tipo de parentesco (presunto padre, madre, hijo, etc.) y quedarn perfectamente precintadas para evitar su vertido durante el transporte y/o almacenaje. El envo debe ser lo ms rpido posible para evitar el envejecimiento de las muestras y en condiciones de refrigeracin. 3. Cadena de custodia.

Se establecer un sistema de cadena de custodia desde el inicio de la toma de muestras, durante su trasporte si procede, as como todo el tiempo que dure el anlisis en el laboratorio e incluso despus del mismo, comunicando al juzgado solicitante, las caractersticas de la conservacin de las muestras biolgicas (tiempo de almacenaje de la muestra biolgicas y/o de sus extractos de ADN, as como la temperatura de conservacin y personas que manipulan o intervienen en el anlisis) incluso despus de haber finalizado el estudio. 4. Consentimiento informado.

La toma de muestra de todas las personas involucradas en el proceso (presunto padre, madre, hijo u otros familiares) debe hacerse con autorizacin judicial y tras el consentimiento informado de todas ellas, por 3971


lo tanto deber existir autorizacin expresa de la persona que cede la muestra biolgica para la realizacin de la prueba gentica. 5. Formulario de envo de muestras.

Antes de iniciar el anlisis se deben conocer algunas cuestiones que constarn en el formulario de recogida de muestras, a continuacin se comentan: La procedencia geogrfica de las personas objeto de estudio para determinar que poblacin de referencia se debe utilizar en el calculo estadstico de la probabilidad de paternidad. La existencia de ciertas relaciones de parentesco entre los individuos implicados en la prueba, este hecho obligara a la introduccin de un coeficiente de consanguinidad en la valoracin estadstica, ya que el vnculo familiar hace que se compartan alelos entre los individuos relacionados genticamente. As mismo se deben conocerse algunas cuestiones clnicas como: Existencia de transfusiones sanguneas recientes o transplantes. En caso afirmativo la muestra de eleccin seria toma de clulas del epitelio bucal. Antecedentes patolgicos familiares y/o personales, que pueden estar asociados a procesos de inestabilidad somtica.

4. LOS

POLIMORFISMOS DE ACCIONES DE FILIACIN

ADN: MARCADORES

GENTICOS UTILIZADOS EN LAS

Los marcadores genticos que utilizamos actualmente en las IBP estn constituidos por determinadas regiones del ADN Repetitivo que presentan una gran variabilidad de tamao entre los distintos individuos de una poblacin. Nuestro laboratorio fue introduciendo en las investigaciones de paternidad primero el estudio de las regiones Minisatlite o VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) descritos por Jeffreys et al en 1985 (1,2) y posteriormente las regiones Microsatlite o STRs (Short Tandem repeats) (3). El principio bsico de los polimorfismos genticos de estas regiones reside en la variacin del nmero de veces que se repite en tandem una secuencia determinada, de 9-80 pares de bases en el caso de VNTRs y de 1-7 pares de bases en el caso de STRs. 3972


Estas regiones hipervariables pertenecen al denominado ADN no codificante, son regiones no conservadas y por tanto no sujetas a una presin selectiva intensa, sufriendo una gran variacin en el nmero de repeticiones de su secuencia, originando un gran nmero de variantes, que denominamos alelos, con un tamao de 400 20.000 pares de bases para los polimorfismos VNTRs y para los polimorfismos STRs de 100 400 pares de bases generalmente. Su gran variabilidad permite que estas regiones sean de gran utilidad en los anlisis de identificacin gentica (4). Los polimorfismos VNTRs y STRs renen todas las condiciones que se exige a un marcador gentico para ser utilizado en las IBP. Se trata, en efecto, de: Marcadores con una herencia mendeliana simple. Objetivos, discontinuos y no influenciados por causas externas. Con ubicacin cromosmica establecida. Frecuencias de aparicin ptimas para la finalidad perseguida. Adems se deben determinar algunos aspectos antes de ser utilizados en la pericia forense. La distribucin de alelos en la poblacin (equilibrio HardyWeinberg). Establecer la existencia o no de ligamento con otros loci. La constatacin de ligamento entre dos loci impide el uso conjunto de ambos como marcadores genticos en estudios forenses. Comprobar su estabilidad somtica y germinal, as como conocer la tasa de mutacin. Valoracin de la tasa de heterocigosidad de cada locus utilizado. Para su determinacin no es necesario ms que una pequea porcin de muestra, clulas del epitelio bucal recogidas mediante hisopo de algodn o pequea cantidad de sangre (300-400 l). Esta caracterstica es otra de las grandes ventajas que ha proporcionado la tecnologa del ADN en los estudios de IBP, permitiendo que situaciones que tradicionalmente no hubiesen podido ser resueltas con los marcadores convencionales (Marcadores genticos eritrocitarios, Sistema HLA, Protenas Plasmticas y enzimas eritrocitarias), actualmente puedan ser realizadas en todos los laboratorios de gentica forense. La deteccin de una mutacin en un estudio de paternidad es uno de los sucesos que todo analista debe tener presente a la hora realizar la interpretacin de la prueba gentica y su valoracin final. Entendemos 3973


por mutacin como un cambio en el material gentico en un locus determinado, que en algunos casos puede ser detectada a causa de un cambio asociado a su accin. El mecanismo de produccin de las mutaciones no es bien conocido, aunque el ms aceptado de entre los muchos propuestos es el denominado stepwise mutation model que consiste en la perdida o ganancia de un nico o pequeo nmero de repeat (5). Brinkmann y colaboradores (6) han realizado una estima de la tasa de mutacin () de los polimorfismos STRs usados en las pruebas de paternidad, ofreciendo una media de para los loci STRs siempre inferior a 1 en 1000 meiosis. Se define la tasa de mutacin = 1/(meiosis/ mutacin). Parece un hecho comprobado, desde hace ya varios aos, que la tasa de mutacin es de 5 a 6 veces ms frecuente para la lnea germinal masculina que en la lnea germinal femenina (6, 7) tanto para los marcadores STRs como VNTRs.

4.1 Los polimorfismos de VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) mediante la hibridacin con sondas Uni-Locus (SLP). Aunque el propsito de esta ponencia no pretende entrar en aspectos metodolgicos y por lo tanto no describiremos las tcnicas utilizadas en el estudio de estos polimorfismos, si presentamos de forma esquemtica el mtodo analtico. Anlisis de los polimorfismos VNTRs reconocidos con sondas SLP: Digestin con enzimas de restriccin del ADN genmico. Los fragmentos de ADN generados se denominan Polimorfismos de Longitud de los Fragmentos de Restriccin (RFLP: restriction fragment length polymorphisms) (8,9). Posterior separacin de los fragmentos generados mediante electroforesis en geles de agarosa, y transferidos por tcnicas de SouthernBlotting a membranas de nylon o nitrocelulosa (10, 11). Hibridacin con sondas uni-locus, mediante secuencias marcadas enzimaticamente y complementarias a las secuencias diana que se encuentran en los RFLP generados. La caracterizacin de una sonda UniLocus (sonda que reconoce un nico locus, de situacin cromosmica conocida, proporcionando un patrn compuesto por dos bandas como mximo), es un requisito imprescindible para su utilizacin en el campo 3974


forense, y debe indicarse el enzima de restriccin utilizado, para el cual el locus es polimrfico. Anlisis de los perfiles de ADN y estimacin de frecuencias en SLP. Con el uso de sistemas de anlisis de imagen determinamos el tamao de los fragmentos obtenidos y asignamos sus frecuencias a partir de las bases de datos poblacionales establecidas (7,12,13,14).

Esquema del anlisis de polimorfismos VNTRs mediante hibridacin con SLP

La utilizacin de los polimorfismos VNTRs mediante la hibridacin con sondas SLP es una de las alternativas de las que dispone el laboratorio de Biologa del INT de Madrid. El mantenimiento de esta tcnica esta justificada a pesar de su complejidad y alto coste, debido al gran polimorfismo que estos marcadores presentan, lo que les permite conseguir un gran Poder de exclusin a Priori (CE), siendo esta caracterstica de especial utilidad en las IBP ms complejas, como son aquellas investigaciones donde el presunto padre est fallecido y el estudio se realiza a travs de sus familiares directos. Los polimorfismos VNTRs presentan una alta heterocigosidad (parmetro que viene definido por el nmero de individuos heterocigotos observados respecto al total analizado). Su gran heterocigosidad es una medida simple de la variacin gentica en una poblacin, y es indicativo de la cuanta del polimorfismo y de la eficacia de cada marcador gentico (15, 16). La tasa de mutacin que presentan estos marcadores es variable, siendo despreciable para algunos de ellos y demasiado alta para otros (hasta un 5% en el caso de la sonda MS1), por tanto debe ser tenida en cuenta cuando se utilicen en las IBP. Loci tan hipervariables como son los VNTR presentan tasas de mutacin altas, debido a que una de las medidas de la variabilidad es la propia tasa de mutacin. Su aparicin en una IBP conducira a una aparente situacin de exclusin, pero ante una exclusin puntual solo cabe la conducta prudente de su valoracin, calculando la 3975


probabilidad de paternidad, prescindiendo del sistema incompatible en el clculo o bien incluyendo el sistema incompatible con un factor de correccin de mutacin. Sin duda esta caracterstica es uno de los principales inconvenientes que poseen estos polimorfismos. Debemos resaltar que la gran limitacin de la tcnica de anlisis de los polimorfismos VNTRs mediante hibridacin con sondas es la necesidad de obtener grandes cantidades de ADN (aproximadamente 200 nanogramos) de alto peso molecular, por tanto aquellas pericias donde las muestras se encuentren envejecidas (restos seos) y su ADN se presente muy degradado o bien aquellos casos donde la concentracin de ADN sea muy baja, ser imprescindible utilizar la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).Tabla 1: los principales polimorfismos VNTRs mediante tcnicas de hibridacin con sondas uni-locus que son utilizados habitualmente en nuestro laboratorio. Se indica la localizacin cromosmica del locus identificado, las sondas utilizadas para su reconocimiento, la heterocigosidad y la tasa de mutacin observada.ZONA SONDA HETEROCIGOSIDAD % TASA MUTACIN %

D1S7 D7S21 D12S11 D5S43 D16S309 D7S22 D2S44 PROBABILIDAD

MS1 94.6 5.2 MS31 92.6 0.7 MS43A 90.0 No observada MS8 77.5 No observada MS205 94.3 0.4 G3 91.7 0.3 99.99%

4.2

Los Polimorfismos STRs (Short Tandem Repeats) Mediante Tcnicas De Amplificacin Gnica PCR (Polymerase Chan Reaction).

Los polimorfismos STRs son analizados mediante tcnicas de PCR y estn ampliamente introducidos en los laboratorios de gentica forense debido a las grandes ventajas que poseen frente a los polimorfismos VNTRs, ya que, son susceptibles de ser analizados a partir de muestras con muy pequeas cantidades de ADN y con restos de ADN de baja calidad (restos seos envejecidos), la gran precisin en la caracterizacin del tamao de los alelos de marcadores STRs y la rapidez de la tcnica son las principales caractersticas por las cuales son los marcadores de eleccin en el campo de la identificacin gentica humana. 3976


Los STRs tetramricos autosmicos utilizados en el campo forense y considerados de gran utilidad en las IBP, poseen un ncleo de repeticin de cuatro nucletidos, sus productos de amplificacin mediante la PCR son muy reproducibles y de fcil interpretacin presentando grandes ventajas respecto los STRs di o trinucleotidos. Los STRs tetramricos del cromosoma Y, son marcadores introducidos posteriormente pero ampliamente validados en el campo forense (17). El cromosoma Y est constituido por secuencias polimorficas altamente repetitivas , situadas principalmente en la porcin heterocromtica del brazo largo del cromosoma. La mayor parte del cromosoma no se recombina durante la meiosis, y la falta de recombinacin determina que todas las secuencias situadas en esta zona se hereden como un bloque, constituyendo un haplotipo, que es trasmitido de padres a hijos a travs de generaciones. Por tanto estos polimorfismos contienen informacin acerca de la historia del linaje paterno (18). El anlisis de los marcadores STRs de cromosoma Y constituyen una ayuda excepcional en las investigaciones de paternidad y en especial en aquellos casos donde el presunto padre este fallecido, teniendo que recurrir al estudio de sus familiares cercanos y/o estudios de linaje (19). Describimos a continuacin de forma simplificada la reaccin en cadena de la Polimerasa PCR, tcnica automatizada de amplificacin gnica que genera con gran rapidez un elevado nmero de copias de la secuencia especfica de ADN que es objeto de estudio. La reaccin de la PCR consiste en la repeticin de un ciclo de temperaturas compuesto de tres etapas cuyo objetivo es sintetizar ADN in vitro: En la primera etapa se desnaturaliza la doble cadena de ADN a ms de 90 C. En la segunda etapa se baja la temperatura y se consigue el anillamiento de los fragmentos de ADN unicatenarios o primers, de secuencia complementaria a las regiones que flanquean la regin de inters que nos interesa amplificar. En la tercera etapa se produce la reaccin de extensin, gracias a la accin de una ADN polimerasa termoestable, cuando alcanza la temperatura optima. Al finalizar los 30-32 ciclos que generalmente constituyen esta reaccin se alcanzan grandes cantidades de ADN de la regin que nos interesa analizar. 3977


El inicio del estudio de los marcadores STRs mediante la tcnica de PCR requera de un anlisis individual para cada marcador gentico, mediante reacciones simples de amplificacin, actualmente se amplifican de forma simultanea hasta 15 loci en una misma reaccin de amplificacin denominndose entonces reacciones de PCR multiplex, gracias al marcaje de los primers con fluorocromos que emiten seal a una longitud de onda determinada. Los productos amplificados, ya marcados y bajo condiciones desnaturalizantes, sern separados de acuerdo a su tamao con una gran resolucin (diferenciacin de una nica base de tamao) y detectados con un sistema de laser incorporado a sistemas semiautomticos (secuenciadores) de electroforesis capilar o mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. La posterior asignacin de los alelos se realizara mediante un anlisis automatizado con la utilizacin de programas informticos que transformaran las seales detectadas (producidas por los fragmentos marcados) y separadas en funcin de su movilidad (dependiente de su tamao) y comparadas automticamente con un estandar interno (ladder de tamao conocida) marcado con un fluorocromo diferente a los utilizados en los fragmentos amplificados. Las principales caractersticas que los marcadores STRs deben poseer para ser incluidas en reacciones PCR Multiplex de aplicacin en el campo forense son: Alto poder de exclusin a Priori, generalmente > 90% Heterocigosidad observada >70% Resultados precisos y reproducibles en las reacciones de PCR Multiplex Baja tasa de mutacin Localizacin cromosmica de los marcadores sin ligamiento entre sus locis Bandas stutter bajas En nuestro laboratorio disponemos de los siguientes Kits comerciales de amplificacin PCR multiplex que ofrecen un gran poder individualizador y por tanto permiten que las investigaciones de paternidad pueden ser resueltas con un gran margen de confianza o dicho de otra manera una Probabilidad de Exclusin a Priori muy elevada. Sistemas desarrollados por PE Applied Biosystem: Proffiler Plus, Cofiler e Identifiler. 3978


Sistema desarrollado por Promega Corporation: PowerPlex 16 System. Todos estos sistemas incluyen marcadores STRs autosmicos y un fragmento de amelogenina para diagnostico de sexo. Sistema desarrollado por Promega Corporation: PowerPlex Y System. Incluye marcadores STRs del Cromosoma Y localizados en la regin no recombinante.Tabla 2: Caractersticas de los marcadores STRs incluidos en los Kits de amplificacin PCR multiplex, Proffiler Plus, Cofiler, Identifiler y PowerPlex 16 System. Se indica la localizacin cromosomica, la Probabilidad de Exclusin a Priori (CE) y tasa de mutacin (20).LOCALIZACIN CROMOSMICA Tasa de Mutacin % Materna - Paterna

LOCUS

KIT AMPLIFICACIN

CE *

D3S1358 vWA FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 THO1 TPOX CSF1PO Penta E Penta D D2S1338 D19S433 Amelogenina

Profiler Plus, Cofiler, Identifiler, Power 0.5892 Plex 16 12p12-pter Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.6405 4q28 Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.7253 8 Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.6382 21 Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.6939 18q21.3 Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.7421 5q23.3-32 Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.4593 13q22-31 Profiler Plus, Identifiler, Power Plex 16 0.5840 Profiler Plus, Cofiler, Identifiler, Power 7q11.21-22 0.6128 Plex 16 16q24-qter Cofiler, Identifiler, Power Plex 16 0.5442 11p15.5 Cofiler, Identifiler, Power Plex 16 0.5882 2p23-2pter Cofiler, Identifiler, Power Plex 16 0.3740 5q33.3-34 Cofiler, Identifiler, Power Plex 16 0.4487 15q Power Plex 16 0.7719 21q Power Plex 16 0.6826 2q35-37.1 Identifiler 0.7447 19q12-13.1 Identifiler 0.6224 Profiler Plus, Cofiler, Identifiler, Power No X:p22.1-22.3 / P:11.2 Plex 16 aplicable Probabilidad de Exclusin a Priori (CE total) = 0.999999956 * valores obtenidos de la base de datos del INTCF de Madrid. 3p

0.03-0.15 0.03-0.32 0.05-0.29 0.03-0.0.20 0.11-0.15 0.06-0.20 0.02-0.14 0.05-0.15 0.02-0.13 0.02-0.11 0.01-0.01 0.01-0.02 0.02-0.14 0.02-0.12 0 - 0.02 No aplicable

3979


Tabla 3: Caractersticas de los marcadores Y-STRs incluidos en el Kits de amplificacin PCR PowerPlex Y System. Se indica la localizacin cromosmica, la secuencia de su repeat y diversidad gnica (21, 22).LOCUS LOCALIZACIN CROMOSMICA SECUENCIA REPEAT 5-3 DIVERSIDAD GNICA (%)

DYS391 DYS389I/II DYS439 DYS393 DYS390 DYS385a/b DYS438 DYS437 DYS19 DYS392

Yq TCTA Yq (TCTG)(TCTA) Complex Yq GATA Yq AGAT Yq (TCTG)(TCTA) Complex Yq GAAA Yq TTTTC Yq (TCTG)(TCTA) Complex Yq TAGA Complex Yq TAT Diversidad del haplotipo observada >0.9981 (0.0021)

56,10 65,54 65,54 46,25 60,64 83,98 58,86 57,43 56,26 56,46

Valores obtenidos de la base de datos del INTCF de Madrid

5. VALORACIN

DE LA PRUEBA BIOLGICA

Una vez concluido el estudio gentico a las personas interesadas se compararn los perfiles genticos de la madre y del hijo con el del presunto padre, basndonos en la transmisin mendeliana simple de los caracteres genticos, segn la cual los caracteres observados en el hijo que no procedan de la madre, forzosamente debern provenir del padre biolgico. Comprobaremos si se produce la compatibilidad gentica o no entre el posible progenitor y el hijo. Tras esta valoracin podremos establecer dos tipos de conclusiones, segn Las Normas para la aplicacin de polimorfismos genticos (ADN) a las pericias mdico-legales recogidas por los laboratorios de biologa forense que integran el Grupo Espaol Portugus de la Sociedad Internacional de Gentica Forense (GEP-ISFG) y por las recomendaciones de la American Association of Blood Banks (AABB) en 1991 y adems exponemos otra alternativa a la conclusin denominada no exclusin de paternidad donde se recoge la posibilidad de introducir en el calculo de la paternidad las inconsistencias genticas halladas en el estudio gentico. 3980


5.1

Exclusin de paternidad.

Comprobamos en el hijo la presencia de un alelo que no posee el presunto padre ni la madre. Existen dos reglas fundamentales que determinan dos tipos de exclusiones. 1.1 La primera regla de Landsteiner o exclusin directa: establece que todo carcter presente en el hijo que no lo posea la madre, debe forzosamente proceder de su padre biolgico. Si el supuesto padre no lo posee, se produce la exclusin de primer orden. 1.2 La segunda regla de Landsteiner o exclusin indirecta: el hijo y el padre son homocigotos para un alelo distinto en un mismo locus. Si esto sucede se produce la exclusin de segundo orden, denominada as porque es menos categrica que la anterior. En este caso se debe tener en cuenta la posibilidad de que existan alelos silentes, mutaciones o alelos presentes pero no identificados. Si en la prueba biolgica se obtiene una nica exclusin (para un solo marcador gentico) por la primera regla de Landsteiner o dos exclusiones por la segunda regla, se debe calcular la probabilidad de paternidad, sin tener en cuenta los marcadores que han producido la exclusin, y adoptar entonces una conclusin global. En el supuesto de que el nmero de exclusiones sea mayor que el indicado anteriormente, la exclusin se considera como probada. 5.2 No exclusin de paternidad.

Comprobamos en el hijo como uno de los dos alelos procede de su madre y el otro puede proceder del presunto padre, para cada uno de los polimorfismos genticos analizados. Si no se han observado inconsistencias genticas hablaremos de resultados analticos con compatibilidad gentica entre el presunto padre y el hijo y ser obligatorio la evaluacin estadstica de los resultados, necesitando de un desarrollo probabilstico de paternidad. La comunicacin del peso de la evidencia gentica por parte del perito ante los tribunales es una de las tareas ms difciles que se plantean durante la prueba pericial. La valoracin estadstica y los parmetros bioestadsticos ms utilizados en las IBP sern posteriormente explicados. 3981


5.3

Mutaciones o inconsistencias genticas; su inclusin en la valoracin estadstica.

Los analistas podemos encontrar en las IBP resultados donde el presunto padre sea incompatible con el hijo cuestionado para un determinado marcador , excluyendo la paternidad si se comprueba este hecho por lo menos para otro marcador ms. Pero si tenemos presente que cada vez el nmero de marcadores que incluimos en las investigaciones de paternidad es mayor y si tomamos como posible la ocurrencia de eventos mutacionales en los marcadores estudiados, podremos hacer una estima de la probabilidad de ocurrencia de una nica mutacin en la lnea germinal paterna/materna. Thomson clculo que la probabilidad de ocurrencia de una mutacin era de 1%, estudiando 12 marcadores STRs y tomando como la estima realizada por Brikmann y col (6). Numerosos cientficos han tratado de establecer aproximaciones probabilsticas para responder a la paternidad cuestionada incluyendo la mutacin paterna observada. La frmula (mutation in Paternity) de Brenner Ch. H (23). Donde la frecuencia de prdida o ganancia de repeats en las mutaciones son igual de frecuentes con independencia del nmero de pasos. X/ Y = /4P(Q). P(Q) = Frecuencia del alelo que el hijo hereda por va paterna. La frmula propuesta por AABB calcula el ndice de Paternidad (IP) utilizando la correccin por mutacin mediante esta sencilla formula. X/ Y = /A. A = Probabilidad de Exclusin a Priori. Se han publicado diferentes valores de , siendo especialmente utilizadas las tasas de mutacin calculadas por Brikmann y col. (6) Y las publicadas por AABB. http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/ mutation.htm Por tanto, en determinadas situaciones, veremos adecuado que para el clculo de la paternidad se incluya el o los marcadores donde hemos observado inconsistencias genticas, la introduccin de factores de correccin por mutacin son cada vez ms recomendadas en las pericias de investigacin de paternidad, ya que el elevado nmero de marcadores estudiados (15 o ms loci) eleva considerablemente la probabilidad de produccin de mutaciones espontneas (24, 25, 26). 3982


6. VALORACIN

ESTADSTICA:

TEOREMA

DE

BAYES

Si tras la valoracin de la prueba de investigacin biolgica de paternidad IBP, concluimos que el presunto padre es compatible genticamente (conjunto de diferentes marcadores genticos analizados) con el hijo cuestionado, deberamos plantearnos si esta conclusin es categrica, es decir, el presunto padre es el nico hombre compatible genticamente con la paternidad de ese hijo o bien si en la poblacin de referencia, en nuestro caso la espaola, existen muchos o pocos individuos que tambin pueden ser denominados como compatibles genticamente para la paternidad planteada. Para resolver esta cuestin debemos recurrir al clculo bioestadistico de la paternidad mediante la aplicacin del TEOREMA DE BAYES. Este teorema es atribuido a un clrigo del siglo XVII, Thomas Bayes y es considerado como uno de los teoremas ms importantes de la estadstica y usado diariamente como teorema base del calculo estadstico de probabilidades que forma parte de los informes periciales emitidos en el rea de la gentica forense. El teorema de Bayes sirve para conocer las probabilidades finales de un suceso a partir de las probabilidades iniciales, dada cierta informacin o informaciones adicionales obtenidas. Generalmente en las IBP se plantean dos hiptesis mutuamente excluyentes, la hiptesis acusadora (la madre M alega que el presunto padre PP es el padre del hijo H) Hp y la hiptesis de la defensa (otro hombre distinto del presunto padre es el padre biolgico del hijo) Hd. Ambas hiptesis son mutuamente excluyentes es decir la probabilidad de que las dos hiptesis se den a la vez es nula. P(Hp y Hd) =0 P(Hp) +P(Hd) =1 P(Hd) =1-P(Hp) frmula 1

Si denominamos E a la evidencia gentica, E = Genotipo del hijo GH condicionado por el genotipo de la madre GM y el genotipo del presunto padre GPP y denominamos I a la evidencia no gentica, como pueden ser aquellas declaraciones o pruebas que aportan la madre y presunto padre acerca de su relacin al juez, llamadas tambin pruebas testificales y aplicando el teorema de Bayes , nuestra interpretacin de la evidencia ser:

3983


P(Hp/E,I) P(Hd/E,I) =

P(E/Hp,I) P(E/Hd,) X

P(Hp/I) P(Hd/I) frmula 2

As de forma objetiva la valoracin de la prueba cientfica y mediante la aplicacin del teorema de Bayes nos permitir obtener una probabilidad final tras multiplicar a la creencia inicial o probabilidad inicial P0, el valor de la evidencia biolgica expresada en forma de apuesta conocida como razn de verosimilitud o Likelihood Ratio (LR) o ndice de Paternidad IP cuando tratamos de IBP.P(E/Hp,I) LR = P(E/Hp,I) = P(GH/GM, GPP,Hp) P(GH/GM, GPP,Hd) = P(Hp/E,I) P(Hd/E,I) = LR X P0 frmula 3

Si asumimos que la P(Hp/I) tiene un valor de 0.5, lo que equivale a considerar que el presunto padre tiene a priori las mismas posibilidades de ser el padre biolgico que de no serlo.P(Hp/I) = P(Hd/I)

La frmula 3 se simplifica.P(Hp/E,I) P(Hd/E,I) = LR ; P(Hp/E,I) = LR x P(Hd/E,I)

Sustituyendo la frmula 1 en la ecuacin, obtenemos:P(Hp/E,I) = LR x 1-P(Hp/E,I) P(Hp/E,I) = LR LR x P(Hp/E,I)

P(Hp/E,I) + LR x P(Hp/E,I) = LR P(Hp/E,I) x(1 + LR) = LR

LR P(Hp/E,I) = LR+1

3984


6.1

La probabilidad de paternidad

La probabilidad de paternidad W se calcula mediante la formula descrita por Essen-Moller cientfico escandinavo en 1938, que desarrolla los aspectos bioestadsticos de las pruebas de paternidad, derivados del Teorema de Bayes.X W= X+Y

Indica la probabilidad que tiene ese individuo de ser el padre biolgico (X), comparado con un hombre al azar de la poblacin (Y). As el valor de X depende exclusivamente del resultado de los anlisis realizados al tro, y el valor de Y corresponde a la frecuencia en la poblacin del alelo del hijo que obligatoriamente ha recibido del padre. Generalmente se asume que la madre y el presunto padre no estn relacionados. 6.2 ndice de paternidad

Indica cuantas veces es mayor la probabilidad del presunto padre de ser el padre biolgico del hijo con respecto a un hombre tomado al azar. IP = X/Y X = Probabilidad de que el presunto padre sea el padre biolgico del hijo/a. Y = Probabilidad de que lo sea un hombre al azar en la poblacin de referencia. Con esta frmula se elude el problema de la probabilidad de paternidad a priori, valor que debera ser fijado por el juez, resultando en cierto modo ms apropiado presentar la probabilidad de paternidad como una razn de verosimilitud. Los laboratorios de gentica forense actualmente disponen en su gran mayora de la tecnologa del ADN, gracias a la cual los resultados obtenidos en las IBP son ms robustos y fiables, voluntariamente estos laboratorios han decidido asumir en sus valoraciones estadsticas un ndice de paternidad mnimo, por tanto los IP emitidos sern superiores a 1000 y 3985


algunos centros, entre los cuales nos encontramos, se acepta un criterio mnimo de IP superior a 10000. Tradicionalmente para hacer estos resultados ms inteligibles, tanto la probabilidad de paternidad como el ndice de paternidad, en el informe se acompaa una tabla con los predicados verbales de Hummel.W 99,73% o ms Ms 99% Ms 95% Ms 90% IP >399:1 >95:1 >19:1 >9:1 Rango de paternidad Prcticamente probada Extremadamente probable Muy probable Probable

A lo largo de estos aos un amplio debate se ha suscitado en la comunidad cientfica sobre la valoracin de la evidencia no gentica I o pruebas testificales. Algunos autores han cuestionado la asuncin de neutralidad al utilizar el valor de 0.5 como P(Hp/I), mientras que para otros este valor ha sido considerado como una premisa bastante conservadora. Las normas del GEP-ISFG sobre esta cuestin son claras, asignndole un valor de P(Hp/I) =0.5 a falta de indicacin expresa por el juez. En la tabla adjunta presentamos la probabilidad de paternidad obtenida al aplicar al ndice de paternidad IP diferentes probabilidades de paternidad a priori (P0).

NDICE DE PATERNIDADP0 0 0.010 0.100 0.500 0.900 1 1 0 0.010 0.100 0.500 0.900 1 10 0 0.09174 0.52631 0.90909 0.98901 1 100 0 0.56251 0.91743 0.99009 0.99889 1 1000 0 0.9099181 0.9910803 0.9990010 0.9998889 1

Los parmetros bioestadsticos hasta ahora mencionados son considerados como parmetros a posteriori y proporcionan resultados directamente valora bles en cada caso individual, pero todo laboratorio de gentica forense debe conocer el potencial informativo de los marcadores genticos o conjunto de marcadores genticos de que dispone, para ello utilizara los denominados parmetros a priori. 3986


6.3

Probabilidad de exclusin a priori

Es de hecho, el potencial de exclusin terico de un laboratorio. Se considera como el porcentaje de presuntos individuos falsamente imputados cuya paternidad biolgica quedara excluida sobre la base del conjunto de marcadores utilizados. As una probabilidad de exclusin a priori del 99,9% significara que de cada 1000 falsos padres, 1 no podra ser excluido. El clculo para un sistema biallico es sencillo: CE = pq x (1-pq) Siendo p y q las frecuencias gnicas de los dos alelos. Para un sistema de tres alelos el calculo sera: CE = pq x (1-pq) + pr X (1-pr) + qr (1-qr) + 3pqr X (1-[pq + pr + qr]) Para sistemas genticos multiallicos codominantes el clculo se complica mucho mas: n n CEtrio = Pi (1-Pi)2 + (Pi Pj ) )2(3Pi+3Pj-4) I=1 i< Siendo n= n de alelos y Pi = frecuencias gnicas respectivas. Cuando se analizan n marcadores, se calcula la probabilidad de exclusin a priori acumulativa que viene dada por la frmula: CEtotal = 1-(1-P1) (1-P2) ...(1-Pn) Siendo P1, P2... Pn las probabilidades de exclusin individuales de cada uno de los sistemas. Los valores CE dependen del n alelos del marcador gentico y de su frecuencia alelica. Se alcanzan valores mximos cuando los n alelos del marcador estudiado tienen como frecuencia alelica 1/n. El GEP-ISFG, grupo de trabajo en el rea de la Biologa Forense que agrupa a laboratorios del territorio espaol, portugus y de Hispanoamrica y que a su vez forma parte del grupo de trabajo de la ISFG, tiene como uno de sus cometidos establecer unos criterios bsicos 3987


de actuacin que garanticen la fiabilidad de las pruebas genticas, estando inspiradas en las recomendaciones de la ISFG. En concreto dentro del rea de la investigacin biolgica de la paternidad se establece que los laboratorios donde se practiquen estas pruebas alcancen al menos un 99.9% de probabilidad de exclusin a priori. Nuestro laboratorio dispone de CEtotal muy por encima del 99.99999%. Sin embargo cuando no disponemos de la madre en el estudio gentico, estudio que se solicita en no pocas ocasiones, el clculo de la CEM debe ser determinada con otra frmula: n CE total= Pi2 (1-Pi)M

n2

+ (Pi Pj) (1-Pi-Pj)2 i

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