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MÉTODOS ACTUALES DE DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO EN LAS INTOXICACIONES POR

SETAS CON INTERÉS FORENSE

María Jesús Iturralde Pardo

Instituto Nacional de Toxicología y de Ciencias forenses Departamento de Madrid

ÍNDICE: 1. INTRODUCCIÓN.–2. CLASIFICACIÓN DE LOS MICETISMOS EN FUNCIÓN DE SU PERÍODO DE LATENCIA: 2.1 MICETISMOS DE CORTO PERIODO DE LATENCIA: 2.1.1 Gastroenteritis aguda por setas. 2.1.2 Intoxicación neurológica por setas (Síndrome micoatropínico). 2.1.3. Intoxicación por hongos alucinó-genos (Síndrome alucinatorio). 2.1.4 Intoxicación mus-carínica por setas (Síndrome micocolinérgico o sudoriano). 2.1.5 Intoxicación cardiovascular por setas (Síndrome coprínico). 2.1.6 Intoxicación hemolítica por setas (Síndrome hemolítico). 2.2 MICETISMOS DE LARGO PERIODO DE LATENCIA: 2.2.1 Intoxicación por setas hepatotóxicas (sín-drome ciclopeptídico). 2.2.2. Intoxicación por setas hidra-cínicas (síndrome giromitriano). 2.2.3. Intoxicación por setas nefrotóxicas (síndrome orellánico). 2.3. NUEVAS PATO-LOGÍAS ASOCIADAS A LAS SETAS: 2.3.1. Rabdomiolisis asociadas a setas. 2.3.2. Eritromelalgia.–3. METODOLOGÍA EXISTENTE PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO: 3.1. TIPO DE MUES-TRAS: 3.1.1. Muestras botánicas. 3.1.2. Muestras clínicas. 3.2. Clasificación botánica: 3.2.1. Características macros-cópicas. 3.2.2. Características microscópicas. 3.3. ESTUDIO DE TOXINAS. 3.3.1. En muestras botánicas. 3.3.2. En mues-tras clínicas. 3.4. REMISIÓN DE MUESTRAS.–4. NUEVAS TECNOLO-GÍAS BASADAS EN EL ADN: 4.1. RAPD. 4.2 RFPL. 4.3 SSCP. 4.4. SECUENCIACIÓN.–5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

M.a JESÚS ITURRALDE

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1. INTRODUCCIÓN

Las intoxicaciones por setas se repiten todos los años durante las épocas en que la climatología favorece el crecimiento de los hongos, siendo el otoño y la primavera las estaciones en las que se lleva a cabo la mayor recolección y consumo por parte de la población. En cuanto a la etiología médico legal, la mayor parte son accidentales; le siguen en frecuencia el consumo voluntario de setas con principios psicoactivos siendo excepcional la etiología homicida o suicida.

A lo largo de 18 años hemos recibido, en el Servicio de Biología, muestras de 60 episodios asociados a setas procedentes de Hospitales (1) y muestras de 31 casos procedentes de Juzgados: unos para investi-gar si las muestras incautadas contienen sustancias psicoactivas y otros para poder establecer si las setas han sido las responsables de producir la muerte. La media anual es de 5 episodios por año.

La importancia de este tipo de intoxicaciones no es tanto por la fre-cuencia con que se presentan sino porque los pacientes pueden haber ingerido setas con toxinas que son potencialmente mortales. Además, en el diagnóstico diferencial de la hepatitis fulminante y de la insuficiencia renal hay que incluir los micetismos.

Desde el punto de vista forense los protocolos de trabajo y los méto-dos de interpretación tienen que basarse en:

1. Investigaciones circunstanciales: si han ingerido setas, cuantas veces, manera de consumirlas.

2. Investigación botánica: sirve para establecer que especie de seta es realmente la que ha producido la muerte. Además puede aportar nue-vos taxones al catalogo de especies tóxicas.

3. Datos clínicos y bioquímicos: el periodo de incubación sirve para distinguir los distintos micetismos. Además existen patología asociadas a setas que no son envenenamientos (alergias, intolerancias, toxiinfeccio-nes alimentarias).

4. El examen histopatológico es importante especialmente en los casos letales. El hígado y el riñón son los órganos que se van a ver más afectados.

5. Análisis de toxinas: en los ejemplares sospechosos y en muestras procedentes de la víctima.

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2. CLASFICACIÓN DE LOS MICETISMOS EN FUNCIÓN DE SU PERIODO DE LATENCIA

Basados en criterios clínicos, las intoxicaciones se clasifican, en fun-ción de la duración del periodo de latencia en dos grandes grupos: los de periodo de latencia corto, en general menos graves, y los de periodo de latencia largo.

2.1 Micetismos De Corto Período De Latencia

El intervalo entre la ingesta y la aparición de los primeros síntomas es inferior a 6 horas, oscilando en general entre 30 minutos y unas 3-4 horas. Suelen ser intoxicaciones leves.

2.1.1 Gastroenteritis agudas por setas

Especies causantes

Entoloma lividum: «seta pérfida»

Sombrero: 5-20 cm, margen enrollado, gris pardusco y radialmente fribriloso. La carne tiene olor a harina rancia.

Láminas: anexas, escotadas, rosa salmón, espaciadas.

Pie: 6-14 cm, duro, sólido, sedoso, blanco, manchado de amarillen-to.

Esporada: rosada.

Espora: 9-12 x 7-9 μm, poliédricas y con un saliente.


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Hábitat: frecuente en otoño, a menudo en grupos, bajo árboles de castaños y robles.

Confusión: Clitocybe nebularis «la pardilla»,esta seta es muy apreciada en el País vasco y con Tricholoma georgi «Seta de San Jorge».

Omphalotus olearius: «Seta de olivo»

Sombrero: 4-10 cm, convexo, aplanado y hundido de color anaranja-do o pardo rojizo.

Láminas: decurrentes, desiguales, estrechas y anaranjadas o amarillas.

Pie: excéntrico y curvado, y del color del sombrero.

Esporada: blanco-amarillenta.

Espora: 5-8 x 4-6,5 μm, lisas, redondas y no amiloides.

Hábitat: en otoño, en base de troncos no sólo de olivos sino también de robles, robinias, etc.

Confusión: con Cantharellus cibarius excelente comestible que crece en el suelo (no en madera) y cuyo sombrero no posee láminas sino venas.


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Boletus satanas: «Boleto de satanás»

Sombrero: 6-25 cm, carnoso, de color blanco.

Tubos: amarillos. Los tubos terminan en unos poros que son de color rojo que azulean con el roce.

Pie: 4-15 x 3-10 cm, corto, rechoncho, amarillo en la parte superior, rojo al centro y recubierto por un retícula roja.

Esporada: marrón.

Espora: 11-15 x 5-6 μm, en forma de uso, lisas, marrón oliva.

Hábitat: prefiere suelos calcáreos y bosquecillos con árboles de pla-nifolios donde suele salir en verano.

Confusión: con Boletus erythropus aunque el pie de este tiene punti-tos rojos en el pie en vez de retícula.

Diversas especies de setas pertenecientes a diferentes géneros provo-can gastroenteritis aguda: Entoloma, Omphalotus, Boletus, Tricholomas, Lactarius, Russulas, Agaricus, Clitocybe, Hebeloma, Nematolma etc.

En España las gastroenteritis más graves han sido producidas por las especies. Entoloma lividum y Tricholoma tigrinun. En el resto de Europa son frecuentes las intoxicaciones por Boletus satanas. Los episodios de gastroenteritis analizados en nuestro Laboratorio han supuesto un 18% siendo la especie Omphalotus olearius la más frecuente. Dos episodios de intolerancia digestiva se produjeron por la ingestión de Macrolepiota procera y Macrolepiota rhacodes siendo ambas especies excelentes comestibles.

Toxinas: En muchas especies no se conocen las sustancias respon-sables de producir los trastornos pero en algunas se han identificado compuestos que, experimentalmente, se muestras nocivos o irritantes


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del tubo digestivo como: Fasciculoles E y F, Hebelósidos, Sesquiterpenos cíclicos, Nematolina, Iludinas y Subiludinas, Bolesatina etc.

Síntomas: Náuseas, vómitos y diarreas de diversa intensidad en fun-ción del tipo de la especie de seta que se haya ingerido así como de la cantidad.

Tratamiento: Es exclusivamente sintomático y de soporte. Casi siempre habrá que evitar la deshidratación y el desequilibrio ióni-co.

Nota: En general no hay que olvidar que muchos de los micetis-mos se producen por desconocimiento de la existencia de hongos tóxicos. Esto hace que se den ingestas al azar de diferentes tipos de setas que pueden incluir especies que conllevan toxicidad tar-día y temprana. En estos casos la aparición precoz de síntomas puede encubrir una intoxicación grave.

2.1.2. Intoxicación neurológica por setas: síndrome micoatropínico

Especies causantes

Amanita muscaria: «Matamoscas», «Falsa oronja», «Oropéndola loca»

Sombrero: 6-15 (20) cm de un llamativo rojo escarlata o rojo anaran-jado con numerosas escamas blancas que desaparecen con la lluvia.

Láminas: libres, apretadas y blancas.


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Pie: blanco, cilíndrico. La base se ensancha en forma de bulbo rodea-da por la volva disociada en diversas verrugas dispuestas en anillos con-céntricos. Anillo: membranoso y colgante.

Esporada: blanca.

Espora: subglobosas 9-11 x 6-9 μm, lisas, hialinas y no amiloides.

Hábitat: a finales de verano y otoño, tanto en bosques de confieras como caducifolios: pinos, abetos, haya, abedules, etc. Preferentemente suelos ácidos.

Nota: A diferencia de los Psilocibes estas setas no se pueden culti-var.

Amanita pantherina «amanita pantera»

Sombrero: 4-10 cm de color pardo oliváceo con verrugas blancas.

Láminas: libres, apretadas y blancas.

Pie: 6-12 cm, blanco, sedoso, de base abultada. Anillo: frágil. La volva disociada en dos o tres anillos.

Esporada: blanca.

Espora: un poco más grandes que las de A. muscaria: 9-12 x 7-9 μm, lisas, hialinas y no amiloides.

Hábitat: en verano y otoño en bosques mixtos.

A. muscaria es la seta más conocida y la encontramos a menu-do ilustrada en libros infantiles. En mitologías antiguas se la identificaba con el «Soma» , el hongo divino de la inmortalidad de las primeras religiones euroasiáticas. Hoy en día, estas setas se comen deliberadamente en diferentes lugares de Europa para obtener efectos alucinatorios. En uno de los casos procedentes de Juzgados relacionado con el consumo de A. muscaria, el detenido, un joven de 20 años, refería su ingesta por que le producía «efec-tos agradables, alteraciones de la visión, risa y desequilibrios en la mente». Se han descrito algunas intoxicaciones importantes en Estados Unidos, Europa y Suráfrica (2) .


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Toxinas: Durante un largo período de tiempo se consideró que la muscarina era la toxina que producía este tipo de intoxicación (Schmiedeberg y Koppe, 1869). Fue a mediados de los años sesenta cuando tres equipos de investigación de forma paralela e independien-te, Takemoto en Japón (1964), Bowden en Inglaterra (1965) y Eugster en Suiza (1965) aislaron dos sustancias activas y las identificaron como Acido iboténico (de ibonten-gu-take, como llaman en Japón a Amanita strobiliformis) y muscimol, ambos derivados del isoxazol y con acción insecticida y narcótica. También se aislaron oxazolona y muscazona. Además se piensa que posiblemente estas setas contengan otras substan-cias, no identificadas todavía, con algún efecto en el ser humano.

Ac. iboténico Muscimol

El ácido iboténico, se descarboxila en el organismo y da lugar al mus-cimol que sería la sustancia verdaderamente activa.

f

q

Muscimol

Acido gamma-aminobutírico

El muscimol es una sustancia soluble en agua, cuya fórmula tiene cierto parecido con la del GABA por lo que puede estimular sus recep-tores cerebrales.

El contenido de toxinas en A. muscaria es muy variable y a veces nulo, lo que explica que en algunos lugares europeos se consuma sin inconvenientes. En general la variedad A. muscaria americana es la más irritante del tubo digestivo, mientras que las formas europeas presentan mayor actividad psicotrópica. Como cifras medias de contenido en com-puestos isoxazólicos se habla de un 0,2% del peso seco de la seta

para A. muscaria y de un 0,4% para A. pantherina. Las maneras más frecuente de consumirlas son: 1) crudas: 5 a 10 gr de seta seca en


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trocitos. 2) con una llama calentar el sombrero y recoger el líquido que sale de las láminas. 3) fumadas los efectos que produce son más intensos pero duran menos tiempo.

Síntomas: Además de irritación gastrointestinal, se producen altera-ciones motoras, por lo que se habla a veces de borrachera por setas. En ocasiones se produce un cuadro de depresión neurológica que puede llegar a coma. En conjunto no puede hablarse de gravedad aunque a lo largo de la historia se ha documentado alguna intoxicación mortal, en especial por A. pantherina.

Tratamiento: prevenir la absorción. Así mismo, debe llevarse a cabo un tratamiento sintomático y de soporte. Los antídotos deben utilizarse de acuerdo con los síntomas: si se observan de tipo anticolinérgico la fisostigmina. Sólo si se presentarán síntomas de estimulación colinérgica, debido a que la seta presentara una concentración inusualmente elevada de muscarina, suministrar atropina.

Análisis de toxinas:

Muestras botánicas: el muscimol se puede detectar por cromatografía en capa fina (3).

Muestras clínicas: en orina puede detectarse la presencia de isoxazoles.

2.1.3 Intoxicación por hongos alucinógenos: síndrome alucinatorio

Especies causantes

Psilocybe semilanceata: «bonete de los libertinos», «gorro de bru-jas», «mongui»


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Sombrero: 0,5-1,5 cm, fuertemente cónico con un característico salien-te puntiagudo en el centro, nunca extendido, crema tostado al secar.

Láminas: ascendentes, pardo purpuráceas, de arista blanca.

Pie: 25-75 x 1-2 mm, flexuoso, pálido, a veces con un tinte azul en la base del pie.

Esporada: chocolate negruzco.

Espora: elipsoidales, de 11,5-14,5 x 7-9 μm, lisas, y con poro germi-nativo.

Hábitat: en parques, prados o bordes de caminos. Se recolecta en otoño. También se puede cultivar.

Panaeolus sphinctrinus

Sombrero: de 2 a 4 cm, campanulado que nunca extiende. Se carac-teriza por tener abundantes restos de velo a modo de jirones de color blanco formando una franja alrededor del sombrero.

Láminas: Adherentes, grises en diferentes tonos por que no maduran todas a la vez , borde blanquecino.

Pie: muy largo 60-120 x 2-3 mm, algo ensanchado en la base, color pardo rojizo en las ¾ partes inferiores.

Esporada: negra.

Espora: forma de limón, algo hexagonales, de 13-18 x 8-12,5 μm, con poro truncado muy pronunciado.

Hábitat: en prados frecuentados por el ganado. Se recolecta preferen-temente en otoño.


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Psilocybe cubensis En México la llaman «El champiñón de San Isidoro Labrador»

Sombrero: 1,5-8 cm, de cónico campanulado a convexo, color amari-llo pálido, superficie lisa.

Láminas. adnatas, de gris púrpura a negro.

Pie: 40-150 x 5-15 mm, blanquecino a amarillento.

Esporada: negra púrpura.

Espora: violeta marrón, 11-17 x 8-10 μm, subelipsoidales, lisas.

Habitat: sobre estiércol de vaca, en regiones subtropicales.

Esta especie es fácil de cultivar por lo que es una de las especies más consumida con fines recreativos.

Debido a la falsa creencia de que el consumo de sustancias alucinó-genas de origen natural es menor que el de sustancias sintéticas y a la facilidad con que se pueden adquirir hongos alucinógenos, su utiliza-ción con fines recreativos está aumentando en España. En el Servicio de Información Toxicológica se reciben consultas de intoxicaciones en adultos que las toman en sopas, tortillas, arroz o en tartas de cumpleaños adqui-ridas por Internet como «smell bags». Consultan por una serie de síntomas que califican como «mal viaje»: crisis de pánico o ansiedad, psicosis o sinto-matología simpaticomimética. En una ocasión un niño pequeño ingirió los ejemplares de la bolsita depositada debajo de la almohada por los padres que ignoraban su verdadero contenido.

Toxinas: el descubrimiento de los principios activos por el químico Suizo Albert Hoffman conocido por muchos como el padre del potente


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alucinógeno LSD, fue posible gracias al trabajo del profesor R. Heim que consiguió cultivar estos hongos en el laboratorio. Dos sustancias derivadas del anillo indol resultaron ser las causantes de la actividad alucinógena de los hongos mágicos mexicanos: psilocibina y psilocina cuya actividad calculó como 1/100 de la del LSD.

La psilocibina, principal componente activo del hongo, se hidroliza rápidamente en el organismo y da lugar a la psilocina siendo ésta la sus-tancia biológicamente activa. Su mecanismo de acción no está plenamen-te aclarado pero se saben que actúan como falsos neurotransmisores.

PsilocinaPsilocibina

La cantidad de sustancia psicoactiva en las setas es muy variable aunque depende de diferentes factores: localización geográfica, condi-ciones climáticas, tiempo de recolección etc. Para Psilocybe semilanceata se han obtenido cantidades entre 0,1 a 1,6 % de psilocibina del peso en seco de la seta, y entre 0 a 0,6% de psilocina. En general se admite un contenido medio del 1% de los derivados indólicos activos del peso seco. Si un ejemplar seco de talla media de P. semilanceata que pese aproxi-madamente 200 mg puede contener 2 mg de psilocibina, un «pequeño viaje» necesitará unos 4 o 5 ejemplares (entre 8-10 mg) y un «gran viaje» de 20 a 40. Una dosis por encima de 150 mg puede provocar una intoxi-cación grave incluso la muerte (4).

La desecación no parece alterar a la psilocibina por lo que se pueden consumir secas o en cápsulas. El que sean sustancias hidrosolubles hace que se consuman en infusiones o en guisos hechos con el agua de hervir las setas. El chocolate y la miel son una buena forma no sólo de consumo sino también de transporte (5).

Obtención de las setas: 1. La especie P. semilancetata se pueden recolectar preferentemente durante el otoño en praderas despe-jadas de suelos ácidos, en montaña o en prados. En la provincia de Madrid crece en la Sierra de Guadarrama. 2. Se pueden obte-ner de las tiendas denominadas Smart Shops existentes en Holanda; Vienen acompañadas de un prospecto en el que figuran las instruc-ciones para su administración, los efectos adversos y las recomenda-ciones a seguir si estos se presentasen. 3. A través de Internet se


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pueden adquirir bolsitas «odorizantes» (smell bags) con las setas o kits que contienen esporas, fertilizantes e instrucciones para su cultivo. 4. También se ha descrito la venta de miel conteniendo las setas trituradas (5).

La tenencia o comercialización de psilocibina y/o psilocina es consi-derada ilegal en muchos países. En España está prohibida la venta según una reciente orden (ORDEN SCO/190/2004 de 28 de Enero, publicado en el B.OE el 6 de febrero de 2004). Esta orden establece la lista de plantas cuya venta al público queda prohibida o restringida por razón de su toxicidad, y además de Stropharia sp y Psilocybe sp. incluye otras setas venenosas (Amanita muscaria, A. pantherina , A. phalloides, Boletus satanas, Clitocybe s.p, Cortinarius orellanus y C. speciosissimus, Galerina marginata, G. automalis y G. unicolor, Gyromitra esculenta, G. giggas, Inocybe sp, Lepiola helveolla, L. joserandi, Lactarius torminoissus, entre otros. La convención de Naciones Unidas sobre sustancias psicotrópicas incluye la psilocibina y psilocina. Estas sustancias están ausentes en las esporas y en las primeras etapas de crecimiento del hongo (tabla 1)

Tabla 1. Estudio de detección de drogas psicoactivas a partir de muestras tomadas en las diferentes etapas de crecimiento de las setas mediante Cromatografía de gases / espectrofotometría de masas (CG-EM). Susan T Gross (2000) (6)

Tipo de muestraTotal de muestras

Psilocina 1 Psilocina 2 No detectada

Esporas 4 4

Micelio 9 9

Nódulos micelio 22 12 7 3

Punta de cabeza 25 19 3 3

Seta madura 11 11 0

Psilocina 1: Muestras consistentes con psilocina si el tiempo de retención y el patrón de fragmentación concordaba con el estándar de psilocina.

Psilocina 2: Muestras que indicaban presencia de psilocina si el tiempo de retención era consistente con el estándar y contenía los iones principales pero le faltaban iones en el patrón de fragmentación.

Síntomas: en pequeñas dosis los síntomas más frecuentes suelen ser alucinaciones, alteraciones de la conducta, agresividad, pérdida de con-trol, síntomas digestivos, taquicardia y midriasis. Las alteraciones duran varias horas (4 a 10 generalmente) y suelen acabar en sueño. El consumo simultáneo con alcohol o con otras drogas puede producir el llamado «mal viaje». También se han descrito en ocasiones cuadros de arritmia


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cardiaca grave e incluso un infarto de miocardio (7). Según la literatura consultada se han producido diversos episodios en los que el resultado de la experiencia no ha sido el esperado. Unas veces por confusión en su recolección con pequeñas Galerinas con resultado de muerte por fallo hepático. Otras veces fue con Cortinarius nefrotóxicos con daño renal (8-9). Otros optaron por la compra en lo que se podría llamar «mercado negro» y los ejemplares que adquirieron o bien eran tóxicos o bien eran hongos inertes embebidos de una, o varias drogas de abuso, como LSD.

Tratamientos: El tratamiento es sintomático y de soporte con la administración de sedantes del tipo de las benzodiacepinas.

Análisis de Laboratorio:

Muestras botánicas: psilocibina y psilocina mediante TLC (6), GC/EM (6), HPLC (10-11)

Muestras clínicas: sangre y orina: psilocina mediante HPLC (12)

2.1.4 Intoxicación muscarínica por setas: síndrome colinérgico o sudo-riano

Especies causantes

Clitocybe dealbata: «Clitocibe blanco»

Nota: las especies de este género que contienen muscarina son blan-cas y de tamaño pequeño, siendo las más famosas C. dealbata, C.rivulosa y C. cerussata.

Sombrero: 2-4 cm, expandido, de blanco a grisáceo, liso.


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Láminas: adnato-decurrentes, delgadas de color cremoso encarnado, apretadas.

Pie: 2-4 cm, del color del sombrero.

Esporada: blanca.

Espora: 4-5,5 x 2-3 μ,m, elipsoidales, hialinas.

Hábitat: verano y otoño en “corros de brujas en sitios despejados, prados céspedes, jardines, caminos.

Confusión: seta de cardo, seta de caña, senderuelas son las más fre-cuentes.

Inocybe fastigiata: «Inocibe cónico»

Nota: muchas especies de este género contienen muscarina por lo que se debe evitar comerlas.

Sombrero: 3-8 cm, cónico, pardo amarillento, fibriloso, cuarteándose hacia el margen.

Láminas: adnatas, amarillo oliváceas, algo estrechas y apretadas.

Pie: 4-10 cm, de blanquecino a amarillo ocráceo, fibriloso, fistuloso.

Esporada: caqui-tabaco.

Espora: 8-14 x 4-7 μ,m, lisas, faseoladas.

Hábitat: junio a octubre, por todas partes, sobre todo bosques y luga-res arenosos.

Toxinas: La sustancia tóxica que poseen estas setas es la muscarina. Su nombre se debe a que en 1969 Schmiedeberg y Koppe encontraron en Amanita muscaria un compuesto tóxico que llamaron muscarina. Sin embargo esta especie sólo contiene trazas de muscarina mientras


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que en algunas setas pertenecientes a los géneros Clitocybe e Inocybe se encuentran mayores cantidades. Estos géneros comprenden especies difíciles de identificar. Por ello investigar la presencia de esta toxina puede ser de gran utilidad. Para la enumeración de las diferentes espe-cies que contienen muscarina puede verse el trabajo de García Rollán (13) aunque hay muchas que todavía no han sido estudiadas.

La riqueza de muscarina de las diversas setas varía mucho, pero en algunas especies de Inocybe se ha detectado más de un 5 % de peso seco.

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Acetil-colina

Muscarina

Síntomas: Los más característicos de este tipo de intoxicaciones son abundante sudoración acompañado de salivación y lagrimeo. Por lo general suelen aparecer entre los 15 y 30 minutos después de la inges-tión de las setas. Estas también producen vómitos, diarreas, miosis, y dis-turbios en la visión, bradicardia e hipotensión. La intoxicación no suele ser grave pero se conoce algún caso de muerte por Inocybe patouillardi y Clitocybe dealbata.

Tratamiento: lavado gástrico si el paciente acude en los primeros 30 minutos, cosa infrecuente. Prevenir la deshidratación debido a que la gran sudoración y la diarrea pueden haber deshidratado de forma nota-ble al paciente. No hay que suministrar atropina, salvo en los casos de intensa estimulación colinérgica con bradicardia o hipotensión marcada.


Muestras botánicas: muscarina mediante capa fina de alta resolución (HPTLC) (3).


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2.1.5. Intoxicación cardiovascular por setas: síndrome coprínico

Especies causantes

Coprinus atramentarius: «Coprino antialcohólico»

Sombrero: Es primero ovoideo, luego acampanado de 3-6 cm de altu-ra, Poco a poco se va abriendo y deshaciendo por el borde, convertido en liquido negro. De color grisáceo, algo pardusco hacia el centro donde se ven algunas escamas. El resto liso y estriado hacia la periferia.

Láminas: libres, amplias, densamente apretadas blancas, luego negras al irse licuando,

Pie: 6-20 cm, blanco, liso. En la base apenas se nota un pequeño anillo que dura poco.

Esporada: negra.

Esporas: elípticas, de 8-10 x 5-7 μm, lisas, con poro germinativo amplio.

Hábitat: desde primavera en grupos apretados , en jardines, bordes de camino, cercanías de troncos.

Se trata, en realidad, de una intoxicación condicional, producida por hongos que interfieren con el metabolismo oxidativo del etanol. Los sín-tomas sólo se presentan si se asocia el consumo de bebidas alcohólicas a la ingestión de Coprinus atramentarius. Otros hongos como Clitocybe clavipes y otras especies del género Coprinus se han relacionado con reacciones tipo «Antabus» en alguna ocasión.


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Toxinas: La ingestión de C. atramentarius seguida de una bebida alcohólica da lugar a unos síntomas semejantes a los producido por Disulfiram conocido también con el nombre de «Antabús», sustancia utili-zada en medicina en los alcoholicos. Esto hizo suponer, en un principio, que el componente causante de la intoxicación era el Disulfiram. En 1975, dos grupos científicos, trabajando unos en Estados Unidos y los otros en Suecia, aislaron independientemente la sustancia denominada Coprina. La estructura, determinada por el Profesor Dardenne, es una combinación del aminoácido glutamina con un derivado de la ciclopro-panona.

Coprina Aminociclo propanol

La coprina, como tal, es inactiva, pero en el organismo se descompo-ne parcialmente dando el hidrato de ciclopropanona o aminociclopropa-nol, que interfiere con la función del enzima acetaldehído-deshidroge-nasa en el hígado. Esto hace que se retarde el metabolimo del alcohol y se acumule acetaldehído en la sangre afectando al sistema nervioso vegetativo.

El contenido de Coprina en la especie C. atramentarius es variable, pero se citan cifras de 160 mg por Kg.

Síntomas: se producen trastornos cardiovasculares tales como vaso-dilatación, congestión y cianosis de la cara, taquicardia, zumbido de oídos etc. cuando se ingiere alguna de estas especies de setas con vino u otra bebida alcohólica de fuerte graduación. Estos síntomas pueden repetirse durante unos días, cada vez que se vuelve a tomar bebidas alcohólicas. En algún caso raro se habla de colapso tras hipotensiones importantes e incluso de lesiones hepáticas o renales.

Tratamiento: aparte de la supresión de bebidas alcohólicas, al menos, durante cinco días después de la ingesta de las setas, son de utilidad las medidas de soporte y sintomáticas. La Vitamina C a dosis altas por vía intravenosa tiene un efecto favorable, tal vez como factor «redox».

Hongos incompatibles con el alcohol: Se ha descrito que la inges-tión de determinadas setas con alcohol producen cuadros de gastroen-teritis que no parecen estar asociados a la formación o acumulación de acetaldehído. Las setas responsables de este tipo de intoxicación son:


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Morchella augusticeps, Pholliota squarrosa, Boletus luridus y Polyporus sulfureus. Se sospecha que la causa de esta intoxicación radica en el hecho de que estas setas contienen toxinas que no se absorben en con-diciones normales pero sí en presencia de alcohol, seguramente por una especial solubilidad de éstas en el etanol.

2.1.6. Intoxicación hemolítica por setas

Existen diferentes especies de setas que contienen hemolisinas ter-molábiles, no bien identificadas, que pueden provocar un trastorno hemolítico, en general leve, si se consumen crudas o poco cocinadas. Sin embargo si se desecha el agua de cocción o se realiza una cocción prolongada pueden consumirse sin problema. Las más conocidas son las colmenillas (Morchellas) y la amanita vinosa (Amanita rubescens). Sin embargo, existe una forma grave de hemólisis mediada por complejos inmunes, que se produce en algunas personas al consumir, de forma repetida, la especie Paxillus involutus.

Paxillus involutus: «Paxilo enrollado»

Sombrero: 5-25 cm, convexo, pronto deprimido, de pardo caqui a pardo ferruginoso. El borde este generalmente muy enrollado.

Láminas: decurrentes, amarillo-rojizas, manchadas de ferruginoso, blandas y que se desprenden con facilidad al empujar con el dedo.

Pie: 3-7 cm, firme, pálido, pardo oscuro al tacto.

Esporada: pardo-ocre.

Esporas: de color ocre herrumbre, elipsoidales, de 8-10 x 5-7 μm, lisas.

Hábitat: especie muy común desde primavera a otoño en bosques, taludes y cunetas.


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En Alemania y algunos países del Este, la consideran como mortal, hasta el punto de termerla casi tanto como a Amanita phalloides. Al pare-cer, se trata más de una alergia a esta seta que de una intoxicación fúngi-ca. Un antígeno de estructura desconocida presente en el hongo estimula la formación de un anticuerpo. Cuando se vuelven a ingerir estas setas, se forman complejos antígeno-anticuerpo que dañan la superficie de los eritrocitos y dan lugar a su aglutinación y hemólisis.

Análisis de laboratorio

Si se sospecha la posibilidad de una hemólisis inmunitaria por la seta Paxilllus involutus se pude detectar la presencia de anticuerpos en el suero del paciente (14).

• Incubar durante 30 minutos a 37ºC una mezcla, a parte iguales, de suero del paciente y un extracto acuoso del hongo al 0,05%.

• Se coloca una gota de la mezcla y otra de una suspensión de hematíes humanos del grupo 0 negativo. Tras una segunda incubación a 37º C se observa mediante centrifugación la presencia o ausencia de aglutinación.

2.2. Micetismos De Largo Período De Latencia

Los síndromes más graves son los asociados a un período de latencia largo. El intervalo entre la ingesta y la aparición de los primeros síntomas es superior a 6 horas, en general entre las 9 y las 15 horas, pudiendo llegar en algún caso hasta los 10 o 15 días.

2.2.1. Intoxicación por setas hepatotóxicas: síndrome cilopeptídico

Especies causantes

Amanita phalloides: «Oronja verde», «Seta mortal», «Cicuta verde». Esta especie es la responsable de la mayoría de fallecimientos producidos por ingestión de setas.


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Sombrero: 5-12 cm, convexo, después plano, verdoso amarillento muy variable.

Láminas: libres, desiguales, blancas. Con una gota de Ac. sulfúrico suelen tomar color violáceo.

Pie: esbelto, aumenta en grosor hacia la base donde forma un bulbo ovoideo rodeado por una Volva con forma de saco, amplia y membrano-sa. Anillo membranoso y colgante en la parte alta del pie.

Esporada: blanca.

Espora: ovales o casi redondas, 8-11 x 7-9 μm, lisas y amiloides.

Hábitat: verano y otoño, bosques de planifolios, especialmente enci-nas.

Confusión: Amanita caesarea, Amanita vaginata, Amanita gemma-ta, Tricholoma equestre “seta de los caballeros”, Tricholoma terreum, Hygrophorus sp.

Nota: la Amanita virosa y Amanita verna son especies igual de tóxicas que A. phalloides.


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Lepiota brunneo-incarnata

Nota: - hay otras pequeñas Lepiotas, como L. helveola y L. fulvella, que han causado graves intoxicaciones en España, incluso mortales.

- Alguna especies del género Galerina, como Galerina marginata, también han causado intoxicaciones graves.

Toxinas: Theodor Wieland aisló dos grupos de toxinas a partir de ejem-plares de A. phalloides: las falotoxinas y las amanitinas o amatoxinas. Tanto por su cantidad como por su acción las amanitinas son las máximas res-ponsables de la toxicidad. Se trata de octapéptidos de estructura bicíclica de peso molecular entre 900 y 1000 daltons. De las ocho amanitinas naturales que existen, tres de ellas son las que se encuentran en mayor proporción, alfa, beta y gamma, y por tanto son las responsables de la toxicidad. Estas toxinas actúan sobre el núcleo celular, inhibiendo la transcripción del ADN al ARN por bloqueo de la enzima específica ARN-polimerasa II. La falta de transcripción conduce a la interrupción de síntesis proteíca que es en defini-tiva la causa de la necrosis celular. Las toxinas penetran fácil y ampliamente en las células del epitelio intestinal y los hepatocitos, ya que ambas presen-tan una elevada tasa de síntesis proteica. La cantidad de toxina presente en A. phalloides fresca es del orden de 0,2-0,4 mg/g. Pequeñas cantidades de esta seta fresca, 50 g, pueden ser potencialmente letales.

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Síntomas:

Fase coleriforme: dura 48 horas y se caracteriza por una gastroenteritis grave: diarrea, nauseas, vómitos y dolor abdominal, acidosis metabólica, oliguria por la deshidratación e hipoglucemia. Puede desencadenarse una insuficiencia renal prerrenal por la hipovolemia. Las pruebas de fun-cionamiento hepático son normales.

Fase de mejoría transitoria: a las 48 horas de la ingestión y en parte por la reposición de líquidos.

Fase de agresión visceral: hacia el cuarto día aumentan las transa-minasas, aparecen hepatitis tóxica con afectación del estado general, subictericia, hepatomegalia blanda y dolorosa, coagulopatía de consumo. Tardíamente puede presentarse insuficiencia renal.

Formas graves: encefalopatía hepática, coma, ascitis, fracaso renal, distrés respiratorio del adulto y muerte a los 5-6 días de la ingesta.

Las típicas alteraciones que producen las setas hepatotóxicas en el hígado y en el riñón consisten en necrosis masiva centrolobulillar y necrosis tubular aguda respectivamente.

Los conocimientos de la cinética de las amatoxinas ha permitido mejorar y afinar los protocolos terapéuticos. Son toxinas que se absor-ben a nivel intestinal y alcanzan el hígado y la circulación general por vía portal. Se eliminan por bilis, reabsorbiéndose nuevamente a nivel intes-tinal con lo que se establece una circulación enterohepática. Circulan en sangre de forma libre, sin unirse a proteínas y se eliminan por vía renal rápidamente.

Tratamiento: de soporte. Rehidratar por vía endovenosa con solucio-nes salinas y glucosadas.

Evitar la absorción de toxinas: sonda nasogástrica o nasoduodenal con aspiración continua y administración periódica con carbón activa-do.

Aumentar la eliminación de las toxinas absorbidas: mantener una diuresis adecuada, neutra con control del balance hídro-electrolítico y, si es preciso, de la presión venosa central.

Tratamiento sintomático: corregir las anomalías analíticas: hemosta-sia, función renal y hepática, glucemia etc.

Tratamiento antidótico: Penicilina G sódica para impedir la entrada de amanitinas al hepatocito. Silibinina: interrumpe la circulación entero-hepática e inhibe el sistema de transporte de las toxinas de membrana del hepatocito. Acido tióctico.


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Muestras botánicas: amanitinas mediante el Test de Wieland o Meixner (15)

α y β amanitina HPTLC (2), HPLC (16).

Muestras clínicas: orina: amanitinas totales mediante el kit «Amanitin Elisa» de los laboratorios Bühlmann (Switzerland). Los resultados son fiables hasta 48 horas post-ingesta.

Nota: los niveles séricos de amanitinas en suero son muy bajos. En cambio, en el mismo momento de la intoxicación, los niveles de ama-nitinas en orina son de 100 a 150 veces mayores que los registrados en suero.

2.2.2 Intoxicación por setas hidracínicas: síndrome giromitriano

Este síndrome, que está producido por Ascomycetes, es muy pareci-do al producido por setas hepatotóxicas en cuanto al largo periodo de latencia y a las manifestaciones clínicas de la intoxicación, aunque en la mayoría de los casos no es tan grave.

Especies causantes

Gyromitra giggas:

Sombrero: 7-20 cm. de anchura, hueco, cerebriforme, con pocas ondulaciones y color crema, avellana.

Pie: grueso, corto, con surcos y desigualdades. Interior con zonas huecas; suele estar oculto por los lóbulos periféricos del sombrero.

Esporada: marfil.


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Espora: 30-37 x 10-14 μm, algo fusiformes por tener un pequeño saliente redondeado a cada extremo. Suelen tener una gruesa gota central.

Hábitat: en primavera en bosques de pinares.

Gyromitra esculenta: «Bonete»

Sombrero: 4-10 cm de diámetro, generalmente mas ancho que largo, con numerosos pliegue que le da aspecto de cerebro. Color pardo-castaño.

Pie: corto, con zonas huecas y algunos surcos, blanquecino o crema algo rosado.

Esporada: marfil.

Espora: elípticas, 18-24 x 9-12 μm, lisas, generalmente con dos gotas internas.

Hábitat: aparece en primavera y prefiere pinares de suelos ácidos.

Toxinas: el Acido helvellico, al que se atribuía antiguamente la toxici-dad de las giromitras, es una mezcla de ácidos carboxílico y no es tóxico. En 1967 List y Luft demostraron la presencia de más de diez hidracinas en estas setas siendo la más abundante la Giromitrina (metil-etil-hidra-cina). En el organismo, por hidrólisis, la giromitrina se transforma en monometilhidracina que actúa bloqueando todos los procesos metabóli-cos que tienen como coenzima el fosfato de piridoxal. Por ello produce una afección multisistémica: cardiocirculatoria, neurológica, hepática y renal, acompañada de hemólisis.

Mutagénico ycancerígeno

MonometilhidracinaGiromitrina


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La dosis letal para el hombre probablemente oscile entre 30-50 mg. de giromitrinas por kilo de peso corporal para el adulto (4,8 a 8 mg. de MMH/Kg) por lo que haría falta ingerir mucha cantidad de setas frescas para intoxicarse gravemente. La giromitrina es una toxina termolábil y volátil lo que explica que no se hayan dado nunca casos de intoxicación con los hongos bien cocinados o secos. De hecho en otros países de Europa se hace un gran consumo de estas especies.

Síntomas: sólo si se ingieren las setas frescas o poco cocinadas se presentan, entre las 6-24 horas postingestión, trastornos gastrointestina-les: epigastralgia, náuseas, vómitos y diarrea. Cefalea y malestar general. La mayoría de los casos suelen recuperarse entre 1 o 6 días. En cuadros más severos se producen alteraciones de la conciencia, convulsiones, coma, taquicardia, hemólisis, insuficiencia hepática y renal -como con-secuencia de la hemólisis- complicadas por la hipovolemia.

Tratamiento: abundantes líquidos para prevenir el daño renal por hemólisis. Como antídoto específico de las hidracinas se administrará vitamina B

6 (piridoxina) a dosis altas por vía intravenosa.

Hoy en día todavía queda por explicar porqué en muchos casos indi-viduos de la misma familia han sufrido una intoxicación mortal, mientras que otros no han tenido ninguna molestia tras la ingestión de estos hon-gos. En algunos ejemplos se ha hablado de casos de anafilaxia o de una predisposición individual.


Muestras botánicas: giromitrina mediante HPTLC (2), Cromatografía de gases (GLC) (17)

2.2.3 Intoxicación por setas nefrotóxicas: síndrome orellánico

Con anterioridad al año 1952, en que ocurrieron varias intoxicaciones mortales en Bydgosz (Polonia), los libros de micología calificaban de comestibles a los cortinarios. De las 102 personas que se intoxicaron, 11 de ellas fallecieron entre 4-16 días post ingesta por fallo renal agudo. Hoy en día se sabe que, al menos dos especies, son severamente tóxicas: Cortinarius orellanus y C. speciosissimus.


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Especies causantes

Cortinarius orellanus:

Sombrero: 3-8 cm, al principio es convexo, algo giboso y luego abier-to, De colores vivos, rojo anaranjado oscuro o pardo rojizo.

Láminas: adherentes o algo escotadas. de color rojizo-herrumbrosas.

Pie: casí cilíndrico, liso, amarillo, ocre-dorado un poco azafranado. Cortina: amarillenta que desaparece pronto sin dejar señal.

Esporada: pardo herrumbre.

Espora: elipsoidal, algo almendrada, de 8,5-12 x 5,5-7,5 μm, finamen-te verrugosas.

Hábitat: se ha citado en Cataluña y en la Sierra de Guadarrama, pero es muy raro en España.

Confusión: con otros Cortinarius.

Cortinarius speciosissimus


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Sombrero: 2-8 cm, convexo, extendiéndose con un mamelón puntia-gudo, rojo tostado, con margen amarillento cubierto de escamas diminu-tas. Fuerte olor a rábano.

Láminas: un poco escotadas, de ocráceas a ferruginosas, anchas, espaciadas.

Pie: 5-11 cm, fusiforme, ocráceo pálido, luego ferruginoso con placas amarillas.

Esporada: pardo-herrumbre

Espora: elipsoides, 9-12 x 6-9 μm, con punteado verrugoso.

Hábitat de septiembre a noviembre en bosques de coníferas y en turberas.

Toxinas: Los cortinarios contienen diversas sustancias de estructura complicada, que no se conocen todavía en su totalidad. Entre ellos des-tacan, como mejor estudiados, la orellanina, identificada por Grzymala (1965), de naturaleza bipiridílica similar a los herbicidas de tipo paraquat y las cortinarinas, de naturaleza ciclopeptídica. En la actualidad se acepta que la mayor parte de la toxicidad deriva de la orellanina, que es un derivado dióxido de tetrahidoxibipiridilo, dotado de un marcado tropis-mo por el tejido renal. Es resistente a la cocción y presenta fluorescencia azul a la luz ultravioleta. Cuando pierde un átomo de oxígeno ligado a N se transforma en la Orellinina que también es tóxica. Cuando pierde los dos oxígenos se transforma en orellina, que no es tóxica.

Orellanina Orellinina Orellina

La cantidad de orellanina en hongos secos de C. orellanus es de 14 mg/g y de 9 mg/g para C. speciosissimus. De 100 a 200 g (3 a 10 som-breros) de setas frescas pueden producir un daño renal irreversible en adultos.

Aunque las características clínicas de la intoxicación orellánica es bien conocida (18) poco se conoce sobre su mecanismo patogénico. Los resultados de los análisis de laboratorio a partir de muestras de plasma, orina, fluidos de diálisis y material de biopsia renal después del comien-


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zo de los síntomas, mediante TLC (19), revelan que la toxina se fija a los riñones y por lo tanto en las muestras de orina, plasma y fluidos de diálisis no se detecta su presencia. Sin embargo, se puede detectar cua-litativamente pequeñas cantidades de orellanina a partir de material de biopsia renal, durante un período de tiempo relativamente largo, desde las primeras manifestaciones clínicas.

Síntomas: Tras un largo periodo de latencia de 2-3 días, incluso llega a veces a ser de 17 días, se presenta un cuadro de sed intensa que se acompaña de poliuria y malestar general inespecífico. Poco a poco evoluciona hacia una grave insuficiencia renal, por nefritis túbulo inters-ticial, que puede llegar a ser irreversible. En ocasiones hepatitis leve. Los síntomas digestivos prácticamente no existen.

Tratamiento: no existen antídotos específicos contra las orellaninas. Por lo tanto el tratamiento es sintomático y de soporte. Al inicio, plas-maféresis o hemoperfusión con resinas. Si se presenta una insuficiencia renal no hay otra opción que la hemodiálisis o trasplante renal debido a la irreversibilidad del cuadro.

Casuística: En 1998 se produjo en España el primer caso de una intoxicación voluntaria por Cortinarius orellanus. El paciente, ex-droga-dicto, consumió dos ejemplares de esta especie porque estaba conven-cido de que tenía los mismos efectos que las «setas mágicas» (20). Hoy en día, debido al incremento del consumo de los hongos psilocíbicos, es importante considerar esta posibilidad cuando se investiga la etiología de una nefritis tubulo-intersticial aguda.

Amanitas nefrotóxicas: Se han descrito intoxicaciones nefrotóxicas por setas pertenecientes al género Amanita. Por un lado, en América se han recogido 5 episodios con una grave insuficiencia renal producida por la ingestión de Amanita smithiana. Por otro lado, la especie respon-sable de este tipo intoxicación en Francia e Italia durante los años 1991 y 1992 ha sido Amanita prossima (21), muy parecida a Amanita ovoidea, especie apreciada como comestible en la Europa meridional.


Muestras botánicas: orellanina mediante TLC (19)

Muestras clínicas: Biopsias de riñón: orellanina mediante TLC (19)


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2.3 Nuevas Patologías Asociadas A Las Setas

2.3.1 Rabdomiolisis

Tricholoma equestre : «Seta de los caballeros». También es conocida como Tricholoma flavovirens.

Sombrero: 5-8 cm, convexo expandido, de amarillo a amarillo pardus-co, con disco central más oscuro.

Láminas: escotadas, de amarillo azufre a amarillo limón.

Pie: 5-10 cm, amarillo pardo con fibrillas parduscas.

Esporada: blanca.

Espora: 6-8 x 3-5 μ,m, ovales, hialinas, lisas.

Hábitat: bosques de coníferas.

En el año 2001 la revista New England Journal of Medicine (22) repor-taba 12 casos de rabdomiolisis asociados al consumo de setas. Cinco hombres y siete mujeres fueron hospitalizados en Gironde (Francia) entre 1992 y 2000 con rabdomiolisis severa que apareció aproximadamente a la semana de comer la especie Tricholoma equestre, considerada desde antiguo como comestible de gran calidad. Los síntomas que mostraban eran fatiga y debilidad muscular acompañada de mialgia principalmente en la parte superior de las piernas. Estos síntomas se acompañaron de eritema facial, nauseas sin vómitos y sudor profundo en ocho pacien-tes. De los doce casos, tres fallecieron. Se descartó el que fuera alguna enfermedad bacteriana, viral o inmunitaria. Todos habían tomado como mínimo en tres ocasiones consecutivas la misma especie, recolectada en pinares de la costa del sudoeste francés entre finales de otoño y princi-pios de invierno.

Otra especie responsable de un síndrome de rabdomiolisis en Taiwán ha sido Russula subnigricans (23). El género Russula se clasifica como causante de síndrome gastrointestinal y en ese país se han detectado


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altas concentraciones de cadmio en los ejemplares; no obstante, este metal nunca ha dado lugar a rabdomiolisis por lo que se atribuye el cuadro a alguna toxina de la seta.

2.3.2 Eritromelalgia

En el año 2001 se publica la aparición de un cuadro de eritromelalgia en dos familias francesas. Al cabo de más de 24 horas de haber ingerido Clitocybe amoenolens, confundida con Lepista inversa, los pacientes se quejaban de parestesias seguidas de un dolor intenso y edema eritema-toso en los dedos. Un síndrome similar ya había sido descrito en Asia originado por Clitocybe acromelalga, especie que contiene ácidos acro-mélicos, agonistas de los receptores glutamato (24).

3. METODOLOGÍA EXISTENTE PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

3.1 Tipos De Muestras

3.1.1 Muestras Botánicas

Siempre que se sospeche una intoxicación por setas se debe estable-cer cuál es la especie responsable de producir la intoxicación. Para ello se recurre al estudio de las muestras botánicas disponible que pueden ser: 1. setas que hayan quedado sin cocinar. 2. restos extraídos de la basura y 3. sobras del guiso. En caso de no poder disponer de ninguna de estas muestras, se recomienda hablar con los familiares o compañeros y, si es posible, volver al lugar donde fueron halladas las setas y reco-lectar nuevos ejemplares. No hay que olvidar que uno de los objetivos del diagnóstico de laboratorio consiste en establecer cuales son las setas que realmente intoxican y de esta manera poder aportar nuevos taxones al catálogo de especies tóxicas. Un ejemplo lo encontramos en el año 1984 cuando por primera vez se probó que la especie responsable de las intoxicaciones ciclopeptídicas en España podía pertenecer también al género Lepiota y no sólo al género Amanita (25).

3.2.2 Muestras clínicas

Por un lado, el análisis se basa en la búsqueda e identificación de estructuras fúngicas en contenido de estómago y heces. Por otro lado se


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trataría de demostrar la presencia de toxinas en muestras procedentes de los fallecidos: orina, sangre, vísceras.

3.2 Clasificación Botánica

3.2.1 Características macroscópicas

En los hongos superiores distinguiremos dos partes: el sombrero y el pie. En el sombrero nos fijaremos en su forma, bordes y color. Por enci-ma puede presentar unas placas a modo de manchas que son los restos del velo universal que cubría el hongo. Por debajo del sombrero puede haber láminas, como la mayoría de las especies tóxicas, poros (Boletus satanas) o aguijones. En el pie es interesante observar el modo de inser-ción de las láminas, la longitud, la consistencia, el color. El pie puede presentar un anillo (Amanitas, Agaricus), una cortina (Cortinarius) y/o una volva que es una especie de estuche que rodea al pie por la parte inferior (Amanitas). La carne puede variar en su consistencia, color, olor y sabor.

Anillo

volva

pie

Láminas PorosAguijones

Membranosa Verrugosa Anillada

A. phalloides A. muscaria A. pantherina

Bordes de sombrero Formas de Sombreros

Escotada Decurrentes Ventruda

Libre Adnata Sinuada Dentada

Sombrero

Sobre el sombrero- Verrugas

- Areolas- Escamas

Liso Estriado Acanalado

Ondulado Estriado Reticulado

Enrollado Vuelto

Delgado Cilíndrico Bulboso Sinuoso Atenuado Hinchado

Macizo Obeso Radicante Hueco

Lateral

Plano Deprimido Convexo

Esférico Hemisférico Cónico

Convexos Mamelonado

subesférico mamelonado acampanado


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Esporada: masa de esporas que deposita elsombrero de una seta sobre una superficie

cualquiera.

El color de la esporada es típico de cadagénero: Blanca: Amanitas, Clitocibes

Rosa: Entolomas

Amarilla: Inocibes

Herrumbre: CortinariosNegra: Coprinos

3.2.2 Características microscópicas

De forma especial se estudian las esporas por ser la estructura fúngica que más información aporta. Para ello, mediante el uso del microscopio óptico (100X), se anota el color, la forma, el tamaño y la ornamentación de la espora y se utiliza el reactivo de Melzer. Con esta tinción la pared esporal puede dar una reacción amiloide, produciendo una coloración azul más o menos intensa como en las esporas de Amanita phalloides, Amanita virosa y Amanita verna; una reacción dextrinoide de colo-ración marrón como en las esporas de diferentes especies del género Lepiota, o bien, no dar respuesta al reactivo como en las esporas de Amanita muscaria y Amanita pantherina (26). De todas ellas, la más difícil de reconocer es la reacción amiloide puesto que a veces se trata de un gris suave o con un ligero matiz azul-grisáceo. La reacción ami-loide es más fácil de observar en la ornamentación de la pared esporal, verrugas, espinas, etc,

Cuando la muestra es un aspirado gástrico, se filtra y se procede a la identificación del posible resto de seta. Los aspirados sin restos aparentes de setas y las heces se homogeneizan por sonicación. La concentración de restos fúngicos se lleva a cabo mediante centrifugación a 3.000 rpm durante diez minutos. El sedimento obtenido se suspende en agua en una proporción 1:1 aproximadamente. La observación con el microsco-pio óptico (40X y 100X) se realiza tras depositar una gota del sedimento sobre un porta-objetos y colocar encima el cubre-objetos. Estas prepara-ciones también se examinan con reactivo de Melzer, añadido por capila-ridad, para el estudio de la pared esporal.

Aunque existe la posibilidad de identificar ciertos géneros de setas mediante el examen de esporas extraídas del contenido de estómago o de las heces (27), apenas existe bibliografía sobre el éxito de esta técnica. Nuestros resultados han sido infructuosos la mayoría de las veces y en


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aquellos casos en los que se han detectado fragmentos de setas, la mayo-ría de las veces, no se han podido identificar posiblemente debido a la alteración de las estructuras fúngicas. Pensamos que la ausencia de restos fúngicos puede deberse al largo tiempo transcurrido entre la ingesta de las setas y la toma de la muestra.

3.3 Investigación De Toxinas

3.3.1 En muestras botánicas

La búsqueda de las toxinas en muestras botánicas es de gran utilidad, tanto para casos en los que no se haya podido establecer la especie tóxica como para confirmarla. Hay métodos rápidos con valor orientati-vo, como el test de Wieland para amanitinas, y métodos confirmativos, de los que el más sencillo y económico es la cromatografía en capa fina (3). También hay técnicas más sofisticadas como la cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC), la cromatografía de gases (CG) o el radioinmunoanálisis (RIA), que no siempre están al alcance de todos los laboratorios.

Debido a que el método más rápido y sencillo para la detección de amanitinas en muestras botánicas es el test de Wieland o Meixner, cono-cido también como el test del «papel de periódico» (15) lo describimos a continuación:

En un trozo de papel de periódico en blanco se marcaron tres cír-culos, uno para la muestra problema sobre el que se deposita un trozo exprimido de la seta problema, en el segundo se deposita un trozo expr-mido de Amanita phalloides como control positivo y en el tercero, con-siderado como control negativo sin muestra. Todos ellos se dejan secar y, a continuación, se añade una gota de ácido clorhídrico 10N en los tres círculos (fig. 1). Una reacción de color azul o azul-verdoso al cabo de unos minutos se interpreta como probable presencia de amanitinas. El test de Meixner para el estudio de amanitinas es un método rápido y sencillo pero, como no es específico, su interpretación requiere cierta cautela. Se han descrito en la literatura falsos positivos con diferentes especies de setas (28) e incluso con extractos de psilocibina (29). En nuestra experiencia hubo un caso de setas cocinadas en el que el test era de difícil interpretación. Por lo tanto, siempre que sea posible, se deben aplicar métodos de confirmación.


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Test de Meixner. 1. Amanita hepatotóxica cocinada; 2. control positivo. Amanita phalloides cruda; 3. control negativo

3.3.2. En muestras clínicas

En general, las setas hepatotóxicas son las responsables de haber producido el mayor número de muertes por ingestión de setas. Debido a que sus toxinas se eliminan principalmente por la orina, el poder deter-minar su presencia en este tipo de muestra sería definitivo. En plasma los niveles son muy bajos, de hecho se ha comprobado que en el mismo momento de la intoxicación, los niveles séricos de amatoxinas son de 100 a 150 veces menores que las registradas en la orina. Hoy en día los laboratorios Bühlmann (Switzerland) han diseñado un kit «Amanitin Elisa» que permite su detección de forma rápida pero los resultados son fiable únicamente en las primeras 48 horas post-ingesta. Esto es un gran inconveniente para las muestras forenses puesto que un fallecimiento por este tipo de setas sobreviene aproximadamente al cuarto-quinto día post-ingesta. En nuestra experiencia los casos en los que se tenían datos bastante certeros sobre la posibilidad de una intoxicación ciclopeptídica nunca se ha detectado presencia de amanitinas en las muestras de orina post morten.

3.4. Remisión De Muestras

Muestras botánicas: se deben de enviar, si es posible, tanto las setas crudas como las cocinadas. Se enviarán por separado en botes de plástico. Rotular.

Muestras clínicas: Orina: Se toma una muestra de unos 10 ml en un tubo que si es posible se introducirá en tubo de transporte. Enviar refrigerado. Es muy importante indicar el tiempo transcurrido desde la ingesta hasta la toma de la muestra.


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Contenido de estómago: Se envía el contenido en un bote de plásti-co. Si se detecta presencia de setas en el contenido, remitirlas por separa-do. Enviar refrigerado. Es muy importante indicar el tiempo transcurrido desde la ingesta hasta la toma de la muestra.

Vísceras: en formol al 10% a partir de la solución comercial. Hígado, Riñón etc.

Rellenar formulario: El conocimiento de datos generales relaciona-dos con la intoxicación, datos clínicos y datos botánicos respecto a las setas ingeridas son de gran ayuda no sólo para el diagnóstico de labora-torio sino para estudio epidemiológico.

Datos generales de la intoxicación: Fecha y hora de la intoxicación. Período de incubación. Primeros síntomas. Tipo de intoxicación. Si ingi-rió alcohol. Ingreso hospitalario.

Datos clínicos: Antecedentes personales y toxicológicos. Tratamiento instaurado. Datos analíticos (transaminasas, creatinina, etc).

Datos de la seta/s responsables: Lugar geográfico de recolección. Hábitat. Causa de confusión. Número de especies consumidas. Cantidad consumida. Forma de consumirlas. Si fueron nuevamente consumidas.

4. NUEVAS TECNOLOGÍAS BASADAS EN EL ADN

La tecnología de análisis del ADN y más concretamente la técnica de amplificación génica (PCR), no sólo ha permitido conocer las diferentes características del genoma humano sino las de cualquier organismo bio-lógico, procariote, vegetal, animal o fúngico. Debido a la exactitud, preci-sión y sensibilidad de estas técnicas, hoy en día la sistemática molecular está complementando e incluso a veces sustituyendo a la sistemática tra-dicional basada en el estudio conjunto de los caracteres macroscópicos y microscópicos.

Las regiones de ADN mitocondrial y nuclear que tienen un mayor interés tanto en estudios de filogenia como en taxonomía de hongos, son las que codifican para el ARN ribosómico. El ADNr mitocondrial consta de dos genes, 16S y 23S, que se repiten espaciados a lo largo de su genoma. Por el contrario el ADNr nuclear tiene muchas copias, desde 60 en el género Coprinus hasta 220 en Neurospora, que se repiten en tandem y se trata de un sistema complejo que incluye los genes 18S, 28S y 5.8S ARNr. Las secuencias de estos genes están separadas por dos espa-ciadores internos que se transcriben, llamados ITS-1 e ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) de una longitud entre 200 y 400 bases. Entre estos


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genes hay un espaciador intergénico que no transcribe, llamado IGS (non-transcribed intergenic spacer).

ADN nuclear: Gen ribosomal ADN mitocondrial: Gen ribosomal

ADNr: s. pequeña

ADNr: subunidad grande

ARN: 18S ARN: s. grandeITS1 ITS2

5.8S 5S

IGS

Las secuencias de los genes ARNr del genoma mitocondrial y nuclear están muy conservadas, evolucionan lentamente y por lo tanto son las más utilizadas para obtener información sobre las relaciones de filogenia. Las zonas no codificantes del ADNr nuclear (ITS-1, ITS-2 e IGS) son más susceptibles de acumular mutaciones y por lo tanto tienen gran interés en el estudio de la identificación y tipificación de especies fúngicas. El diseño de cebadores universales dentro de las zonas altamente conser-vadas de los genes ARNr para PCR (30) ha permitido amplificar las regiones ITS-1, ITS-2 e IGS en un amplio rango de organismos.

Existen diferentes metodologías, todas ellas basadas en la PCR, que permiten diferenciar las especies de setas. Para amplificar cada una de las regiones diana con interés en taxonomía (a veces el genoma entero) se diseñan cebadores específicos para ellas y los productos amplificados pueden ser caracterizados de diferentes maneras. Las técnicas más utili-zadas en micología son:

Random Amplification of Polymorphic DNA: ADN polimórfico ampli-ficado al azar (RAPD), PCR/Restriction Fragment Length Polymorphism: análisis del polimorfismo de los fragmentos de longitud (PCR/RFLP) y Amplified Fragment Length Polymorphism: amplificación de fragmen-tos de longitud polimórfica (PCR/AFLP): todas estas técnicas permiten obtener para cada organismo, una serie fragmentos del ADN de dife-rentes tamaños que dan lugar a un patrón de bandas conocido como «DNA fingerprints» o huella genética. Ello se consigue mediante el uso de pequeños cebadores de secuencia arbitraria: fingerprints RAPD (Figura 1) (31) o utilizando enzimas de restricción: fingerprints RFLP (figura 2) (32) y fingerprints AFLP (31). En todos estos polimorfismos no se sabe cuál es el locus que produce cada uno de los fragmentos, por lo tanto aportan poca información sobre su variabilidad. Aunque son técnicas fáciles y rápidas de realizar, el principal inconveniente es la dificultad en obtener una reproducibilidad aceptable entre laboratorios.


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- 33 -

Genoma entero

Separación electroforética:fragmentos amplificados

DetecciónAmplificación5´ 3´

3´ 5´ 3´ 5´

5´ 3´

5’3’

5’ 3’

Iniciadores de secuenciaarbitraria

Método de análisis de polimorfismosPCR/RAPD: ADN polimórfico amplificado al azar

Figura 1

+

Método de análisis de polimorfismos PCR/RFLP:polimorfismos de fragmentos de longitud

Separación electroforética:fragmentos de restricción

Detección

Lugar de restriccióndonde los enzimas

cortan el ADNde forma específica

AmplificaciónRegión diana

B

CD

F

Enzimas de restricción

Digestión

ITS-1 ITS-2

A

C

E

D

B

F +

Figura 2

PCR/Single-Stranded Conformation Analysis: análisis de conformación de las cadenas desnaturalizadas PCR/SSCA (Figura 3): es un método rápido y económico para detectar polimorfismos de secuencias sin necesidad de secuenciar. La aplicación de esta técnica por nosotros en el estudio de las regiones ITS-1 e ITS-2 a partir de diferentes especies de setas comestibles y en


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algunas de las especies tóxicas más frecuentes demostró, por un lado, un alto grado de variación entre las especies, ya que cada una podía ser diferenciada en base a su patrón de bandas PCR/SSCA y, por otro lado, un cierto grado de variación intraespecífica. Al igual que ocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siempre reproducible pero puede utilizarse como método de screening previo a la secuenciación (33).

Método de análisis de polimorfismos PCR/SSCA:análisis de conformación de las cadenas desnaturalizadas

Separación electroforética:desnaturalizante: Gel MDE


ITS-1 ITS-2

Detección La movilidad del ADN de cadenasencilla varía con cambios en la

composición de bases

Desnaturalizar

57 58 59 60 61

ITS-2

57 58 59 60 61

ITS-1

Figura 3

PCR/secuenciación (Figura 4): el método más fiable y sensible para detectar y comprender mejor la diversidad genética es la secuenciación directa de los productos de amplificación de la región diana. La técnica más utilizada es la secuenciación cíclica con terminadores marcados. Las secuencias de nucleótidos obtenidas para las regiones diana en cada organismo y en diferentes laboratorios pueden ser comparadas y publi-cadas en bases de datos electrónicas (GENBANK, EMBL etc) y de esta manera se facilita la comparación entre ellas y con las de otros taxones.

Método de análisis de polimorfismosPCR/Secuenciación


ITS-1

Figura 4

Secuenciacióncíclica con

Terminadores

Marcados confluorocromos

Separación electroforética

Edición de laPRIMER DIRECTO

PRIMER REVERSO

secuencia


4096

Si comparamos las secuencias entre individuos de una misma especie de seta o de especies distintas, se puede establecer el grado de variabilidad que existen entre ellas y tratar de desarrollar un test específico con fines identificativos. Un ejemplo lo aporta un estudio realizado a partir de cinco especies diferentes del género Psilocybe y otras cinco del géne-ro Paneolus. Por los datos de secuencia ITS-1 obtenidos se estableció que dentro de esta región hay una zona determinada cuya secuencia es común a estas especies y que además no se encuentra en ningún otro genoma de hongos. Conociendo su ubicación se diseñaron unos cebado-res flanqueantes a esta secuencia. Estos productos amplificados sólo se generan en presencia de ejemplares pertenecientes a uno de estos dos géneros y por lo tanto son específicos de ellos (34).

La creación de una base de datos de estas regiones no codificantes, a partir de especies tóxicas de la península ibérica, está siendo objeto de investigación en nuestro laboratorio.

Ultimamente cobra interés el estudio de polimorfismos de sustitución de un nucleótido (SNP): se trata de fragmentos homólogos de ADN cuya secuencia difiere en tan solo un nucleótido. El desarrollo de nue-vas tecnologías, como la secuenciación directa, micro-arrays de ADN, espectrometría de masas, Real-Time PCR (RT-PCR) etc, y su aplicación al estudio de los SNP´s está siendo de gran utilidad en el estudio del genoma humano y es de prever que también contribuya al avance en la investigación genética de las setas.

El desarrollo de los métodos de biología molecular aplicados al diag-nóstico de las intoxicaciones por setas constituirá un nuevo campo de estudio dentro de la toxicología.

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