med rettelser / forbedrings-ideer Skriftlig svar på oppgavene 1 – 6 …folk.ntnu.no/audunfor/6. semester/Kromatografi/Eksamen LF... · 2013-05-03 · KROMATOGRAFI Mandag 22. mai

Kandidat-nr.: ..........................................Studieprogr.: ................................... (frivillig)

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITETINSTITUTT FOR KJEMI

Faglig kontakt under eksamen: Institutt for kjemi;Professor Anne Fiksdahl, tel. 735 94094(Faglærer F.-Aman. Rudolf Schmid (evt. M.: 913 75 546))

MED LØSNINGSFORSLAG

Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI

Mandag 22. mai 2012, kl. 9.00 – 13.00 (4 timer)

Bokmål

med rettelser / forbedrings-ideer

Skriftlig svar på oppgavene 1 – 6 7 skal gis på oppgavearkene bak som skal innleveres

(bruk ekstra ark om nødvendig)

Hjelpemidler: D Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt. Bestemt (godkjent) enkel kalkulator tillatt.

Dette oppgavesett består av tretten - 13 - sider : 1 forside (s. 1), 12 sider med 6 oppgaver (s. 2-13)

Vektingen av hver (del-)oppgave er oppgitt. Maks. poengtall er 102. Karakterskalaen (100%) tar utgangspunkt i 100 poeng.Det skal ikke skrives med blyant, fordi du ikke kan ha med deg gjennomslag av svarene dine (sikkerhetskopi).

……………………………………………………….. Rudolf Schmid

Eksamensansvarlig faglærer

Oppgavesettet er kontrollert :

…………………………………………………Morten Martinsen

Sensor

Sensurdato : Fredag, 12.06.2012

Eksamen KJ 2053 / 2012 – Vår – bokmål (22.05.2012) Kandidat-nr. ………..…..………. Side 2 av 14

Oppgave 1 - 6 Besvares på oppgavearket og innleveres

___________________________________________________________________________

Oppgave 1. (19 p.)a.) Skriv ned formelen til den forenklede "van Deemter-ligningen", (1+10 p.)

h = A + B/u + C u = A + B/u + CMF u + CsMF u + CSF u (= HE + HL + HMF + HCsMF + HSF )

el. evt.h = B/u + ( 1/A + 1/(C u) )-1

og benevn og forklar kort leddene i ligningen. (i) A = Eddy Diff.

=cA dp dp =Partikkeldiameter

(ii) B/u = bidrag fra Longitudinal diffusjon B = cB Dx,MF

Dx,MF = Diff konst av analytt X I MF

(iii) C = massetransfer-termen (= C tmt(SF-MF-SF )

eller oppdelt : CMF = bidrag fra massetransfer i mobil fase = cMF dp

2 / DMF

(iv) CsMF = bidrag fra massetransfer i stillestående mobil fase = csMF dp

2 / DMF

(v) CSF = bidrag fra massetransfer i stasjonær fase= cSF df

2 / DSF Dx,MF = Diff.-konst. av analytt X I SF

1.b.) (2p) Illustrer v.h.a. en skisse av "van

Deemter-kurven" ( bruk som eksempel gasskromatografi.

og / eller kombinert med

vanDeemter-kurve for GC

Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:38 2053_eksam-2012-V-H-B_a_med svarforv_ok-post.doc


1.c) Hva er sammenhengen … (1p) (i) … mellom k, tR og t0 ?

k = tR-t0/t0 eller tR = t0(1+k)

(1p) (ii) … mellom k og R ?

k = (1-R) / R = (1/R) -1 og /eller R = = 1/ (1+k)

(2p) (iii) … mellom N og Neff ?

N = 5,54(tR/w 0,5)2

Neff = 5,54(t’R/w 0,5) 2 = 5,54 ((tR –t0) / w 0,5) 2 N / Neff = (t / t’ )2 = ((k+1)t0 / k t0 )2

N = Neff (( k+1) / k )2 ; N = Neff = N (k / ( k+1) )2

(2p) (iv) …. mellom N og RS ?

RS = ¼ k / (1 +k) N ½ (α - 1) / α = ¼ √Neff1/2 (α - 1) / α

og evt. Nreq = 16 (RS)2 ) (α /(α - 1 ))2 ((k + 1)/ k)2

(1p) (v) Hvordan kvantifiseres topp-asymmetri i et kromatogram (gi en formel, evt. med en forklarende skisse)?

Asymmetri-parameter (blant flere mulige) :

f.eks. AS = b / a

(a, b, jfr. figuren, c = 0,1 hmax)



Oppgave 2. ( xx p)

2.a (8p)(3p) (i) Forklar og skissér hvordan en kvantitativ analyse utføres v.h.a. intern standard, IS :

Innledningsvis settes en standardkurve opp på grunnlag av en serie analyser av stoffet i ulike kjente konsentrasjoner tilsatt en (helst fast) kjent mengde IS. Integralforholdet (areal/evt. topphøyde) stoff/IS plottes mot vektforhold av prøve (evt. mot vekt når tilsatt mengde IS er konstant, se lærebok, s. 292, fig. 16.4)Tilsats av en kjente mengde (gjerne den samme) IS til den ukjente prøven gir oss integralforholdet ukjent prøve/IS. Standardkurven tillater deretter avlesning av mengde/konsentrasjon stoff i prøven.

(2p) (ii) Hvilke krav stilles til en intern standard, IS ? Nevn flest mulig.IS må: - gi en topp nær, men sep. fra analysert stoff (og evt. andre stoff i prøven),

- ha like kjemiske og fysikalske egenskaper med analysert stoff,- ikke finnes i prøven eller overlappe med andre stoff i prøven,- være stabil,- være tilgjengelig i ren form,- tilsettes i en kons. sammenlignbar med kons. i prøven.

(1p) (iii) Hvilke feilkilder elimineres særlig ved denne metoden, IS ?

Bruk av IS eliminerer feil pga.:- unøyaktighet i injisert volum, - ustabile kromatografiske betingelser, - stofftap i prøveopparbeidelse (dersom IS tilsettes før prøveopparb., (”surrogat-IS”))

(2p) (iv) Hva er sammenhengen mellom Intern standard metoden og den Relative respons-faktoren (RRF)? Sett opp formelen for utregning av RRF (med en kort forklaring).

RRF-metoden er forenklet ISTD-metode m. bruk av ett-punkts-kalibrering (Forutsetter lineær kalibrering og at kurven går gjennom origo)

og



2.b) (1p) (i) Hva er det lineære område av en detektor.

(IUPAC) Området av konsentrasjonen - eller massestrømmen (mass flow) - av et stoff i mobilfasen i detektoren, innenfor hvilket følsomheten (responsfaktoren, sensitivity, S) av detektoren er konstant innenfor spesifiserte grenser ± x (vanligvis ± 5 %).

Innenfor det lineære området øker detektor-signalet y lineært (proporsjonalt) med konsentra-sjonen c eller massestrømmen dm/dt - "detektoren er lineær".

(1p) (ii) Hva er det dynamiske området av en detektor ? Er det dynamiske området anvendbar for kvantitative analyser ?

(IUPAC) det dynamiske området, (Dynamic Range) for en detektor er ”Området av konsentrasjonen - eller massestrømmen (mass-flow) - av et stoff i mobilfasen i detektoren, innenfor hvilket en liten økning i konsentrasjon eller massestrøm produserer en økning i detektorsignal; ikke (nødvendigvis) lineær. Detektoren kan brukes til kvantitativ analyse innenfor det dynamiske område. Men kalibreringen blir mer krevende; særlig kan IKKE ett-punktkalibrering brukes. (Det dynamiske området er alltid større enn det lineære området.)

Når det diskuteres usikkerhet av et analyseresultat: (1p) (iii) Hva menes med ”presisjonen” av et analyseresultat ? Hvordan rapporteres den i

resultatet ?

Presisjonen er måleusikkerheten i et analyseresultat som er bestemt av tilfeldige feil – den bestemmer reproduserbarhet/repeterbarhet av resultatet (f.eks. av tR, hmax, toppareal). Kontroll med tilfeldige feil fås ved å gjenta målingene slik at det blir grunnlag til å kunne vurdere presisjonen v.h.a. statistikk : Mål for presisjon er ofte : standardavvik (med antall målinger oppgitt) av måleresultatene. (eller f.eks. konfidensintervall).

(2p) (iv) Hva menes med ”nøyaktighet” av et analyseresultat ? Hvilke metoder kan brukes for å sjekke nøyaktigheten til resultatene av en kromatografisk analyse ?

Nøyaktigheten bestemmes av systematiske feil (eng.: accuarcy) .Systematiske feil kan skyldes "personlige feil", instrumentelle feil, metode-feil; oppdages ikke ved gjentak av analysen. Nøyaktighetssjekk: bl.a. analyse av standarder, blindprløver, spikede prøver (gjenvinning), sertifiserte refereansematerialer (med ”nøyaktig kjent” innehold), sammenligne egne resultater med andre lab’er s resultater.



(1+2p) Oppgave 3. (yy p) 3.a) (i) Navngi og beskriv kort hovedkomponentene til en ionebytter (generelt). (2p)

- Matriksen: (funksjonalisert) materiale som ioner eller ionogene grupper (ioniserbare funksjonelle grupper) er bundet til, (for ionebyttere for kro.: ikke-løselig, partikkelformet) - Faste ioner (/ funksjonelle grupper): med ladning, kovalent bundne til matriksen - Motioner : ioner av motsatt ladning som kompenserer ladningene til de faste ionene, elektrostatisk bundet, eller oppløst og flyttbar i elektrolytt, innenfor ionebytteren. - Evt. elektrolytt : ion-solvatiserende løsningsmiddel med oppløste ioner/salt

(4p) (ii) Tegn de kjemiske strukturene til ”retensjonspunktene” for hhv. kationer og anioner i ionebytterkromatografi, IEC (2 for hver ion-type)

for kationer :R-SO2

- R-COO -

(sterkt sur) (svakt sur)

for anioner: R-N+HR’2 R-N+(R’3) R’ = metyl el. etyl (svakt basisk) (sterkt basisk)

eller andre ammonium-/amingrupper

3.b Når det i superkritisk fluid kromatografi, SFC, brukes gradienter kan dette typisk gjøres på flere ulike måter. Hvilke parametre kan varieres, nevn minst 3 ?

(3p) 1) tetthets-gradient, (trykk-gradient, ”restriktor-gradient” (?))2) modifikator-gradient, 3) temperatur-gradient



3.c(2p) (i) Når det anvendes Fastfase-ekstraksjon (SPE, Solid Phase Extraction), hvilke

to fordeler kan særlig oppnås med det i forhold til væske-væske ekstraksjon?

- tidsforbruk redusert - og ii)- - løsningsmiddel forbruk redusert

- (evt. høyere utbytte/gjenvinning + evt. bedre reproduserbarhet)

(3p) (ii) Nevn tre viktige typer sorbenter som benyttes til fastfase ekstraksjon, og deres aktuelle kromatografiske separasjonsmekanismer.

- normal fase / silica- omvendt fase / C18 (silica modifiserte silyl-ethere)- ionebyttere (alle typer silica baserte kation/anion, svake/sterke)

3.d For kromatografiske analyser brukes derivatisering av analytter av og til. (i) På hvilke måter kan derivatisering forbedre det kromatografiske resultatet ?

(2p) Nevn 2 generelle (strategier for) derivatisering:- detektor-orientert: skape, eller øke signalet av en analytt i en gitt detektor, når følsomheten

ellers er for dårlig. - kolonne-orientert. muliggjøre eller forbedre elueringen av analytten fra en gitt

kolonnetype. F.eks. øke flyktigheten for å muliggjøre GC-analyser

(ii) Gi et eksempel hver (for 3.d.(i)) som illustrerer bruk av derivatisering: Oppgi (4p) analytt-stoffgruppe, derivatiseringsreaksjon/-reagens-type og hvordan derivatisering

forbedrer konkret det kromatografiske resultat.

Rel. generelle svar godtas (ikke detaljert gjennomgått i pensum) Detektor-orientert: f.eks. binde fluorescenrende grupper eller UV-absorberende grupper til stoffer uten egen kromofor : f.eks. aminiosyrer, (reaksjon på aminogruppen eller på karboksylgruppen mulig). gir respons i Fluo-Det eller i UV-det.

Kolonneorientert: f.eks. silylering eller acetylering av karbohydrater (OH-grupper) for sukkeranalyse v.h.a. GLC, nedsatt polaritet og kokepunkt etter acetylering eller silylering.



Oppgave 4. (xxp)4.a (i) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen ved omvendt fase (RP) HPLC, (2p) angi spesifikt navn og delstruktur.

Oktadekyl-silika (monomer (”brush”))

Silika – O – Si(R’)2 – n-C18 H37 R’ er oftest Metyleller

OSi

OSiO

SiO

SiO

Si

OO

O

O

OO

O

O

Si

H

Si

CH3

CH3

CH3

CH3

SiOO O H

O

OSiCH3

n-C18H37

CH3

O H

CH3n-C18H37

(Her med én ”end-capped-gruppe” (TMS) i midten (ikke nødvendig for å få 2 p))

(ii) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen ved gass-væske-kromatografi, GLC, angi navn og delstruktur.

(2p)

f.eks.Si

OSi

OSi

CH3CH3n

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3

Eksempelet er en metyl-silikon : PDMS = PolyDiMetylSiloksan (også ”PolyDiMetylSilikon”) (alternative produkt-navn : OV-1, OV-101, SE-30, SP-2100, CP-Sil 5, m.fl. ! ).

(iii) Hva betyr ”end-capped” / ”end-capping” og hvor blir det anvendt ? (1p)

Anvendes for alkylsilan-HPLC-stasjonærfaser: restlilanolgruppene som ikke har reagert med dimetyl-oktadekylsilan ettersilaniseres med trimetylklorsilan el.l.: derivatiserer de mest lett-tilgjenglige OH-gruppene til upolare TMS-grupper. Gir bedre toppsymmetri for polare analytter som ellers vekselvirker med rest-silanolene stoffer. Forlenger muligens brukstiden til kolonnene noe, ved å øke stabiliteten i basisk miljø. (hindrer/bremser hydrolyse).

(1p) (iv) Hvilke fordeler har en automatisk prøvegiver/prøveinjektor (Auto(matic) sampler) ved kromatografiske analyser ? Nevn 2 og grunngi kort.

- Forbedrer som regel reproduserbarheten av injeksjoner (i f.t. manuell inj.)- Sparer/frisetter arbeidstid fordi kromatografisystemet kan selv injisere/gjennomføre analyse-serier uten at mennesket trenger å være konstant el. jevnlig tilstede.



4.c Enten Beskriv kort en splitløs injeksjon, hvor og når den brukes, fremgangsmåten, fordeler og ulemper, og lag en skisse over utstyret

(4p)

Eller Beskriv hvilke 2 vanlige injeksjonsmetoder som kan anvendes for kapillær-soneelektroforese.

Ad splitløs injektor- Gjerne enkel skisse- GC-kapillærkolonne teknikk, m. fordampningsinjekter (omtrent som en split-injektor), for sterkt fortynnede prøveløsninger - hele prøven fordampes og sendes inn i kolonna, over en ”lengre” periode (ca. minuttet).- godt resultat er avhengig av ”solvent effect” (løsningsmiddeleffekt) for å unngå toppspredning (i tid og i rom): kald kolonne ved injeksjon som gjør at lsm. kondenserer i kolonneinngangen. - Evt. bruk av retensjons-gap (for kondenseringssone, også som (”guard”-)forkolonne). - Tillater maksimal utnyttelse av veldig fortynnede prøver, litt mindre diskriminering (enn split)- begrensninger: i prøvestørrelse (0,7 – 1,5 uL), i starttemperatur (lavere enn lsm-kp.), krever svært rene lsm.

Ad CZE-injeksonsmetoder: - Hydrodynamisk injeksjon: væskeinjeksjon ifra prøveglasset v.h.a. trykkforskjell (overtrykk, vakuum el. nivåforskjell mellom inn- og ut-gang), udiskriminert transport av hele prøven inn i kapillæren (representativ (sub-)prøve). - Elektrokinetisk injeksjon: ion-injeksjon ifra prøveglasset v.h.a. elektrisk spenning / elektroforetisk transport av prøven inn i kolonne (evt. hjulpet, eller motarbeidet, av elektroosmosebasert væsketransport). Rel. mengder ulike analyttioner i kolonna avviker frå kons. i prøven - er avhengig av deres relative elektroforetiske mobilitet (størst (og i riktig retning) gir størst prøvemengde i kolonna).

4.c) (i) Nevn den viktigste ioniserings-teknikken for GC-MS og skisser (grafisk) ionekilde-prinsippet.

(2p)(i) GC/MS:

EI = Elektron Ionisering (Electron Ionisation) er typisk. En energirik elektronstråle med høy energi ioniserer analytt-molekyler til radikalkationer, som i mer eller mindre stor grad fragmenterer (fragment-ioner kan gi ekstra struktur-informasjon, utover evt. synlig ufragmentert molekyl-ion).



4.c (ii) Skisser og sammenlign kort typiske UV-detektorer som brukes i hhv. HPLC og CZE (4p) (en av hver); vær spesifikt m.h.t detektorens ”UV-celle”.

HPLC :Variabel bølgeølengde-detektor

UV-detektor-”Flow- celle”

typisk ”Z-celle”

I vanlig HPLC er detektoren etter kolonna (unntak noen kapillær-HPLC-systemer), og detektorcellen er som regel noen mm lang og ligger i fokus av en monokrom (vanlig det.) eller polykrom (DiodeArray det.) lysstråle. Rel. lang lysvei i prøven gir rel. god følsomhet (jfr CE), men for lang lysvei gir trang celle med lite lysgjennomgang p.g.a. trang åpning (”liten blender”). CZE :

UV-detektor-”Flow-

celle” = Kapillæren

typisk ”on-column/in-column”

I vanlig CZE skjer UV-deteksjonen typisk inne på fused silica kapillæren ”på-kolonna”, og detektorcellen er da bare 30-100 mikrometer ”lang ”og ligger i fokus av en

monokrom (vanlig detektor) eller polykrom (DiodeArray-det.) lysstråle. Rel. kort lysvei i prøven gir lav konsentrasjonsfølsomhet (kompenseres delvis av høy kolonneeffektivitet: veldig små toppvolum og dermed høy lokal prøve-konsentrasjon).(Ett nytt system bruker Z-cellen (som er vanlig i HPLC)).

(3p) (iii) Ranger HPLC-detektorene basert på fluorescens, brytningsindeks (RI) og UV/synlig lys fra …

… minst til mest følsom: RI-D < UV-D < Fluoresc-D (for analytter som faktisk gir respons (i UV el. Fluoresc.)

… minst til mest selektiv: RI-D < UV-D < Fluoresc-D (RI-D universell, UV-abs er rel.. utbredt, Fluoresc. sjeldent)

… minst til mest ”lettbrukt/ukomplisert”:RI-D < Fluoresc-D < UV-D

- RI-D - trykk-, temp.- & gradient-følsom; - Fluoresc. - følsom mot quenching (bl.a. v. O2 , også flere parametre (eksitasjons-lys), metningsproblem (indre filter-problem));

- UV-D - rel. ukomplisert,



Oppgave 5. (10p)5.a Du ønsker å anvende en isokratisk kiral HPLC-separasjon for å isolere preparativt én av enatiomerene i en

nesten rasemisk blanding (nært like mye av begge enantiomerene).Du har en publikasjon som inneholder ingen kromatogram, bare teoretiske vurderinger og noen avledede parametre. Men du trenger konkrete praksisnære tall om kromatogrammet, bl.a. for vurdering av tidsforbruk, løsningsmiddelforbruk, og om separasjonen blir godt nok for isolering ved gjentatt injeksjon med fraksjons-oppsamling av R-(-)-enantiomeren (topp nr. 1). Selve kolonneformat brukt i publikasjonen er ikke kommersielt tilgjengelig, men en noe mindre kolonne med samme pakningsmaterial kan du kjøpe. Publiserte data:

Kolonna 30 x 0,46 cm, lineær MF-hastighet 7,5 cm/min, N = 12000, k (topp 1) = 7,7, separasjonsfaktor = 1.1, asymmertri ca. 1,2. Tverrsnittareal-andel MF:SF = 40% : 60%.

Din tilgjengelige kolonne er: 22 x 0,46 cm. (Anbefaling: Sett opp dine utregninger først med ”algebraiske formler” her før du setter inn tallene, som forsikring mot numeriske regnefeil)

Regn ut :1p (i) volumetrisk pumpehastighet (i mL/min) på din kolonne, som skal være samme lineære

hastigheten som på kolonna i litteraturen:

Kolonnediameter og tverrsnitt er lik på begge kolonner – lik volumetrisk hastighet, F =u ∙ A = u ∙π∙ r2 = 7,5 ∙ 3,14 ∙ 0,23 ∙ 0,23 =1,2 ml/min: men denne verdien er faktisk …

FEIL : den forutsetter åpent rør uten pakningsmaterial i kolonna: Med pakningsmaterialet tilstede i røret trengs opplysning om ”Interstitial porosity”, d.v.s andelen som opptas av MF av det totale tverrsnitsarealet: det er ca. 0,4 (=40 % , U.Neue ”HPLC Columns” 1997, p.30).

F korrig for pakning: 1,2 ·0,4= 0,48 mL/min.

1p (ii) Anslag for platetall på din kolonne.

Antall er ca. proporsjonalt med kolonnelengden N = 22 x 12000 / 30 = 8800

(Kan evt. utregnes via platehøyde el. plater/meter)

2p (iii) Observert oppløsning, RS , på ”litteratur-kolonna”, og forvented oppløsning på din kolonne (regn uten asymmetri).

Resultatene varierer litt, avhengig av hvilke form av foremlen som brukes:

Rs = ¼ (k/(1+k)) N1/2 (α - 1 )/ α, eller = ¼ (k/(1+k)) N1/2 (α - 1 ), og om det brukes k1 eller k = (k1 +k2)/2

med k1 Opprinnelig kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) ((1,1 – 1)/1,1) 12000 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,091 x 110 = 2,21 egen, ny kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) ((1,1 – 1)/1,1) 8800 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,091 x 94 = 1,89

medk Opprinnelig kol. = 0,25 (8,2 / 9,2) ((1,1 – 1)/1,1) 12000 1/2 = 0,25 x 0,89 x 0,09 x 110 = 2,19 egen, ny kol. = 0,25 (8,2 / 9,2) ((1,1 – 1)/1,1) 8800 1/2 = 0,25 x 0,89 x 0,09 x 94 = 1,88

med (α-1)& k1: oppr.kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) (1,1 – 1)) 12000 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,1 x 110 = 2,42 egen, ny kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) (1,1 – 1) 8800 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,1 x 94 = 2,08



2p (iv) Beregnede retensjonstider for topp 1 og topp 2 på din 22cm-kolonne:

Topp 1: egen, ny kol. tR,1 = (1+k1) t0 = (1+k1) L / u = (1 + 7,7) x 22 / 7,5 = 25,5 min opprinn.kol. = analog regning: (1 + 7,7) x 30 / 7,5 = 34,8 min,

Topp 2: egen, ny kol. k2 = k1 x = 7,7 · 1,1 = 8,47 ≈ 8,5; tR,2 = (1+k2) L/u = (1 + 8,5) · 22 / 7,5 = 27,85 minopprinnelig kol. = analog regning: og for topp 2 : = (1 + 8,5) · 30 / 7,5 = 38,0 min))

1p (v) basert på tallene du har nå, og med den angitte asymmetrien, forventer du på din kolonne en god nok separasjon mellom toppene for preparativ isolering av topp 1 ? (Grunngi kort)

Oppløsningen ideal er 1,9 , som er bedre enn basislinjeseparert. Asymmetri 1,2 betyr svaktailing, betyr at baksiden av toppen blir ca. 20 % bredere enn forsiden, dvs. noe mindre enn

20% av basisbredden (klart mindre enn en σ , som er 25 %)Rs = 1,9 betyr at avstanden mellom toppene er 1,9 ganger større enn gjennomsnits-basis-bredden av toppene: en økning i toppbredden med maks. 20% på den ene halvparten reduserer da oppløsningen til ca. 1,9/1,2 = 1,6 (worst-case scenario) , som fortsatt er bedre enn 1,5, som er grensen for basislinjeseparasjon. Separasjonen er forventet å være (mer enn) godt nok. Alternativ: regn ut basisbredden fra tR og N: for tR2 : wb2 =4 tR2 / n1/2 =4 x 28/94 = 1,20 min

Toppavstand t2 – t1 = 27,85 – 25,5 = 2,35 min. Basislinjesep. krever minst 1,5 x wb = 1,8 min, som tåler en økning med nærmere 30% før bredden har nådd 2,35 min.

2p (vi) Hva er svitsj-tidspunktene for fraksjons-oppsamleren (i minutt fra tR = 0, din kolonne) du vill anbefale:start/stopp av oppsamling av topp 1 (én fraksjon for toppen).

tR(1) = 25,5 min (se (iv)) konservativt kutt, ved ca. basisbredde endpunktene (evt. avrundet litt oppover ettersom det er rapportert basislinjeseparasjon . Fra N= 16 (tR/wb)2 :

wb = (16 ∙ tR2 / N )1/2 = (16 ∙ 25,5 2 / 8800)1/2 = 1,09 min , halv basisbredd : 0,55 min

Svitsjpunkt før : 25,5 – 0,55 min : avrundet ca. 24,8 min Svitsjpunkt etter : 25,5 + (1,2 ∙ 0,55) min : avrundet ca. 26,2 min1p (vii) Antatt ”din” topp 2, den uinteressante isomeren, er siste topp som elueres, hvor mye

MF forbruker du pr. injeksjon ved gjentatt preparativ oppsamling av topp 1. tR(2) = (1+k) t0 = (1+ (k(1) ∙ α) ∙ L / u = (1 + (7,7 ∙ 1,1) 22 / 7,5 = 27,8 min

wb (2)= (16 ∙ tR2 / N )1/2 = (16 ∙ 27,8 2 / 8800)1/2 = 1,19 min

avrundes oppover : tR(2) + asymmetri-korrig halv basisbredde (alternativ 2 x ”halvbredde”) 27,8 + 0,6 x 120/100 = 28,5 min; avrundes til ca. 29 - 30 min.

Lsm-forbruk = F x sluttid = 1,2 ml/min * 30 min = 36 ml/ analyse.



Oppgave 6. (20p)

Gi Ja/Nei svar pluss (nødvendig !) kort forklaring ("fordi…"): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar : uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!).

Ja/Nei …, fordi ….1. Er kolonneblødning et typisk

problem ved GLC ?Ja SF –væske har alltid litt damptrykk, og når

kolonne-temperaturen øker kraftig øker også innholdet af SF i bæregassen. Denne transporteres da ut av kolonna = kolonnebløding, til detektoren

som detekterbart konstant signal.2. I TLC brukes tilsats-stoffet F254

som moderator for aktiviteten av plata

nei F254 er det fluorescerende stoff i sjiktet for fluoresiserer ved bestråling med UV-lys

(m.fluorec.lampe)

3. Ved superkritisk fluid kromatografi brukes restriktoren bak (nedstrøms for) flammeioniseringsdetektoren

Nei FID er GC-detektor, derfor skal fluidet være avspennt til gass for å ufngere. restriktoren er

mellom kolonna og før FID

4. Brukes CO2 som mobil fase mer innen SFC enn innen GLC ?

Ja CO2 brukes praktisk talt ikke ved GC (mest H2, He evt. N2 ved GC), men brukes mye i SFC

5. Større Elektroosmose gir større separasjonen av analyttene i kapillærsoneelektroforese.

Nei Elektroosmose flytter alle analytter like fort, bidrar ikke aktiv til separasjon (evt. forkorter eller fo-

rlenger separasjonstid, og nedkorter (evt.forlenger) den tiden elektroforesen kan aktivt separere

6. Eddy-diffusjon gir et viktig sonespredningsbidra i CZE.

Nei Eddy diff. finnes bare i pakkede systemer og CZE er åpen kolonne - ingen Eddy diff.

7. En molekylærsikt-PLOT-kolonne brukes til GSC.

Ja PLOT er faststoff (molekylærsiktpulver) lagt på kolonnevegg i et kapillærrør,Gass – faststoff Kro = GSC.

8. Elektronaffinitetsdetektoren (ECD) har høy følsomhet for polyklorerte dibenzo-dioksiner (PCDD’er).

Ja ECD har god følsomhet på bl.a. klorerete og særlig på polklorerte forbondelser.

9. Cellulose-TLC gir bedre separsjon enn papirkromatografi.

Ja Papir har grovere fibre, TLC har finere partikler, derfor mindre effektiv ”partikkeldiametetr” og

mindre sonespredning.

10. Aromatiske løsningsmidler er særlig egnet som HPLC-elueringsmiddel for fluorescens-detektoren.

nei Aromatiske lsm. har selv fluorescens i UV-område; der fluorescensdetektoren oftest har eksiterings-lyset fra, og

aromatiske løsningsmidler absorberer sterkt eksistasjonslyset – fungerer som filter, at det ikke blir

nok lys igjen til analytt. fortsetter på neste side



(Oppgave 7 fortsetter)Gi Ja/Nei svar pluss (nødvendig !) kort forklaring ("fordi…"): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar: uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!).

Ja/Nei

…, fordi ….

11. Dersom t0= 0.75 min og forbindelse A eluerer ut med retensjonstid tR,A = 2,25 min, betyr det at ca 67 % av stoffet foreligger i mobil fase (MF).

Nei k = ( tr – to) / tok= = 2,25 – 0,75 / 0,75 = 2 = nMF/NSF

andel stoff i mobilfase det er 33 % (= R in %)

12. Hydrofob(isk) interaksjonskromato-grafi (HIC) brukes hovedsakelig på små peptider og aminosyrer.

Nei HIC brukes typisk på makromolekyler som proteiner,evt (større) peptider, mindre anvendt for

småmolekyler

13. En stasjonær GLC-fase med CP-index 85 er ganske upolar.

Nei CP=0 er upolar (som squalan)CP = 100 er veldig polar ( som OV-275)

CP= 85 må da vurderes som ganske polar

14. Platehøyden i kapillær-GC er mye lavere enn i pakket kolonne-GC og hovedårsak for den høye effektiviteten i kapillær-GC.

Nei Platehøyden er noe lavere, men ikke MYE lavere, og hovedårsaken for det store platetallet er primært da mye større kolonnelengden av WCOT-kolonnen.

15. Når du bytter 0,1 M HCl ut med 0,1 M KCl som MF ved (kation-)ione-bytterkromatografi på en sterk sur kationbytter reduseres retensjonen

Ja Ved samme konsentrasjon og ladning av kationene i bufferen er det ionets selektivitet (rel. affinitet til fast-

ionet) som bestemmer rel. retensjon av analyttionene. K binder sterkere enn H (er et større nakent ion) og har

dermed større elueringsstyrke.(OBS: Noen bruker surhet av 0,1M HCl som protonerer baser og øker retensjon på kationbyttere: Godtatt som 80% riktig.Men: bare liten uttelling for: syre pluss (svak) anionbytter =

nøytralisering. 16. En SF med konveks adsorpsjons-

isoterm gir haledannelse (tailing) ved bruk i kromatografi

Ja Konveks isoterm betyr høyere adsorpsjon ved lavere konsetrasjoner enn ved høyere: Ved av-tagende kons. ettter toppmaksimum øker da ad-sorpsjonen jo lengere etter maksimum - tailing

17. I GLC gir økt filmtykkelse av SF økt retensjon (andre parametre konstant)

ja Økt filmtykkelse (øvrige dimensjoner like) gjør k (som er = K*VSF/VMF)

18. Gradient-eluering i RP-LC skjer typisk ved lineær hastighetsøkning av MF-hastigheten.

Nei Gradienteluering skjer typisk ved økning i elueringsstyrke / f.eks. lineært.

19. Ved Ved HPLC bør det brukes eluenter med høy viskositet.

Nei Viskositeten skaper høyt mottrykk og er uønsket. Høy viskositet gir for de fleste analyser ingen

fordel..20. Er retensjonen av en dialkohol ved

RP-HPLC sterkt avhengig av pH til mobilfasen

Nei Alkoholgrppen er ikke så sterkt sur (eller basisk)at pH-variasjoner innenfor RP-HLC-området endrer retensjonen noe vesentlig.


Documents

med rettelser / forbedrings-ideer Skriftlig svar på oppgavene 1 – 6 …folk.ntnu.no/audunfor/6. semester/Kromatografi/Eksamen LF... · 2013-05-03 · KROMATOGRAFI Mandag 22. mai