MASTER RAD - Prirodno matematicki fakultet · seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri,

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Biološka aktivnost i hemijski sastav etarskog ulja Pinus

sylvestris (Pinaceae) poreklom iz različitih delova biljke

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Tanja Stojiljković 192 Dr Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Biological activity and chemical composition of essential oil

of Pinus sylvestris (Pinaceae) from various parts of plant

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Tanja Stojiljković 192 Dr. Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Tanja Stojiljković rođena je 06. aprila 1993. godine u Nišu. Osnovnu školu

„Bubanjski heroji“ završava 2008. godine u Nišu, nakon čega upisuje gimnaziju „Bora

Stanković“, koju završava 2012. godine sa odličnim uspehom. Osnovne akademske studije na

Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu završava 2015. godine i iste godine upisuje Master

akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku završava.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru dr Zorici Mitić na saradnji, izdvojenom

vremenu, usmeravanju i pomoći prilikom celokupne izrade ovog master rada. Takođe,

najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije za ocenu master rada dr Bojanu Zlatkoviću i dr

Snežani Jovanović.

Veliku zahvalnost dugujem i svojim prijateljima, na prvom mestu Katarini na

zajedničkom trudu i radu, kao i roditeljima, sestri Tijani, na razumevanju, pomoći i podršci

koju su mi pružili tokom studiranja.

SAŽETAK

Ovo istraživanje je sprovedeno u cilju dobijanja podataka o hemijskom sastavu

etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz četina Pinus sylvestris sa područja Srbije, kao i

poređenja dobiljenih rezultata sa literaturnim podacima o sastavu ulja belog bora poreklom iz

različitih organa biljke (četine, izdanci i šišarke). Kombinacijom GC-FID i GC-MS analize u

etarskom ulju četina P. sylvestris iz zapadne Srbije utvrđena je dominacija monoterpena

(64.6%) sa α-pinenom kao glavnom komponentom koja čini 41.8% ulja. Sa druge strane,

najzastupljeniji seskviterpeni, β-kariofilen i δ-kadinen, detektovani su u umerenim

koncentracijama (6.0 i 6.0%). U okviru diterpenske frakcije utvrđena su samo dva jedinjenja,

cembren i 13-epi-manoil-oksid, koja zajedno čine svega 2.6% ulja. Na osnovu dosadašnjih

istraživanja možemo konstatovati da postoji velika varijabilnost u hemijskom sastavu

etarskog ulja P. sylvestris poreklom iz različitih organa biljke, ali istovremeno i iz različitih

delova areala vrste. Razlike se vrlo često ispoljavaju i u pogledu dominacije druge klase

terpenskih jedinjenja (mono-, seskvi- ili diterpeni). Takođe, prema dostupnim literaturnim

podacima, etarsko ulje P. sylvestris poseduje veći broj bioloških aktivnosti: antibakterijsku

(naročito protiv Gram (+) bakterija Rhodococcus sp. i Bacillus sp. kao i Gram (-)

Acinetobacter baumanii, Aermonas sobria i Escherichia coli), antifungalnu (naročito protiv

Candida albicans i Ulocladium oudemansii), larvicidnu protiv Aedes aegypti i Culex

quinquefasciatus (Culicidae), i antikancerogenu (pokazuje značajan citotoksični efekat na

ER-negativne i ER-pozitivne ćelijske linije kancera dojke). Sa druge strane, pojedine

komponente etarskog ulja P. sylvestris deluju kao atraktanti, tj. aktivatori olfaktornih

neuroreceptora kod nekoliko vrsta herbivornih insekata koji su osnovni uzrok defolijacije

borova.

Ključne reči: Pinus sylvestris, etarsko ulje, varijabilnost, biološka aktivnost

ABSTRACT

The goals of this research are obtaining data on chemical composition of essential oil

isolated by hydrodistillation from needles of Pinus sylvestris from Serbia and comparison of

these results with literature data on composition of Scots pine essential oil obtained from

various parts of plant (needles, twigs and cones). Combination of GC-FID and GC-MS

analyses of essential oils from needles of P. sylvestris from Western Serbia has shown

domination of monoterpenes (64.6%) with α-pinene as the main component comprising

41.8% of oil. On the other hand, the sesquiterpenes with highest recorded levels, β-

caryophyllene and δ-cadinene, were detected in moderate concentrations (6.0 and 6.0%).

Within the diterpene fraction there were only two identified compounds, cembrene and 13-

epi-manoyl oxide, together comprising only 2.6% of total oil. Consistent with previous

research it may be concluded that there is a great variability in chemical composition of

essential oil of P. sylvestris, both when samples are taken from various organs of the same

plant and from plants from different parts of range of this species. The differences are often

expressed as domination of another class of terpene compounds (mono-, sesqui- or

diterpenes). In addition, the available literature sources state that essential oil of P. sylvestris

has a number of biological activities: antibacterial (particularly against Gram (+) bacteria

Rhodococcus sp. and Bacillus sp., as well as Gram (-) bacteria Acinetobacter baumanii,

Aermonas sobria and Escherichia coli), antifungal (particularly against Candida albicans and

Ulocladium oudemansii), larvicidal against Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus

(Culicidae) and anticancer (showing significant cytotoxic effect on ER-negative and ER-

positive cell lines of breast cancer). On the other hand, certain components of essential oil of

P. sylvestris show attractant activity as activators of olfactory neuroreceptors in several

species of herbivorous insects which are the main cause of defoliation in pines.

Keywords: Pinus sylvestris, essential oil, variability, biological activity

SADRŽAJ

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus sylvestris ..................................................................... 1

1.1.1. Habitus i anatomija ................................................................................................... 1

1.1.2. Stanište i distribucija ................................................................................................. 1

1.1.3. Privredni značaj ........................................................................................................ 3

1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja.................................................................................... 4

1.2.1. Fizičke osobine ......................................................................................................... 5

1.2.2. Hemijski sastav ......................................................................................................... 6

1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja ........................................................... 7

1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova ................................................. 8

2. CILJEVI RADA ................................................................................................................... 10

3. MATERIJAL I METODE .................................................................................................... 11

3.1. Biljni materijal ............................................................................................................... 11

3.2. Izolovanje etarskog ulja (hidro-destilacija) ................................................................... 12

3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja ........................................................................ 12

3.4. Identifikacija komponenti .............................................................................................. 13

4. REZULTATI I DISKUSIJA ................................................................................................ 14

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. sylvestris ......................................................... 14

4.2. Hemijski sastav etarskog ulja izdanaka i šišarki P. sylvestris ....................................... 22

4.3. Biološka aktivnost etarskog ulja P. sylvestris ............................................................... 26

4.3.1. Antimikrobna aktivnost .......................................................................................... 26

4.3.2. Larvicidna aktivnost protiv Diptera (Culicidae) ..................................................... 29

4.3.3. Herbivorni insketi: osnovni uzrok defolijacije kod borova .................................... 29

4.3.4. Antikancerogena aktivnost ...................................................................................... 31

5. ZAKLJUČCI ........................................................................................................................ 33

6. LITERATURA ..................................................................................................................... 35

Tanja Stojiljković Master rad

1

1. UVOD

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus sylvestris

1.1.1. Habitus i anatomija

Pinus sylvestris L. – beli bor (Pinaceae) je drvo visoko do 40 m, staro do 150-200

godina sa retkom, uskom do ambrelasto raširenom krošnjom. Kora u donjem delu odraslog

stabla sivosmeđa, debela, a u gornjem delu, u regionu krošnje, sa tankim crvenkastosmeđim

ljuspama (slika 1.1). Korenov sistem vrlo plastičan, prilagodljiv. Mlade grančice u početku

zelenožute, kasnije sivosmeđe. Javljaju se po dve četine koje traju 2-3 godine,

otvorenozelene, duge 4-7 cm, široke do 2 mm, često uvrnute oko svoje ose. Smoni kanali do

epidermisa; ćelije epidermisa imaju jednaku visinu i širinu. Rukavci trajni, u početku dugi do

1 cm, kasnije kraći. Muške šišarke (mikrostrobilusi) resoliko zbijeni. Ženske šišarke (makro-,

megastrobilusi) zrele krajem sledeće godine, sa jasnom drškom, sivosmeđe, bez sjaja, duge

2.5-7 cm, široke 2-3.5 cm. Apofize piramidalno izvučene ili ravne, vrlo varijabilne. Seme

sitno, dugo 3-4 mm, sa 3-4 puta dužim kriocetom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski

strobilusi se pojavljuju V i VI meseca (Jovanović, 1992).

1.1.2. Stanište i distribucija

Beli bor ima veliku edafsko-klimatsku amplitudu, ali kao izrazita vrsta svetlosti,

osetljiv je na konkurenciju (naročito pri prirodnom podmlađivanju semenom) – senčenje

sciofilnih vrsta (bukva, jela, smrča i dr.). Pretežno je u montanom (planinskom) pojasu, iznad

1000 m nadmorske visine, ponekad i niže, mešajući se sa crnim borom. Javlja se najčešće na

serpentinu i krečnjaku, ali i na drugim geološkim supstratima. Opisan je izvestan broj

fitocenoza sa belim borom; Pinetum nigrae-sylvestris Z. Pav. 1951, je čest na serpentinskim

strmenima zapadne Srbije. Beli bor dominira na većim nadmorskim visinama i na staništima

sa blažim nagibom, dubljim i svežijim zemljištima. Javlja se, u manjoj meri, kao promešana

vrsta, u fitocenozama kitnjaka, omorike, bukve, jele, smrče i molike. Beli bor je izložen

napadima velikog broja vrsta insekata i gljivica (Jovanović, 1992).


2

P. sylvestris ima vrlo prostran areal u Evropi i Aziji; počev od istočnog dela

Pirinejskog poluostrva, Škotske i gotovo cele Skandinavije do oko 70 severne geografske

širine severne Azije, do Ohotskog mora (slika 1.2). Na jugu Evrope se javlja disjunktno na

visokim planinama sva tri velika poluostrva; takođe na Krimu i Kavkazu. Pripadnost flornom

elementu: Evroazijski borealno-subborealni (bor-temp), mont-subalp (Jovanović, 1992).

Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: severnozapadna

Srbija - Povlen, Maljen; zapadna Srbija - Zlatibor, Mokra gora, Tara; jugozapadna Srbija -

Nova Varoš, Radočelo, Zlatar; centralna Srbija - Kopaonik, Stolovi, Studena; Metohija -

Prokletije, Mokra planina; Kosovo - Šar-planina (Jovanović, 1992).

Slika 1.1. P. sylvestris iz zapadne Srbije (Tara, Zaovinsko jezero; foto: Zlatković, 2013)


3

1.1.3. Privredni značaj

Veoma važna šumska vrsta, vrlo često upotrebljavana pri pošumljavanju teških

terena (ispranih plitkih, degradiranih zemljišta), peskova, brdskih i planinskih krajeva. Brzo

rastuća vrsta, naročito od 10 do 40 godina. Česta po parkovima i gradskom zelenilu. Drvo je

veoma upotrebljivo: građevinsko i stolarsko drvo, vodogradnje, rudničko drvo, stubovi za

vodove, pragove, elise, celulozno drvo, ploče vlaknatice, pougljavanje. Smolarenjem se

dobija smola. Iz panjeva i otpadaka dobija se katran i terpentinsko ulje. Mlade grančice i

četine se upotrebljavalju u medicini (Jovanović, 1992).

Slika 1.2. Oblast rasprostranjenja vrste P. sylvestris prema Euro+Med PlantBase (preuzeto sa:

http://euromed.luomus.fi/euromed_map.php?taxon=341361&size=medium)


4

1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja

Etarska ulja su mirisne smese isparljivih, lipofilnih sastojaka (sekundarnih biljnih

metabolita), koje se sintetišu i lokalizuju u specijalnim sekretornim strukturama biljaka i

mogu se predestilovati vodenom parom (Petrović et al., 2009).

Kao proizvodi aromatičnih biljaka, etarska ulja se razlikuju od masnih ulja po svojoj

isparljivosti. Sastojci koji čine etarsko ulje su uglavnom tečni, a sam sastav etarskog ulja

jedne vrste može biti varijabilan za različite organe, što zavisi od uslova sredine. U toplom

klimatu, sadržaj etarskog ulja je veći pa se zbog toga često kaže da su etarska ulja proizvodi

heliosinteze (Gorunović i Lukić, 2001).

Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive, mirisne tečnosti; pojedina su na sobnoj

temperaturi viskozna ili čvrste konzistencije. Glavni sastojci etarskih ulja su monoterpeni,

seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili

nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri, aldehidi, ketoni, epoksidi ili karboksilne kiseline. Etarska

ulja su smese oko 20 - 200 sastojaka. Ovi sastojci su, na osnovu koncentracije u etarskom

ulju, podeljeni na: glavne (20 - 95%), sporedne (1 - 20%) i zastupljene u tragovima (ispod

1%). Etarska ulja najčešće sadrže svega nekoliko glavnih komponenti (npr. karvakrol (30%) i

timol (27%) u etarskom ulju Origanum compactum, a mentol (59%) i menton (19%) u ulju

Mentha x piperita), a nekada je to samo jedan sastojak (npr. 1,8-cineol (50%) u etarskom ulju

Cinnamomum camphora ili linalol (68%) u ulju Coriandrum sativum).

Etarska ulja su uglavnom produkti kopnenih biljaka (Embryophyta). Ove biljke su

raspoređene u preko pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Pinaceae,

Cupressaceae, Lauraceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae i

Asteraceae. Etarska ulja se mogu naći u svim delovima biljke (korenu, rizomu, stablu, kori,

semenu, listovima, cvetovima i plodovima), ravnomerno raspoređena u svim biljnim

organima ili samo u određenom biljnom organu - najčešće i u najvećem procentu su

zastupljena u listu i cvetu. Interesantno je da etarska ulja lokalizovana u različitim delovima

iste biljke, mogu biti sličnog sastava, ali mogu se i značajno razlikovati (etarsko ulje zelenog i

zrelog ploda, listova i korena peršuna razlikuju se po dominantnim sastojcima) (Kovačević,

2004). Prinosi etarskih ulja se obično kreću između 0.2 i 2.0%, mada postoje znatna

odstupanja. U zavisnosti od sadržaja etarskog ulja koji može da varira (prinos izuzetno

cenjenog ružinog ulja često ne prelazi 0.03%, dok prinos nekih drugih ulja može dostizati i do


5

20%, npr. etarsko ulje karanfilića) biljke su podeljene u red bogatih ili siromašnih uljem

(Gašić, 1985).

Etarska ulja se najčešće nalaze u slobodnom stanju i to egzogeno: u žlezdama,

žlezdanim ljuspama i žlezdanim dlakama, i endogeno: u sekretornim ćelijama, intercelularnim

šizogenim šupljinama i intercelularnim šizogenim i lizogenim rezervoarima. Postoje izuzeci

kada su ulja vezana u obliku heterozida (seme crne slačice, seme gorkog badema). U vezanom

obliku ulja su bez mirisa, a pod uticajem specifičnih enzima i u prisustvu vode, nastaju

isparljivi mirisni sastojci (aglikoni).

Biološka funkcija etarskih ulja povezana je sa atraktantnim delovanjem na insekte,

čime je obezbeđeno prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Sa druge strane, veoma je

značajna i uloga etarskih ulja u zaštiti biljaka od napada insekata i životinja, herbivora.

Takođe, gotovo sva ulja više ili manje intenzivno sprečavaju razvoj mikroorganizama, i tako

suzbijaju širenje infekcija na biljkama u kojima nastaju. Interesantni su i podaci o specifičnim

efektima ulja jedne biljke, koje prelazi u podlogu i inhibira klijanje semena drugih biljaka

(alelopatija). Neka etarska ulja sprečavaju klijanje sopstvenih semena i obezbuđuju životni

prostor svake individue. Stara je teorija, koja samo delimično može biti prihvaćena, da biljke

sintezom i odavanjem ovih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu, koja ih štiti

od prekomerne transpiracije u različitim nepovoljnim uslovima.

Različite metode ekstrakcije dovode i do upotrebe etarskih ulja u drugačije svrhe. Pa

su tako neka etarska ulja postala važna u farmaciji i našla su terapijsku primenu, dok se pak

neka druga koriste u kozmetičkoj, parfimerijskoj i prehrambenoj industriji. Zbog prisustva

etarskih ulja i zbog svojih organoleptičkih osobina, aromatične biljke se svakodnevno koriste

kao kulinarski začini (Kovačević, 2004).

1.2.1. Fizičke osobine

Etarska ulja su na sobnoj temperaturi tečnosti, aromatičnog mirisa, retko obojena kad

su sveža ili su pak žuta do žutozelena. Pojedina su specifično obojena (npr. etarsko ulje

cimeta i karanfilića smeđecrveno). Droge sa proazulenima daju destilacijom vodenom parom

plavo ili zeleno obojena etarska ulja (npr. plava etarska ulja daju Matricariae flos, Absinthii

herba i Millefolii herba). Proazuleni su neisparljivi, bezbojni, gorki seskviterpenski laktoni.

Tokom destilacije vodenom parom prelaze u obojene isparljive azulene. Miris etarskih ulja

potiče od sastojaka sa kiseoničnim funkcionalnim grupama. On je intenzivan čak i kada su ovi


6

sastojci zastupljeni u niskom procentu (etarsko ulje limuna). U koncentrovanom obliku

etarska ulja uglavnom imaju oštar, nadražujući ukus, koji pali. Razblaživanjem ukus

uglavnom postaje prijatan. Izuzeci su npr. etarsko ulje anisa i morača koja su slatkog ukusa

(Petrović et al., 2009).

Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu,

mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali

broj sastojaka ulja je rastvorljiv; ovakvi proizvodi nazivaju se aromatične vode.

Kao tečnosti, etarska ulja su definisana nekim fizičkim konstantama. Relativna gustina

ulja može biti manja ili veća od 1; ipak neuporedivo je mani broj etarskih ulja čija je relativna

gustina veća od 1 tj. od gustine vode (npr. etarska ulja cimeta i karamfilića). Kao parametar

kvaliteta, značajne su vrednosti indeksa refrakcije i ugla skretanja ravni polarizovane

svetlosti. Kao specifična karakteristika definisana je i rastvorljivost etarskog ulja u etanolu

određenog razblaženja (Gorunović i Lukić, 2001; Kovačević, 2004).

Etarska ulja imaju povećan indeks refleksije i veoma često su optički aktivna

jedinjenja. Ona su isparljiva sa vodenom parom jer podležu Daltonovom zakonu. Po njemu će

smesa dve tečnosti koje se ne mešaju i hemijski ne reaguju međusobno (u ovom slučaju voda i

etarsko ulje) proključati kad zbir parcijalnih pritisaka pare obe tečnosti bude jednak

atmosferskom pritisku tj. 760 mm Hg (Gorunović i Lukić, 2001).

Specifičnost ove grupe biljnih proizvoda je da nemaju tačno definisanu temperaturu

ključanja. Pošto su to smeše različitih jedinjenja, svako od njih isparava na svojoj temperaturi

ključanja. Tako, etarska ulja frakciono ključaju u intervalu od 150 - 350 °C. Dok neki sastojci

etarskih ulja isparavaju na nižim temperaturama, pa zato ulja imaju specifičan, uglavnom

prijatan miris (Kovačević, 2004).

1.2.2. Hemijski sastav

Etarska ulja su složene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i

fenilpropanskih derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i

seskviterpeni.

Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih

i aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti

uljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi, epoksidi.


7

U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog

skeleta; zbog dužine lanaca C atoma veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa

terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara.

U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci (C6-C3) zastupljeni u manjim

količinama. Postoje i izuzeci, kada glavninu ulja čine upravo ovakva jedinjenja. Najčešće su

to aril- ili propenilfenoli (eugenol, anetol) i aldehidi (cimetni aldehid). Ovakva jedinjenja su

uglavnom prisutna u etarskom ulju biljaka iz familija Apiaceae i Myrtaceae. Kao sastojci

etarskih ulja sreću se i C6-C1 jedinjenja, kao što je vanilin i derivati antranilne kiseline.

Tokom destilacije, iz biljne sirovine mogu predestilisati i različita alifatična jedinjenja

manje molekulske mase (zasićeni i nezasićeni ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, estri, laktoni)

koji se rastvaraju u etarskom ulju i postaju njegov sastavni deo. Takođe, kod nekih droga koje

su izložene fermentaciji ili torefakciji, na primer, male količine prisutnog etarskog ulja

postaju obogaćene sumpornim i azotnim jedinjenjima koja nastaju tokom tih specifičnih

procesa; time se formira specifična aroma ovakvih droga (seme kafe, kakaovca) (Kovačević,

2004).

1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja

Kao što je slučaj i sa drugim sekundarnim metabolitima biljaka, i produkcija etarskih

ulja je genetski determinisana. Samo do nekih granica, genetska kontrola je podložna

uticajima endogenih i egzogenih faktora. Ne postoje opšta pravila, tako da neke biljne vrste u

različitim klimatskim ulsovima i različitim delovima sveta proizvode približne količine

etarskog ulja, gotovo identičnog sastava. S druge strane, pojedinačne jedinke u okviru iste

populacije biljka mogu sintetisati međusobno različita etarska ulja. Ovakva varijabilnost

biljnog genoma, omogućava pojavu različitih hemijskih rasa (hemotipova biljaka), kao i

mogućnost izdvajanja visokoproduktivnih linija, i njihovo vegetativno kloniranje.

Najvažniji faktori koji mogu uticati na sastav etarskog ulja neke vrste (jedinke) su:

genotip, fenofaza ontogenetskog razvoja (što je veoma značajno za definisanje optimalnog

vremena prikupljanja biljnog materijala), ekološki faktori (faktori sredine), način obrade

biljne sirovine, način izolacije etarskog ulja.

Količina i sastav etarskog ulja može da zavisi od faze ontogenetskog razvoja biljke.

Proučavanjem ovakvih uticaja, određuje se optimalno vreme prikupljanja biljnog meterijala.


8

Tako, najviše ulja sadrži pred otvaranje sakupljen pupoljak cveta karanfilića ili list matičnjaka

sakupljen neposredno pre cvetanja biljke.

Temperatura, vlažnost i aeracija zemljišta, mineralne soli u podlozi, nadmorska visina,

dužina izloženosti svetlu i kvalitet svetlosti, vlažnost vazduha i vazdušna strujanja, mogu da

utiču na promenljivost količine etarskog ulja u biljnom materijalu. Ispitivanje uticaja ovih

faktora na aromatične sirovine, interesantano je sa dva aspekta. Kod samoniklih biljaka mogu

biti definisana geografska područja i regioni sa kojih se može dobiti najkvalitetnija droga

(droga definisanog geografskog porekla). U odnosu na gajene vrste, proučavanjem ovih

faktrora uticaja, mogu biti definisani optimalni uslovi gajenja, koji obezbeđuju količinu i

kvalitet biljne mase. Pošto se danas najveći broj aromatičnih droga dobija od gajenih biljaka,

ovakva istraživanja su veoma značajna.

Svaka obrada aromatične sirovine (sušenje, usitnjavanje, ekstrakcija) uslovljava

delimičan gubitak etarskog ulja i promene njegovog sastava. Procesom industrijske

ekstrakcije uvek se dobija oko 20% manje ulja nego u laboratorijskim uslovima. Što se tiče

sastava, mnogo se više zna o etarskim uljima izolovanim iz biljnog tkiva, nego o nativnom

ulju, onom koje se nalazi u sekretornim strukturama biljke (Kovačević, 2004).

1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova

Prema Dervendzi (1992), etarsko ulje borova (Pini aetheroleum) najviše se koristi u

narodnoj medicini za lečenje respiratornih infekcija praćenih kašljem, bronhitisom,

bronhijalnom astom, efizemom, traheitisom, sinuzitisom, laringitisom, faringitisom i

influencom. Pored toga, etarska ulja borova široko se koriste kao aditivi u prehrambenoj i

industriji alkoholnih pića. U mnogim proizvodima namenjenim za čišćenje, ulja borova

poznata su kao osvežavajuća i dezinfekciona sredstva. Takođe, ova ulja intenzivno se koriste

u farmaceutskoj, kozmetičkoj i parfimerijskoj industriji.

Na osnovu pregleda literaturnih podataka, možemo reći da etarsko ulje borova

poseduje čitav niz bioloških aktivnosti:

• antibakterijsku i antifungalnu (Toroglu, 2007; Kolayli et al., 2009; Politeo et

al., 2011; Karapandzova et al., 2011; Šarac et al., 2014);

• akaricidnu (Macchioni et al., 2002);

• larvicidnu i repelentnu aktivnost protiv Aedes albopictus (Koutsaviti et al.,

2015);


9

• antiagregantnu (antitrombocitnu; Tognolini et al., 2006);

• antioksidativnu (Ustun et al., 2012);

• herbicidnu aktivnost protiv Phalaris canariensis, Trifolium campestre i Sinapis

arvesis (Amri et al., 2014).


10

2. CILJEVI RADA

Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:

1. Određivanje hemijskog sastava etarskog ulja četina poreklom iz jedna autohtone

populacije P. sylvestris sa područja zapadne Srbije

2. Poređenje dobijenih rezultata sa publikovanim podacima o hemijskom sastavu

etarskog ulja P. sylvestris poreklom iz različitih organa biljke: četine, izdanci i

šišarke

3. Određivanje varijabilnosti sastava etarskog ulja P. sylvestris

4. Upoznavanje sa biološkim aktivnostima etarskog ulja P. sylvestris


11

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni materijal

Biljni materijal (sveže četine) P. sylvestris sakupljen je u jednoj autohtonoj populaciji

na području zapadne Srbije (Tara, Zaovinsko jezero; tabela 3.1). Geografski položaj

populacije određen je uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin eTrex Vista® C). Orografske

karakteristike staništa, pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle

Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije 90

x 90 m (Farr al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski

primerak je deponovan u Herbarijumu Departama za biologiju i ekologiju, Prirodno-

matematičkog fakulteta u Nišu (“Herbarijum Moesiacum Niš” - HMN).

U odabranoj populaciji belog bora izvršeno je sakupljanje četina sa većeg broja

odraslih stabala. U ručnom frižideru material je sa mesta sakupljanja prenesen do zamrzivača

(-20 °C) na skladištenje do momenta upotrebe.

Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabrane populacije P. sylvestris.

Takson P. sylvestris

Lokalitet Tara (Zaovinsko jezero)

Geografska širina (N) 43°52'40.30"

Geografska dužina (E) 19°24'55.56''

Nadmorska visina (m a.s.l.) 912

Ekspozicija SW

Geološka podloga Serpentinit

Datum sakupljanja 26.06.2013.

Vaučer broj 6938 HMN


12

3.2. Izolovanje etarskog ulja (hidro-destilacija)

Iz 204 g svežih i iseckanih četina P. sylvestris destilovano je etarsko ulje u aparatu

tipa Clavenger u toku 2.5 h. Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen

anhidrovanim Mg2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje

filtracijom, etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču bez zagrevanja, a

etarsko ulje je čuvano u zatvorenim hromatografskim vijalama na 4 °C do analize. Prinos

etarskog ulja je izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. w/w, obračunato u odnosu na

početnu količinu biljnog materijala. 40 µL ulja razblaženo je etrom do 1 mL za dalje

hromatografske analize.

3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja

Hemijski sastav etarskog ulja određen je pomoću GC-FID (gasna hromatografija sa

plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografija-masena spektrometrija)

tehnika analize. Uzorak etarskog ulja koji je rastvoren u etru sniman je u triplikatu na

7890/7000B gasnom hromatografu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-

semplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm

debljina filma) kuplovan sa plamenim jonizacionim detektorom 7890A (FID) i masenim

detektorom 5977A (MS). Temperaturni program: izotermalno prvih 2.25 minuta 50 °C, zatim

linearni porast temperature (gradijent 4 °C/min) od 50 do 290 °C. Temperatura injektora 250

°C, interfejsa 300 °C; protok nosećeg gasa – helijuma 1.0 mL/min. Injektovana zapremina

ulja 1µL, split 40:1. Bekfleš 1.89 min, na 280 °C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS

uslovi (EI): jonizacija -70 eV, opseg masa 35 – 435 amu (3 skena u sekundi), vreme skenova

0.2 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već

navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID

pikova sa hromatograma snimljenih pod istim uslovima kao GC-MS, bez korekcionih

faktora.


13

3.4. Identifikacija komponenti

Komponente etarskog ulja identifikovane su pomoću AMDIS softvera (Automated

Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011) na

osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na osnovu retencionih vremena

standardne serije n-alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i pod istim uslovima kao i

uzorak ulja. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007 i NIST Chemistry

WebBook).


14

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. sylvestris

Biljni materijal (sveže četine) P. sylvestris prikupljen je na području zapadne Srbije

(Tara, Zaovinsko jezero) krajem juna meseca 2013. godine (tabela 3.1). Iz svežih četina

postupkom hidro-destilacije u aparatu po Clevenger-u izolovano je etarsko ulje svetlo žute

boje sa prinosom od 0.26% (w/w). Kombinacijom GC-FID i GC-MS analize u etarskom ulju

belog bora identifikovana su 82 jedinjenja čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a

dobijeni hromatogram prikazan je na slici 4.1. U cilju poređenja dobijenih rezultata sa

literaturnim podacima u tabeli 4.1. je, takođe, dat uporedni pregled pet studija sa sastavom

etarskog ulja četina P. sylvestris, koja su izolovana postupkom hidro-destilacije kao i u ovom

radu (Kubeczka i Schultze, 1987; Tsitsimpikou et al., 2001; Venskutonis et al., 2000; Ustun

et al., 2012; Ioannou et al., 2014).

Etarsko ulje P. sylvestris, sa područja zapadne Srbije, odlikuje dominacija

monoterpena (64.6%) sa α-pinenom kao glavnom komponentom koja čini 41.8% ulja.

Sledeće najzastupljenije jedinjenje iz monoterpenske frakcije je kamfen, koji je, međutim,

prisutan u niskoj koncentraciji (4.7%). Sa druge strane, najzastupljeniji seskviterpeni, β-

kariofilen i δ-kadinen, detektovani su u umerenim koncentracijama (6.0 i 6.0%). U okviru

diterpenske frakcije detektovana su samo dva jedinjenja, cembren i 13-epi-manoil- oksid,

koja zajedno čine 2.6% ulja. Na ovaj način, prosečan hemijski profil glavnih terpenskih

komponenti (preko 5%) u etraskom ulju P. sylvestris možemo predstaviti na sledeći način:

α-pinen >>> β-kariofilen = δ-kadinen

(>>> označava razliku veću od 15.1%, = razliku od 0.1-1.0%, prema Petrakis et al., 2001).


15

Slika 4.1. Hromatogram etarskog ulja četina P. sylvestris sa područja zapadne Srbije

α-pinen

β-kariofilen δ-kadinen


16

Tabela 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. sylvestris izolovanog hidro-destilacijom.

Takson P. sylvestris P. sylvestris P. sylvestris P. sylvestris P. sylvestris P. sylvestris P. sylvestris

subsp. scotica

Poreklo biljnog

materijala Srbija, Tara

Velika Britanija,

Botanička bašta

Univerziteta u

Kembridžu

Turska,

Yedigoller,

Bolu

Litvanija, različiti

lokalitetia)

Velika Britanija,

Kraljevska

Botanička bašta

u Edinburgu

Nemačka,

Botanička bašta

Univerziteta u

Vurzburgu

Španija,

Kraljevska

botanička bašta

u Madridu

Referenca ova studija Ioannou et al.

(2014)

Ustun et al.

(2012)

Venskutonis et al.

(2000)

Tsitsimpikou et

al. (2001)

Kubeczka i

Schultze (1987)

Ioannou et al.

(2014)

R. br. Komponente Sadržaj (%)

minimum maksimum

1. (Z)-2-Penten-1-ol tr - - - - - - -

2. n-Heksanal tr - 0.2 - - - - -

3. (Z)-2-Heksen-1-al 0.1 - - - - - - -

4. (E)-2-Heksen-1-al - - - tr 1.0 - - -

5. (Z)-3-Heksen-1-ol - - - 0.1 - - -

6. Ksanten tr - - - - - - -

7. Triciklen 1.2 0.5 - 0.1 1.2 - 1.0 0.5

8. α-Tujen 0.1 0.6 0.5 0.1 0.7 - - tr

9. α-Pinen 41.9 34.4 39.1 18.5 33.0 - 42.1 9.5

10. Kamfen 4.7 2.1 1.0 1.5 5.3 - 4.1 2.2

11. Tuja-2,4(10)-dien tr - - - - - - -

12. Sabinen 0.1 Tr - 0.3 0.7 - 0.7 tr

13. β-Pinen 3.2 6.8 15.6 0.6 2.1 - 1.9 5.7

14. β-Mircen 1.9 0.8 0.7 0.8 2.3 - 2.2 0.8

15. α-Felandren 0.1 - - - - - - tr

16. δ-3-Karen 3.6 - - 9.1 24.6 - 20.6 10.7

17. α-Terpinen 0.1 - - tr 0.1 - 0.1 0.1

18. p-Cimen 0.1 - - - 0.2 - 0.1 -

19. Limonen i β-

Felandren 2.0 0.7 1.5 0.6 1.2 - 5.5 0.6

20. Silvestren - 0.6 - - - - - -

21. (Z)-β-Ocimen 0.1 - - - tr - - tr

22. (E)-β-Ocimen 2.0 1.3 - 0.3 1.8 - 0.8 1.4

23. γ-Terpinen 0.2 - tr 0.1 0.3 - 0.3 0.2

24. p-Menta-2,4(8)-dien - - - - tr - - -


17

25. Terpinolen 0.6 0.7 - 1.0 2.4 - 1.72 1.3

26. n-Nonanal tr - - - - - - -

27. α-Fenhol tr - - - - - - -

28. α-Kamfolenal tr - - - - - - -

29. trans-Pinokarveol 0.1 - 1.5 - - - - -

30. trans-Verbenol tr - - - - - - -

31. Kamfen-hidrat 0.1 - - - - - - -

32. Pinokarvon tr - 0.7 - - - - -

33. Borneol tr - - - - - - -

34. p-Menta-1,5-dien-8-ol tr - - - 0.2 - - -

35. Terpinen-4-ol 0.1 - - tr 0.1 - - tr

36. p-Cimen-8-ol tr - - - tr - - -

37. α-Terpineol 0.2 - 1.8 - 0.1 - tr -

38. Mirtenol 0.1 - 0.5 - - - - -

39. Verbenon tr - - - - - - -

40. trans-Karveol tr - - - - - - -

41. Timil-metil-etar tr - - - - - - -

42. Karvon tr - - - - - - -

43. Bornil-acetat 1.9 - 0.5 0.5 3.0 - 0.1 0.8

44. 2-Undekanon 0.1 - - 0.1 1.1 - - -

45. Terpinen-4-il-acetat - - - 0.2 0.4 - - -

46. trans-Pinokarvil-acetat - - 0.3 - - - - -

47. Bicikloelemen tr Tr - - - - - 0.1

48. α-Terpinil-acetate 0.3 - - tr 1.2 - - 0.1

49. α-Kubeben tr Tr - - - - - tr

50. α-Ilangen tr - - - - - - -

51. α-Kopaen 0.2 0.3 - 0.2 0.6 - 0.2 0.1

52. β-Burbonen 0.1 Tr - 0.1 0.2 2.4 - tr

53. β-Kubeben - Tr - - - - - tr

54. β-Elemen 0.6 1.6 - 0.8 2.7 0.7 - 1.6

55. α-Funebren - - - - - 0.8 - -

56. Metileugenol - - - - tr - - -

57. (E)-Kariofilen 6.0 4.7 8.6 2.6 4.9 - 1.0 2.6

58. Mirtenal - - 0.6 - - - - -

59. β-Kopaen 0.1 Tr - - - - - tr

60. β-Gurjunen - - - 0.1 1.0 - - -

61. trans-α-Bergamoten - - - - 0.1 - - -

62. Aromadendren 0.2 0.5 - 0.1 0.4 - - tr

63. cis-Muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - -


18

64. trans-Muurola-3,5-

dien 0.1 - - - - - - -

65. α-Humulen 1.2 0.9 1.4 0.6 1.5 - tr 0.5

66. Seskvisabinen - Tr - - - - - -

67. cis-Muurola-4(14),5-

dien 0.2 - - - 0.1 - - 0.1

68. trans-Kadina-1(6),4-

dien 0.2 Tr - - - - - 0.1

69. allo-Aromadendren - - - 0.1 0.4 - - -

70. γ-Gurjunen - - - - 0.3 - - -

71. γ-Muurolen 0.6 0.9 1.8 0.5 1.5 2.5 - tr

72. Germakrene D 3.0 3.7 16.1 1.4 6.5 - 1.5 5.1

73. β-Selinen 0.6 1.6 - 0.5 1.3 0.9 - 0.2

74. trans-Muurola-

4(14),5-dien 0.2 Tr - - - - - 0.1

75. Biciklogermakren 2.9 6.0 - 2.1 6.2 - - 3.2

76. α-Muurolen 1.0 1.1 0.4 - 1.3 0.9 - 0.6

77. (Z)-β-Bisabolen - - - 0.1 0.2 - - -

78. Germakren A 0.3 0.7 - - - - - 0.2

79. δ-Amorfen - Tr - - - - - tr

80. γ-Kadinen 2.5 3.8 - 3.0 5.5 - - 0.9

81. Kubebol - - - - - 0.4 - 0.4

82. δ-Kadinen 6.0 7.1 2.4 4.7 11.6 - 4.8 3.5

83. Zonaren 0.1 - - - - - - -

84. trans-Kadina-1,4-dien 0.2 Tr - 0.1 0.3 - - 0.2

85. α-Kadinen 0.3 Tr - 0.2 4.0 - - 0.2

86. α-Kalakoren tr - - - - - - -

87. β-Kalakoren tr - - - - - - -

88. cis-Muurol-5-en-4β-ol - - - - 0.1 - - -

89. cis-Muurol-5-en-4α -ol - - - - 0.1 - - -

90. (Z)-3-Hekseni-benzoat - - - - 0.4 - - -

91. Germakren D-4-ol 0.4 Tr - 2.6 13.2 - 1.9 10.0

92. Spatulenol 0.4 - - - - 4.3 - tr

93. Kariofilen-oksid 0.2 - 0.8 0.1 0.3 12.7 - -

94. Humulen-epoksid II - - - - - 2.5 - -

95. Viridiflorol tr - - - 0.1 - - -

96. β-Oplopenon tr - - - - - - -

97. 1,10-di-epi-Kubenol 0.1 Tr - 0.1 0.3 - - 0.1

98. 1-epi-Kubenol 0.2 Tr - 0.2 0.5 - - 0.2


19

99. Kubenol - - - 2.0 5.1 - - -

100. epi-α-Kadinol - 1.8 - - - - 0.6 1.5

101. epi-α-Murrolol 2.0 1.8 - - - 1.9 0.6 1.7

102. α-Murrolol 0.3 - - - 0.7 0.7 - 0.5

103. α-Kadinol 2.0 3.5 - 1.9 7.7 3.1 1.3 4.1

104. α-Bisabolol - - - 0.1 0.2 - - -

105. Oplopanon - - - - 0.1 2.8 - -

106. Benzil-benzoat - - - - 0.2 - - -

107. Benzil-salicilat - - - - 0.1 - - -

108. Cembren 0.2 - - - - - - -

109. Manoil-oksid tr - - - - 30.2 - 0.1

110. 13-epi-Manoil-oksid 2.4 - - - - - - 0.1

111. Abietadien - - - - - - - tr

112. Isoabienol - - - - - - - 25.9

113. Metil-levopimarat - - - - - - - tr

114. Metil-neoabietat - - - - - - - tr

115. Heptakozan - - - - - 1.1 - -

116. Nonakozan - - - - - 6.8 - -

Ukupno 99.8 98.2 96.0 92.9 99.2 74.7 93.0 98.2

Monoterpeni 64.6 48.5 64.3 45.1 69.1 0.0 81.1 33.9

Seskviterpeni 32.3 49.7 31.5 27.9 50.0 36.6 11.9 37.9

Diterpeni 2.6 0.0 - 0.0 0.0 30.2 - 26.4

Ostalo 0.3 0.0 0.2 0.3 2.0 7.9 - 0.0

tr – detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a) Venskutonis et al. (2000) istraživali su sastav etarskog ulja četina P. sylvestris sa 15 raličitih lokaliteta na području Litvanije; u ovom radu su prikazane samo

minimalne i maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti


20

Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz svežih četina belog

bora ispitivao je veliki broj autora i u većini studija je pokazana dominacija α-pinena kao i u

ovom radu (tabela 4.1, slika 4.2). Ipak, Tsitsimpikou et al. (2001) su objavili veoma

neobičan terpenski profil za P. sylvestris iz Kraljevske botaničke bašte u Edinburgu, koji

odlikuje dominacija diterpena manoil-oksida (30.2%), dok nijedna monoterpenska

komponenta nije detektovana. Interesanto je da je manoil-oksid komponenta koja dominira u

etarskom ulju crnog bora sa Korzike (P. nigra subsp. laricio; Rezzi et al., 2001). Naime, reč

je o podvrsti koja zauzima najjužnije tačke u arealu P. nigra i prirodno je rasprosrtanjena

samo na Mediteranskim ostrvima (Korzika i Sicilija) kao i na najjužnijem delu Apeninskog

poluostrva (Kalabrija). Na ovaj način, dominacija istog diterpena u pojedinim uzorcima P.

nigra i P. sylvestris može da ukazuje i na određeni stepen filogenetske bliskosti između ove

dve vrste Diploxylon borova. Međutim, većina genetičkih studija ukazala je na najbliži

položaj P. sylvestris i P. mugo (krivulj), dok se P. nigra odvaja u posebnu grupu koja je čak

bliža pojedinim američkim i/ili azijskim vrstama borova (Gernandt et al., 2005).

Ako izuzmemo studiju Tsitsimpikou et al. (2001), sva ostala istraživana etarska ulja

P. sylvestris su sa α-pinenom kao glavnom komponentom i mogu se, generalno, podeliti u

dva hemotipa (grupe): hemotip bez ili sa niskom koncentracijom δ-3-karena (ova studija;

Ustun et al., 2012; Ioannou et al., 2014) i hemotip sa visokom koncetracijom δ-3-karena

(Kubeczka i Schultze, 1987; Venskutonis et al., 2000). S obzirom da α-pinen i δ-3-karen

predstavljaju dominantne komponente u etarskom ulju četina P. mugo (Ioannou et al., 2014;

Hajdari et al., 2015), kao i da "δ-3-karen" hemotip P. sylvestris odlikuje dominacija istih

jedinjenja, očigledno je da se filogenetska bliskost ove dve vrste ogleda i u njihovim

terpenskim profilima.


21

Slika 4.2. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju četina P. sylvestris

Hemotip P. sylvestris subsp. scotica

Hemotipovi P. sylvestris


22

Thoss et al. (2007) su istraživali infraspecijsku i fenološku varijabilnost monoterpena

u četinama belog bora i pokazali da promene u sastavu zavise od hemotipa. Hemotip "bez δ-

3-karena" odlikuje veća koncentracija α-pinena, β-pinena i kamfena kao i veća zastupljenost

ukupnih monoterpena, što ukazuje na to da odsustvo δ-3-karena ovakve individue

nadoknađuju sintezom drugih monoterpenskih jedinjenja. Sa druge strane, interesantno je da

je relativna koncentracija δ-3-karena, kod "δ-3-karen" hemotipa, veća u mladim četinama u

poređenju sa koncentracijom ovog jedinjenja kod potpuno razvijenih, zrelih četina. Autori su

ukazali na mogućnost postojanja evolutivnih razloga za ovakvu distribuciju resursa tj.

relativno visok sadržaj δ-3-karena u veoma mladim četinama može biti povezan sa većom

biološkom aktivnošću i zaštitnom funkcijom ovog jedinjanja koja je potrebna mladim

četinama tokom razvojnog stadijuma.

Sastav etarskog ulja za P. sylvestris subsp. scotica (Beissn.) E.F.Warb. (iz Kraljevske

botaničke bašte u Madridu) objavili su po prvi put Ioannou et al. (2014) (tabela 4.1, slika

4.2). Interesantno je da diterpeni čine značajnu frakciju ovog ulja (26.4%) sa izoabienolom

kao glavnim diterpenom koji predstavlja i dominantnu komponentu ulja (25.9%). Takođe,

ovo ulje je bogato i δ-3-karenom (10.7%), tako da pripada "δ-3-karen" hemotipu. Ovakvi

rezultati svakako ukazuju na mogući značaj terpena kao markera u infraspecijskoj

klasifikaciji belog bora, s obzirom da se istraživana podvrsta odlikuje dominacijom

diterpenskog jedinjenja koje nije prisutno u uljima ostalih ispitivanih uzoraka belog bora

(tabela 4.1). Sa druge strane, važno je napomenuti da u Flori Evrope, Gaussen et al. (1993)

ipak ne opisuju infraspecijske taksone P. sylvestris tj. smatraju da se postojeće varijante

mogu tretirati samo kao geografske grupe, bez posebnog taksonomskog statusa.

4.2. Hemijski sastav etarskog ulja izdanaka i šišarki P.

sylvestris

Hemijski sastav etarskog ulja izdanaka i šišarki P. sylvestris ispitivan je manje u

odnosu na sastav etarskog ulja četina (tabela 4.2, slika 4.3). Ustun et al. (2012) su istraživali

sastav ulja dobijenog hidro-destilacijom iz izdanaka P. sylvestris iz Turske. U ulju je

utvrđena dominacija monoterpena (65.0%) sa α-pinenom kao glavnom komponentom koja

čini 50.4% ulja. Najzastupljeniji seskviterpen, (E)-kariofilen, detektovan je, takođe, u visokoj

koncentraciji (10.8%). U okviru diterpenske frakcije, identifikovane su četiri komponente

koje zajedno čine 9.8% ulja. Sandarakopimarinal je glavni diterpen (6.7%), čije prisustvo nije


23

utvrđeno u etarskom ulju četina ove vrste (Ustun et al., 2012). Sa druge strane, Koukos et al.

(2001) su objavili sastav etarskog ulja izolovonog destilacijom vodenom parom iz izdanaka

belog bora sa područja Grčke. Interesantno je da nijedna diterpenska komponenta nije

detektovana, dok je β-felandren glavni monoterpen koji predstavlja dominantnu komponenta

ulja (29.1%). Ovo je, prema našim istraživanjima, jedina studija koja je pokazala dominaciju

β-felandrena u ulju P. sylvestris.

Prema Tumen et al. (2010), u etarskom ulju šišarki P. sylvestris iz Turske, diterpeni

predstavljaju najzastupljeniju terpensku klasu (42.4%), zatim slede monoterpeni (24.7%) i

seskviterpeni (18.8%). Diterpen 18-norabieta-8,11,13-trien je identifikovan kao dominanta

komponeta ulja (18.8%), a pored njega su još dva diterpena prisutna u koncentraciji iznad 5%

(dehidroabietal i abieta-8,11,13-trien). α-Pinen i kariofilen-oksid su utvrđeni u visokim

koncentracijama kao glavne mono- i seskviterpenske komponente (14.8 i 12.6%,

respektivno).

Tabela 4.2. Hemijski sastav etarskog ulja izdanaka i šišarki P. sylvestris.

Takson P. sylvestris P. sylvestris P. sylvestris

Poreklo biljnog materijala Turska,

Yedigoller, Bolu

Grčka,

Menoikion Turska, Bartin

Organ Izdanci Izdanci Šišarke

Način izolacije Hidro-destilacija Destilacija

vodenom parom Hidro-destilacija

Referenca Ustun et al.

(2012)

Koukos et al.

(2001)

Tumen et al.

(2010)

R. br. Komponente Sadržaj (%)

1. n-Heksanal 0.4 - -

2. Triciklen - 0.2 0.1

3. α-Pinen 50.4 19.4 14.8

4. Kamfen 1.0 2.3 0.6

5. Tuja-2,4(10)-dien - - 0.6

6. β-Pinen 3.9 17.3 1.8

7. β-Mircen 0.7 14.0 0.2

8. p-Cimen - - 0.5

9. α-Felandren - 0.1 -

10 Limonen 2.3 - 0.5

11. β-Felandren 0.3 29.1

12. Terpinolen - - tr

13. p-Cimenen - - 0.2

14. α-Kamfolen-aldehid - - 0.9

15. trans-Pinokarveol 1.1 - 0.9

16. cis-Verbenol - - tr

17. trans-Verbenol - - 0.1

18. Pinokarvon - - 0.2

19. Borneol - - tr

20. p-Menta-1,5-dien-8-ol 0.9 - 1.1

21. 4-Terpineol - - tr

22. α-Terpinolen - 0.2 -

23. α-Terpineol 1.3 - 0.4

24. Mirtenal - - 1.2


24

25. Mirtenol 0.4 0.3

26. Verbenon - - 0.6

27. (E)-2,4-Dekadienal 0.4 - -

28. trans-Karveol 0.7 0.2 tr

29. Linalil-acetat - 0.1 -

30. Bornil-acetat 2.0 1.3 tr

31. α-Terpinil-acetat - 0.9 -

32. α-Kopaen - 0.3 0.1

33. Junipen - 0.3 -

34. Longifolen - - 1.2

35. (E)-Kariofilen 10.8 1.3 2.9

36. (E)-2-Dekanal 0.4 - -

37. β-Kubeben - 0.2 -

38. α-Humulen 1.7 0.6 0.6

39. Germakren D 2.3 - tr

40. α-Muurolen - 0.4 tr

41. γ-Kadinen - - tr

42. Kubebol 0.3 - -

43. trans-kalamenen - - tr

44. δ-Kadinen 0.8 0.5

45. Kariofilen-oksid 1.1 - 12.6

46. Humulen-epoksid - - 1.5

47. 19-Norabieta-8,11,13-trien - - 4.8

48. Sandarakopimaradien 0.7 - -

49. Manoil-oksid 1.2 - -

50. 13-epi-Manoil-oksid 1.2 - -

51. Norabieta-4(18),8,11,13-

tetraen - - 4.6

52. Palustradien - - 0.4

53. 18-Norabieta-8,11,13-

trien - - 15.8

54. Abieta-8,11,13-trien - - 5.2

55. Abieta-7,13-dien - - 1.0

56. Neoabietadien i cis-

Abienol - - 0.1

57. Pimaral - - 0.6

58. Sandarakopimarinal 6.7 - -

59. Isopimaral - - 0.3

60. Palustral - - 1.5

61. Dehidroabietal - - 7.1

62. Abietal - - 0.8

63. Neoabietal - - 0.2

Ukupno 93.0 89.0 85.9

Monoterpeni 65.0 85.4 24.7

Seskviterpeni 17.0 3.62 18.8

Diterpeni 9.8 - 42.4

Ostalo 1.2 - 0.0

tr – detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano


25

Kao što se može videti na osnovu tabela 4.1 i 4.2, postoji velika varijabilnost u

hemijskom sastavu etarskog ulja P. sylvestris poreklom iz različitih organa biljke, ali

istovremeno i iz različitih delova areala vrste. Razlike se vrlo često ispoljavaju i u pogledu

dominacije druge klase terpenskih jedinjenja (mono-, seskvi- ili diterpeni). U etarskom ulju

četina najčešće dominiraju monoterpeni sa α-pinenom (0.0 - 42.1%), δ-3-karenom (0.0 –

24.6%) i β-pinenom (0.0 – 15.6%) kao glavnim komponentama. Seskviterpeni su nešto slabije

zastupljeni, a kao glavni izdvojili su se (E)-kariofilen (0.0 – 8.6%), germakren D (0.0 –

16.1%) i δ-kadinen (0.0 – 11.6%). Dve diterpenske komponente labdanskog strukturnog tipa,

Slika 4.3. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju izdanaka i šišarki

P. sylvestris


26

manoil-oksid i izoabienol, detektovane su kao dominantne u ulju pojedinih uzoraka P.

sylvestris (30.2% i 25.9%, respektivno).

U ulju izdanaka glavni monotepreni su α-pinen (19.4 – 50.4%), β-felandren (0.3 –

29.1%) i β-pinen (3.9 – 17.3%), dok je u okviru seskviterpenske frakcije jedino (E)-kariofilen

detektovan u koncentraciji iznad 5% (1.3 – 10.8%). Za razliku od etarskog ulja četina u kome

su identifikovani diterpeni labdanskog strukturnog tipa, u ulju izdanaka belog bora iz Turske

utvrđeno je prisustvo diterpena pimaranskog tipa (sandarakopimarinal) u koncentraciji od

6.7%.

U etarskom ulju šišarki P. sylvestris iz Turske dominiraju diterpeni abietanskog

strukturnog tipa: 18-norabieta-8,11,13-trien (18.8%), dehidroabietal (7.1%) i abieta-8,11,13-

trien (5.2%). Pored navedenih diterpena, α-pinen i kariofilen-oksid su, takođe, detektovani u

visokim koncentracijama (14.8 i 12.6%, respektivno).

4.3. Biološka aktivnost etarskog ulja P. sylvestris

4.3.1. Antimikrobna aktivnost

U ovom odeljku prikazan je uporedni pregled literaturnih podataka o antibakterijskoj i

antifungalnoj aktivnosti etarskog ulja P. sylvestris određenih metodama agar dilucije

(Hammer et al., 1999) i agar difuzije (Motiejūnaitė i Pečiulyė, 2004). Vrednosti minimalnih

inhibitornih koncentracija (MIC) i minimalnih inhibitornih koncentracija potrebnih za

inhibiciju rasta 90% mikroorganizama (MIC90) izražene u % (v/v) prikazane su u tabeli 4.3.

Hammer et al. (1999) su testirali antimikrobnu aktvinost 52 etarska ulja i ekstrakta

protiv Acinetobacter baumanii, Aermonas sobria, Candida albicans, Enterococcus faecalis,

Echerichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonela enterica subsp.

enterica, Serratia marcescens i Staphylococcus aureus, metodom agar dilucije. Najjaču

aktivnost ispoljila su etarska ulja Cymbopogon citratus, Origanum vulgare i Pimenta

racemosa koja su inhibirala sve organizme pri koncentraciji ≤ 2% (v/v). Šest ispitivanih ulja

nije imalo nikakvo antimikrobno delovanje, dok se etarsko ulje P. sylvestris nalazi u grupi

ulja sa umerenim antimikrobnim potencijalom, tj. MIC od 2.0 ili > 2.0% (v/v). Među

testiranim patogenima, najbolju aktivnost etarsko ulje P. sylvestris ispoljalo je protiv Gram (-)

bakterija Acinetobacter baumanii, Aermonas sobria i Escherichia coli i kvasca Candida

albicans (tabela 4.3).


27

Tabela 4.3. Vrednosti MIC i MIC90 etarskog ulja P. sylvestris % (v/v) protiv određenih vrsta

mikroorganizama.

Testirani mikroorganizmi MIC MIC90 Referenca

Gram (+)

bakterije

Enterococcus faecalis >2.0 Hammer et al. (1999)

Staphylococcus aureus >2.0 Hammer et al. (1999)

Rhodococcus sp. 0.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Bacillus sp. 0.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Gram (-)

bakterije

Acinetobacter baumanii 2.0 Hammer et al. (1999)

Aeromonas sobria 2.0 Hammer et al. (1999)

Escherichia coli 2.0 Hammer et al. (1999)

Klebiella pneumoniae >2.0 Hammer et al. (1999)

Pseudomonas aeruginosa >2.0 Hammer et al. (1999)

Salmonella typhimuium >2.0 Hammer et al. (1999)

Serratia marcescens >2.0 Hammer et al. (1999)

Gljive

Candida albicans 2.0 Hammer et al. (1999)

Chaetomium globosum 0.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Cladosporium

cladosporioides 0.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Aspergillus niger 0.75-1.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Aspergillus versicolor 0.75-1.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Aureobasidium pallulans 0.5-0.75 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Paecilomyces variotii 1.2 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Penicillium chysogenum 1.0-2.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Phoma glomerata 1.5-2.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Phoma sp. 0.75 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Rhizopus stolonifer 0.5-0.75 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Stachybotrys chartarum 1.0-1.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Trichoderma viride 0.55 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Ulocladium atrum 0.75-1.0 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Caudida lipolytica 0.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Geotricum candida 0.35-0.5 Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004)

Sa druge strane, Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004) su ispitivali antimikrobni potencijal

etarskog ulja P. sylvestris u cilju poboljšanja kvaliteta unutrašnjeg vazuha (IAQ - indoor air

quality) kod sindroma bolesne zgrade - SBS (Sick Building Syndrome). Termin SBS se


28

koristi za opis situacije u kojoj stanovnici i korisnici zgrade osećaju nedostatke udobnosti, ali

i akutne zdravstvene probleme koji su direktno povezani sa vremenom provedenim u objektu.

Po definiciji Svetske zdravstvene organizacije (SZO), sindrom bolesne zgrade je stanje

praćeno iritacijama sluznica, vegetativnim smetnjama kao što su glavobolje i umor, a isto tako

i narušavanjem mentalnog zdravlja, depresijom, iritiranošću i letargijom, a direktno je

povezan sa kvalitetom unutrašnjeg vazuha. Kao osnovni uzroci SBS navode se

neodgovarajuća ventilacija, hemijski zagađivači u enterijeru, hemijski zagađivači iz

spoljašnjih izvora i naravno biološki zagađivači. Motiejūnaitė i Pečiulyė (2004) su odredili

antimikrobnu aktivnost etarskog ulja P. sylvestris protiv 17 vrsta patogena koji se navode kao

česti uzročnici SBS. Utvrđeno je da ovo ulje pokazuje antimikrobnu aktivnost na 13 vrsta

mikroorganizama (osam gljiva, dve kvasolike gljive, jedan kvasac i dve bakterije), gde su

utvrđene minimalne inhibitorne koncentracije od 1.0-2.5, 1.0-1.2, 0.5-0.75, i 0.75-1.2% (v/v),

respektivno (tabela 4.3) Prema rezistentnosti na etarsko ulje belog bora, mikroorganizmi se

mogu grupisati na sledeći način: gljive, spore bakterija, kvasolike gljive, kvasci i bakterije

(gljive kao najrezistentnije i bakterije kao najosetljivije). Dobijeni rezultati potvrđuju

antimikrobni potencijal etarskog ulja P. sylvestris kao i njegovu upotrebu za poboljšanje

kvaliteta unutrašnjeg vazuha kod SBS (Motiejūnaitė i Pečiulyė, 2004).

Takođe, poznato je da su kod četinara biosinteza i infiltracija smola u tkivima

uključeni u proces odbrane od različitih povreda i gljivičnih infekcija (Maciąg et al., 2007). U

reakciji na povredu borovi akumuliraju 40% više oleoresina, koji predstavlja aromatičnu

smolu (rastvor smole u etarskom ulju). Oleoresini borova sadrže oko 60-70% smolnih

kiselina, kao i isparljive i ne-isparljive terpenoide. Smatra se da su monoterpeni toksični za

patogene gljive koje nastanjuju drvo četinara, dok smolne kiseline pokazuju malu toksičnost i

predstavljaju uglavnom mehaničku barijeru. Na ovaj način možemo pretpostaviti da gljive

koje učestvuju u mikorizi mogu imati i važnu ulogu u zaštiti korena biljke od različitih

patogena. Naime, stimulacija korena domaćina da sintetiše isparljive antimikrobne supstance

je jedan od predloženih mehanizama zaštite od infekcija (Maciąg et al., 2007). Napierala-

Filipiaka et al. (2002) i Werner et al. (2004) su odredili kvalitativne i kvantitativne promene u

sadržaju i sastavu terpena u korenima klijanaca P. sylvestris nakon inokulacije mikoriznih

gljiva. Prema Napierala-Filipiaka et al. (2002) inokulacija klijanaca belog bora sa šest sojeva

gljiva dovodi do povećne biosinteze terpena i to uglavnom α-pinena i δ-3-karena. U obe

studije je, takođe, pokazano da efekat inokulacije zavisi i od podloge, jer je na nezagađenoj

podlozi inokulacija biljaka gljivama izazvala biosintezu sličnog sadržaja isparljivih


29

komponenti, dok su na zagađenom substratu mikorizni korenovi pokazali značajno manji

sadržaj terpena (32-33%) u odnosu na korenove koji nisu bili u mikorizi (56%). Takođe,

mikorizne gljive pokazale su različit efekat na koncentraciju nekoliko terpena na oba

substrata. Sadržaj β-pinena, mircena, terpinolena i γ-muurolena je bio drastično manji na

zagađenoj podlozi. Sa druge strane, sadržaj ostalih komponenti, a naročito seskviterpena je

bio uvećan (Werner et al., 2004).

4.3.2. Larvicidna aktivnost protiv Diptera (Culicidae)

Fayemiwo et al. (2014) su testirali larvicidni potencijal etarskog ulja P. sylvestris i

Syzygium aromaticum (karanfilić) protiv dve vrste komaraca: Aedes aegypti (vektor virusa

žute, denga i zika groznice) i Culex quinquefasciatus (vektor valjkastog crva koji uzrokuje

elefantiazis, encefalitis i zika virusa). Oba etarska ulja su uzrokovala smrtnost preko 85%

larvi u roku od 24h. Ipak, larve A. aegypti su osetljivije na dejstvo oba etarska ulja [(LC50(S.

aromaticum)=92.56 mg/L, LC50(P. sylvestris)=100.39 mg/L] u odnosu na larve C.

quinquefasciatus [(LC50(S. aromaticum)=124.42 mg/L, LC50(P. sylvestris)=128.00 mg/L].

Iako za etarsko ulje S. aromaticum možemo reći da je toksičnije za larve komaraca od

etarskog ulja P. sylvestris, razlika u letalnim koncentracijama nije bila statistički značajna

(p>0.05). Dobijeni rezultati opravdavaju larvicidni potencijal oba etarska ulja kao i njihovu

upotrebu u kontroli ispitivanih vektora (Fayemiwo et al., 2014).

4.3.3. Herbivorni insketi: osnovni uzrok defolijacije kod borova

S obzirom da tokom napada herbivornih insekata četinarske šume mogu da pretrpe

intenzivnu defolijaciju, u velikom broju dosadašnjih studija ispitivana je interakcija između

insekata i četinara. Ustanovljeno je da monoterpenske komponente etarskih ulja imaju veoma

važnu ulogu u pomenutoj interakciji, tj. da sprečavaju ishranu i polaganje jaja raznih vrsta

fitofagnih insekata (Litvag i Monson, 1998).

Ipak, među najvažnijim herbivornim insektima koji izazivaju defolijaciju borova su

Lymantria monacha (omorikov prelac), L. dispar (gubar) i Diprion pini (borova zolja). Kao

što je pomenuto u uvodnom poglavlju, P. sylvestris je jedna od najšire rasprostanjenih vrsta

četinara u Evroaziji, sa arealom koji se proteže od Velike Britanije sve do istočnog Sibira,

tako da šteta koju nanose ovi fitofagni insekti može da ima ozbiljne ekološke i ekonomske


30

posledice. Lymantria monacha je najopasnija štetočina koja izaziva defolijaciju kod P.

sylvestris, s obzirom da jedna gusenica tokom svog razvića može da uništi oko 300 borovih

iglica. Međutim, prema Kolk i Starzyk (1996), iako stablo smrče (Picea spp.) u normalnim

uslovima ne može da preživi ako mu je uništeno više od 50% iglica, P. sylvestris ima veću

rezinstenciju.

U cilju istraživanja potencijalnog rizika od širenja L. monacha u Severnoj Americi,

Keena i Withers (2001) su testirali opstanak i razvoj larvi L. monacha tokom prvih 14 dana

razvoja, na 26 severnoameričkih i 8 introdukovanih evropskih biljnih vrsta. Razvoj stabilnih

populacija L. monacha u Severnoj Americi bi mogao dovesti do velike katastrofe, s obzirom

da je reč o vrsti koja može da preživi i razvije se na velikom broju vrsta drveća značajnih sa

ekološkog i ekonomskog aspekta. Podaci o stepenu pogodnosti domaćina pokazali su da je za

opstanak i razvoj larvi L. monacha pogodno sedam vrsta četinara, uključujući i P. sylvestris,

kao i šest širokolisnih vrsta.

Prema Wibe et al. (1998), konfiguracija monoterpena je veoma važna u privlačenju

određenih vrsta insekata. Velikog borovog surlaša, Hylobius abietis, privlači etarsko ulje koje

proizvodi klijanac P. sylvestris. Autori ukazuju na mogućnost da H. abietis razlikuje biljne

vrste koje mogu ili ne mogu da budu njegovi domaćini, upravo na osnovu enantiomera. I

pored invidualnih varijacija, svaka biljna vrsta konstantno sadrži više jednog enantiomera od

drugog, npr. P. sylvestris sadrži više (–) nego (+)-α-pinena. Različiti enantiomeri ili stimulišu

ili inhibiraju olfaktorne neuroreceptore insekata, i na taj način insekti mogu da izaberu

odgovarajuću biljku domaćina (Wibe et al., 1998).

U drugom istraživanju, Wibe et al. (1997) su ispitivali uticaj pojedinačnih komponenti

etrarskog ulja na aktivaciju olfaktornih neuroreceptora kod H. abietis. Neuroreceptori su

klasifikovani u 30 tipova na osnovu jedinjenja koja izazivaju najjači odgovor. Kod 14 tipova

najjači odgovor je bio na monoterpene, uključujući biciklične (npr. α-pinen, kamfor i

mirtenal) za 8, monociklične (limonen, karvon, α-terpinen) za tri i aciklične (npr. mircen i

linalol) isto za tri tipa neuroreceptora. Takođe, pet seskviterpenskih komponenti je izazvalo

jak odgovor, uključujući α-kopaen i (E)-β-farnezen, a pored seskviterpena izdvojio se i anetol,

jedinjenje koje je derivat fenilpropana i biosintetički nije povezan sa terpenima. Na osnovu

ovakvih rezultata možemo zaključiti da je veza između hemijske strukture i aktivnosti veoma

važna za dekodiranje informacije biljnih mirisa.

U sklopu istraživanja o tome zašto fitofagne insekte privlače borovi, Mumm et al.

(2003) su ispitivali headspace isparljive komponente P. sylvestris čija je biosinteza


31

indukovana polaganjem jaja borove zolje (D. pini). Kako bi odredili koje isparljive

komponente privlače ovog parazitoida, atraktivna mirisna smesa P. sylvestris indukovana

konstantnom ovipozicijom D. pini upoređena je sa ne-atraktivnim mirisom oslobođenim

veštačkim oštećenjem grančica belog bora, što je bila imitacija zasecanja koje ženka D. pini

vrši pre polaganja jaja. Analiza je pokazala da se jedina razlika u hemijskom sastavu odnosi

na značajno veći sadržaj (E)-β-farnezena u mirisnoj smesi indukovanoj stvarnom

ovipozicijom D. pini.

Litvak i Monson (1998) su istraživali mogućnost da napad herbivora pokreće sintezu

monoterpena kod četiri vrste četinara, kao i prostorni obrazac sinteze monoterpena u četinama

P. ponderosa. Rezultati su pokazali da larve tigrastog moljca, herbivora korišćenog u ovom

istraživanju, uvek pojedu samo polovinu ili dve trećine svake četine P. ponderosa, pre nego

što pređu na neoštećenu četinu. Smatra se da je za ovo odgovorna veća koncentracija i

raznovrsnost monoterpenskih jedinjenja u donjem delu četine. Iako ovakve nalaze potvrđuju i

ranije studije, autori ne isključuju i druga moguća objašnjenja kao što su distribucija vode ili

dostupnost azota. Takođe, autori navode da oštećenje tkiva pokreće bisintetske cikluse

monoterpena u roku od 4-8 dana kod svih ispitivanih vrsta osim kod Picea engelmannii

(Litvak i Monson, 1998).

4.3.4. Antikancerogena aktivnost

Poslednjih godina interesovanje za prirodnim biljnim komponentama sa potencijalnim

antikancerogenim efektima kontinuirano raste i značajna pažnja je usmerena na pronalazak

hemopreventivnih biljnih preparata koji bi usporili ili potpuno zaustavili proces

kancerogeneze. Naime, većina sadašnjih antitumorskih lekova ima negativne sporedne efekte

koji prate njihova terapeutska dejstva. Zbog toga ispitivanja biljnih produkata i identifikacija

novih prirodnih proizvoda sa jakom antikancerogenom aktivnošću, a istovremeno malom

citotoksičnošću na normalne ćelije, dobijaju sve veći značaj u oblasti antikancerogenih

studija.

Do sada je publikovano nekoliko radova u kojima je pokazano da četine borova imaju

značajan antioksidativni, antimutageni i antiproliferativni efekat na ćelije kancera (Huang et

al., 2005; Lee et al., 2007; Wu et al., 2011). U slučaju P. sylvestris, Hoai et al. (2015) su

testirali citotoksičnu ativnost metanolnog ekstrakta i etarskog ulja četina korišćenjem

sulforhodamin B (SRB) testa u različitim linijama ćelija kancera dojke. Ekstrakt četina belog


32

bora suprimira vijabilnost nekoliko ćelijskih linija humanog kancera pokazujući jači efekat na

estrogen receptor (ER)-negativne ćelije, MDA-MB-231 (IC50=35 mg/mL) u poređenju sa ER-

pozitivnim ćelijama, MCF-7 (IC50=86 mg/mL). Etarsko ulje P. sylvestris pokazalo je jači

citotoksični efekat i na ER-negativne i na ER-pozitivne ćelijske linije kancera dojke (IC50=29

μg/mL za obe ćelijske linije) u odnosu na metanolni ekstrakt (IC50=42 and 80 μg/mL,

respektivno). Rezultati ovog rada ukazuju na hemopreventivni ili hemoterapeutski potencijal

etarskog ulja i ekstrakta četina P. sylvestris u tretmanu karcinoma dojke koji ne reaguje na

hormonsku terapiju.


33

5. ZAKLJUČCI

1. Etarsko ulje P. sylvestris, sa područja zapadne Srbije, odlikuje dominacija

monoterpena (64.6%) sa α-pinenom kao glavnom komponentom koja čini 41.8% ulja.

Sledeće najzastupljenije jedinjenje iz monoterpenske frakcije je kamfen, koji je

prisutan u niskoj koncentraciji (4.7%). Sa druge strane, najzastupljeniji seskviterpeni,

β-kariofilen i δ-kadinen, detektovani su u umerenim koncentracijama (6.0 i 6.0%). U

okviru diterpenske frakcije utvrđena su samo dva jedinjenja, cembren i 13-epi-manoil-

oksid, koja zajedno čine svega 2.6% ulja. Na ovaj način, prosečan hemijski profil

glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etraskom ulju P. sylvestris možemo

predstaviti na sledeći način:

α-pinen >>> β-kariofilen = δ-kadinen

(>>> označava razliku veću od 15.1%, = razliku od 0.1-1.0%)

2. Na osnovu dosadašnjih istraživanja možemo zaključiti da postoji velika varijabilnost

u hemijskom sastavu etarskog ulja P. sylvestris poreklom iz različitih organa biljke,

ali istovremeno i iz različitih delova areala vrste. Razlike se vrlo često ispoljavaju i u

pogledu dominacije druge klase terpenskih jedinjenja (mono-, seskvi- ili diterpeni). U

etarskom ulju četina najčešće dominiraju monoterpeni sa α-pinenom (0.0 - 42.1%), δ-

3-karenom (0.0 – 24.6%) i β-pinenom (0.0 – 15.6%) kao glavnim komponentama.

Seskviterpeni su nešto slabije zastupljeni, a kao glavni izdvojili su se (E)-kariofilen

(0.0 – 8.6%), germakren D (0.0 – 16.1%) i δ-kadinen (0.0 – 11.6%). Takođe, postoje i

podaci da diterpenske komponente labdanskog strukturnog tipa, tj. manoil-oksid i

izoabienol, mogu da dominiraju u etarskom ulju četina P. sylvestris (30.2% i 25.9%,

respektivno).

3. U ulju izdanaka glavni monotepreni su α-pinen (19.4 – 50.4%), β-felandren (0.3 –

29.1%) i β-pinen (3.9 – 17.3%), dok je u okviru seskviterpenske frakcije jedino (E)-

kariofilen detektovan u koncentraciji iznad 5% (1.3 – 10.8%). Za razliku od etarskog

ulja četina u kome su identifikovani diterpeni labdanskog strukturnog tipa, u ulju

izdanaka belog bora iz Turske utvrđeno je prisustvo diterpena pimaranskog tipa

(sandarakopimarinal) u koncentraciji od 6.7%.


34

4. U etarskom ulju šišarki P. sylvestris iz Turske dominiraju diterpeni abietanskog tipa:

18-norabieta-8,11,13-trien (18.8%), dehidroabietal (7.1%) i abieta-8,11,13-trien

(5.2%). Pored navedenih diterpena, α-pinen i kariofilen-oksid su, takođe, detektovani

u visokim koncentracijama (14.8 i 12.6%, respektivno).

5. Na osnovu pregleda literaturnih podataka, možemo zaključiti da etarsko ulje P.

sylvestris poseduje veći broj bioloških aktivnosti:

a) antibakterijsku (naročito protiv Gram (+) bakterija Rhodococcus sp. i Bacillus sp.

kao i Gram (-) Acinetobacter baumanii, Aermonas sobria i Escherichia coli)

b) antifungalnu (naročito protiv Candida albicans i Ulocladium oudemansii)

c) larvicidnu protiv Aedes aegypti i Culex quinquefasciatus (Culicidae)

d) antikancerogenu – citotoksični efekat na ER-negativne i ER-pozitivne ćelijske

linije kancera dojke

6. Sa druge strane, pojedine komponente etarskog ulja P. sylvestris deluju kao atraktanti,

tj. aktivatori olfaktornih neuroreceptora kod nekoliko vrsta herbivornih insekata

(Lymantria monacha, L. dispar, Diprion pini i Hylobius abietis) koji su osnovni uzrok

defolijacije borova.


35

6. LITERATURA

Adams R. P. 2007. Identification of Essential Oil Component by Gas

Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, IL.

Deans S. G., Ritchie G. 1987. Antibacterial properties of plant essential oils. International

Journal of Food Microbiology, 5 (2), 165-180.

European Pharmacopoeia. 1997. Biological tests. 3th ed. Paris: Council of Europe, 123–7.

Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,

Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M.,Oskin

M., Burbank D., Alsdorf D. 2007. The shuttle radar topography mission. Reviews of

Geophysics, 45, RG2004. 10.1029/2005RG000183.

Fayemiwo K., Adeleke M., Okoro O. P., Awojide S. H., Olufemi I. 2014. Larvicidal

efficacies and chemical composition of essential oils of Pinus sylvestris and Syzygium

aromaticum against mosquitoes. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 4(1),

30-4.

Gašić M. J. 1985. Etarska ulja. IHTM, Beograd.

Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1993. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,

Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea. 1,

2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44.

Gernandt D. S., Geada López G., Ortiz García S., Liston A.2005. Phylogeny and

classification of Pinus. Taxon, 54, 29-42.

Gorunović M., Lukić P. 2001. Farmakognozija. Farmaceutski fakultet u Beogradu.

Hammer K. A., Carson C. F., Riley T. V. 1999. Antimicrobial activity of essential oils and

other plant extracts. Journal of Applied Microbiology, 86, 985-990.

Hili P., Evens C.S., Veness R. G. 1997. Antimicrobial activity of essential oils: the effect of

dimethylsulfoxide on the activity of cinnamom oil. Letters in Applied Microbiology,

24, 269-275.


36

Ioannou E., Koutsaviti A., Tzakou O., Roussis V. 2014. The genus Pinus: a comparative

study on the needle essential oil composition of 46 pine species. Phytochemistry

Reviews, DOI 10.1007/s11101-014-9338-4.

Janssen A. M., Scheffer J. J. C., Baerheim Svendsen A. 1987. Antimicrobial activity of

essential oils: a 1976-86 literature review. Aspect of the test methods. Planta Medica,

53, 395-398.

Jovanović B. 1992. P. nigra Arn. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka i

umetnosti, Beograd, pp. 200-202.

Keena M. A., Withers T. M. 2001. Lymantria monacha (Nun moth) and L. dispar (Gypsy

moth) survival and development on improved Pinus radiate. New Zealand Journal of

Forestry Science, 31, 66-77.

Kolk A., Starzyk J. R. 1996. The Atlas of Forest Insect Pests. Multico, Warszawa.

Koukos P. K., Papadopoulou, K. I., Papagiannopoùlos A. D., Patiaka D. Th. 2001. Essential

oils of the twigs of some conifers grown in Greece. European Journal of Wood and

Wood Products, 58(6), 437-438.

Kovačević N. 2004. Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Srpaska školska knjiga, Beograd.

Kubeczka A-H., i Schultze W. 1987. Biology and chemistry of conifer oils. Flavour and

Fragrance Journal, 2, 137-148.

Lawless J., 1995. The Illustrated Encyclopedia of Essential Oils. Shaftesbury, UK: Element

Books Ltd.

Lis-Balchin M., Deans S. G. 1997. Bioactivity of selected plant essential oils against Listeria

monocytogenes. Journal of Applied Bacteriology, 82, 759-762.

Litvak M. E., Monson R. K., 1998. Patterns of induced and constitutive monoterpene

production in conifer needles in relation to insect herbivory. Oecologia, 114, 531-540.

Maciąg A., Kelemba D., Milaković D., Christensen H. H., Antolović V. 2007. Essential oil

composition and plant-insect relations in scots pine (Pinus sylvestris L.). Scientific

Bulletin of The Technical University of Lodz, No. 1008, Food Chemistry and

Biotechnology, 71, 87-91.

Mirov N. T. 1967. The genus Pinus. Ronald Press Company, New York, NY.


37

Mishra A. K., Dubey N. K. 1994. Evaluation of some essential oils for their toxicity against

fungi causing deterioration of stored food commodities. Applied and Environmental

Microbiology, 60, 1101-1105.

Morris J. A., Khettry A., Seitz E. W. 1979. Antimicrobial activity of aroma chemicals and

essential oils. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 56, 595-603.

Mumm R., Schrank K., Wegener R., Schulz S., Hilker M. 2003. Chemical analysis of

volatiles emitted by Pinus sylvestris after induction by insect oviposition. Journal of

Chemical Ecology, 29, 1235-1251.

Napierala-Filipiaka A., Werner A., Mardarowiez M., Gawdzik J. 2002. Concentrations of

terpenes in mycorrhizal roots of Scots pine (Pinus sylvestris L.) seedlings grown in

vitro. Acta Physiologiae Plantarum, 24, 137-143.

Pavlović Z. 1951. Vegetacija planine Zlatibor. Zbornik radova Instituta za ekologiju i

biogeogeografiju SANU, 2, 115-182.

Petrakis P. V., Tsitsimpikou C., Tzakou O., Couladis M., Vagias C., Roussis V. 2001. Needle

volatiles from five Pinus species growing in Greece. Flavour and Fragrance Journal,

16, 249-252.

Petrović S., Maksimović Z., Kundaković T. 2009. Analiza sastojaka biljnih droga. Priručnik

za teorijsku i praktičnu nastavu iz predmeta Farmakognozija. Farmaceutski fakultet,

Beograd.

Reuter H. I., Nelson A., Jarvis A., 2007. An evaluation of void filling interpolation methods

for SRTM data. International Journal of Geographycal Information Science, 21, 983-

1008.

Reynolds J. E. F. 1996. Martindale – the Extra Pharmacopoeia 31st edn. London: Royal

Pharmaceutical Society of Great Britain.

Rezzi S., Bighelli A., Mouillot D., Casanova J. 2001. Composition and chemical variability of

the needle essential oil of Pinus nigra subsp. laricio from Corsica. Flavour and

Fragrance Journal, 16, 379-383.

Ross S. A., El-Keltawi N. E., Megalla S. E., 1980. Antimicrobial activity of some Egyptian

aromatic plants. Fitoterapia, 51, 201-205.


38

Santos A. M., Vasconcelos T., Mateus E., Farrall M. H., Gomes Da Silva M. D. R., Paiva M.

R., Branco M. 2006. Characterization of the volatile fraction emitted by phloems of

four Pinus species by solied-phase microextraction and gas chromatography-mass

spectrometry. Journal of Chromatography A, 1105, 191-198.

Šarac Z. 2014. Utvrđivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra

Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera. Doktorska

disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Šarac Z., Matejić J. S., Stojanović-Radić Z. Z., Veselinović J. B., Džamić A. M., Bojović S.,

Marin P. D. 2014. Biological activity of Pinus nigra terpenes – evaluation of FtsZ

inhibition by selected compounds as contribution to their antimicrobial activity.

Computers in Biology and Medicine, 54, 72-78.

Thao D. T., Orav A., Raal A., Duc H. V., Hoai N. T. 2015. Selectivity of Pinus sylvestris

extract and essential oil to estrogen-insensitive breast cancer cells Pinus sylvestris

against cancer cells. Pharmacognosy Magazine, 11(Suppl 2): 290–295.

Thoss V., O’Reilly-Wapstra J., Iason G. R. 2007. Assessment and implication of intraspecific

and phonological variabilityt in monoterpene of Scots pine (Pinus sylvestris) foliage.

Journal of Chemical Ecology, 33, 477-491.

Tsitsimpikou C, Petrakis P. V., Ortiz A., Harvala C., Roussis V. 2001. Volatile needle

terpenoids of six Pinus species. Journal of Essential Oil Research, 13, 174-178.

Tumen I., Aydemir D., Gundez G., Uner B., Centin H. 2010. Changes in the chemical

structure of thermally treated wood. Article in Bioresources 5(3), 1936-1944.

Ustun O., Senol F. S., Kurcuoglu M., Erdogan Orhan I., Kartal M, Baser K. H. C. 2012.

Investigation on chemical composition, anticholinesterase and antioxidant activities of

extracts and essential oils of Turkish Pinus species and pycnogenol. Industial Crops

and Products, 38, 115-123.

Venskutonis L., Vyskupaityte K., Plausinatis R. 2000. Composition of essential oils of Pinus

sylvestris L. from different locations od Lithuania. Journal of Essential Oil Research,

12, 559-565.

Werner A., Napierala-Filipiaka A., Mardarowiez M., Gawdzik J.. 2004. The effects of heavy

metals, content of nutrients and inoculation with mycorrhizal fungi on the level of

terpenoids In roots of Pinus sylvestris. Acta Physiologiae Plantarum, 26, 187-196.


39

Wibe A., Borg-Karlson A-K., Norin T., Mustaparta H. 1997. Identification of plant volatiles

activating single receptor neurons in the pine weevil (Hylobius abietis). Journal of

Chromatography A, 180, 585-595.

Yousef R. T. and Tawil G. G. 1980. Antimicrobial activity of volatile oils. Die Pharmazie,

35, 698-701.

Zlatković B., Šarac Z. 2016. Praktikum iz sistematike biljaka. Prirodno-matematički fakultet,

Univerzitet u Nišu.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Тања Стојиљковић

Ментор, МН: Зорица С. Митић

Наслов рада, НР: Биолошка активност и хемијски састав етарског уља Pinus sylvestris

(Pinaceae) пореклом из различитих делова биљке

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2017.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

39 страна; 5 слика; 4 табеле

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Ботаника

Предметна одредница/Кључне речи,

ПО: Pinus sylvestris, етарско уље, варијабилност, биолошка активност

УДК 581.5 : 544.02 +582.475 : 665.52

Чува се, ЧУ: Библиотека Извод, ИЗ: Ово истраживање је спроведено у циљу добијања података о хемијском

саставу етарског уља четина Pinus sylvestris са подручја Србије, као и поређења добиљених резултата са литературним подацима о саставу уља белог бора пореклом из различитих органа биљке (четине, изданци и шишарке). Комбинацијом GC-FID и GC-MS анализе у етарском уљу четина P. sylvestris из западне Србије утврђена је доминација монотерпена (64.6%) са α-пиненом као главном компонентом која чини 41.8% уља. На основу досадашњих истраживања можемо констатовати да постоји велика варијабилност у саставу уља белог бора пореклом из различитих органа биљке, али истовремено и из различитих делова ареала врсте. Такође, према доступним литературним подацима, етарско уље P. sylvestris поседује већи број биолошких активности: антибактеријску, антифунгалну, ларвицидну против Aedes aegypti и Culex quinquefasciatus као и антиканцерогену. Са друге стране, поједине компоненте етарског уља P. sylvestris делују као атрактанти, тј. активатори олфакторних неурорецептора код неколико врста хербиворних инсеката који су основни узрок дефолијације борова.

Датум прихватања теме, ДП: 17.05.2017.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Бојан Златковић

Члан: Др Снежана Јовановић

Члан,

ментор: Др Зорица Митић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Tanja Stojiljković

Mentor, MN: Zorica S. Mitić

Title, TI: Biological activity and chemical composition of essential oil of Pinus sylvestris

(Pinaceae) from various parts of plant

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2017

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/a

ppendixes)

39 p.; 5 pictures; 4 tables

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Botany

Subject/Key words, S/KW: Pinus sylvestris, essential oil, variability, biological activity

UC 581.5 : 544.02 +582.475 : 665.52

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB: The goals of this research are obtaining data on chemical composition of needle essential oil of Pinus sylvestris from Serbia and comparison of these results with literature data on composition of Scots pine essential oil collected from various parts of plant (needles, twigs and cones). Combination of GC-FID and GC-MS analyses of essential oils from needles of P. sylvestris from Western Serbia has shown domination of monoterpenes (64.6%) with α-pinene as the main component comprising 41.8% of oil. Consistent with previous research it may be concluded that there is a great variability in chemical composition of essential oil of P. sylvestris, both when samples are taken from various organs of the same plant and from plants from different parts of range of this species. In addition, the available literature sources state that essential oil of P. sylvestris has a number of biological activities: antibacterial, antifungal, larvicidal against Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus and anticancer. On the other hand, certain components of essential oil of P. sylvestris show attractant activity as activators of olfactory neuroreceptors in several species of herbivorous insects which are the main cause of defoliation in pines.

Accepted by the Scientific Board

on, ASB:

17.05.2017.

Defended on, DE:

Defended

Board,

DB:

President: Dr. Bojan Zlatković

Member: Dr. Snežana Jovanović

Member, Mentor: Dr. Zorica Mitić

Documents

MASTER RAD - Prirodno matematicki fakultet · seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri,