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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE FSICA DE SO CARLOS
Mario de Oliveira Neto
Espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo
estrutural de protenas
So Carlos 2008
MARIO DE OLIVEIRA NETO
Espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo
estrutural de protenas
Tese apresentada ao programa de Ps-graduao em Fsica do Instituto de Fsica de So Carlos, da Universidade de So Paulo, para obteno do ttulo de Doutor em Cincias. rea de concentrao: Fsica Aplicada. Opo: Fsica Biomolecular.
Orientao: Prof. Dr. Igor Polikarpov Co-orientao: Prof. Dr. Aldo Flix Craievich
So Carlos 2008
AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalogrfica elaborada pelo Servio de Biblioteca e Informao IFSC/USP
Oliveira Neto, Mario de Espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo estrutural de protenas /Mario de Oliveira Neto; orientador Igor Polikarpov./ co-orientador Aldo Felix Craievich.-- So Carlos, 2008.
153p.
Tese (Doutorado em Cincias - rea de concentrao: Fsica Aplicada Opo Fsica Biomolecular) Instituto de Fsica de So Carlos da Universidade de So Paulo.
1. SAXS. 2.Receptores nucleares. 3. IL-22/IL-22R1. 4. ferredoxina. I. Ttulo.
DEDICATRIA
A Pri, aos meu pais e irmos, com todo
amor e carinho.
AGRADECIMENTOS
Aos orientadores, prof. Igor Polikarpov, prof. Aldo Flix Craievich, prof. Yvonne
Primerano Mascarenhas e Hannes Fischer, pela confiana, amizade e pelas aulas de SAXS; a
Maria Auxiliadora dos Santos, Marcos Calgaro e Ana Carolina M. Figueira pelos ensinamentos
no laboratrio de bioqumica; a equipe da oficina mecnica do IFSC, sob coordenao de Carlos
Nazareth Gonalves que desenvolveram os projetos mecnicos solicitados para o equipamento de
SAXS do IFSC; aos tcnicos de raios X, Jos Augusto L. Rocha e Jos Geraldo Catarino; as
tcnicas do laboratrio de Bioqumca Norma Bianca Saes e Susana Andrea Sculaccio; ao Michel
Ballestero, aluno de iniciao cientfica, parceiro nos estudos de SAXS; ao Thiago Bueno
(ICMC/USP) pelo programa de pr-tratamento de dados feito para o equipamento de SAXS do
IFSC; ao Ronaldo Luiz Alonso pelas demonstraes matemticas envolvidas no fenmeno de
espalhamento; as pessoas que confiaram no meu trabalho, e que desenvolvo estreita colaborao:
Douglas Machado (IQSC/USP), Tatiana Bastista (IQSC/USP), Carla Cristina Schmitt
Cavalheiro (IQSC/USP), Caroline Migliorini Figueira (IFSC/USP), Wanius Garcia
(IFSC/USP), Fabio de Lima Leite (Embrapa), Eliangela de Morais Teixeira. Jos Ribamar S.
F. Jnior (USP) e Jos Ramon Beltran Abrego (Ibilce/UNESP); aos professores, colegas de
trabalho e funcionrios do Departamento de Cristalografia; aos amigos Luis Maurcio T. R. Lima
(UFRJ), Napoleo F. Valadares (IFSC/USP), Rodrigo Mello, Fabiano Mello, Carlos
Castilho A. Frana e Helena Aguiar Frana. Aos amigos de longa data, Eric Marques Regadas,
Renan Marques Regadas, Fabio Fuckuma, Emerson Ribeiro e Antnio Joaquim da Silva Neto.
Em especial a famlia pelo constante apoio, meu pai Gilmar Andrade de Oliveira, minha me
Cristina Dantas de Oliveira, meus irmos Rodrigo Andrade de Oliveira e Luciana Dantas Di
Stfano, Renato Di Stfano, Lorenzo Di Stfano, Ceclia A. de Paula; aos meus padrinhos
Shiguero Takai e Leomar Leite Takai, a minha futura esposa Priscila Maziero. e seus pais
Alcides Antnio Maziero (Alemo) e Sonia Regina Maziero. Muito obrigado!!!Todos vocs esto
comigo...
No convm a gente levantar escndalo de comeo: s aos poucos que o escuro claro
(Guimares Rosa)
Resumo
O espalhamento de raios X a baixo ngulo tem se mostrado uma poderosa ferramenta na
nalise estrutural de protenas em soluo. Estudos em condies prximas ao estado nativo
podem ser realizados, permitindo a visualizao tridimensional de protenas ou complexos
formados. A tese apresentada aborda a teoria envolvida para utilizao desta ferramenta. Uma
nova metodologia foi proposta para a determinao da massa molecular de protenas em soluo,
utilizando apenas uma curva de SAXS em unidades arbitrrias, visto que at o momento, este
procedimento era realizado em comparao com outra protena padro de peso molecular
conhecido. Com relao instrumentao cientfica, um equipamento de SAXS foi desenvolvido
no Instituto de Fsica de So Carlos, permitindo agora que medidas de SAXS em protenas em
soluo sejam realizadas no instituto. Clonagem, expresso e purificao foram realizadas para o
domnio de ligao ao DNA da isoforma do receptor tireoideano humano, a caracterizao
experimental desta protena foi realizada por anisotropia de fluorescncia, crosslink e SAXS.
Aps formao do complexo DNA-protena, F2-DBD hTR, o mesmo foi submetido a
cristalizao, os cristais obtidos para o complexo no apresentaram padro de difrao e modelos
de baixa resoluo foram gerados utilizando SAXS. Alm disso, estudos de baixo ngulo foram
realizados linha de SAXS do LNLS para a enzima ferredoxina redutase de leptospira interrogans
e para o complexo formado por interleucina-22 e pelo receptor interleucina-22, sendo seus
modelos tridimensionais resolvidos.
Palavras-Chave: SAXS. receptores nucleares. IL-22/IL-22R1. ferredoxina.
ABSTRACT
Small angle X-ray scattering has been proven to be a powerful tool in the structural
analysis of proteins in solution. This technique permits the three-dimensional visualization of
native proteins envelop at the level of nanometers. In this study we discuss the small angle X-ray
scattering theory and we proposed a new methodology to determine the molecular weight of
proteins in solution, using only SAXS curve in arbitrary units. Prior the development of this
method, the proteins molecular weighs were calculated by comparison with another of known
size, usually bovine serum albumin. We also assembled SAXS equipment at the Physics Institute
of So Carlos, which will permits in house measurements; as well as the cloning, expression and
purification of DBD hTR, followed by the characterization of this protein by fluorescence
anisotropy, crosslink and SAXS. The DNA-protein complex, F2-DBD hTR, was subjected to
crystallization assays. Although, the crystals obtained for the complex showed no pattern of
diffraction we were able to generate low-resolution models for the F2-DBD hTR using SAXS
analysis. Moreover, the studies of the protein LepFNR and the complex IL-22/IL-22R1 by small
angle X-ray scattering were performed in the line of SAXS of the LNLS, and their three-
dimensional models were resolved.
Keywords: SAXS. nuclear receptor. IL-22/IL-22R1. ferredoxin.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por eltrons livres. Um eltron est localizado na origem O na qual um feixe monocromtico, paralelo e polarizado de raios X incidente...........................................................................................................................................22
Figura 1.2 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um eltron sobre a ao de um feixe no polarizado. O eltron localizado na origem O na qual um feixe de raios X paralelo, monocromtico e no polarizado incidente na direo Ox. O campo incidente tem uma componente paralela ao plano OXP, E//, e outra perpendicular a este plano, E. ...................................23
Figura 1.3 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um par de eltrons. (A). Um eltron est localizado na origem e o outro a uma distncia r
r. Existe uma diferena (AB + BC)
no caminho ptico entre os dois feixes espalhados, causando uma diferena de fase. (B).
Relao geomtrica entre os vetores 1Br
, 0Br
, e qr
. ...............................................................................25
Figura 1.4 - Lei da reciprocidade entre espaos real e reciproco. Duas esferas com densidade eletrnica constante )(r
r e raios R1 e R2 sofrendo a ao do mesmo feixe de raios X. As
intensidades so normalizadas por I(0). .................................................................................................28
Figura 1.5 - Representao esquemtica para a amplitude de espalhamento. Carbono (linha azul) e oxignio (linha vermelha).......................................................................................................................29
Figura 1.6 - Intensidades de espalhamento e funo de distribuio de distncias para diferentes objetos geomtricos. Figura extrada de (SVERGUN, KOCH, 2003). ..................................................38
Figura 1.7 Representao esquemtica de uma protena em soluo........................................................................45
Figura 3.1 - Esquema do equipamento de SAXS do IFSC. 1. Gerador de Raios X; 2. monocromador; 3. Fendas horizontal e vertical, o equipamento possui duas caixas de fendas espaadas de 1 metro; 4. Tubo evacuado de 1 metro de comprimento; 5 Fenda horizontal (parasita); 6. Porta-amostra; 7. caminho de vcuo; 8. Bloqueador do feixe direto; 9. Detector unidimensional sensvel a posio..........................................................................................................51
Figura 3.2 - Viso geral do mocromomador. ...............................................................................................................53
Figura 3.3 - Sistema de colimao. (A) Viso geral do sistema de colimao. (B) Viso frontal da caixa das fendas 1 e 2 . (C) Viso frontal da fenda 3 ( fenda parasita). ...........................................................54
Figura 3.4 Porta-amostra...........................................................................................................................................55
Figura 3.5 - Caminho de vcuo e bloquador do feixe direto. (A) viso geral do caminho de vcuo. (B) O bloqueador do feixe direto encontra-se em frente a janela de sada dos ftons espalhados, o bloqueador pode ser movimentado com a ajuda de um micrmetro................................56
Figura 3.6 - Sistema de deteco unidimensional sensvel a posio. .........................................................................57
Figura 3.7 - esquema demonstrando a geometria de feixe linha com detector unidimensional. A altura do feixe, assim como a janela do detector causam deformao na curva de SAXS. ..............................60
Figura 3.8 - Monocromador otimizado para o Cobre. (A) viso lateral da caixa do espelho monocromador. (B) viso superior da caixa do espelho monocromador. ..............................................63
Figura 3.9 - Cela do porta-amostra com cmara para exposio de filmes de raios X para verificao do alinhamento do porta-amostra. .............................................................................................................. 63
Figura 3.10 - Perfil Trapezoidal do feixe de raios X. .................................................................................................. 64
Figura 3.11 - Imagens do feixe de raios X obtidas durante o alinhamento do equipamento. Na imagem da esquerda verficamos o feixe branco contendo todos os comprimentos de onda de raios X do Cu e o feixe com comprimento de onda do K do Cu. Na imagem da direita, temos somente o feixe K do Cu, aps o fechamento da fenda de sada da cmara do espelho monocromador....................................................................................................................................... 66
Figura 3.12 - (A) Cela do porta-amostra, e cmara para exposio de filme. (B) Filme de raios X demonstrando o perfil do feixe na posio do porta-amostra. ............................................................... 67
Figura 3.13 - Medida experimental do perfil da altura do feixe de raios X, obtido no plano de deteco. ................. 68
Figura 3.14 - Intensidade de espalhamento em funo do vetor de espalhamento q. (A) BSA medida a distncia de 339 mm. (B) ferredoxina medida a distncia de 739 mm. ................................................. 69
Figura 3.15 - (A) Curvas de espalhamento corrigidas pelo efeito de deformao de ferredoxina a 5 mg/mL (B) Funo de distribuio de distncias para ferredoxina obtidas no IFSC. Pontos com barras de erros so os dados experimentais corrigidos pelo efeito de deformao da curva e a linha azul o espalhamento simulado para o monmero de ferredoxina pdb id:2RC5 ....................................................................................................................... 70
Figura 3.16 - Principais componentes da linha de SAXS do LNLS. (1) espelho para focalizao vertical do feixe; (2) cristal de silcio para monocromatizao e focalizao horizontal do feixe; (3) sistema de colimao; (4) porta-amostra; (5) detector de raios X. Uma viso lateral do equipamento mostrada na parte superior da figura e outra viso superior do equipamento mostrada na parte inferior da figura (KELLERMAN et al, 1997)................................. 72
Figura 4.1 - Volume calculado para esferas de diferentes Rg ( 33/4 RV = ) contra o volume calculado pela relao QI /)0(2 2 a partir das curvas de I(q) calculadas para estas esferas. A equao 45 foi calculada para diferentes qmx. Os intervalos mostrados vo de 1x10
3 3 V 106 3 e 0.1 -1 qmax 0.9
-1. .................................................................................................... 78
Figura 4.2 - Volume calculado com o programa Crysol para as 1148 protenas do PDB em funo do volume calculado a partir das curvas simuladas de SAXS para as mesmas 1148 protenas utilizando a relao QI /)0(2
2 para diferentes valores de qmx. Os valores so mostrados em intervalos de qmx. 0.2, 0.3 e 0.4-1. A linha tracejada representa o volume esperado para as protenas. ................................................................................................................................... 79
Figura 4.3 - Coeficientes obtidos a partir da reta obtida na figura 4.2 (A) coeficiente linear contra o valor de qmx (B) coeficiente angular contra o valor de qmx . ................................................................. 79
Figura 4.4 - (A) Intensidade de espalhamento para Ferrodoxina. (B) Intensidade vezes (q2) para Ferrodoxina. Os dados experimentais so dados em pontos e o ajuste do Gnom extrapolado a q=0 em linha preta........................................................................................................... 80
Figura 4.5 - Razo entre a massa molecular real (MMreal) e calculada (MMcalculado) contra a massa molecular do oligmero (MMreal) para 25 protenas estudadas.............................................................. 83
Figura 5.1 - Ilustrao esquemtica do RXR DBD.. ................................................................................................... 86
Figura 5.2 - Elementos de resposta a receptores nucleares. ........................................................................................ 89
Figura 5.3 - Eletroforese em 1% gel de agarose (BioRad) para visualizao do produto da reao de digesto com as enzimas de restrio NdeI e XhoI...............................................................................108
Figura 5.4 - Eletroforese em 1% gel de agarose (BioRad) para visualizao do produto da reao de PCR. .....................................................................................................................................................109
Figura 5.5 - SDS PAGE, expresso em funo do tempo de induo. (1) MM, (2) T0 Induo, (3) 1 hora (4) 2 horas (5) 3 horas (6) 4 horas (7) 5 horas. .....................................................................................109
Figura 5.6 - SDS PAGE - Lise celular (1)MM, (2) extrato lisado, (3) pellet. A seta preta indica o His6DBD hTR (15.3 KDa). ................................................................................................................110
Figura 5.7 - SDS PAGE - cromatografia de afinidade (1) MM, (2) extrato, (3) 1 Lavagem 10 mM Imidazol(4) 2 Lavagem 10 mM Imidazol (5) 3 Lavagem 10 mM Imidazol (6) Eluio 3 vc 250 mM Imidazol (7) Eluio 3 vc 500 mM Imidazol (8) Eluio 3 vc 500 mM Imidazol. A seta preta indica o His6 DBD-hTR (15.3 KDa)...............................................................111
Figura 5.8 - Curva de calibrao da Superdex 75 HL 26/60......................................................................................112
Figura 5.9 - Eluio isocrtica do His6-DBD hTR, perfil medido a 280 nm. ..........................................................112
Figura 5.10 - SDS PAGE do his6 DBD-hTR aps purificao por excluso molecular: (1) padro de MM (2)his6 DBD-hTR .......................................................................................................................113
Figura 5.11 - SDS PAGE - Digesto com trombina bovina (1) padro de MM (2) T0 (3) 1 hora (4) 2 horas (5) 3 horas (6) 4 horas.................................................................................................................114
Figura 5.12 - Anisotropia de fluorescncia do DBD hTR. A anisotropia visualizada em funo da concentrao da protena. .....................................................................................................................114
Figura 5.13 Determinao da concentrao de DSS utilizado na reao de crosslinking. 130 M de DBD hTR reagiram com diferentes concentraes de DSS e as amostras foram resolvidas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 15%. As concentraes finais de DSS, em mM, esto indicadas nas figuras. Os gel foi corado com Coomassie blue. ...........................115
Figura 5.14 - Crosslink qumico de DBD hTR em concentraes de 2 130 M com 2.5 mM de DSS e as amostras foram resolvidas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 15%. As concentraes finais de DBD hTR em M, esto indicadas nas figura. O gel foi corado com Prata..............................................................................................................................................116
Figura 5.15 - Curva experimental de SAXS do DBD hTR a 40 M com ajuste do programa Oligomer (KONAREV et al, 2003). .....................................................................................................................117
Figura 5.16 - Gel Nativo da reao de ligao com DNA (1) padro de pesos moleculares, (2) DBD-hTR (3) DNA F2 (3) DBD-hTR . Aps eletrofores, protena e DNA podem ser visualizados no mesmo ponto no gel, o DNA em excesso pode ser visualizado mais abaixo no gel. .......................................................................................................................................117
Figura 5.17 - Micro cristais obtidos em condies de cristalizao (Hampton Research HR2-116). a.(0.05 M de Cacodilato de Sdio, pH 6.5, 0.08 M Acetato deMagnsio, 30% w/v PEG-4000) b.(0.05 MES, pH 5.6, 0.1 M Sulfato de Amnio, 0.01 M MgCl2, 20% w/v PEG-8000). ...................................................................................................................................................122
Figura 5.18 - Curva de espalhamento em soluo do hTR DBD ligado ao elemento responsivo F2 e resultados de procedimento de ajuste. Curva experimental (pontos com barras de erro);
intensidade de espalhamento para os DAMs (Gasbor) (linha azul clara); intensidade de espalhamento para o complexo em alta resoluo (linha amarela). O inserto contm o grfico de Guinier (ln I versus q)........................................................................................................ 123
Figura 5.19 - Funo de distribuio de distncia evoluda a partir da curva de espalhamento do complexo hTR DBD ligado ao F2. .................................................................................................... 124
Figura 5.20 - Sobreposio do modelo de tomos dummy (DAM) com o modelo proposto em alta resoluo. Os modelos so rotados 90 em relao aos eixos x e y. ................................................... 125
Figura 6.1 - Curva experimental de SAXS de LepFNR e ajuste terico com modelo modelo cristalogrfico. Curva experimental de SAXS (crculos com barra de erros); intensiade de espalhamento simulado a partir da DAM (linha verde); intensidade de espalhamento simulado a partir do monmero cristalogrfico de LepFNR (pdb id: 2RC5) (linha azul). O inserto contem o grfico de guinier, do qual foi calculado o Rg. ..................................................... 129
Figura 6.2 Comparao da funo de distribuio de distncias para LepFNR. As p(r) foram calculadas com o programa Gnom a partir dos dados experimentais (circulos com barra de erros); a partir do DAM (linha verde); a partir do monmero cristalogrfico de LepFNR (pdb id: 2RC5) (linha azul). .................................................................................................. 130
Figura 6.3 Viso stereo mostrando a superposio do monmero cristalogrfico de LepFNR com o modelo obtido ab initio por SAXS. A imagem superior foi rotacionada 90 em torno dos eixos x (centro) e y (inferior). .............................................................................................................. 131
Figura 6.4 (A) Estrutura cristalogrfica de IL-22 (pdb id:1M4R). (B) Estrutura cristalogrfica de IL-10 (pdb id: 1J7V)................................................................................................................................. 133
Figura 6.5 - Estrutura cristalogrfica do complexo IL-10/IL-10R1 (pdb id:1J7V). .................................................. 134
Figura 6.6 - Curva de espalhamento experimental de IL-22/IL-22R1 (log I contra q) e resultados de procedimento de ajuste. O inserto contm o grfcio de Guinier (log I versus q2). Curva experimental aps a subtrao da constante de Porod (crculo com barra de erros); intensidade de espalhamento simulado para o DAM (Dammin) (linha verde); intensidade de espalhamento simulado para o modelo de corpo rgido (linha azul); intensidade de espalhamento simulado para o IL-10/IL-10R1 (pdb id: 1J7V) (linha vermelha)................................. 136
Figura 6.7 - Funo de distribuio de distncias para os dados experimentais de IL-22/IL-22R1 (crculos com barras de erros); para o modelo de corpo rgido (linha azul); e para IL-10/IL-10R1 (linha vermelha). .............................................................................................................. 137
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 - Parmetros responsveis pelo efeito de deformao nas curvas de SAXS. .............................................69
Tabela 3.2 - parmetros estruturais da ferredoxina obtidos por SAXS em comparao com Ferrodoxina cristalogrfico. ...................................................................................................................71
Tabela 4.1 - Volume, MM calculados e razo entre MM calculado e esperado (34.4 kDa) utilizando vrios valores de qmx para ferredoxina. ..............................................................................................81
Tabela 4.2 - Volume, MM calculados e razo utilizando vrios valores de qmax para as 25 protenas estudadas. Os resultados so mostrados em ordem crescente de MM....................................................81
Tabela 5.1 - oligonucleotdeos iniciadores utilizados para a amplificao ds gene DBD hTR. ................................91
Tabela 5.2 - Reagentes utilizados na reao de PCR. ..................................................................................................91
Tabela 5.3 - Protocolo do programa de PCR (com Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity) utilizado pelo termociclador PTC-100 TM Programable Thermal Controller..........................................92
Tabela 5.4 - Reagentes usados na reao de adio de dATP no gene DBD hTR.....................................................93
Tabela 5.5 - Reagentes usados na reao de ligao do fragmento do DBD hTR adenilado no vetor pGEM-T (Promega). ............................................................................................................................93
Tabela 5.6 - Reagentes utilizados nas reaes de clivagem. ........................................................................................95
Tabela 5.7 - Reagentes usados nas reaes de clivagem (NdeI e XhoI). .....................................................................95
Tabela 5.8 - Reagentes utilizados na reao de ligao com T4 DNA Ligase (Invitrogen). ........................................96
Tabela 5.9 - condio de cristalizao dos complexos de DBDs dos receptores nucleares e seus elementos responsivos. .........................................................................................................................119
Tabela 5.10 - condio do poo - 20 mM Hepes, PEG 3350 w/v 15-50%, pHs 6.5 8.0 ........................................121
Tabela 5.11 - Parmetros estruturais do complexo F2 DBD hTR. ..........................................................................123
Tabela 6.1 Parmetros estruturais da LepFNR. ......................................................................................................132
Tabela 6.2 Parmetros estruturais da IL-22/IL-22R1..............................................................................................139
LISTA DE ABREVIATURAS AF-1 - funo de ativao 1
BSA albumina de soro bovino
DAM modelo de tomos dummy
DBD domnio de ligao ao DNA
DBD hTR - domnio de ligao ao DNA da isoforma do receptor tireoideano humano
Dmx. dimetro mximo
DMSO sulfoxido de dimetil
DR repetio direta
DSS succinimidil
DTT - Ditioiodotreitol
ER receptor do estrognio
F2 Palmdromo invertido espaado por 6 pares de base
FITC Isotiocianato de fluoresceina
GR receptor de glucocorticide
HREs elementos responsivos dos hormnios
IL-22/IL-22R1 interleucina 22/receptor 1 de interleucina 22
IPTG - Isopropil -D-tiogalactopiranosdeo
LBD domnio de ligao ao ligante
LB Meio de cultura c
LepFNR ferredoxina de Leptospira interrogans
MM massa molecular
NGFI-B protena B induzida pelo fator de crescimento neural
PCR reao de polimerizao em cadeia
PDB banco de dados de protenas
PPAR - receptor ativador da proliferao de peroxissomos
PSD 1D detector unidimensional sensvel a posio
PTC controle de temperature programvel
RAR receptor do cido retinico
Rg raio de giro
RXR receptor do cido retinico X
SAXS espalhamento de raios X a baixo ngulo
TR receptor tireoideano
TREs elementos responsivos do T3
V - volume
VDR receptor de vitamina D
SUMRIO
1 Teoria de espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo estrutural de protenas. ............................. 20
1.1 Princpios do espalhamento de raios X. ................................................................................................................ 21 1.1.1 Espalhamento de raios X por eltrons livres. ...................................................................................................... 21 1.1.2. Espalhamento de raios X por dois elementos de volume, interferncia. ............................................................ 25 1.1.3 Lei da reciprocidade............................................................................................................................................ 27 1.1.4 O problema de fase............................................................................................................................................. 28 1.1.5 Espalhamento de raios X por um tomo ............................................................................................................. 29 1.1.6 Espalhamento de raios X para um grupo de n tomos ........................................................................................ 30 1.1.7. Transformada inversa da funo Intensidade. .................................................................................................... 30 1.1.8 Espalhamento para sistemas diludos. ................................................................................................................. 32 1.1.9 Redefinio da funo de correlao................................................................................................................... 35 1.1.10 Sistema isotrpico, diludo e monodisperso...................................................................................................... 36
1.2 Anlises das curvas de SAXS ............................................................................................................................... 38 1.2.1 Regio dos menores qs na curva de SAXS, determinao do raio de girao .................................................... 39 1.2.2 Regio central da curva de SAXS, determinao do volume.............................................................................. 39
1.3 Anlises de protenas em soluo utilizando SAXS.............................................................................................. 41 1.3.1 Reconstruo ab-initio da forma da protena a partir de dados de SAXS. .......................................................... 41 1.3.2 Clculo de intensidade de SAXS a partir das coordenadas atmicas .................................................................. 44
2 Objetivos do trabalho ............................................................................................................................................... 47
3 Instrumentao para o espalhamento de raios X a baixo ngulo.............................................................................. 49
3.1 Equipamento de SAXS do Instituto de Fsica da USP de So Carlos ................................................................... 49
3.1.1 Introduo. ......................................................................................................................................................... 50 3.1.1.1 Descrio detalhada dos componentes do equipamento.................................................................................. 52 3.1.1.2 Efeito de deformao da curva de intensidade de SAXS (smearing) ............................................................... 58 3.1.2 Metodologia ........................................................................................................................................................ 62 3.1.2.1 Alinhamento do equipamento .......................................................................................................................... 62 3.1.2.2 Efeito de deformao da curva de intensidade de SAXS (smearing) ............................................................... 64 3.1.2.2.1 Medida dos parmetros do feixe ................................................................................................................... 64 3.1.2.3 Experimentos para caracterizao do equipamento.......................................................................................... 65 3.1.3 Resultados ........................................................................................................................................................... 66 3.1.3.1 Alinhamento do equipamento .......................................................................................................................... 66 3.1.3.2 Correo da deformao da curva de intensidade de SAXS ............................................................................ 68 3.1.3.3. Experimento padro para caracterizao do equipamento. ............................................................................. 69
3.2 Linha de SAXS do Laboratrio Nacional de Luz Sincrotron................................................................................ 72
4 Procedimento e resultados de determinao do estado oligomrico de protenas em soluo utilizando SAXS em escala relativa....................................................................................................... 74
4.1 Introduo ............................................................................................................................................................. 75
4.2 Metodologia .......................................................................................................................................................... 75
4.3 Resultados ............................................................................................................................................................. 77
4.4 Concluso.............................................................................................................................................................. 83
5 Caracterizao do domnio de ligao ao DNA da isoforma do receptor tireoideano (DBD hTR) .................. 84 5.1 Introduo ............................................................................................................................................................. 85
5.1.1 Os receptores nucleares....................................................................................................................................... 85 5.1.1.1 Detalhes da ligao do DBD aos elementos responsivos do DNA .................................................................. 86 5.1.1.2 Os Receptores Tireoideanos ............................................................................................................................ 89
5.2 Metodologia ...........................................................................................................................................................90 5.2.1 Sub-clonagem do fragmento de DNA codificador do DBD hTR ..................................................................... 90 5.2.2 Expresso do DBD hTR em clulas competentes de Escherichia coli BL21(DE3).......................................... 98 5.2.3 Purificao do domnio de ligao ao DNA do Receptor Tireoideano Isoforma ............................................. 99 5.2.3.1 Cromatografia por afinidade do domnio DBD do hTR ................................................................................ 99 5.2.3.2 Cromatografia por excluso molecular .......................................................................................................... 100 5.2.4 Digesto com trombina bovina ......................................................................................................................... 100 5.2.5 Anisotropia de Fluorescncia............................................................................................................................ 101 5.2.6 Crosslink Qumico ............................................................................................................................................ 101 5.2.7 SAXS do DBD hTR........................................................................................................................................ 103 5.2.8 Ligao do DBD hTR no elemento responsivo F2 ......................................................................................... 104 5.2.9 Ensaio de cristalizao do DBD hTR ............................................................................................................. 104 5.2.10 SAXS do complexo F2-DBD hTR................................................................................................................ 105
5.3 Resultados............................................................................................................................................................107 5.3.1 Sub-clonagem do fragmento de DNA codificador do DBD hTR ................................................................... 107 5.3.1.1 Sub-clonagem do fragmento de DNA codificador do DBD hTR no vetor pGEM-T ................................ 107 5.3.1.2 Sequenciamento do fragmento DBD hTR ................................................................................................... 108 5.3.1.3 Transformao em clulas competentes de Escherichia coli BL21(DE3) ..................................................... 108 5.3.2 Expresso do DBD hTR em clulas competentes de Escherichia coli BL21(DE3)........................................ 109 5.3.3 Purificao do domnio de ligao ao DNA do Receptor Tireoideano Isoforma ........................................... 110 5.3.3.1 Cromatografia por afinidade do DBD hTR.................................................................................................. 110 5.3.3.2 Cromatografia por excluso molecular .......................................................................................................... 111 5.3.4 Digesto com trombina bovina ......................................................................................................................... 113 5.3.5 Anisotropia de Fluorescncia............................................................................................................................ 114 5.3.6 Crosslink Qumico ............................................................................................................................................ 115 5.3.7 SAXS do DBD hTR........................................................................................................................................ 116 5.3.8 Ligao do DBD hTR no elemento responsivo F2 ......................................................................................... 117 5.3.9 Estudos de cristalizao do complexo DBD hTR ligado ao elemento responsivo F2 .................................... 118 5.3.10 SAXS do F2 DBD hTR................................................................................................................................. 122
5.4 Concluso ............................................................................................................................................................125
6 Estudos por SAXS de ferredoxina-FAD e do complexo formado por interleucina-22 e interleucina-22R1 .....................................................................................................................................................126
6.1 Estrutura de baixa resoluo de ferredoxina de Leptospira interrogans...............................................................127 6.1.1 Introduo ......................................................................................................................................................... 127 6.1.2 Metodologia ...................................................................................................................................................... 128 6.1.3 Resultados e Discusso ..................................................................................................................................... 129 6.1.4. Concluso ........................................................................................................................................................ 132
6. 2 Estrutura de baixa resoluo do complexo IL-22/IL-22R1.................................................................................133 6.2.1 Introduo ......................................................................................................................................................... 133 6.2.2 Metodologia ...................................................................................................................................................... 134 6.2.2.1 Anlise dos dados de SAXS .......................................................................................................................... 134 6.2.2.2 Modelagem de corpo rgido do complexo IL-22/IL-22R1............................................................................. 135 6.2.3 Resultados e discusso...................................................................................................................................... 136 6.2.4 Concluso ......................................................................................................................................................... 139
Referncias 140
Anexo 1. Lista de trabalhos publicados durante o perodo. ...............................................................................151 Anexo 2 Publicaes descritas na tese .................................................................................................................... 153
20 Captulo 1
1 Teoria de espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao
estudo estrutural de protenas.
Resumo
A determinao da estrutura terciria e quaternria de protenas em soluo um
importante passo para completa caracterizao da amostra em estudo. A interpretao de dados
de SAXS - espalhamento de raios X a baixo ngulo permite uma anlise detalhada da estrutura
global de protenas, as quais podem ter seu tamanho varivel entre poucos kDa e muitos MDa. A
determinao direta do envelope molecular, a predio de estruturas quaternrias em oligmeros,
a verificao de transies conformacionais que ocorrem por interao com ligantes, assim como,
a visualizao de processos de enovelamento e desenovelamento protico (SVERGUN; KOCH,
2003) podem ser realizadas com SAXS (SVERGUN et al, 1996). Com o empacotamento
cristalogrfico, perdemos a informao exata a respeito da estrutura quaternria de uma protena.
Uma ligeira mudana na posio relativa dos domnios, ou subunidades, pode ser melhor
visualizada prximo ao estado nativo, utilizando SAXS. Neste tipo de experimento, uma soluo
de macromolculas exposta aos raios X. A intensidade espalhada I(q) funo da transferncia
de momento q. O captulo a seguir explana detalhadamente a teoria envolvida em SAXS, o
mesmo foi sintetizado no captulo Simulated Annealing of Two Electron Density Solution
Systems, aceito para publicao no livro Global Optimization: Focus on Simulated Annealing, I-
Tech Education and Publishing KG.
Captulo 1 21
1.1 Princpios do espalhamento de raios X.
1.1.1 Espalhamento de raios X por eltrons livres.
O uso dos raios X na caracterizao estrutural de materiais depende essencialmente de sua
interao com a matria atravs dos eltrons que constituem seus tomos e molculas. Os eltrons
so sensveis aos campos, eltrico e magntico oscilando senoidalmente. Se a radiao incidente
monocromtica, os campos, eltrico e magntico podem ser representados por uma funo
peridica do tipo:
tEE 2cos0rr
=
tHH 2cos0rr
=
(1)
onde 0Er
e 0Hr
so respectivamente os valores mximos dps campos eltricos e magnticos e
a freqncia da radiao.
A direo da propagao dos raios X dada pelo vetor de Poynting: HEcPrrr
= )4/( .
Considerando-se um eltron situado na origem de um sistema de coordenadas xyz, sobre o qual
incide um feixe paralelo, polarizado e monocromtico de raios X. (figura 1.1). O eltron sob a
ao do campo eltrico 0Er
da onda incidente sofre a ao de uma fora dada por:
tEeF 2cos0rr
= (2)
22 Captulo 1
Figura 1.1 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por eltrons livres. Um eltron est localizado na origem O na qual um feixe monocromtico, paralelo e polarizado de raios X incidente.
Sob a ao dessa fora o eltron acelerado
tm
Ee
m
Fa 2cos0
rrr
== (3)
em decorrncia desta acelerao o eltron torna-se uma fonte esfrica de ondas eletromagnticas
de mesma freqncia que a radiao incidente (espalhamento elstico). O espalhamento
produzido pelo eltron foi analisado por J. J. Thomson, o qual determinou que:
204
sin
cR
eaE
= (4)
Substituindo a equao 3 em 4 temos:
20
02
4
sin2cos
cRwt
m
EeE
= (5)
onde o ngulo entre a direo do feixe espalhado e a direo do campo eltrico da onda
incidente, o a constante dieltrica do vcuo, R a distncia entre o eltron e o ponto de
observao, c a velocidade da luz, e m e e so respectivamente, a massa e carga do eltron. A
Captulo 1 23
expresso mc
e2
0
2
4 tem a dimenso de comprimento e, de acordo com o eletromagnetismo
clssico, denominada comprimento de espalhamento ou raio do eltron ( m1510.82.2 ). Para
simplificar a notao a amplitude da onda espalhada por um eltron livre ser designada apenas
por eA .
mc
eAe 2
0
2
4=
(6)
Para o caso do feixe incidente no polarizado, considerara-se o campo eltrico do feixe
incidente decomposto em duas componentes iguais mutuamente perpendiculares. Na figura 1.2
temos um feixe no polarizado paralelo propagando-se na direo Ox incidindo sobre um eltron
situado em O. Para determinar a natureza do campo eltrico espalhado na direo OP, o campo
eltrico incidente pode ser decomposto em duas componentes mutuamente perpendiculares, uma
paralela ao plano OXP, E//, e outra perpendicular, E.
Figura 1.2 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um eltron sobre a ao de um feixe no polarizado. O eltron localizado na origem O na qual um feixe de raios X paralelo, monocromtico e no polarizado incidente na direo Ox. O campo incidente tem uma componente paralela ao plano OXP, E//, e outra perpendicular a este plano, E.
24 Captulo 1
Sob a ao desses dois campos o eltron adquire uma acelerao com componentes
perpendicular e paralela dadas respectivamente por a meEa / = e meEa ///// = . Substituindo
estas expresses na equao 5, obtemos o campo eltrico da onda espalhada:
R
EA
mRc
EeE e == 2
0
2
4'
R
EA
mRc
EeE e
2cos4
2cos' //
20
//2
// ==
(7)
a intensidade Io do feixe incidente pode tambm ser decomposta em duas componentes iguais
perpendicular e paralela, respectivamente proporcionais a 2E and E//2:
2022
//
IEE =
(8)
E a intensidade total espalhada no ponto P ser dada por:
]''[)2( 22// += EEI
2
)2cos1(
4)2(
22
20
2
20
+
=
mc
e
R
II
2
)2cos1()()2(
22
20
+
= eAR
II
(9)
Levando-se em conta ainda que Io e R podem ser considerados constantes durante a
medida, a intensidade espalhada pelo eltron dada por:
2
)2cos1()2,(
22
+= ee ARI
(10)
Pode-se observar pelas equaes 6 e 9 que apenas os eltrons contribuem efetivamente
para a intensidade espalhada, pois a mesma varia inversamente com o quadrado da sua massa.
Por essa razo, embora os ncleos atmicos tambm sejam carregados e, portanto, tambm
Captulo 1 25
sofram a ao do campo eltrico da onda incidente, sua massa muito maior que a dos eltrons
(massa do prton = 1837 vezes a massa do eltron) e sua contribuio para a intensidade total
desprezvel. O termo (1 + cos2 2)/2 chamado fator de polarizao, em experimentos de SAXS,
o mximo ngulo de espalhamento est em torno de 5 graus e (1 + cos2 2)/2 praticamente 1.
1.1.2. Espalhamento de raios X por dois elementos de volume, interferncia.
Para calcular a amplitude de um feixe monocromtico de raios X espalhado por um corpo
com densidade eletrnica )(rr
arbitrria, calcularemos primeiramente a amplitude espalhada por
um elemento de volume )(rdr
. Consideremos em uma partcula, dois eltrons espaados por um
rr
, imersos em um feixe de raios X paralelo e monocromtico, como ilustrado na figura 1.3(A).
As ondas espalhadas sero coerentes, espalhamento incoerente tambm pode ocorrer, mas ser
desprezvel para os baixos ngulos.
(A) (B)
Figura 1.3 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um par de eltrons. (A). Um eltron est localizado na origem e o outro a uma distncia r
r. Existe uma diferena (AB + BC) no caminho ptico
entre os dois feixes espalhados, causando uma diferena de fase. (B). Relao geomtrica entre os
vetores 1Br
, 0Br
, e qr
.
Como existe uma diferena de caminho ptico entre os dois feixes, haver
obrigatoriamente uma diferena de fase entre eles representada por :
26 Captulo 1
l
=2
(11)
como a diferena de caminho ptico dada por BCB A l += , a diferena de fase :
) A(2 BCB +
= (12)
As direes dos feixes, incidente e espalhado so dadas pelos versores unitrios 0Br
e 1Br
.
0BrABrr
= e 1BrBCrr
= (13)
E a diferena de fase pode ser reescrita:
)(2 1 0BBr
rrr
= (14)
onde:
)(2 1 0BBq
rrr
= (15)
ento:
2cosrqqr ==rr
(16)
onde 2 o ngulo entre rr
e sr
. Assim, somente o produto dos componentes qrrr
relevante
para .
Na prtica, devido ao enorme nmero de eltrons em uma macromolcula, conveniente
introduzir o conceito de densidade eletrnica )(rr
. A amplitude de espalhamento ser dada por:
= dVerAqA ie )()(rr
(17)
Substituindo a equao 16 em 17:
dVerAqA qrie =rrrr
)()( (18)
Captulo 1 27
A Figura 1.3(B) mostra as relaes geomtricas existentes entre os vetores 12 Br
, 02 Br
,
e qr
. Pode ser visto facilmente que qr
perpendicular a bissetriz do ngulo entre 12 Br
e 02 Br
,
e que seu mdulo :
sin4
=q (19)
1.1.3 Lei da reciprocidade
Qualquer processo de espalhamento caracterizado por uma lei de reciprocidade que d
uma relao inversa entre tamanho da partcula e ngulo de espalhamento. No caso de duas
esferas com densidade eletrnica )(rr
e raios R1 and R2 sob a ao do mesmo feixe de raios X;
dI a intensidade espalhada para um elemento de volume dV para dois diferentes pontos da
esfera. (figura 1.4). Assim, existe uma diferena de caminho ptico nas duas esferas. Se 2
zero, ento q, e so nulos para todos os elementos de volume. A mesma diferena de
caminho igual a , por exemplo, ocorre a mais altos ngulos para a esfera menor. As curvas de
espalhamento para as duas esferas claramente revelam a reciprocidade existente entre os espaos
real e de espalhamento, tambm chamado, espao recproco. Uma conseqncia para a relao de
reciprocidade entre os espaos, direto e recproco que quanto maior for a partcula, seu
espalhamento de raios X a baixo ngulo estar concentrado em menores intervalos 2.
(GLATTER; KRATKY, 1982)
28 Captulo 1
Figura 1.4 - Lei da reciprocidade entre espaos real e reciproco. Duas esferas com densidade eletrnica constante )(r
r e raios R1 e R2 sofrendo a ao do mesmo feixe de raios X. As intensidades so
normalizadas por I(0).
1.1.4 O problema de fase
A intensidade de espalhamento )(qIr
pode ser medida quantitativamente, e proporcional
ao quadrado da amplitude de espalhamento A(q):
*)()()( qAqAqIrrr
(20)
onde *)(qAr
o complexo conjugado de )(qAr
.
De acordo com as propriedades de Fourier, a transformada inversa de )(qAr
(equao 18)
permite o clculo da )(rr
, o qual uma quantidade real e positiva. Contudo, para obter a )(rr
, a
fase e o mdulo do vetor de espalhamento )(qAr
so requeridos:
ieqAqA )()(rr
= (21)
Captulo 1 29
A intensidade de espalhamento, a qual medida experimentalmente, dada pela
multiplicao entre a amplitude de espalhamento e seu conjugado.
( ) 222 )()()()( qAeeqAqAqI ii rrrr == (22)
Somente o mdulo de )(qAr
pode ser conhecido, sua fase perdida. Este denominado
Problema da Fase. Desta forma, no podemos determinar )(qAr
, pois no conhecemos ie .
1.1.5 Espalhamento de raios X por um tomo
A equao 18 pode ser calculada para os tomos de todos os elementos sempre que se
conhea a funo )(rr
. Para qr
= 0, a integral da equao 18 resulta no nmero total de eltrons
dos diversos tomos neutros, i.e., o seu nmero atmico Z. Conforme qr
cresce, as diferenas de
fase levam a uma diminuio progressiva do valor de )(qAr
. Curvas deste tipo so mostradas para
o carbono e o oxignio na figura 1.5.
Figura 1.5 - Representao esquemtica para a amplitude de espalhamento. Carbono (linha azul) e oxignio (linha vermelha).
30 Captulo 1
Por definio, o fator de espalhamento atmico a razo entre a amplitude espalhada pelo
tomo e a amplitude espalhada por um eltron.
e
tomo
A
qAqf
)()(
rr
= (23)
1.1.6 Espalhamento de raios X para um grupo de n tomos
Uma vez obtidos os fatores de espalhamento atmicos, a equao 18 pode ser re-escrita
levando-se em conta o vetor posio jrr
de cada tomo e somando-se sobre todos n tomos, com
fator de espalhamento )(qf jr
:
=
=n
j
rqi
jjeqfqA
1
)()(rrrr
(24)
A intensidade de espalhamento pode ser obtida se as coordenadas atmicas dos tomos
so conhecidas. Para n tomos com fatores de espalhamento )(qf jr
e coordenadas jrr
para cada
centro de espalhamento da partcula:
= =
=n
j
n
k
rqi
kjjkefqfqI
1 1
)()(rrrr
(25)
1.1.7. Transformada inversa da funo Intensidade.
Devido ao Problema da Fase, no possvel inverter diretamente )(qAr
para obter a
densidade eletrnica )(rr
. Patterson props o clculo da transformada de Fourier tomando como
coeficientes as intensidades dos feixes espalhados, obtidos pelo produto de )(qAr
(equao 18) e
seu complexo conjugado (PATTERSON, 1935):
Captulo 1 31
Se considerarmos a partcula isolada (na prtica, um sistema diludo), esta integral
depende apenas dos pares de distncias relativas entre os elementos de volume da mesma e do
produto das respectivas densidades eletrnicas. Esta integral pode ser calculada em dois passos:
1o passo: Matematicamente esta etapa corresponde ao clculo da funo de auto-
correlao )(~ rr
, fazendo 12 rrrrrr
= constantes.
dVrrr )()()(~ 21rrr
= (27)
Esta funo, conhecida como funo de Patterson ou funo de distribuio de pares,
definida num novo espao C(r) (espao de correlao) no qual cada rr
corresponde a uma
distncia )( 12 rrrr
tomada sobre todo o objeto espalhador e cujo valor a mdia dos produtos das
densidades eletrnicas nos pontos 1rr
e 2rr
.
2o passo: Consiste na integrao no espao C(r) para obter )(qIr
:
rqierdVqIrrrr = )(~)( 2 (28)
Para um sistema concentrado de macromolculas em soluo, a intensidade de
espalhamento dada por )().()(* qSqIqIrrr
= , onde )(qIr
chamado fator de forma (equao 26) e
est relacionada com as distncias intra-partculas, ou seja, correlaes de distncias internas das
macromolculas, enquanto )(qSr
chamado fator de estrutura, e est associado com correlaes
entre as partculas. Para sistemas diludos, os quais sero abordados nesta tese, )(qSr
se aproxima
de 1, e somente o fator de forma contribui para o espalhamento (CRAIEVICH, 2005).
= )(2121 21)()()( rrrrrrrr qi
errdVdVqI (26)
32 Captulo 1
Podemos concluir que a distribuio das intensidades espalhadas no espao recproco
funo da distribuio de densidade eletrnica na partcula espalhadora atravs da sua funo de
auto-correlao e que esta ltima pode ser obtida diretamente das intensidades espalhadas pelo
clculo da transformada inversa de Fourier da equao 28:
= rqiedVqIrrrrr *3
212 )()()(~ (29)
onde *dV o elemento de volume no espao recproco.
Uma propriedade importante da funo de auto-correlao a existncia de um centro de
inverso nessa funo, pois o produto )()( 21 rrrr
igual a )()( 12 rrrr
, resultando no mesmo valor
para a funo tanto para r como para r, independentemente do fato da partcula espalhadora
possuir ou no um centro de inverso. Devemos ainda notar a relao de reciprocidade existente
entre as equaes 28 e 29, pois os seus valores dependem apenas do produto rq r
. Assim
conforme rr
cresce, forosamente qr
diminui.
1.1.8 Espalhamento para sistemas diludos.
Para anlise das curvas de SAXS, adotaremos algumas restries simplificadoras:
(a) O sistema estatisticamente isotrpico devido esfericidade da partcula, ou a
distribuio espacial das partculas ou ainda devido ao movimento randmico das partculas no
meio.
(b) No h interao de longa distncia entre as partculas, i.e, o sistema suficientemente
diludo.
De acordo com a restrio (a), a )(~2 rr
centro simtrica dependendo somente do mdulo
de rr
. Assim podemos substituir o fator de fase rqierr
pelo valor mdio em torno de rr
. A equao
chamada de frmula de Debye (GLATTER; KRATKY, 1982).
Captulo 1 33
qr
qre rqi
sin=
rr
(30)
Assim podemos reescrever as equaes 25 e 28:
= =
=n
i
n
j ij
ij
jiqr
qrffqI
1 1
sin)(
(31)
= qrqr
rdVqIsin
)(~)( 2 (32)
Ainda, a expresso da reciprocidade entre r e q aparente na frmula de Debye. Se o
produto qr mantido constante, um acrscimo em r causa um decrscimo em q .
O termo qrsin uma funo peridica e o denominador qr chamado fator de
amortecimento, gerando mximos progressivamente menores. Desta forma, o intervalo para
medida usual de espalhamento aproximadamente de 0 a 2.5o.
A conseqncia da restrio (b) que para grandes valores de r , as densidades
eletrnicas ficam independentes e podem ser substitudas pelo seu valor mdio . A funo de
auto-correlao deve tender para um valor constante 2
V , enquanto que na origem )0(~2 toma
o valor mximo 2V (o mximo do curso). Assim, no espao C(r) haver informao estrutural
relevante apenas na regio em que 2
for significativamente diferente do valor constante final.
Por essa razo a funo de auto-correlao redefinida como = , expressando de fato
apenas as flutuaes de densidade eletrnica responsveis pelo fenmeno de espalhamento:
)())(()(~ 22 rVrr == (33)
Com a conveniente mudana de notao, a funo de correlao )(r introduzida, a
qual est associada com a mdia da flutuao de densidade eletrnica entre dois elementos de
volume separados pela distncia r, onde r = r1 r2 .
34 Captulo 1
)()()( 21 rrr = (34)
As flutuaes de densidade eletrnica, tomadas em relao ao meio que contm os
espalhadores, podem ser negativas ou positivas. Assim a presena de poros em um material leva
a uma flutuao negativa. Entretanto a funo caracterstica (r) ser sempre positiva, uma vez
que, de acordo com a equao 33, ela dada por )(~2 r , com 2)0( = e 0 para grandes rs.
Adicionando (r) e os limites de integrao de 0 a na equao 32 e mudando o parmetro de
integrao para dr, a intensidade :
=0
2 sin)(4)(qr
qrrdrrVqI
(35)
Para q = 0
=0
2 )(4)0( rdrrVI (36)
(r) encontrado como a transformada inversa de Fourier da equao 35:
=0
22
sin)(
2
1)(
qr
qrqdqIqrV
(37)
Para r = 0
2
0
22
)(2
1)0(
VqdqIqV ==
(38)
O valor de )0(I dado pela equao 36 experimentalmente impossvel de medir por
coincidir com a direo do feixe incidente. Entretanto ele pode ser obtido por extrapolao da
curva I(q) e permite obter, ao menos aproximadamente, o nmero total de eltrons existente no
volume da partcula.
Captulo 1 35
Por sua vez, a equao (38) nos diz que o valor da integral da intensidade no espao
recproco constante. Mesmo que uma dada partcula apresente alteraes em sua forma, se ela
se conservar ntegra, o valor da integral ser constante igual a 2V , apesar das eventuais
alteraes que ocorram no padro de difrao ou espalhamento. Esta constante, chamada
Invariante, e dada por:
=0
2 )(qdqIqQ (39)
A condio de restrio para sistemas isotrpicos nos levaram a considerar valores mdios
dando, como conseqncia, um carter escalar distribuio da funo de auto-correlao no
espao C(r).
1.1.9 Redefinio da funo de correlao
Devido ao quadrado da diferena de densidade eletrnica ser constante e sempre positiva
(a densidade das protenas so sempre maiores que a do solvente), conveniente separar )(r ,
definida na equao 33, na forma
( ) )()( 02
rr = (40)
Onde )(0 r uma nova funo de correlao, dependente somente da geometria da
partcula, com 1)0(0 = e 0)( max0 = Dr (onde maxD a mxima distncia intra partcula).
)(0 r chamada funo caracterstica e tem significado mais intuitivo.
Assim, conveniente reescrever as equaes 35, 36, 37, 38 e 39:
( ) =D
qr
qrrdrrVqI
0
022 sin)(4)(
(41)
36 Captulo 1
( ) ( ) 220
022 )(4)0( VrdrrVI
D
= (42)
( )
=0
22
20
sin)(
2
1)(
qr
qrqdqIqrV
(43)
( )
=0
22
20 )(2
1)0( qdqIqV
(44)
( )220
2 2)( ==
VqdqIqQ (45)
1.1.10 Sistema isotrpico, diludo e monodisperso
Assumindo-se que o sistema de interesse uma soluo diluda de partculas idnticas
(monodisperso) com densidade eletrnica constante , embedida em um meio com densidade
constante 0 (solvente). Assim somente )( 0p= relevante para o espalhamento. A
condio de sistema diludo garante que cada partcula faa contribuio independente para
intensidade de espalhamento, como todas as partculas so idnticas, somente uma nica partcula
precisa ser considerada.
Uma anlise mais completa para determinao da geometria da partcula pode tambm ser
feita atravs do clculo, a partir dos dados experimentais, da funo de distribuio de distncias
p(r), onde )(4)( 02 rrrp = . Assim, a equao 41 pode ser reescrita como:
( ) =D
qr
qrdrrpVqI
0
2 sin)()( (46)
A p(r) pode ser obtida a partir da transformada inversa da transformada de Fourier de I(q),
a qual possui valor igual a 0 na mxima dimenso da partcula Dmax. importante a considerao
Captulo 1 37
de que este material assume condies restritivas de um sistema monodisperso de partculas
suficientemente diludas em soluo. Alm disso, tambm importante ter contraste entre
partcula e solvente.
A p(r) contm a mesma informao da intensidade de espalhamento I(q), mas a
representao da p(r) no espao real mais intuitiva. Alm disto, informao sobre a forma da
partcula em soluo pode ser deduzida visualmente da p(r). A figura 1.6 apresenta padres de
espalhamento e p(r) caractersticos de objetos geomtricos com mesmo Dmx. Partculas
globulares possuem uma p(r) na forma de uma funo gaussiana centro simtrica com um
mximo em Dmax/2. Partculas alongadas possuem uma p(r) com mximo em menores distncias
correspondendo ao raio da seco de corte Rc. Partculas achatadas mostram um mximo mais
alargado, tambm deslocando o mximo para distncias menores que Dmax/2. p(r) com um
mximo deslocado para distncias maiores que Dmax/2 indicativa de cascas esfricas. Partculas
consistindo de subunidades bem separadas apresentam dois mximos, o primeiro correspondendo
s distncias intra-subunidades e outro a separao entre as subunidades. (SVERGUN, KOCH,
2003).
As diferenas nos padres de espalhamento permitem determinar objetos esfericamente
simtricos, os quais produzem mnimos no padro de espalhamento. Partculas muito
anisotrpicas possuem padro de espalhamento com um decaimento bem menor comparado com
partculas globulares.
38 Captulo 1
Figura 1.6 - Intensidades de espalhamento e funo de distribuio de distncias para diferentes objetos geomtricos. Figura extrada de (SVERGUN, KOCH, 2003).
1.2 Anlises das curvas de SAXS
Para anlise de uma curva de SAXS, conveniente distinguir trs regies na curva de
espalhamento. Na regio dos ngulos prximos de zero, pode-se determinar o raio de girao Rg
da macromolcula. Na regio central, a razo I(0)/Q pode fornecer informao relativa ao
volume e na regio de mais alto ngulo obtemos a relao superfcie/volume da macromolculas
(Feigin e Svergun, 1987).
Captulo 1 39
1.2.1 Regio dos menores qs na curva de SAXS, determinao do raio de girao
Assumindo o caso ideal, de partculas esfricas no interagentes em soluo, Guinier
mostrou que para 0q , a curva de Intensidade pode ser descrita como uma funo
exponencial: (GUINIER; FOURNET, 1955)
3
22
)0()(gRq
eIqI
= (47)
Onde Rg o raio de girao correspondente a distncia mdia quadrtica dos eltrons da
partcula at o seu centro de gravidade, analogamente, o Rg pode ser visto com o raio de inrcia
na mecnica clssica. Aproximaes similares, no discutidas nesta tese, so consideradas para
partculas alongadas e achatadas. Para um sistema monodisperso, o grfico de Guinier,
2)(ln qqI demonstra uma linha reta a qual intercepta I (0), a inclinao desta reta proporcional
ao Rg. Contudo devemos ter em mente que a aproximao de Guinier vlida somente para os
ngulos prximos de 0, respeitando a equao q < 1.3/ Rg (GLATTER; KRATKY, 1982).
tambm possvel obter o Rg como o segundo momento normalizado da funo de distribuio de
distncias p(r) da partcula (Svergun e Koch, 2003). O programa Gnom (Semenyuk e Svergun,
1991) (Svergun, 1992) calcula o Rg a partir da p(r), este pode ser comparado com Rg obtido pelo
mtodo de Guinier.
1.2.2 Regio central da curva de SAXS, determinao do volume
Ao se dividir a equao 42 por 45, tem-se um termo relativo a uma intensidade arbitrria
presente tanto no enumerador como no denominador da equao. As caractersticas associadas a
estas intensidades sero canceladas, permitindo o clculo do volume ser realizado em unidades
absolutas (3):
40 Captulo 1
22
)0(
V
Q
I=
(48)
importante frisar que para o clculo de V , os dados devem ser corretamente
extrapolados a )0(I utilizando a aproximao de Guinier. A relao 48 ser utilizada no captulo
4 para determinao do estado de oligomerizao de protenas em soluo.
1.2.3 Regio de mais alto ngulo da curva de SAXS, determinao da razo
superfcie/volume
A anlise da regio de mais alto ngulo de SAXS contm informao acerca dos aspectos
finos da partcula, ou seja, expressa o comportamento de )(0 r a pequenos rs., ns assumimos
que a partcula tenha densidade eletrnica uniforme (corpo homogneo) com interface bem
definida com a densidade eletrnica do solvente. Porod mostrou que neste caso o comportamento
assinttico no final da curva dado pela relao existente entre a parte da curva de intensidade e
a quarta potncia de q (GLATTER; KRATKY, 1982):
( ) ( ) Sqq
VqI4
2
4
2 28)(
= (49)
O valor assinttico para I(q) x q4 esperado ser proporcional a superfcie total da
partcula:
)(lim 4 qIqQV
Sq =
(50)
Os dados a altos ngulos so assumidos seguir um comportamento linear em )(4 qIq contra
4q . Se houver heterogeneidades na densidade eletrnica da particular espalhadora, verifica-se
uma inclinao na regio linear de AqIBqqIq + )()( 44 . Subtraindo B (constante de Porod) de
I(q), a o espalhamento correspondente ser caracterstico de um corpo homogneo.
Captulo 1 41
1.3 Anlises de protenas em soluo utilizando SAXS
1.3.1 Reconstruo ab-initio da forma da protena a partir de dados de SAXS.
Um dos objetivos de SAXS aplicado ao estudo de protenas em soluo est em resolver
um modelo tridimensional a partir de uma curva unidimensional de espalhamento. Exceto para
casos triviais de partculas esfricas, a soluo no claramente nica e modelos diferentes
podem ser obtidos da mesma curva de SAXS, possuindo estes quase a mesma discrepncia em
relao s curvas experimentais. (VOLKOVA, 2003)
No passado, a determinao de forma de objetos espalhadores foi realizada por
julgamento de acerto erro, computando modelos tridimensionais de objetos geomtricos como,
esferas, cilindros, elipses, prismas, etc, e comparando-os com os dados experimentais. O primeiro
mtodo ab initio para determinao de forma foi proposto por Stuhrmann (1970, 1970b). Neste
mtodo a partcula representada por uma funo de envelope angular r = F (), que descreve as
partculas em coordenadas esfricas (r, ). Contudo, a utilizao de funo de envelope angular,
se limita a formas relativamente simples.
Um modelo tridimensional de melhor qualidade, utilizando um modelo de tomos dummy
do ingls DAM - dummy atom model pode ser construdo ab initio utilizando mtodo de Monte
Carlo (Hromkovic, 2001). O mtodo foi primeiramente implementado no programa DALAI_GA
(CHACON, 1998, 2000). Um volume, por exemplo uma esfera de dimetro igual ao Dmx, a qual
determinada a partir dos dados experimentais definida e preenchida com empacotamento
denso de esferas menores de raio r0 e k fases (relativas s densidades eletrnicas intra partcula).
Assim o nmero de esferas ser N=(R/r0)3.
42 Captulo 1
Cada tomo assinado com um ndice jX indicando a fase a qual ele pertence ( jX possui
intervalo de zero para o solvente at k) . Dando a posio atmica jX , a forma e estrutura do
DAM pode ser descrita.
Cada tomo dummy de kth fase assumido tem contraste k , e a intensidade de
espalhamento para o DAM dada por:
=
=
K
k
kk qAqI1
)()( (51)
onde )(qAk a amplitude de espalhamento para o volume ocupado pela kth fase. Representando as
amplitudes utilizando os harmnicos esfricos )(lmY .
)()()(0
1
1
)( =
= =lm
l m
k
lmk YqAqA (52)
As amplitudes parciais para o volume ocupado pela kth fase no DAM so dadas por:
=
=kN
j
jlmj
lk
lm YqrjqfiqA1
*1
)( )()()(/2)( (53)
onde a somatria age sobre todos os tomos dummy de kth fase. rj, j so dados em coordenadas
polares, )(1 xj a funo de Bessel e )(qf a funo de espalhamento (fator de forma).
Assim a intensidade dada por:
= = >=
+=
0
1
1
*)()(
1
2)(2 )]([)(2)]([2)(l m kn
n
lmn
k
lmk
K
k
k
lmk qAqAqAqI (54)
No programa Dammin (SVERGUN, 1999). Para simplicar a soluo, uma estrutura
homognea assumida, tomando como constante a densidade eletrnica interna da partcula, (a
influncia de no homogeneidade da partcula pode ser corrigida pela subtrao da constante de
Porod (seo 1.2.3). Esta simplificao razovel para a determinao de estruturas
Captulo 1 43
tridimensionais com informaes de espalhamento concentradas no baixo ngulo. Assim, cada
esfera de raio r0 recebe um ndice k igual a 1, ao solvente atribudo ndice igual a 0.
Dando o conjunto de M curvas experimentais MiqI i ,...1),()(exp = , temos o objetivo de
minimizar a discrepncia entre a curva de espalhamento gerado a partir do modelo inicial (esfera)
e a curva experimental.
2
1
)(
1
)()(exp
2 )](/))()([(1
= =
=M
i
iN
j
jj
i
j
i qqIqIM
(55)
em que N(i) o nmero de pontos esxperimentais na ith curva e q( ) denota os erros
experimentais. Pretende-se encontrar no fim do processo de minimizao (da diferena global
entre a curva experimental e a calculada a partir do modelo) a forma tridimensional da
macromolcula em soluo.
O programa assume empacotamento hexagonal Nc = 12, exceto para os tomos de borda.
A perda de conectividade entre os tomos definida por ][1)(1)( 5.05.0 ce NNee eeNPNC == ,
em que C(12) = 1 para conectividade ideal e a conectividade individual de tomos no solvente
caracterizada pela quantidade de tomos contactantes eN pertencentes a mesma fase k. A funo
decai de C(12) = 1 para C(6) = 0.943 (partculas de borda), seguindo at C(0)=0.0002 para os
tomos que no devem aparecer no modelo final. A compacidade de uma configurao X pode
ser dada como uma mdia de conectividade dos tomos os quais no so solvente )( eNC . A
configurao pode ser caracterizada como uma funo mdia = )(1)( eNCXP .
A tarefa de recuperar um modelo de baixa resoluo a partir de uma curva de SAXS pode
ser formulada do seguinte modo: a apartir de um DAM inicial, encontrar uma configurao X que
minimize a funo
44 Captulo 1
)()( 2 XPXf += (56)
em que > 0 a funo peso de penalidade de P(X).
O mtodo de minimizao por simulated annealing descrito abaixo:
1. Inicio em uma configurao randmica 0X a altas temperaturas 0T , sendo )( 00 XfT = .
2. Seleo de um tomo do conjunto, mudana randmica de sua fase (configurao 'X ),
e aplicao da funo )()'( XfXf = .
3. Alterao do valor 'X para a opo testada, se 0
Captulo 1 45
Figura 1.7 Representao esquemtica de uma protena em soluo.
Protenas em soluo podem ser esquematicamente representadas como ilustrado na
Figura 1.7. A partcula com densidade eletrnica )(rar
cercada por um solvente de densidade
eletrnica mdia 0 . A hidratao da protena representada por uma camada de espessura e
densidade b . A curva de SAXS de uma protena em uma soluo suficientemente diluda
proporcional ao espalhamento de um nico objeto espalhador. A intensidade de espalhamento
pode ser descrita como:
+=
2)()()( qAAqAqI bssa
(57)
onde )(qAa a amplitude espalhada para protena no vcuo, sA e bA so respectivamente, as
amplitudes de espalhamento para o volume excludo (solvente) e para a camada de hidratao,
ambas com densidade eletrnica respectivamente, s e b . A camada de solvatao modelada
contendo espessura de 3.0 . A contribuio da amplitude acrescida por )(qAb , onde
sb = . O smbolo significa a promediao da mdia.
Quando a estrutura cristalogrfica da protena conhecida, a amplitude )(qI , equao 51,
pode ser determinada utilizando mtodo de expanso multipolar com o programa Crysol. O nico
46 Captulo 1
parmetro desconhecido que precisa ser ajustado o volume excludo da protena, V, e a
diferena entre a densidade eletrnica entre o solvente e a camada de hidratao. Esses
parmetros e um fator de escala c, so obtidos num procedimento de ajuste utilizando o programa
Crysol (Svergun, 1995). Assim a intensidade de espalhamento obtida experimentalmente por
SAXS e a I(q) obtida por simulao a partir de um banco de dados de protenas podem ser
comparadas:
2
1
00
2
)(
),,()(1),(
=
=
pN
i i
iie
p q
rqcIqI
Nr
(58)
onde pN o nmero de pontos experimentais, )( iq so os erros da intensidade experimental
)( ie qI e c o fator de escala entre os dados experimentais e o modelo cristalogrfico.
Captulo 2 47
2 Objetivos do trabalho
Os objetivos deste trabalho esto concentrados na apreciao da teoria envolvida no
espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado a um sistema monodisperso de protenas em
soluo, em diferentes estudos de SAXS para caracterizao de diferentes protenas, assim como
no desenvolvimento de uma metodologia para determinao do estado de oligomerizao de
protenas em soluo e na implementao de instrumentao para SAXS. Os objetivos
especficos desta tese foram:
(1) Instrumentao de SAXS.
Implementao de um equipamento de baixo ngulo no Instituto de Fsica da USP de So
Carlos capaz de obter curvas de SAXS de boa qualidade, para o estudo estrutural de
macromolculas em soluo.
(2) Desenvolvimento de metodologia para determinao do estado de oligomerizao de
protenas em soluo.
` Utilizando medidas realizadas na linha de SAXS do LNLS, uma metodologia para
determinao da massa molecular de protenas, a qual no so necessrias medidas de protena
padro para comparao da massa molecular, foi extensivamente utilizada demonstrando alta
confiabilidade.
48 Captulo 2
(3) Caracterizao do DBD hTR.
Clonagem, expresso e purificao foi realizada para o DBD hTR, com o intuito da
caracterizao experimental desta protena. Para isto, anisotropia de fluorescncia, crosslink e
SAXS foram realizados. Aps formao do complexo DNA-protena, F2-DBD hTR, o mesmo
foi submetido a cristalizao e SAXS.
(4) Estudos por SAXS de ferredoxina-FAD e do complexo formado por interleucina-22
e interleucina-22R1.
A protena ferredoxina redutase de leptospira interrogans e o complexo formado por
interleucina-22 e o receptor interleucina-22R1 foram submetidos a baixo ngulo com o intuito de
determinao do estado de oligomerizao, assim como do envelope tridimensional dos
complexos.
Capitulo 3 49
3 Instrumentao para o espalhamento de raios X a baixo ngulo
3.1 Equipamento de SAXS do Instituto de Fsica da USP de So Carlos
Resumo
Durante o desenvolvimento deste trabalho dependemos da linha de SAXS do Laboratrio
Nacional de Luz Sincrotron (LNLS) para realizao de experimentos com protenas em soluo.
Muitas destas coletas poderiam ter sido feitas no Instituto de Fsica da USP de So Carlos se
possussemos um equipamento adequado. Por isso, foi desenvolvida, como parte da tese, uma
cmara de SAXS com deteco unidimensional associada a uma fonte de raios X do tipo nodo
rotatrio posicionada para obteno de feixe linha.
50 Captulo 3
3.1.1 Introduo.
Com recursos do projeto temtico FAPESP no 2006/00182-8 do prof. Dr. Igor Polikarpov,
intitulado Biofsica estrutural dos receptores nucleares e protenas relacionadas, foram
adquiridos uma tica multicamadas para monocromatizao do feixe de raios X, um sistema de
colimao e um detector unidimensional sensvel a posio. Um porta-amostra, uma caixa de
fendas, um caminho de vcuo de distncia varivel, assim como um dispositivo para
posicionamento do bloqueador de feixe direto e os sustentadores do sistema foram desenvolvidos
com o apoio da oficina mecnica do IFSC. Acessrios, como micrmetros, e outros dispositivos
foram adquiridos com reserva tcnica do projeto FAPESP no 02/14041-6.
Capitulo
3
51
Um
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52 Capitulo 3
3.1.1.1 Descrio detalhada dos componentes do equipamento
Uma descrio detalhada dos componentes do equipamento mostrada abaixo:
Gerador de Raios X
Anodo rotatrio de Cobre (Cu), Rigaku Rotaflex modelo RU 200B. O gerador foi
posicionado verticalmente de modo a se obter um feixe de raios X com seo reta, com foco de
tamanho 10 x 1 mm a uma inclinao de 6 contra o plano horizontal do foco. A utilizao do
feixe linha conveniente com o uso do anodo rotatrio, pois permite maior fluxo de ftons de
raios X incidentes na amostra.
Monocromador
Uma tica multicamadas composta de tungstnio e silcio otimizada para amplificar um
feixe linha de comprimento de onda caracterstico do K do Cu de 8.04 keV utilizada
(MACRANDER, 1998). O espelho monocromador tem comprimento de 60 mm e fica
posicionado dentro de uma cmara constantemente evacuada. Em ticas multicamadas, somente
para ngulos rasantes, menores que o ngulo crtico (c), o feixe de raios X refletido.
Captulo 3 53
Figura 3.2 - Viso geral do mocromomador.
Sistema de colimao
O sistema de colimao consiste de duas fendas paralelas. Sendo a abertura destas fendas
muito menor que a distncia entre elas. Este sistema tem a desvantagem que as fendas emitem
espalhamento secundrio (espalhamento parasita) na regio dos ngulos prximos de zero.
Contudo uma terceira fenda foi posicionada rente ao feixe, eliminando o o espalhamento parasita
causado pelas duas primeiras fendas. Assim, o sistema de colimao composto de trs fendas de
tntalo, sendo que as duas primeiras, espaadas de 1 metro, so responsveis pela colimao
horizontal e vertical do feixe e a terceira, chamada de fenda parasita, foi posicionada de modo a
no tocar o feixe. O sistema de colimao do equipamento evacuado minimizando o contato do
feixe colimado com molculas de ar.
54 Captulo 3
(A)
(B) (C)
Figura 3.3 - Sistema de colimao. (A) Viso geral do sistema de colimao. (B) Viso frontal da caixa das fendas 1 e 2 . (C) Viso frontal da fenda 3 ( fenda parasita).
Porta-amostra
O sistema de colimao tem como objetivo um feixe linha vertical, de modo que o feixe
no ultrapasse os parmetros da cela do porta-amostra 12 x 2 mm, que possui espao para
aproximadamente 200 L de soluo entre duas janelas de mica. O porta-amostra acoplado a
um banho trmico, o qual permite que a soluo de amostra seja resfriada.
Captulo 3 55
Figura 3.4 Porta-amostra.
Caminho de vcuo e bloqueador do feixe direto
No equipamento de SAXS do IFSC possvel utilizar diferentes distncias entre amostra
e detector (339 mm e 739 mm), cobrindo assim, diferentes intervalos em q. O caminho entre a
amostra e o detector encontra-se em vcuo, de modo a eliminar o espalhamento caracterstico das
molculas presentes no ar. Ao fim do caminho de vcuo, uma placa de chumbo de
aproximadamente 3 mm de largura, chamada de bloqueador do feixe direto, impede que o feixe
de raios X incida diretamente sobre o detector. O bloqueador do feixe direto foi posicionado
sobre uma haste conectada a um micrmetro, o qual permite seu movimento lateral.
56 Captulo 3
(A) (B)
Figura 3.5 - Caminho de vcuo e bloquador do feixe direto. (A) viso geral do caminho de vcuo. (B) O bloqueador do feixe direto encontra-se em frente a janela de sada dos ftons espalhados, o bloqueador pode ser movimentado com a ajuda de um micrmetro.
Sistema de deteco
O sistema de deteco de raios X do equipamento de SAXS do IFSC do tipo
unidimensional sensvel a posio e constitudo de um detector de raios X e uma eletrnica
associada que fornece um sinal digital para o computador de leitura dos dados, o sistema foi
desenvolvido pelo grupo de detectores do Centro Brasileiro de Pesquisas Fsicas. O detector de
raios X est posicionado sobre uma mesa de posicionamento XYZ a qual permite movimentar o
detector verticalmente, em profundidade, e lateralmente (figura 3.6) (BARBOSA, 1996).
Captulo 3 57
Figura 3.6 - Sistema de deteco unidimensional sensvel a posio.
O detector possui em seu interior um fio condutor (anodo), frente a uma janela de Berlio
(80 mm x 8 mm). O detector selado e no seu interior h uma mistura de 90% Argnio e 10%
Metano. Os ftons de raios X incidentes entram pela janela do detector e ionizam o gs, gerando
pulsos eltricos que so capturados pelos respectivos eletrodos (anodo e