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Diagnosi differenziale delle encefaliti virali
Maria R. Capobianchi
Laboratorio di VirologiaIstituto Nazionale Malattie Infettive “L. Spallanzani”
Le procedure diagnostiche di routine comprendono una piccola schiera dipatogeni noti
Restano fuori Patogeni emergenti
Patogeni legati a situazioni epidemiche contingenti
Agenti che sono neuropatogeni solo in presenza di fattori individuali dirischio
Agenti noti di cui non si conosce o non è sospettato il potenzialeneuropatogeno
Una vasta schiera di agenti sconosciuti
L’innovazione tecnologica per migliorare l’efficienza diagnostica
La maggioranza dei casi di meningo-encefalite (fino a 80%) rimane
ad eziologia sconosciuta
0
20
40
60
80
100
120
140
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
Men NN Virale Haem. Pneu. Strep. Staph List. Altri
Virali: circa 70-130/180-230 segnalazioni per anno
Dati SIMI Lazio (analisi SERESMI non pubblicata)
Meningiti Virali Lazio 2005-2016
Courtesy of S. Lanini
Eziologia Lazio campione 2016-2017
17%
12%
1%70%
Entero Herpes WNV Ignoto
Altre malattie con manifestazioni SNC• Parotite, Varicella, Morbillo, Arbovirosi
Meningiti virali: spesso manifestazione (infrequente) di alcune malattie virali
Courtesy of S. Lanini
A causa della analogie nella presentazione clinica, è difficile distinguere tra infezionivirali e batteriche sulla base della presentazione clinica
Quindi la diagnosi di laboratorio è cruciale per la gestione clinica
Il liquor è il campione di scelta
Importanza della diagnosi di laboratorio
Indizi utili (ma non sufficienti a guidare unaterapia mirata):
• Conta cellulare (90% delle meningitibatteriche presentano >100 WBC/mm3)
• Glucosio (ridotto in meningiti batteriche e fungine, normali in forme virali)
• Proteine (elevate quasi sempre)
Metodi indirettiSiero,liquor
• ELISA• IFA• Test di neutralizzazione• Immunità cellulare
Metodi direttiliquor
• Microscopia• Antigeni• Coltura• Metodi molecolari
Diagnosi di laboratorio
Approccio di Laboratorio: pregi e difetti
Standard diagnostico per le forme batteriche: • Coltura
Risultato lento Elevata sensibilità, ma negativa nelle forme decapitate
• Esame microscopicoRisultato immediatoSensibilità fra 60 e 90% nelle forme floride, scarsa nelle forme decapitate
• AntigeniRisultato immediatoSensibilità bassa
• MolecolareRisultato rapidoSensibilità elevata; rileva infezioni decapitate e patogeni non coltivabiliCaratterizzazione per sequenziamento
Standard diagnostico per le forme virali:• Coltura
Gold standard, sensibilità bassa, risultato lento• Molecolare
Diamond standard, sensibilità elevata, risultato rapidoCaratterizzazione per sequenziamento
Game changers.1
Le tecniche molecolari di rilevazione degli acidi nucleici, ed inparticolare la PCR, hanno rivoluzionato la diagnosi di laboratoriodelle infezioni (virali) del SNC, aumentando in modo significativo la% di identificazione
Aspetti favorevoli:
Elevata sensibilità
Elevata specificità
Tempi rapidi di risposta
Costi contenuti
Metodi quali- e quantitativi
BETTER TEST BETTER CARE
Game changers.2
The multiplex revolution: paradigm shift from disease-based sequential diagnosis of etiological agents to a syndrome-based assessment
I saggi monoplex (ricerca mirata di agenti singoli) sono vantaggiosi in caso di indaginemirata per forte sospetto clinico, ma spesso si devono applicare in manierasequenziale a seguito di esclusione, oppure in batterie parallele complesse e costose, che richiedono volumi ampi di campione o rachicentesi ripetute
L’approccio sindromico ha stimolato lo sviluppo di pannelli multiplex(agenti eziologici più probabili associate ad un quadro sindromico)
Vantaggi:
•Piccolo volume di campione
•un singolo prelievo
•rapidità di risultato
•possibilità di rilevare rapidamente infezioni miste
Esistono numerose soluzioni commerciali sia per i saggi monoplex che per i saggimultiplex
The multiplex revolution: paradigm shift from disease-based sequential diagnosis of etiological agents to a syndrome-based assessment
Bacteria: Virus: Fungi:
E. coli K1 CMVC. neoformans o gattii
Haemophilusinfluenzae
Enterovirus
Listeria monocytogenes
HSV-1
N. meningitidis HSV-2)
S. agalactiae HHV-6
S. pneumoniaeHumanparechovirus
VZV
Meningitis-Encephalitis (ME) Panel (FilmArray)
Esempi di piattaforme basate su pannelli sindromici multiplex
Programma di intervento per la riorganizzazione della sorveglianza ed il miglioramento diagnostico delle
sindromi neurologiche di sospetta origine infettiva nella regione Lazio (DCA U00162/2018)
Settori di intervento
• Sorveglianza integrata della sindrome neurologica acuta a sospettaeziologia infettiva
• Gestione della sindrome neurologica nell’ambito della rete dellemalattie infettive
• Sistema di diagnostica avanzata a supporto dellarete e della sorveglianza (approccio comune estandardizzato basato su PCR multiplex rapida)
Hydration lysis Inject Sample Start run
Bacteria: Virus: Fungi:
1. Escherichia coli K1 1. Cytomegalovirus 1. Cryptococcus neoformans
2. Haemophilus influenzae 2. Enterovirus 2. Cryptococcus gattii
3. Listeria monocytogenes 3. Herpes simplex virus 1 (HSV-1)
4. Neisseria meningitidis (incapsulato)
4. Herpes simplex virus 2 (HSV-2)
5. Streptococcus agalactiae 5. Human herpesvirus 6 (HHV-6)
6. Streptococcus pneumoniae 6. Human parechovirus (HPeV)
7. Varicella zoster virus (VZV)
•Test eseguibile in urgenza (piattaforma maneggevole, semplice) •Risultati in poco più di 1 ora dal caricamento
INMI: Meningitis-Encephalitis (ME) Panel
1%3%7%
20%
69%
Viral
Bacterial
Prion
Parasitic
Fungi
26%
29%
3%4%
11%
12%
15%
Enterovirus
HSV-1
VZV
WNV
EBV
Measles
HSV-2
Dati del progetto California Encephalitis
1570 pazienti (1998-2005): agente eziologico identificato nel 16% dei casi
Borrelliaspecies
Candida
Aspergillo NeisseriameningitidisMycobacterium
tuberculosisTreponema pallidum 0
Bartonella henselae
ChlamydophilapsittaciChlamydia trachomatis
Legionella pneumophilaBaylisascaris procioni
influenza B
rubella virusinfluenza ASt Louis encephalitis
Powassan virus
Rabbies virus
Toscana
Western equine encephalitis virus
Kunjin virusKunjin virus
Nipha virusCoxiellaburnetii
Mycoplasma pneumoniae
LeptospiraBrucella
Group B StreptococcusMurray Valley encephalitis virus (MVEV)
Bacillus anthracis
Salmonella spp
Streptococcuspneumoniae
Streptococcuspiogene
Rickettsia rickettsia
Toxoplasma gondii
Histoplasma capsulatumBalamuthia mandrillaris
Coccidioides immitis
Cryptococcus gattiiù
EBV: Epstein-Barr virus
Listeria monocytogenes
Escherichiacoli
Streptococcus agalactiae
Cryptococcusneoformans
HSV1HSV2CMV
HHV6
humanenteroviruses
Humanparechovirus
mumps virus dengue: Dengue virus
WNV
La crosse virus
Rocio virus
Colorado tick fever vius
Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV)
Eastern Venezuela equine encephalitis virus
Rift Valley virus
CHIK
Parvovirus B19
Adenovirus
Louping ill virus
HIV
JEV
~60% sconosciuto~ il 40% noto
Nella gran parte dei casi di meningo-encefalite l’eziologia rimane sconosciuta
60%
20%
“Il viroma noto"
“Il viroma grigio”
“Il viroma ignoto (dark)”
20%
Vir
om
a to
tale
“circa 90% delle sequenze hanno le sembianze di materiale genetico virale, ma non sono classificate tassonomicamente"
…esistono almeno 320.000 virus di mammiferi cheattendono di essere scoperti...
Courtesy of Fabrizio Maggi
Game changers.3
La sfida per il futuro (prossimo): oltre la PCR
Sviluppo di tecniche avanzate
CLINICAL METAGENOMICS: THE HOPE, THE HYPE, AND THE HERE AND NOW
RICERCADIAGNOSTICA
Advances in microbial communities studies from Leeuwenhoek to NGS
Escobar-Zepeda A. Front. Genet. 2015
Contemporary analysis of all genomes present in a sampleCurrent/future applications• Pathogen discovery• Description of microbial communities (virome, microbiome) • Analysis of microbial variability• Diagnostics the future lab
Metagenomics
Metagenomic next-generation sequencing (mNGS) is a
game-changing technology for infectious disease diagnosis as
nearly all pathogens – viruses, bacteria, fungi, and parasites – can
be detected in a single assay
NGS offers the potential to interrogate clinical specimens for the presence of infectious diseases
in a completely unbiased manner.
However, significant challenges confront clinical microbiology laboratories attempting to
implement metagenomics using traditional clinical work flows
Il primo caso clinico (meningo-encefalite fulminante) in cui la metagenomica ha permesso la diagnosi eziologica tempestiva e la conseguente adozione di terapiamirata, efficace
Absence of mycobacteria (Panel G, acid-fast), fungi (PanelH, Gomori methenamine silver), and leptospira or other spirochetes (Panel I, Warthin–Starry silver). TEM revealed the presence of an inflammatoryinfiltrate and the absence of inclusion bodies, viral particles, or other evidence of microorganisms
Temporal trends in the publication of Encephalitis Cases
involving NGS in the last decade
Brown JR et al J of Inf 2018
Agenti identificati con tecniche di metagenomica (shot-gun) NGS
Agenti noti 16HSV-1, Varicella, Morbillo, Parotite, Coxsackie A9, JC virus, EBV, West Nilevirus, St Louis encephalitis virus, Echovirus 30, M. tubercolosis, Cryptococcus neoformans
Agenti nuovi 18Arenavirus, Squirrel bornavirus, Cyclovirus, Densovirus, Astrovirus, Gemycircuarlvirus
Patogeni inattesi 5Parvovirus 4, Coronavirus OC43, Astrovirus VA1/HMO-C, mumpsvaccine virus
Patogeni rari 5Balamuthia mandrillaris, Candida tropicalis, Brucella melitensis, Leptospira santarosai, Naegleriafowleri
Brown JR et al J of Inf 2018
44 CASE REPORTS
Il protocollo sindromico per la gestione del paziente (DCA U00162/2018)
ASPETTI DIAGNOSTICI IL LABORATORIO
• Analisi metagenomica (basata su NGS) su tutti i campioni di liquor negativi allo screening (F.A.)
• I risultati verranno riferiti al contesto territoriale, stagionale e individuale (fattori di rischio)
• La mappatura spazio-temporale servirà a disegnare pannelli diagnostici differenziati per i vari contesti della nostra regione
Sperimentazione di un modello di diagnostica avanzata che si avvale dell’ausilio della metagenomica per l’attribuzione eziologica delle meningoencefaliti
mNGS WORKFLOW (SISPA)
Total nucleic acid extraction
Reverse transcription and amplification of nucleic acid(non targeted amplification):
Sequence Independent Single Primer Amplification - SISPA
Amplicon purification & fragmentation
Sequencing with Ion Torrent S5 platform
Library preparation
Preliminary work included optimization of SISPA, using positive controls (true clinical CSF samples) or negative CSF samples spiked with known amount of DNA (HSV) and RNA (HCV) viruses
Bioinformatic workflow
1. Quality control of raw reads was performedusing BaseCaller and Cutadapt
2. High quality reads were mapped to humangenome using Bowtie2 (in very-sensitivemode)
3. No-human reads where mapped to NCBInucleotide database, with a cut-off E-valueof 10-5
Results. 2CSF negative to FilmArray were analyzed by metagenomics
Total CSF: 72
Age(years)
N° Gender (%M)
Diseases
60 17 58 1 Meningoencephalitis; 6 Encephalitis; 10 Not defined
Eukaryotic reads: 7.54 x 104 (range: 2.90x 104 -6.13 x 106 )
Bacterial reads: 2.41 x 104 (range: 6.90x 101 -2.68 x 107 )
Viral reads: 20.5 (range: 1 - 1.91 x 107 )
Human reads: 3.93 x 107 (range: 5.25x 105 -5.29 x 107 )
No hits reads: 4.41 x 105 (range: 2.06x 105 -2.45 x 106 )
viral reads ≈ 0,00005%(range: 0,000003 % - 34 %)
Average reads per sample: 4.17 x 107 ± 1.42 x 106 (95% CI)Median reads length: 190nt (30-390)
Results 3. 72 CSF analyzed by metagenomics
Conclusions (pros)
• Viruses excluded from FilmArray detected in ~15% (11/72) of CSF, in some cases confirmed a posteriori by targeted PCR
• Overall good agreement results between IonTorrent and Illumina platforms
• In some cases relevant number of reads (i.e. TTV), providing near full genome characterization
• Unbiased mNGS may represent a suitable approach to characterize the virome in samples containing small amounts of NA (i.e. CSF)
• Possible to foresee the eventual replacement of many single-agent assays performed in reference laboratories with a unified mNGS approach?
Conclusions (cons)• In some cases disagreement between NGS and targeted amplification
(PCR) RNA vs DNA? Amplified region?
• Lack of standardization for data analysis and interpretation
• So far timeframe not compatible for clinical decision-making
Open issues
• Difficulties in discriminating between pathogenic organisms or bystanders (non pathogenic) and contaminants (i.e. reagent and environmental contaminant background signatures) Need of algorithm correctly prioritizing etiologic pathogens
• Ethical implications of metagenomics: incidental findings
Laboratory diagnosis of meningitis/encephalitis is critical for patient care
Laboratory diagnosis of meningitis/encephalitis is multifaceted with many complexities, not suitable to one stop shopping
New assays are constantly being developed to aid in the diagnosis of meningitis/encephalitis
SUMMARY
Paris, May 1888
Work in progress
Barbara Bartolini
M. Beatrice Valli
Martina Rueca
Cesare Gruber
SERESMI
Giuseppe Ippolito