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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
T É C N I C A S E N I N M U N O LO G I A
I
M A R I A J O S E J A R A M I L L O E S T R E L L A
8 DE SEPT IEMBRE DEL 2011
DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE
La cuantificación de los subgrupos de células utiliza 3 factores:
1. Existencia de una molécula en la superficie celular específica
de subgrupo (p.ej. , CD4 para los linfocitos T)
2. Un anticuerpo monoclonal específico de la molécula
3. Sustancias químicas llamadas fluorocromos que producen
fluorescencia a una longitud de onda concreta cuando se
exponen a una fuente de luz excitadora: fluoresceína (verde),
ficoeritrina (naranja) y aloficocianina (rojo)
DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE
Citometría de Flujo
DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE
ACT IVAC ION DE LOS L INFOCITOS T Y DETERMINAC ION DE LAS RESPUESTAS EN EL
LABORATORIO : SEPARACION Y ANAL IS IS DE LOS L INFOCITOS PARA
LAS RESPUESTAS PROL IFERAT IVAS
Separación de los leucocitos de la sangre utilizando gradiente de densidad.
La purificación puede obtenerse utilizando anticuerpos monoclonales específicos marcados con bolas magnéticas
ACT IVAC ION DE LOS L INFOCITOS T Y DETERMINAC ION DE LAS RESPUESTAS EN EL
LABORATORIO : SEPARACION Y ANAL IS IS DE LOS L INFOCITOS PARA
LAS RESPUESTAS PROL IFERAT IVAS
Análisis de la proliferación para determinar la respuesta del linfocito T al antígeno específico
A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :
E S T I M U LO S P O L I C LO N A L E S
METODOS DE ACTIVACION
ACTIVADOR POLICLONAL O
MITÓGENO
LA LECTINA FITOHEMAGLUTININA
(PHA)
ENLACES CRUZADOS
CON GLUCOPROTEI
NAS DE SUPERFICIE
DE LINFOCITOS T.
ANTI-CD3
MONOCLONAL
ENLACES CRUZADOS CON
EL COMPLEJ
O TCR
SUPERANTÍGENOS
ENTEROTOXINA B
ESTAFILOCÓCICA
SUSTANCIAS MICROBIANAS SE
UNEN A LOS DOMINIOS DE LAS
CADENAS Vβ DEL TCR
ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y MEDIR SU RESPUESTA (INVESTIGACIÓN Y EXPLORACION DIAGNOSTICA EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIAS)
PROLIFERACION DE LINFOCITOS T Y PRODUCCION DE CITOCINAS EFECTORAS
ACTIVACION Y PROLOFERACION DE TODOS LOS LINFOCITOS T FRENTE A ESTIMULOS ESPECIFICOS
A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :
C I T O C I N A S Y T E T R Á M E R O S
La determinación de la respuesta del linfocito T se lleva a cabo de diferentes modos, uno de los más sencillos es la citometría de flujo pero con frecuencia se requiere de información mas detallada sobre las citocinas, lo que permite clasificar las respuestas como TH1, TH2, TH17 o Treg.
Las citocinas que se producen pueden determinarse:
1. ELISA: inmunoanálisis enzimático sobre fase sólida
2. Citometría de Flujo: para determinarlos dentro de la célula
3. PCR (reacción en cadena de la polimerasa: para los transcritos de ARNm específicos de las citocinas..
4. ADN recombinante para sintetizar molécula del HLA solubles
A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :
C I T O C I N A S Y T E T R Á M E R O S
ADN recombinante para sintetizar molécula del HLA solubles. Las moléculas de HLA se ensamblan en los complejos de 4 componentes péptido-HLA (tetrámero de HLA) lo que aumenta la avidez de interacción . El tetrámero se acopla a un fluorocromo de modo que los linfocitos T individuales son capaces de unirse al epítopo específico.
Revolucionado la capacidad de determinar respuestas inmunitarias por
ejemplo: al virus de Epstein-Barr(respuestas antivíricas)
A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :
A N A L I S I S D E C I T O T OX I C I D A D
Examinar la lisis específica por los CTL y la destrucción de los linfocitos asesinos naturales.
El análisis se basa en la incubación de las células efectoras y las células diana y la determinación de afección de éstas.
En la evaluación de la actividad de CTL debe usarse la célula diana emparejada con la molécula del MCH apropiado.
Las células diana se marcan mediante incubación con cromato sódico radiactivo.Si las células diana son dañadas por los efectores se libera el cromo del citoplasma.Los niveles de radiactividad son proporcionales a la lisis de la célula diana.
TOLERANCIA INMUNOLÓGICA
Burnet y Medewar, galardonados con el premio Nobel de Medicina en 1960, estudiaron el rechazo de injertos cutáneos alogénicos (no propios), en los que observaron una asociación linfocítica masiva.
La importancia radica en que se puede obtener tolerancia a antígenos extraños, aunque la vía de inyección neonatal no se use en el transplante de órganos.
MEDICION ENSAYO EJEMPLOS ESPECIFICOS
Concentración de Ig Nefelometría IgG, IgM, IgA e IgE
Gammapatías monoclonales
Inmunoelectroforesis, inmunofijación
Componente M
Complemento:Componentes individuales Actividad hemolítica total
ELISAPrueba de fijación de
complemento
C1, C2, C3, C4CH50
Anticuerpos de agentes infecciosos:
VIHStreptococo
Treponema pallidum
ELISA, western blotAglutinaciónAglutinación
Anti-gp24, gp41, gp120Polisacarido anticapsular
VDRL
Autoinmunidad:Anticuerpos anti-Ig Hemaglutinacion
pasivaFactor reumatoide
Anticuerpos antinucleares Inmunofluorescencia ANA, y anti DNA`s
Marcadores de superficie celular
Linfocitos normalesTumores celulares
Citometría de flujoCitometría de flujo
CD4, CD8, CD19CD10 o células leucémicas