Seediscussions,stats,andauthorprofilesforthispublicationat:https://www.researchgate.net/publication/278024048

Wykorzystaniemiejscowo-specyficznychnukleazdomodyfikacjigenomówroślinnych(Site-specificnucleasesinplant...

ArticleinAdvancesincellbiology·November2014

CITATIONS

0

READS

786

2authors:

Someoftheauthorsofthispublicationarealsoworkingontheserelatedprojects:

IdentificationandcharacterizationofbarleyhomologsofPSR1transcriptionfactorinvolvedinthe

regulationofgeneexpressioninresponsetophosphorusdeficiencyinbarley(Hordeumvulgare).

Viewproject

PawełSegaAdamMickiewiczUniversity

4PUBLICATIONS0CITATIONS

SEEPROFILE

AnnaLinkiewicz

InstytutHodowliiAklimatyzacjiRoslin

41PUBLICATIONS1,554CITATIONS

SEEPROFILE

AllcontentfollowingthispagewasuploadedbyPawełSegaon11June2015.

Theuserhasrequestedenhancementofthedownloadedfile.Allin-textreferencesunderlinedinblueareaddedtotheoriginaldocumentandarelinkedtopublicationsonResearchGate,lettingyouaccessandreadthemimmediately.

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 41 2014 NR 4 (701–720)

WYKORZYSTANIE MIEJSCOWO-SPECYFICZNYCH NUKLEAZ DO MODYFIKACJI

GENOMÓW ROŚLINNYCH

SITE-SPECIFIC NUCLEASES IN PLANT GENOME EDITING

Paweł SEGA, Anna LINKIEWICZ

Laboratorium Kontroli GMO, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Państwowy Instytut Badawczy w Radzikowie

Streszczenie: Możliwość precyzyjnej modyfikacji fragmentu DNA w genomie roślinnym, na drodze mu-tagenezy miejscowo-specyficznej, stanowi istotne osiągnięcie dla prac podstawowych z zakresu biologii roślin jak też dla biotechnologii roślin uprawnych. Precyzyjne zmiany w genomie są możliwe dzięki opra-cowaniu przełomowej metody mutagenezy ukierunkowanej, polegającej na wykorzystaniu nukleaz mie-jscowo-specyficznych – nowych narzędzi biologii syntetycznej. Zaprojektowane domeny wiążące DNA pochodzące z czynników transkrypcyjnych z motywem palca cynkowego czy bakteryjnych czynników aktywujących transkrypcję TAL, w połączeniu z domeną nukleolityczną enzymów restrykcyjnych klasy II, odpowiadają za rozpoznawanie oraz wprowadzanie pożądanych zmian w wybranym locus. Precyzy-jne wprowadzenie zmiany w sekwencji DNA, zachodzi w miejscu podwójnego pęknięcia nici DNA, co w konsekwencji wyzwala mechanizmy naprawcze, które obejmują zarówno niehomologiczne łączenie końców jak i rekombinację homologiczną. Wśród nukleaz miejscowo-specyficznych wyróżnić można: meganukleazy, nukleazy z motywem palca cynkowego, aktywujące transkrypcję nukleazy TALE oraz bakteryjny system CRISPR/Cas9. Zastosowanie wymienionych technik może pozwolić na uniknięcie problemów natury prawnej, związanych z wykorzystaniem organizmów genetycznie zmodyfikowanych na drodze transgenezy. W artykule porównano powszechnie stosowane nukleazy miejscowo-specy-ficzne, a także przeprowadzono ocenę omawianych technik mutagenezy co do możliwości otrzymywan-ia roślin nietransgenicznych o cechach pożądanych w nowoczesnej hodowli roślin.

Słowa kluczowe: nukleazy DNA, mutageneza ukierunkowana, inżynieria genetyczna, hodowla roślin

Summary: The ability to edit DNA sequences in plant genomes via site-directed mutagenesis is of great importance for basic plant biology and agriculture biotechnology. Targeted genome modifications be-come possible using site-specific nucleases- new synthetic biology tools. Recent advances in genetic engineering allow to modify naturally occurring nucleases. Designed domains derived from zinc finger transcription factors or transcription activator-like effectors fused to endonuclease domain of a class II restriction enzyme are responsible for identifying and introducing desired changes in the select-ed locus. Precise editing of DNA sequence occurs by introducing double strand break and repair by

702 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

subsequent mechanism involving either non-homologous end joining or homologous recombination. Site-specific nucleases comprise meganucleases, zinc-finger nucleases, transcription activator-like ef-fector nucleases, and clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system. The application of these tools can help overcome legal problems related to use of genetically modified organisms. We present and discuss commonly used systems for site-specific genome engi-neering and highlight the ability to create non-transgenic plants for modern plant breeding.

Key words: DNA nucleases, targeted mutagenesis, genetic engineering, crop breeding improvement

WSTĘP

Mutacje są kluczowymi czynnikami zmienności oraz ewolucji genomów. Roz-wój współczesnej genetyki, inżynierii genetycznej oraz genomiki umożliwił po-szukiwanie a także generowanie nowych źródeł zmienności na drodze mutagenezy ukierunkowanej. Spontaniczne mutacje gromadzą się w sposób naturalny, w wyni-ku np. błędów podczas replikacji, transpozycji oraz naprawy DNA po ekspozycji na światło UV. Mutageny fizyczne takie jak promieniowanie jonizujące, promie-niowanie ultrafioletowe czy chemiczne, np. EMS (metanosulfonian etylu) z powo-dzeniem wykorzystuje się od lat do generowania postępu biologicznego w hodowli roślin. Zastosowanie mutagenów pozwala na indukcję szeregu zmian zlokalizowa-nych w losowych, niemożliwych do przewidzenia miejscach w całym genomie. Z tego powodu fenotyp roślin otrzymanych po mutagenezie jest wypadkową wszyst-kich uzyskanych mutacji. Zniwelowanie tła genetycznego po mutagenezie induko-wanej jest pracochłonnym etapem w konwencjonalnej hodowli roślin [6, 15, 67].

Dopiero pod koniec lat 90 ubiegłego wieku stało się możliwe indukowanie muta-cji w ściśle określonym miejscu w genomie. Osiągnięcia na polu inżynierii genetycz-nej umożliwiły wprowadzenie w materiale genetycznym roślin uprawnych kierunko-wych, miejscowo-specyficznych zmian, takich jak mutacje punktowe, insercje czy delecje całych odcinków DNA. Miejscowo specyficzne nukleazy (ang. Site-Specific Nucleases, SSN), białka enzymatyczne z grupy endonukleaz, umożliwiają wprowa-dzenie konkretnej zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA w określonym miejscu w genomie. Ich działanie polega na rozpoznaniu i przecięciu dwuniciowej cząsteczki DNA o ściśle określonej sekwencji. Podstawowe zastosowania u roślin dotyczą obec-nie inaktywacji pojedynczych genów, nieznacznych modyfikacji funkcji genu (po-przez mutację sekwencji czy naprawę rekombinacyjną) oraz miejscowo-specyficznej integracji egzogennej sekwencji DNA [2, 67]. Prace na modelowych gatunkach, ta-kich jak rzodkiewnik [2, 96] czy ryż [52, 59], w dużej mierze przyczyniły się do roz-woju nowej technologii, a w rezultacie do wzrostu w ostatnich latach liczby użytecz-nych patentów [100]. W pracy zostaną opisane postępy związane z wykorzystaniem technik nukleaz miejscowo-specyficznych do badań nad funkcją genów w systemach roślinnych oraz do uzyskania nowych cech, istotnych dla hodowli roślin.

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 703

UKIERUNKOWANA MODYFIKACJA GENOMÓW ROŚLINNYCH

Wszystkie techniki mutagenezy z udziałem miejscowo specyficznych nukleaz łą-czy wspólny etap prowadzący do pęknięcia podwójnej nici DNA (ang. Double-Strand Break, DSB), oraz odbudowa nici przez jeden z dwóch szlaków naprawczych dsD-NA w komórce. Komórkowe procesy naprawy zmian typu DSB polegają na łączeniu niehomologicznych końców DNA (ang. Non-Homologous End Joining, NHEJ) lub homologicznej rekombinacji (ang. Homologous Recombination, HR) [44, 67, 78]. U wyższych eukariontów, w tym u roślin, dominuje szlak naprawy DNA typu NHEJ występujący 1000 razy częściej niż rekombinacja homologiczna [67, 93]. Jednak jest mniej precyzyjny, przez co z większym prawdopodobieństwem generuje małe delecje lub insercje (tzw. indele). W konsekwencji powstałe zmiany prowadzą do wyłączenia funkcji genu lub przesunięcia ramki odczytu [67, 90]. Alternatywnym podejściem jest wykorzystanie obecności donora zawierającego homologiczną sekwencję DNA do miejsca powstania pęknięcia podwójnej nici DNA [47, 54]. Aktywowany jest wów-czas mechanizm naprawy HR, co prowadzi do zamiany konkretnej sekwencji, jej integracji lub addycji dodatkowego fragmentu DNA. Homologiczna rekombinacja umożliwia precyzyjną naprawę w miejscu skrzyżowania donorowego DNA z DSB. Pozwala na zamianę egzogennego locus zawierającego w swojej sekwencji bezbłędne mutacje, a także wprowadzanie dowolnych, obcych genów [44, 93].

Techniki miejscowo-specyficznych nukleaz dzieli się na trzy grupy, w zależności od poziomu integracji rekombinowanego DNA z genomem gospodarza. Do pierwszej grupy można zaliczyć metody wykorzystujące nukleazy do generowania miejsco-wo-specyficznych przypadkowych mutacji, najczęściej za pośrednictwem jednego, podwójnego pęknięcia DNA [36]. Metody należące do tej grupy mogą również być zaprojektowane tak, aby wprowadzać dwa pęknięcia podwójnej nici DNA. Wówczas powstaje duża delecja między dwoma docelowymi regionami DNA. W ten sposób możliwe jest usunięcie całych regionów regulatorowych, egzonów, intronów, całe-go genu lub nawet części chromosomów. Powstanie dwóch DSB może prowadzić do duplikacji, inwersji lub translokacji sekwencji znajdującej się między powstałymi pęknięciami [56, 72]. W przypadku technik drugiego typu wykorzystuje się egzo-genną matrycę DNA (zwaną DNA donorowym) do naprawy uszkodzeń za pomo-cą mechanizmu homologicznej rekombinacji. Donorowe DNA zawiera pożądane, ukierunkowane mutacje (substytucje nukleotydowe i/lub krótkie indele), ale wymaga również wysokiej homologii sekwencji do genu endogennego, aby umożliwić zajście homologicznej rekombinacji [31]. Tak zmodyfikowany egzogenny fragment DNA jest wprowadzany na miejsce istniejącej, homologicznej sekwencji. Tego typu zmiany są przydatne np. w celu naprawy niepożądanych, spontanicznych mutacji (ukierunko-wana korekcja genu) lub wprowadzenia nowych, ukierunkowanych mutacji oraz war-tościowych cech (zastąpienie genu lub allelu) [31, 70]. W trzeciej grupie znajdują się

704 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

techniki mające na celu wprowadzenie długich fragmentów DNA (np. transgenów) w określonym locus, stosując zaprojektowane DNA donorowe. Egzogenne DNA po-winno zawierać pożądaną sekwencję wraz z DNA flankującym, wykazującym wy-soką homologię do docelowego locus. Ułatwia to ukierunkowaną integrację DNA w miejscu powstania pęknięcia podwójnej nici DNA [56, 70, 72].

NUKLEAZY MIEJSCOWO-SPECYFICZNE

Do generowania zmian w genomach roślinnych wykorzystuje się meganukleazy, nukleazy z motywem palca cynkowego (ang. Zinc Finger Nucleases, ZFN), nukleazy TALE (ang. Transcription Activator-Like Effectors) oraz modyfikacje bakteryjnego systemu odpornościowego CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated).

MEGANUKLEAZY

Meganukleazy są to naturalnie występujące, wysoce specyficzne endonu-kleazy, zwane również samonaprowadzającymi endonukleazami (ang. homing endonucleases), rozpoznające sekwencje o długości 14-40 pz. Po raz pierwszy zo-stały opisane w latach osiemdziesiątych XX wieku u drożdży [3, 40]. Można je znaleźć w wielu organizmach żywych, od archebakterii, przez fagi, grzyby, aż po niektóre gatunki alg, rośliny wyższe i zwierzęta. Zidentyfikowano setki tego typu enzymów podlegających ekspresji w różnych kompartymentach komórkowych: jądrze komórkowym, mitochondrium czy chloroplastach. Jednak do tej pory ich rola nie została jednoznacznie opisana, dlatego najczęściej są klasyfikowane jako „samolubne elementy genetyczne”. Uważa się, że meganukleazy biorą udział w rozpoznawaniu oraz cięciu sekwencji łączącej dwa egzony, w której znajduje się intron. Tego typu pasożytnicze molekuły są zdolne do samowycinania z cząsteczki gospodarza (mRNA, rRNA, tRNA z intronów lub białka z intein) oraz ligowania do końca innych cząsteczek bez zaburzania ich biologicznej funkcji [2, 67].

Ze względu na strukturę powtórzeń (motywów) oraz sekwencję aminokwasową, meganukleazy można podzielić na 5 rodzin: LAGLIDADG [43, 86], GIY-YIG [48], HNH [94], His-Cys box [24] oraz PD-(D/E)XK [50, 84]. Nazewnictwo poszczegól-nych klas enzymów w ramach rodziny, opiera się o prefiks dołączony do nazwy en-zymu: I, dla enzymów kodowanych w intronach (np. I-CreI); PI, kodowanych w inte-inach (np. PI-SceI) lub F, dla enzymów niezależnie kodowanych (np. F-SceI) [3, 75].

Największą i najlepiej scharakteryzowaną molekularnie rodziną jest LAGLI-DADG, której nazwa pochodzi od konserwowanego powtórzenia peptydowego. Me-ganukleazy z tej rodziny najczęściej są kodowane w intronach lub inteinach, rzadko występują jako niezależne jednostki transkrypcyjne. Niektóre z nich zawierają jeden, inne dwa charakterystyczne motywy sekwencji aminokwasowej LAGLIDADG, któ-

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 705

re stanowią zasadniczy element aktywności enzymatycznej. Rodzina ta zawiera dwie bardzo dobrze poznane i molekularnie scharakteryzowane endonukleazy: endonukle-aza I-CreI, wyizolowana z Chlamydomonas reinhardtii (ryc. 1), zawierająca jeden motyw [3, 79, 87] oraz endonukleaza I-SceI z Saccharomyces cerevisiae z dwoma motywami [49, 23]. W obu przypadkach struktura peptydu jest podobna, zawierająca fałdowanie αββαββα, z motywem LAGLIDADG zawartym w terminalnym odcinku pierwszej helisy. Charakterystyczne powtórzenie wchodzi w skład dwuczęściowego centrum katalitycznego oraz formuje rdzeń łączący podjednostki. Naturalnie wy-stępujące endonukleazy rozcinają w miejscu rozpoznawania konkretne, niezmienne sekwencje DNA. Inżynieria genetyczna pozwala na otrzymanie zrekombinowanych endonukleaz, ukierunkowanych na wybrane locus w genomie [86].

Najczęściej wykorzystywany enzym I-CreI jest homodimerem rozpoznającym fragment sekwencji DNA o długości 22 pz (ryc. 1). Przestrzennie enzym zbudo-wany jest z dwóch przeciwległych monomerów, z których każdy wiąże odcinek DNA o długości 9 pz [2, 3]. Interakcje białko-DNA zachodzą za pośrednictwem wiązań wodorowych. Pomiędzy odwróconymi monomerami pozostaje fragment DNA o długości 4 pz, który nie jest fizycznie związany z enzymem. Enzym nacina wiązanie fosfodiestrowe po obu stronach centralnej sekwencji, pozostawiając dwa niesparowane odcinki DNA o długości 4 pz z nawisami 3’. Analizy strukturalne kompleksu wiążącego I-CreI wykazały, że mechanizm rozpoznawania DNA nie jest skomplikowany. Wiązane zasady azotowe DNA są określane na podstawie ich bezpośredniego kontaktu z pojedynczym łańcuchem bocznym aminokwasu zawar-tego w strukturze enzymu [79]. Mechanizm ten pozwala na dobór aktywności oraz miejsca wiązania meganukleaz, poprzez zmianę niewielkiej liczby aminokwasów, bezpośrednio zaangażowanych w wiązanie niezależnych zasad [2].

RYCINA 1. Interakcje DNA-białko meganukleazy I-CreI z docelową sekwencją. Kolorem szarym za-znaczono monomery wiążące DNA. Czerwoną linią zaznaczono miejsce cięcia. Litery N – oznaczają dowolny nukleotyd sekwencji docelowej [wg 2, zmienione]FIGURE 1. DNA-protein interactions of I-CreI meganuclease and targeted DNA sequences DNA-binding monomers are indicated in grey. Red lines show cleavage site. Letter N – means any nuc-leotide of targeted sequence [acc. to 2, changed]

706 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

TABELA 1. Przykładowe zastosowania meganukleaz, ZFN, nukleaz TALE, systemu CRISPR/Cas9 u roślinTABLE 1. List of applications of meganucleases, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9-mediated genome editing in plants

Gatunek Cel badania Nukleaza Metoda dostarczenia Referencja

Rzodkiewnik

Cięcie unikalnej, egzogennej sekwen-cji DNA np. genu markerowego BAR czy genu reporterowego GUS

Meganukleaza I-CreI Agrotransformacja [2]

ZFN Agrotransformacja [20]

Inaktywacja genu ABA-INSENSITIVE4 (ABI4) ZFN Agrotransformacja [65]

Inaktywacja genu ALCOHOL DEHYDROGENASE1 (ADH1) oraz TRANSPARENT TESTA4 (TT4)

ZFN/TALENAgrotransformacjaTransformacja protoplastów

[95][14]

Inaktywacja genów BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 (BRI1), JASMONATE-ZIM- -DOMAIN PROTEIN 1 (JAZ1) oraz GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE (GAI)

CRISPR/Cas9 Agrotransformacja [26]

Bawełna Addycja genów hppd, epsps Meganukleaza I-CreI Biolistyczna [22]

JęczmieńUkierunkowana mutageneza promo-tora genu HvPAPhy_a TALEN Agrotransformacja [91]

Inaktywacja genu reporterowego gfp TALEN Agrotransformacja [35]

KukurydzaUkierunkowana mutageneza genu LIGULELESS1 (LG1)

Meganukleaza I-CreI Agrotransformacja [32]

Addycja genu IPK1 ZFN Kultura komórkowa [83]

RyżInaktywacja promotora genu Os11N3 TALEN Agrotransformacja [52]Inaktywacja genu CHLOROPHYLL A OXYGENASE 1 (CAO1) CRISPR/Cas9 Agrotransformacja [59]

SojaUkierunkowana mutageneza genu DICER-LIKE (DCL) ZFN Agrotransformacja [19]

Inaktywacja genu mDeRED CRISPR/Cas9 Agrotransformacja [41]

TytońInaktywacja genów SurA, SurB TALEN Transformacja

protoplastów [97]

Inaktywacja genu PHYTOENE DE-SATURASE (PDS) CRISPR/Cas9 Agrotransformacja [53]

[63]

Meganukleazy jako pierwsze zostały wykorzystane do indukowania ukierunko-wanych dwuniciowych pęknięć w genomach roślin m.in. do mutagenezy kukury-dzy [32], do usunięcia transgenicznych sekwencji u rzodkiewnika [2], w uzyskaniu transgenezy wielokrotnej (z ang. gene stacking) u bawełny [22] (tab. 1). Nie przy-puszcza się jednak, aby meganukleazy w przyszłości pełniły znaczącą rolę w ge-nerowaniu zmian genetycznych u roślin, ze względu na czasochłonne tworzenie konstruktów oraz skomplikowaną metodykę (tab. 2).

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 707

TABELA 2. Porównanie technik miejscowo-specyficznej mutagenezy oraz ocena ich przydatności w genomice roślinTABLE 2. Comparison of site-specific nucleases-based methods and their evaluation in plant genomics

Meganukleazy ZFN TALEN CRISPR/CAS

Cechy charaktery-

styczne

• Długość sekwencji docelowej: > 12 pz• Naturalne endode-oksyrybonukleazy

• Długość sekwencji docelowej: 18-30 pz• Dwa monomery zbudowane z 3-6 modułów, każdy wiążący tryplet DNA + domena FokI• Kompleks białko:DNA

• Długość sekwencji docelowej: 50-60 pz• Dwa monomery, każ-dy zbudowany z 13-30 modułów, wiążą 1 pz + domena FokI• Kompleks białko: DNA

• Długość sekwencji docelowej: ok. 20 pz• Parowanie RNA oraz DNA przy udziale transkryptu napro-wadzającego oraz nukleazy Cas9• Kompleks RNA:DNA

Zalety

+bardzo niska cytotoksyczność

+bardzo niski poziom efektów niedocelowych

+wysoce specyficzne

+prosty transfer do komórki

+najlepiej poznana technika

+duża liczba baz danych, sekwen-cji oraz aplikacji bioinformatycznych

+dostępne metody detekcji oraz oceny aktywności niedocelo-wej na genom

+możliwość montażu różnych motywów ZFN (CoDA)

+bardzo prosta budowa domen wiążących DNA

+łatwość modyfikacji sekwencji

+wydajne, powtarzalne, swoiste

+mniej cytotoksyczne niż ZFN

+niski poziom efektów niedocelowych w genomie

+rosnąca dostępność narzędzi bioinforma-tycznych, baz danych

+stosunkowo tanie podejście

+możliwość cięcia w konkret-nym, specyficznym rejonie DNA

+prosta budowa oparta o jedno, stałe białko oraz elastyczną cząsteczkę RNA

+najkrótszy czas zaprojektowa-nia cząsteczki

+najtańsze podejście +dynamicznie rosnące zaintere-

sowanie w genomice roślin

Wady

- ograniczona liczba meganukleaz do wykorzystania - trudne projekto-

wanie konstruktów w porównaniu do pozostałych technik - budowa

niemodułowa

- ograniczone możli-wości ukierunkowania enzymu na konkretne locus - brak palców cynko-

wych dla wszystkich trypletów DNA - trudna konstrukcja

ukierunkowanych ZFN - najdroższe podejście

- efektywność procesu ograniczona w rejonach nieaktywnych tran-skrypcyjnie (zależne epigenetycznie) - wieloznaczność

modułu rozpoznającego guaninę (G/A)

- wysoki poziom efektów niedo-celowych w genomie - konieczna ocena wpływu

tego podejścia na cyto- oraz genotoksyczność - mały zasób informacji, apli-

kacji bioinformatycznych, baz danych

Perspektywy + + + + + + + + + + + + + + Specyficzność działania Wysoka Średnia Wysoka Wysoka

Efekty niedocelowe Niskie Wysokie Niskie Wysokie

Toksyczność Niska Wysoka Niska WysokaProjektowanie konstruktu Trudne Trudne Łatwe Bardzo łatwe

Wydajność vs koszty Średnia Niska Wysoka Bardzo wysoka

708 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

NUKLEAZY Z MOTYWEM PALCA CYNKOWEGO

Nukleazy z motywem palca cynkowego są najlepiej scharakteryzowaną oraz jedną z najczęściej wykorzystywanych w ostatnich latach technik miejscowo-spe-cyficznej mutagenezy. W przeciwieństwie do meganukleaz są to syntetyczne białka, powstałe w wyniku połączenia naturalnie występujących domen – wiążącej DNA, z motywem palca cynkowego oraz domeny nacinającą DNA, posiadającej enzym restrykcyjny typu IIS, np. FokI [13]. Palec cynkowy zbudowany z dwóch anty-równoległych β-kartek i jednej α-helisy. W centrum katalitycznym obecny jest jon cynku (Zn2+), który odgrywa kluczową rolę dla funkcjonalności oraz stabilności domeny. Najpopularniejsza klasa palców cynkowych Cys2His2, zawiera motyw se-kwencji o długości około 30 aminokwasów [29]. Struktura drugorzędowa domeny zawiera fałdowanie αββα, która jest stabilizowana przez centralnie położony atom cynku koordynowany dwiema wysoce konserwowanymi resztami cysteiny oraz histydyny [29, 31, 72]. Poszczególne palce cynkowe odpowiadają za rozpoznanie trzech sąsiadujących nukleotydów. Zaznaczyć należy, że wykazują one pełną funk-cjonalność jako monomery, dzięki czemu możliwe jest łączenie kilku palców cyn-kowych, w zależności od sekwencji nukleotydowej. Montaż od 3 do 4 monomerów pozwala na ukierunkowanie miejsca docelowego, a w konsekwencji rozpoznanie miejsca wiązania DNA o długości 18-30 pz [15] (ryc. 2A). Nukleazy ZFN posiadają również domenę FokI, która do aktywności katalitycznej wymaga dimeryzacji pary monomerów, rozdzielonych w konstruktach genetycznych przerywnikiem o długo-ści 5-9 pz. Podczas połączenia dwóch monomerów FokI dochodzi do nacięcia DNA oraz powstania pęknięcia podwójnej nici DNA [15, 46, 72].

Do tej pory opracowano liczne rozwiązania pozwalające na projektowanie, two-rzenie oraz montaż własnych, niestandardowych nukleaz ZFN. Teoretycznie poli-morficzne moduły są zdolne do rozpoznania każdej trójki nukleotydów. Informacje dotyczące naturalnych jak i sztucznych motywów rozpoznających niemal wszyst-kie kombinacje nukleotydów, można znaleźć w bazie danych ZiFBD [29]. Łączenie poszczególnych monomerów w zależności od sekwencji docelowej (tzw. CoDA, ang. Context-Dependent Assembly) nie jest przypadkowe [76]. Dobór palców cynko-wych jest ważny z powodu różnic w efektywności oraz specyficzności wiązania DNA [8]. Palce cynkowe dla pojedynczej nici DNA są montowane przy użyciu N- (F1) oraz C- (F3) końcowych monomerów, zawierających wspólny monomer (F2) (ryc. 2A). Kombinacja ta pozwala na wykorzystanie łącznie 600 różnych palców F1 oraz F3, tak zaprojektowanych aby łączyć się ze stałymi jednostkami F2 [16, 25, 46, 47].

Technika nukleaz ZFN ma zastosowanie nie tylko w medycynie, ale coraz czę-ściej w biotechnologii roślin. W 2005 po raz pierwszy przeprowadzono ukierunko-waną mutagenezę za pośrednictwem nukleaz ZFN u rzodkiewnika [55]. W kolej-nych latach zastosowano je u tego samego gatunku do inaktywacji niepożądanych elementów genetycznych po transgenezie np. genu reporterowego gus [20] czy inaktywacji sekwencji endogennych [65, 95]. Podobne badania prowadzono dla ty-toniu [12, 88, 92], soi [19], kukurydzy [83] czy petunii [58] (tab. 1).

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 709

RYCINA 2. Schemat trzech nukleaz miejscowo-specyficznych: (A) Para nukleaz z motywem palca cynkowego związana z DNA. Odpowiednio F1, F2, F3 oznaczają pojedyncze moduły, każdy wiążący 3 nukleotydy; Kolorem fioletowym oznaczono domeny nacinające DNA (FokI); (B) Para monomerów TALEN, każdy zbudowany z 16-17 modułow. Czterema kolorami oznaczono indywidualne moduły charakterystyczne dla każdej zasady azotowej. Kolorem fioletowym oznaczono domeny nacinające DNA (FokI); (C) System CRISPR/Cas zawierający nukleazę Cas9 oraz chimerę RNA zbudowaną z komplementarnego jednoniciowego RNA (guided RNA) [wg 13, 15, 67, zmienione]FIGURE 2. Schematic representation of three site-specific nucleases: (A) Pair of ZFNs bound to DNA. Individual modules (F1, F2, F3) recognize and bind three nucleotides of the targeted sequence; FokI cleavage domains are shown as purple elipsas; (B) Pair of transcription activator-like effector nucleases (TALENs) containing 16-17 individual modules, each one binds a single base pair (shows as four colors), FokI cleavage domains are shown as purple elipsas; (C) The CRISPR/Cas system build of single endonuclease, Cas9 and a complementary single-strand guided RNA [acc. to 13, 15, 67, changed]

710 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

NUKLEAZY TALE

Pomimo rosnącego zainteresowania nukleazami z motywem palca cynkowego oraz prac prowadzonych nad tym systemem od 1996 r., możliwości ukierunkowa-nej mutagenezy są nadal ograniczone. W przełomowych badaniach grupy Bonas [9, 45] został opisany sposób w jaki patogeniczne bakterie z rodzaju Xantomonas infekując roślinę, dostarczają na teren komórki egzogenne białka tzw. czynniki ak-tywujące transkrypcję. TALEs są naturalnie występującymi białkami, które zawie-rają domenę wiążącą się z różnymi roślinnymi promotorami. Wywołują choroby u wielu gatunków roślin m.in. u ryżu czy bawełny [82]. Naturalny proces polega na rozpoznaniu poprzez odpowiednie domeny docelowej sekwencji DNA w geno-mie gospodarza oraz aktywacji ekspresji genów niezbędnych dla rozprzestrzeniania oraz namnażania się patogenu [9, 10, 31].

TALEN, czyli nukleazy powstałe w wyniku dodania domeny nukleolitycznej do domeny wiążącej DNA, konstruowane są jako dimery, podobnie jak ZFN. Charakte-ryzują się znacznie prostszą budową elementów wiążących DNA, co przekłada się na łatwość ich modyfikacji. Wykazują specyficzne cechy strukturalne, w tym sekwencję odpowiadającą za sekrecję typu III oraz translokację sygnałów w regionie N-końco-wym, sygnał lokalizacji jądrowej (ang. Nuclear Localization Signal, NLS), kwasową domenę aktywacji transkrypcji na końcu -C oraz centralną domenę wiążącą DNA. Domena wiążąca DNA może być różnej długości i składa się z 13 do 30 wysoce konserwowanych modułów (ryc. 2B). Każdy moduł odpowiada za rozpoznanie oraz wiązanie jednego, konkretnego nukleotydu. Specyficzność wiązania DNA wynika z obecności pojedynczych polimorfizmów pomiędzy 12 a 13 resztą aminokwasową sekwencji modułów. Polimorficzne składowe białka TALE określa się, jako odrębne powtarzalne zmienne (ang. Repeat-Variable Diresidue, RVD). Można wyróżnić pra-wie 20 modułów RVD, jednak cztery z nich: HD (rozpoznający cytozynę), NG (roz-poznający tyminę), NI (rozpoznający adeninę) oraz NN (rozpoznający guaninę i ade-ninę), są najczęściej wykorzystywane na etapie projektowania nukleaz [60, 62, 85].

Odkrycie systemu bakteryjnego regulującego ekspresję genów eukariotycznych szybko stało się przełomowe dla postępu mutagenezy ukierunkowanej roślin. Po-czątkowo opisywano mechanizm działania nukleaz TALE u modelowych gatunków zwierząt. Jednak zaledwie w ostatnich kilku latach opisano efektywność tego podej-ścia do modyfikacji genomów roślinnych m.in. u rzodkiewnika [14, 51], tytoniu [57, 97], ryżu [52, 80] oraz kłosownicy [80] (tab. 1).

SYSTEM CRISPR/CAS9

W ostatnim czasie opisano nowy sposób ukierunkowanej mutagenezy wyko-rzystujący system CRISPR/Cas, który jest rodzajem mechanizmu odpornościowe-go występującego u bakterii np. Streptococcus pyogenes. W genomowym locus

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 711

CRISPR kodowana jest endonukleaza Cas9. Białko to jest dużą, monomeryczną nukleazą DNA nakierowaną na sekwencję nukleotydową docelowego locus. Uda-ne rozpoznanie oraz związanie endonukleazy jest zależne od krótkiej sekwencji sąsiadującej tzw. PAM (z ang. Protospacer Adjacent Motif). Ponadto Cas9 two-rzy kompleks z dwiema małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA znanymi jako CRISPR RNA (crRNA) i transaktywujacym crRNA (tracrRNA). Jednostki RNA umożliwiają białku Cas9 rozpoznanie i przecięcie określonego miejsca w obcym, infekującym komórkę bakterii DNA np. DNA faga czy DNA plazmidowym [4, 15, 68, 74]. W 2012 roku Jinek wraz ze współpracownikami wykazali, że syn-tetyczna, jednoniciowa chimera RNA (ang. single guided RNA, sgRNA) stano-wiąca fuzję crRNA oraz tracrRNA jest tak samo funkcjonalna jak pojedyncze odpowiedniki występujące naturalnie [42]. W rezultacie, w opracowanym syste-mie CRISPR/Cas wykorzystywanym w mutagenezie występują dwie składowe: endonukleaza Cas9 oraz naprowadzające RNA (gRNA) (ryc. 2C).

Zaletą systemu CRISPR/Cas9 jest wysoka specyficzność oraz łatwość projek-towania konstruktu, zależna głównie od 20 par zasad budujących gRNA (tab. 2). Białko Cas9 nie wymaga większych zmian i sprawdziło się do tej pory w wielu testowanych systemach. Oprócz tego multipleksowanie i uzyskanie ekspresji kil-ku syntetycznych RNA w ramach jednego eksperymentu pozwala obniżyć nakła-dy finansowe i skrócić czas doświadczenia [17]. W rezultacie to właśnie system CRISPR/Cas bazujący na naturalnym systemie odpornościowym bakterii, znaj-duje największe uznanie wśród badaczy i może stać się przełomową techniką do produkcji pożądanych, nietransgenicznych odmian roślin. Po raz pierwszy w 2013 roku kilka grup badawczych przeprowadziło eksperyment na modelowych gatun-kach roślin: tytoniu [53, 63], ryżu [81] oraz rzodkiewniku [53] (tab. 1).

AKTYWNOŚĆ NIEDOCELOWA

Wszystkie opisane typy mutagenezy miejscowo specyficznej pozwalają na wprowadzenie zaplanowanych zmian w informacji genetycznej roślin. Istnie-ją jednak dane wykazujące wyjątki od swoistości zaprojektowanych nukleaz, gdzie cięcie endonukleaz nie zawsze następuje wyłącznie w określonym miejscu w genomie.

Rozważając aktywność niedocelową nukleaz należy już na etapie projekto-wania doświadczenia uwzględnić szereg czynników endogennych (epigenetyka, błędy w naprawie DNA) oraz egzogennych (budowa nukleaz, wybór metody transferu do komórki) mogących wpłynąć na skalę tego zjawiska [67]. Główna przyczyna aktywności niedocelowej SSN związana jest z brakiem specyficzne-go wiązania poszczególnych modułów lub domen białkowych enzymu z doce-lowym miejscem w genomie. Wzrost aktywności niedocelowej obserwuje się

712 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

w przypadku obecności innych sekwencji wykazujących wysoki stopień homolo-gii. Ponieważ może to doprowadzić do ewentualnych, niezamierzonych mutacji punktowych lub translokacji, pracuje się nad zwiększeniem przewidywalności doświadczenia oraz zmniejszeniem aktywności wykraczającej poza określony rejon DNA. Istotna jest znajomość mechanizmów naprawy DSB, ponieważ re-zultat docelowego cięcia, bez względu na rodzaj nukleaz, jest pośrednio zdeter-minowany przez komórkowe mechanizmy naprawy DNA. Różnią się one między organizmami, typami komórek oraz stadiami rozwojowymi organizmu [64, 66, 67]. Wpływ czynników mutagennych na cały organizm jest określany na podsta-wie testów genotoksycznych oraz cytotoksycznych. Działanie genotoksyczne to zdolność do indukowania zmian na poziomie DNA bezpośrednio przez konkretny mutagen, zarówno dla pojedynczego genu jak i całego genomu. Natomiast testy cytotoksyczne określają możliwości przeżycia komórek, zaburzenia podstawo-wych procesów komórkowych, replikacji oraz transkrypcji DNA [18, 30].

W komórkach pęknięcia podwójnej nici DNA naprawiane są relatywnie szyb-ko, często nie pozostawiając żadnych śladów lub generując indele o długości kil-ku par zasad. W kontekście całego genomu te niewielkie zmiany są trudne do zi-dentyfikowania. Inżynieria genetyczna pozwala na modyfikację enzymów do typu „nickase”, powodujących pęknięcia pojedynczej nici DNA (ang. Single-Strand Break, SSB) a nie podwójnych, jak ma to miejsce w typowej reakcji enzymatycz-nej [47, 73]. Pojedyncze pęknięcia nici DNA nie są substratami do mniej precy-zyjnego szlaku naprawy NHEJ, ale są korygowane za pośrednictwem homolo-gicznej rekombinacji tj. poprzez wycięcie uszkodzonego fragmentu oraz ligację. Zmodyfikowane białka enzymatyczne typu „nickase” stosuje się m.in. w systemie CRISPR/Cas9, w którym zmodyfikowana endonuklaza Cas9-D10A posiada poje-dynczą zmianę w sekwencji aminokwasowej [17]. Innym przykładem modyfika-cji jest opracowana w warunkach in vitro metoda wykorzystująca integrazę wek-tora lentiwirusa, która jak się okazuje jest wychwytywana oraz ligowana przez białka uczestniczące w procesie NHEJ [30].

Ponadto nukleazy, ze względu na specyfikę budowy, różnią się poziomem ak-tywności niedocelowej. Moduły wiążące TALE-DNA wykazują degenerację kodu genetycznego. Co prawda rozpoznają każdy z czterech nukleotydów, jednak mo-duł dla guaniny wykazuje również powinowactwo do adeniny. Może to prowadzić do niespecyficznego, wielokrotnego wiązania się z DNA. Stale udoskonala się narzędzia wykorzystywane podczas projektowania nukleaz TALE. Jednak w dal-szym ciągu opisano oraz zwalidowano niewiele testów jednoznacznie określa-jących wpływ niezamierzonej aktywności na cały genom, tak jak to już zostało opisane dla nukleaz z motywem palca cynkowego [61, 67]. Udoskonalenie oraz porównanie metod diagnostycznych u różnych organizmów w przyszłości po-zwoli zwiększyć specyficzność oraz precyzyjnie określić zmiany wywołane ak-tywnością niedocelową SSN.

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 713

EPIGENETYKA A AKTYWNOŚĆ NUKLEAZ

Struktura chromatyny wpływa na upakowanie oraz różnice w dostępności ge-nomowego DNA, co przekłada się na specyficzność a przy tym skuteczność nu-kleaz [5]. Przykładowo aktywność nukleaz TALE jest obniżona w obecności 5-metylocytozyny, podczas gdy nadaktywność jest obserwowana w czasie deme-tylacji w regionie cięcia. Analizy in vivo wykazały negatywną korelację pomiędzy aktywnością nukleaz TALE, a liczbą powtórzeń CpG w docelowej sekwencji [11]. Natomiast częstotliwość cięcia miejsc docelowych przez meganukleazy ulega zna-czącej poprawie po traktowaniu komórek czynnikami odpowiadającymi za roz-luźnienie chromatyny [21]. Z kolei wyciszenie genu ATF7IP, kodującego białko zaangażowane w reorganizację chromatyny, zwiększa prawdopodobieństwo wpro-wadzenia genu za pośrednictwem homologicznej rekombinacji [21, 67, 89].

Moduły rozpoznające docelowe DNA obecne w ZFN czy TALEN są zależne od czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z sekwencjami docelowymi w rejonach chromatynowych. Tym samym białka hybrydowe mogą wiązać się z gęsto upakowa-nym DNA. Wprowadzone zmiany na poziomie DNA mogą znacząco lub trwale wpły-nąć na dynamikę interakcji chromatyny, małych RNA, enzymów, a także sekwencji regulatorowych DNA. Wprowadzenie transgenu do otaczającej struktury chromatyny może wpłynąć na jej lokalne właściwości, powodując tym samym zaburzenie ekspre-sji genów sąsiadujących, oraz zmianę fenotypu otrzymanego organizmu. Nie ma jed-nak do tej pory żadnych jednoznacznych przykładów w literaturze, aby takie efekty, jeśli w ogóle występują, utrzymywały się po usunięciu transgenu [1, 67].

Dla roślin zmodyfikowanych genetycznie efekty niedocelowe, cis- czy trans-epi-genetyczne są tolerowane dzięki żmudnej, długotrwałej selekcji populacji w progra-mach hodowlanych. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych technik hodowlanych, rośliny GM z niepożądanymi cechami fenotypowymi czy niekorzystnymi efektami ubocznymi po mutagenezie, nie przechodzą etapu selekcyjnego [1, 11, 67].

TRANSFER NUKLEAZ DO ORGANIZMU

Wybór metody transferu nukleaz do organizmu często jest zależny od: koncen-tracji nukleaz w komórce, poziomu ich ekspresji, specyficzności wiązania sekwencji docelowej oraz dostępnej aparatury. Minimalizację efektów niedocelowych można uzyskać poprzez optymalizację zawartości nukleaz w komórce. Niska koncentracja powoduje iż cięcie jest wykonywane w stosunkowo krótkim czasie, co ogranicza wtórne uszkodzenia. Mutageneza ukierunkowana na ogół wymaga wprowadzenia genów kodujących nukleazy poprzez transgenezę. Jednakże transgen może zostać rozsegregowany w kolejnych pokoleniach, podczas procesu selekcji [37, 66]. Istot-nym jest, że obecność transgenu nie jest wymagana do utrzymania ulepszonej ce-

714 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

chy. Opracowano wiele metod dostarczenia nukleaz do komórki, między innymi uzyskując przejściową ekspresję z wykorzystaniem kaset ekspresyjnych opartych o promotory indukowane. Konstrukty mogą zostać wprowadzone za pomocą agro-transformacji [65, 95], z wykorzystaniem wektorów plazmidowych [39, 88, 98] czy wektorów wirusowych (lentiwirusy, wektory adenowirusowe, adenosatelitarne wektory wirusowe), które nie integrują z genomem gospodarza, a więc z perspekty-wy biobezpieczeństwa są mniej kontrowersyjne [18, 38, 69]. Wektory wirusowe po-wodujące przejściową ekspresję zastosowano między innymi u petunii. Z wiruso-wym wektorem TRV (ang. Tobacco Rattle Virus) dostarczono nukleazę z motywem palca cynkowego bez etapu transgenezy [58]. Nukleazy mogą również zostać wpro-wadzone w postaci mRNA, co omija kwestię integracji z genomem oraz skraca czas trwania ekspresji. Podejście to jest stosowane u wielu organizmów modelowych, takich jak muszka owocowa [7], danio pręgowany [28], szczur [34], królik [27] czy komórki ludzkie [99]. Nukleazy mogą zostać również wprowadzone bezpośrednio jako białko. Jednak ich wytwarzanie, izolacja oraz oczyszczanie w odpowiednich ilościach jest niezwykle trudne do osiągnięcia [71]. Niezależnie od sposobu dostar-czania, nukleazy mogą być zaopatrzone w konstytutywną lub indukowaną sekwen-cję odpowiedzialną za degradację oraz redukcję czasu półtrwania w komórce.

PODSUMOWANIE

Wprowadzenie nowych narzędzi inżynierii genetycznej w postaci nukleaz miej-scowo-specyficznych zrewolucjonizowało świat nauki. Nowe metody znacznie po-szerzyły dotychczasowe możliwości mutagenezy genomów zarówno roślinnych jak i zwierzęcych. Zmiany w strukturze DNA indukowane technikami SSN są rozpo-znawane i naprawiane przez jeden z mechanizmów naprawy DNA w komórce. Teo-retycznie nukleazy są przeznaczone do cięcia DNA w określonych miejscach, jed-nak może dojść również do cięcia w miejscach niezamierzonych. Różne strategie są wykorzystywane do zmniejszenia niezamierzonego efektu mutagenezy, w tym sto-sowanie heterodimerów czy enzymu typu „nickase” DNA. Do tej pory pozostaje do rozwiązania wiele istotnych problemów związanych ze swoistością, wydajnością oraz toksycznością stosowania SSN, zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Na ostateczny efekt niedocelowy powstały w wyniku aktywności nukleaz wpływają: specyfika wybranej metody, częstotliwość występowania miejsc homologicznych do sekwencji docelowej, czynniki endogenne (epigenetyka, wielkość genomu) oraz egzogenne (zastosowany konstrukt, optymalizacja eksperymentu).

Udoskonalenie istniejących metod SSN będzie możliwe dzięki oszacowaniu wpływu czynników transkrypcyjnych oraz rekombinaz na strukturę oraz funkcję genomu. Niewiele jest badań, które porównywałyby zastosowanie różnych nukleaz dla modyfikacji określonego endogennego locus. Takie badanie mogłoby dostar-

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 715

czyć wielu istotnych informacji, jeżeli chodzi o wybór oraz modyfikację najbardziej skutecznych oraz bezpiecznych nukleaz. Poszczególne typy SSN (meganukleazy, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) różnią się między sobą budową modułów, długością rozpoznawanej sekwencji, specyficznością oraz skalą aktywności niedocelowej i jej toksycznego wpływu na cały organizm. Miejscowo-specyficzne nukleazy stwarzają możliwość przeprowadzenia precyzyjnej korekty, wymiany lub insercji genów bez konieczności stosowania jakichkolwiek markerów selekcyjnych oraz wprowadza-nia obcego materiału genetycznego.

W dalszym ciągu wiele kwestii pozostaje bez jednoznacznej odpowiedzi. Ja-kie typy mutacji są możliwe do efektywnego wygenerowania w systemach roślin-nych? Czy zmodyfikowane zmiany w genomach są stabilne i dziedziczone? Z jaką częstotliwością występują efekty niedocelowe oraz w jaki sposób można zminima-lizować ich skutki [33]? Niewykluczone, że w przyszłości realne będzie zaplanowa-nie oraz wprowadzenie dowolnej zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA, z dużą przewidywalnością, bez niekorzystnego wpływu na organizm. Będzie to narzędzie bezpieczne, pozwalające przyspieszyć procesy selekcji oraz hodowli agronomicz-nie ważnych gatunków roślin. Komercyjne wykorzystanie produktów roślinnych otrzymanych za pośrednictwem tych technik będzie w dużej mierze uzależnione od obowiązujących regulacji prawnych.

PODZIĘKOWANIA

Praca zrealizowana w ramach tematu badawczego nr. PB 4-1-03-4-01 z funduszu Postępu Biologicznego finansowanego przez Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi

LITERATURA

[1] Allis DC, Jenuwein T, ReinbeRg D. Genetics versus epigenetics. [w] Overview and concepts. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2007; 25

[2] AnTunes Ms, sMiTh JJ, JAnTz D, MeDfoRD Ji. Targeted DNA excision in Arabidopsis by a re-engi-neered homing endonuclease. BMC Biotechnology 2012; 12: 1-12

[3] ARnoulD s, DelenDA C, gRizoT s, DesseAux C, PAques f, silvA gh, sMiTh J. The I-CreI meganuclease and its engineered derivatives: applications from cell modification to gene therapy. Protein Eng 2011; 24: 27-31

[4] bARRAngou R. CRISPR-Cas systems and RNA-guided interference. Wiley interdiscip Rev RNA 2013; 4: 267-278

[5] bell o, TiwARi vK, ToMA nh, sChubeleR D. Determinants and dynamics of genome accessibility. Nat Rev Genet 2011; 12(8): 554-564

[6] belhAJ K, ChAPARRo-gARCiA A, KAMoun s, neKRAsov v. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods 2013; 9: 39-45

[7] beuMeR K, bhATTAChARyyA g, bibiKovA M, TRAuTMAn JK, CARRoll D. Efficient gene targeting in dro-sophila with zinc-finger nucleases. Genetics 2006; 172(4): 2391-2401

716 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

[8] bhAKTA Ms, henRy iM, ousTeRouT Dg, DAs KT, loCKwooD sh, MeCKleR Jf, wAllen MC, zyKoviCh A, yu y, leo h, xu l, geRsbACh CA, segAl DJ. Highly active zinc-finger nucleases by extended mod-ular assembly. Biotechfor 2013; 23: 530-538

[9] boCh J, bonAs u. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annu Rev Phytopathol 2010; 48: 419-436

[10] bogDAnove AJ, shoRnACK s, lAhAye T. TAL effectors: finding plant genes for disease and defense. Curr Opin Plant Biol 2010; 13: 394-401

[11] bulTMAnn s, MoRbiTzeR R, sChMiDT Cs, ThAnish K, sPADA f, elsAesseR J, lAhAye T, leonhARDT h. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res 2012; 40(12): 5368-5377

[12] CAi Cq, Doyon y, Ainley wM, MilleR JC, DeKelveR RC, Moehle eA, RoCK JM, lee yl, gARRison R, sChulenbeRg l, blue R, woRDen A, bAKeR l, fARAJi f, zhAng l, holMes MC, RebAR eJ, Colling-wooD Tn, Rubin-wilson b, gRegoRy PD, uRnov fD, PeTolino Jf. Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases. Plant Mol Biol 2009; 69: 699-709

[13] CARRoll D. Genome engineer ing wit h zinc-finger nucl eases. Genet ics 2011; 188: 773-782[14] CeRMAK T, Doyle el, ChRisTiAn M, wAng l, zhAng y, sChMiDT C, bAlleR JA, soMiA nv, bogDAnove

AJ, voyTAs Df. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based con-struct for DNA targeting. Nucleic Acids Res 2011; 39: 82

[15] Chen K, gAo C. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improve-ments. Plant Cell Rep 2013; doi 10.1007/s00299-013-1539-6

[16] Chou sT, leng q, Mixson AJ. Zinc finger nucleases: tailor-made for gene therapy. Drugs Future 2012; 37(3): 183-196

[17] Cong l, RAn fA, Cox D, lin s, bARReTTo R, hAbib n, hsu PD, wu x, JiAng w, MARRAfffini lA, zhAng f. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339: 819-823

[18] CoRnu Ti, ThiboDeAu-begAnny s, guhl e, Alwin s, eiChTingeR M, Joung JK. DNA-binding specific-ity is a major determinant of the activity and toxicity of zinc-finger nucleases. Mol Ther 2008; 16(2): 325-358

[19] CuRTin sJ, zhAng f, sAnDeR JD, hAun wJ, sTARKeR C, bAlTes nJ, Reyon D, DAhlboRg eJ, gooDwin MJ, CoffMAn AP, Dobbs D, Joung JK, voyTAs Df, sTuPAR RM. Targeted mutagenesis of duplicated genes in soybean with zinc-finger nucleases. Plant Physiol 2011; 156: 466-473

[20] De PATeR s, neuTebooM lw, PinAs Je, hooyKAAs PJJ, vAn DeR zAAl bJ. ZFN-induced mutagenesis and gene-targeting in Arabidopsis through Agrobacterium-mediated floral dip transformation. Plant Biotechnol J 2009; 7: 821-835

[21] DelACoTe f, PeRez C, guyoT v, MiKonio C, PoTRel P, CAbAniols JP, DelenDA C, PAques f, DuChATeAu P. Identification of genes regulating gene targeting by a high-throughput screening approach. J Nucleic Acids 2011; doi:10.4061/2011/947212

[22] D’hAlluin K, vAnDeRsTRAeTen C, hulle J, RosolowsKA J, bRAnDe i, PennewAeRT A, DhonT K, bossuT M, JAnTz D, RuiTeR R, bRoADhvesT J. Targeted molecular trait stacking in cotton through targeted dou-ble-strand break induction. Plant Biotechnol J 2013; 11: 933-41

[23] DuAn x, giMble fs, quioCho fA. Crystal structure of PI-SceI, a homing endonuclease with protein splicing activity. Cell 1997; 89: 555-564

[24] eKlunD Jl, ulge uT, eAsTbeRg J, MonnAT RJ. Altered target site specificity variants of the I-Ppol His-Cys box homing endonuclease. Nucleic Acids Res 2007; 35(17): 5839-5850

[25] esvelT KM, wAng hh. Genome-scale engineering for systems and synthetic biology. Mol Syst Biol 2013; 9 doi:10.1038/msb.2012.66

[26] feng z, zhAng b, Ding w, liu x, yAng Dl, wei P, CAo f, zhu s, zhAng f, MAo y, zhu JK. Efficient genome editing in plants using CRISPR/Cas system. Cell Res 2013; 23: 1229-1232

[27] flisiKowsKA T, ThoRey is, offneR s, Ros f, lifKe v, zeiTleR b, RoTTMAnn o, vinCenT A, zhAng l, JenKins s, nieRsbACh h, King AJ, gRegoRy PD, sChnieKe Ae, PlATzeR J. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE 2011; 6(6): e21045

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 717

[28] foley Je, MAeDeR Ml, PeARlbeRg J, Joung JK, PeTeRson RT, yeh JR. Targeted mutagenesis in zebraf-ish using customized zinc finger nucleases. Nat Protoc 2009; 4(12): 1855-1867

[29] fu f, sAnDeR JD, MAeDeR M, ThiboDeAu-begAnny s, Joung JK, Dobbs D, MillleR l, voyTAs Df. Zinc finger database (ZiFBD): a repository for information on C2H2 zinc fingers and engineered zinc-finger arrays. Nucleic Acids Res 2009; 37: 279-283

[30] gAbRiel R, loMbARDo A, ARens A, MilleR JC, genovese P, KAePPel C. An unbiased genome ge-nome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol 2011; 29(9): 816-823

[31] gAJ T, geRsbACh CA, bARbAs iii Cf. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engi-neering. Trends Biotechnol 2013; 31(7) 397-402

[32] gAo h, sMiTh J, yAng M, Jones s, DJuKAnoviC v, niCholson Mg, wesT A, biDney D, fAlCo sC, JAnTz D, lyzniK lA. Heritable targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease. The Plant J 2010; 61: 176-187

[33] gAo y, zhAo y. Specific and heritable gene editing in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014; 111(12): 4357-4358

[34] geuRTs AM, CosT gJ, fReyveRT y, zeiTleR b, MilleR JC, Choi vM, JenKins ss, wooD A, Cui x, Meng x, vinCenT A, lAM s, MiChAlKiewiCz M, sChilling R, foeCKleR J, KAllowAy s, weileR h, MenoReT s, Anegon i, DAvis gD, zhAng l, RebAR eJ, gRegoRy PD, uRnov fD, JACob hJ, buelow R. Knockout rats produced using deisgned zinc finger nucleases. Science 2009; 325(5939): 433

[35] guRushiDze M, hensei g, hieKel s, sCheDel s, vAlKov v, KuMlehn J. True-breeding targeted gene knock-out in barley using designer TALE-nuclease in haploid cells. PLoS ONE 2014; 9(3): 92046-54

[36] hACKeTT Pb, soMiA nv. Delivering the second revolution in site-specific nucleases. Elife 2014; 8 doi 10.7554/eLife.01911

[37] hoheR T, wAllACe l, KhAn K, CAThoMen T, ReiChelT J. Highly efficient zinc-finger nuclease-mediated distruption of an eGFP transgene in keratinocyte stem cells without impairment of stem cell proper-ties. Stem Cell Rev and Rep 2012; 8: 426-434

[38] holKeRs M, MAggio i, liu J, JAnssen JM, Miselli f, Mussolino C, ReCChiA A, CAThoMen T, gon-CAlves MAfv. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Nucleic Acids Res 2013; doi:10.1093/nar/gks1446

[39] holT n, wAng J, KiM K, fRieDMAn g, wAng x, TAuPin v, CRooKs gM, Kohn Db, gRegoRy PD, holMes MC, CAnnon PM. Zinc finger nuclease-mediated CCR5 knockout hematopoietic stem cell tran-plantation controls HIV-1 in vivo. Nat Biotechnol 2010; 28(8): 839-84

[40] JACquieR A, DuJon b. An intron-encoded protein is active in a gene conversion process that spreads an intron into a mitochondrial gene. Cell 1985; 41: 3830394

[41] JiAng w, zhou h, bi h, fRoMM M, yAng b, weeKs DP. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-medi-ated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res 2013; 41(20): 188-198

[42] JineK M, ChylinsKi K, fonfARA i, hAueR M, DouDnA JA, ChARPenTieR e. A pogrammable du-al-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337: 816-821

[43] JuRiCA ns, MonnAT RJ, sToDDARD bl. DNA recognition and cleavage by the LAGLIDADG homing endonuclease I-CreI. Mol Cell 1998; 2(4): 469-476

[44] KAKARougKAs A, Jeggo PA. DNA DSB repair pathway choice: an orchestrated handover mechanism. Br J Radiol 2014; doi: bjr.birjournals.org/cgi/reprint/bjr.20130685v3

[45] KAy s, bonAs u. How Xantomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol 2009; 12: 37-43

[46] KiM s, KiM Js. Targeted genome engineering via zinc finger nucleases. Plant Biotechnol Rep 2011; 5: 9-17

[47] KiM e, KiM s, KiM Dh, Choi bs, Choi iy, KiM Js. Precision genome engineering with programmable DNA-nicking enzymes. Genome Res 2012; 22: 1327-1333

[48] KleinsTiveR bP, wolfs JM, eDgell DR. The monomeric GIY-YIG homing endonuclease I-Bmol uses a molecular anchor and a flexible tether to sequentially nick DNA. Nucleic Acids Res 2013; 41(10): 5413-5427

718 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

[49] KuiJPeRs ngA, ChRouMPi s, vos T, solis-esCAlAnTe D, bosMAn l, PRonK JT, DARAn JM, DA-RAn-lAPuJADe P. One-step assembly and targeted integration of multigene constructs assisted by the I-SceI meganuclease in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 2013; 13(8): 769-781

[50] lAgAneCKAs M, MARgeleviCius M, venClovAs C. Identification of new homologs of PD-(D/E)XK nu-cleases by support vector machines traned on data derived from profile-profile alignments. Nucleic Acids Res 2010; 39(4): 1187-96

[51] li l, PiATeK MJ, ATef A, PiATeK A, wibowo A, fAng x, sAbiR Js, zhu JK, MAhfouz MM. Rapid and highly efficient construction of TALE-based transcirptional regulators and nucleases for genome modification. Plant Mol Biol 2012a; 78: 407-416

[52] li T, liu b, sPAlDing Mh, weeKs DP, yAng b. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. J Genet Genomics 2012b; 39: 209-215

[53] li Jf, noRville Je, AACh J, MCCoRMACK M, zhAng D, bush J, ChuRCh gM, sheen J. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana us-ing guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol 2013; 31: 688-691

[54] li y, ReynolDs P. o’neill P, CuCinoTTA fA. Modeling damage complexity-dependent non-homologous end-joining repair pathway. PLOS One 2014; doi:10.1371/journal.pone.0085816

[55] llyoD A, PlAisieR Cl, CARRoll D, DRews gn. Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. PNAS 2005; 102(6): 2232-2237

[56] lusseR M, PARisi C, PlAn D, RoDRiquez-CeRezo e. Deployment of new biotechnologies in plant breed-ing. Nature Biotechnol 2012; 30: 231-239

[57] MAhfouz MM, li l, shAMiMuzzAMAn M, wibowo A, fAng x, zhu JK. De novo-engineered trann-scription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks. Proc Natl Acad Sci 2011; 108: 2623-2628

[58] MARTon i, zuKeR A, shKlARMAn e, zeevi v, TovKACh A, Roffe s, ovADis M, TzfiRA T, vAinsTein A. Nontransgenic genome modification in plant cells. Plant Physiol 2010; 154: 1079-1087

[59] MiAo J, guo D, zhAng J, huAng q, gin g, zhAng x, wAn J, gu h, qu lJ. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res 2013; 23: 1233-36

[60] MilleR JC, TAn s, qiAo g, bARlow KA, wAng J, xiA Df, Meng x, PAsChon De, leung e, hinKley sJ, DulAy gP, huA Kl, AnKouDinovA i, CosT gJ, uRnov fD, zhAng hs, holMes MC, zhAng l, gRegoRy PD, RebAR eJ. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 2011; 29: 143-148

[61] Mussolino C, MoRbiTzeR R, luTge f, DAnneMAnn n, lAhAye T, CAThoMen T. A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity. Nucleic Acids Res 2011; 39(21): 9283-9293

[62] Mussolino C, CAThoMen T. TALE nucleases: tailored genome engineering made easy. Curr Opin Bio-technol 2012; 23: 644-650

[63] neKRAsov v, sTAsKAwiCz b, weigel D, Jones JD, KAMoun s. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 2013; 31: 691-693

[64] olsen PA, solhAug A, booTh JA, gelAzAusKAiTe M, KRAuss s. Cellular responses to targeted genomic sequence modification using single-stranded oligonucleotides and zinc-finger nucleases. DNA Repair 2009; 8298-82308

[65] osAKAbe K, osAKAbe y, ToKi s. Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases. PNAS 2010; 107(26): 12034-12039

[66] PATTAnAyAK v, RAMiRez Cl, Joung JK, liu DR. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-fin-ger nucleases by in vitro selection. Nat Methods 2011; 8(9): 765-770

[67] PAuwels K, PoDevin n, bReyeR D, CARRoll D, heRMAn P. Engineering nucleases for gene targeting: safety and regulatory considerations. New biotechnology 2013; 31(1) 18-25

[68] Pennisi e. The CRISPR cr aze. Science 2013; 341: 833-836[69] PeRez ee, wAng J, MilleR JC, JouvenoT y, KiM KA, liu o, wAng n, lee g, bARTseviCh vv, lee yl,

gusChin Dy, RuPniewsKi i, wAiTe AJ, CARPeniTo C, CARRoll Rg, oRAnge Js, uRnov f, RebAR eJ, AnDo D, gRegoRy PD, Riley Jl, holMes MC, June Ch. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 2008; 26(7): 808-816

[70] PoDevin n, DAvies hv, hARTung f, nogue f, CAsACubeRTA JM. Site-directed nucleases: a paradigm shift in predictable, knowledge-based plant breeding. Trends Biotechnol 2013; 31: 375-383

MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 719

[71] PRueTT-MilleR sM, ReADing Dw, PoRTeR sn, PoRTeus Mh. Attenuation of zinc finger nuclease toxici-ty by small-molecule regulation of protein levels. PLoS Genet 2009; 5(2): e1000376

[72] PuChTA h, fAuseR f. Gene targeting in plants: 25 years later. Int J Dev Biol 2013; 57: 629-637[73] RAMiRez Cl, CeRTo MT, Mussolino C, gooDwin MJ, CRADiCK TJ, MCCAffRey AP, CAThoMen T, sChA-

RenbeRg AM, Joung JK. Engineered zinc finger nickases induce homology-directed repair with reduced mutagenic effects. Nucleic Acids Res 2012; 40: 5560-5568

[74] RiChTeR h, RAnDAu l, PlAgens A. Exploiting CRISPR/Cas: interference mechanisms and applications. Int J Mol Sci 2013; doi:10.3390/ijms140714518

[75] RobeRTs JR, belfoRT M, besToR T, bhAgwAT As, biCKle TA, biTinAiTe J, bluMenThAl RM, Deg-TyARev sK, DRyDen DTf, Dybvig K, fiRMAn K, gRoMovA es, guMPoRT Ri, hAlfoRD se, hATTMAn s, heiTMAn J, hoRnby DP, JAnulAiTis A, JelTsCh A, JosePhsen J, Kiss A, KlAenhAMMeR TR, KobAyAshi i, Kong h, KRugeR Dh, lACKs s, MARinus Mg, MiyAhARA M, MoRgAn RD, MuRRAy ne, nAgARAJA v, PieKARowiCz A, PingouD A, RAleigh e, RAo Dn, ReiCh n, RePin ve, selKeR eu, shAw PC, sTein DC, sToDDARD bl, szybAlsKi w, TRAuTneR TA, vAn eTTen Jl, viToR JMb, wilson gg, xu sy. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res 2003; 31(7): 1805-1812

[76] sAnDeR JD, DAhlboRg eJ, gooDwin MJ, CADe l, zhAng f, CifuenTes D, CuRTin sJ, blACKbuRn Js, ThiboDeAu-begAnny s, qi y, PieRiCK CJ, hoffMAn e, MAeDeR Ml, KhyATeR C, Reyon D, Dobbs D, lAngenAu DM, sTuPAR RM, giRAlDez AJ, voyTAs Df, PeTeRson RT, yeh JR, Joung JK. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA). Nat Methods 2011; 8: 67-69

[77] sAnDeR JD, MAeDeR Ml, Joung JK. Engineering designer nucleases with customized cleavage specifi-cities. Curr Protoc Mol Biol 2011; doi:10.1002/0471142727.mb1213s96

[78] sAnDeR JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Bio-technol 2014; 32(4): 347-352

[79] seligMAn lM, ChisholM KM, ChevAlieR bs, ChADsey Ms, eDwARDs sT, sAvAge Jh, veilleT Al. Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease. Nucleic Acids Res 2002; 30(17): 3870-3879

[80] shAn q, wAng y, Chen K, liAng z, li J, zhAng y, zhAng K, liu J, voyTAs Df, zheng x, zhAng y, gAo C. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Mol Plant 2013a; 6(4): 1365-1368

[81] shAn q, wAng y, li J, zhAng y, Chen K, liAng z, zhAng K, liu J, xi JJ, qiu Jl, gAo C. Targeted genome modification of crop plants using a CRISP-Cas system. Nat Biotechnol 2013b; 31: 686-688

[82] shoRnACK s, MosCou MJ, wARD eR, hoRvATh DM. Engineer ing pl ant disease r esistance based on TAL effectors. Annu Rev Phytopathol 2013; 51: 383-406

[83] shuKlA vK, Doyon y, MilleR JC, DeKelveR RC, Moehle eA, woRDen se, MiTChell JC, ARnolD nl, goPAlAn s, Meng x, Choi vM, RoCK JM, wu yy, KATibAh ge, zhifAng g, MCCAsKill D, siMPson MA, blAKeslee b, gReenwAlT sA, buTleR hJ, hinKley sJ, zhAng l, RebAR eJ, gRegoRy PD, uRnov fD. Pr ecise genome modificat ion in t he cr op species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature 2009; 459: 437-440

[84] sTeCzKiewiCz K, MuszewsKA A, KnizewsKi l, RyChlewsKi l, ginAlsKi K. Sequence, structure and functional diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterase superfamily. Nucleic Acids Res 2012; 40(15): 7016-41

[85] sTReubel J, bluCheR C, lAnDgRAf A, boCh J. TAL effector RVD specificities and efficiencies. Nat Biotechnol 2012; 30: 593-595

[86] sussMAn D, ChADsey M, fAuCe s, engel A, bRueTT A, MonnAT R JR, sToDDARD bl, seligMAn lM. Isolation and characterization of new homing endonuclease specificities at individual target site position. J Mol Biol 2004; 342: 31-41

[87] ThoMPson AJ, yuAn xq, KuDliCKi w, heRRin Dl. Cleavage and recognition pattern of a double-strand-specific endonuclease (I-CreI) encoded by the chloroplast 23S-ribosomal-RNA intron of Chlamydo-monas reinhardtii. Gene 1992; 119(2): 247-251

[88] TownsenD JA, wRighT DA, winfRey RJ, MoRgAn ff, MAeDeR Ml, Joung JK, voyTAs Df. High frequ-ency modification of plant genes using engineered zinc finger nucleases. Nature 2009; 459(7245): 442-445

720 P. SEGA, A. LINKIEWICZ

[89] vAlTon J, DuPuy A, DAboussi f, ThoMAs s, MAReChAl A, MACMAsTeR R, MelliAnD K, JuileRAT A, DuChATeAu P. Overcoming transcription activator-like effector (TALE) DNA binding domain sensivity to cytosine methylation. J Biol Chem 2012; 287(46): 38427-38432

[90] voyTAs Df. Plant genome engineering with sequence-specific nucleases. Annu Rev Plant Biol 2013; 64: 327-350

[91] wenDT T, holM Pb, sTARKeR Cg, ChRisTiAn M, voyTAs Df, bRinCh-PeDeRsen h, holMe ib. TAL effector nucleases induce mutations at a pre-selected location in the genome of primary barley transfor-mants. Plant Mol Biol 2013; 83: 279-85

[92] wRighT DA, TownsenD JA, winfRey JR RJ, iRwin PA, RAJAgoPAl J, lonosKy PM, hAll Db, JonDle MD, voyTAs Df. High-frequency homologous recombination in plants mediated by zinc-finger nucle-ases. Plant J 2005; 44: 693-705

[93] wyMAn C, KAnAAR R. DNA double-strand break repair: all’s well that ends well. Annu Rev Genet 2006; 40: 363-383

[94] xu s, Kuzin AP, seeThARAMAn J, guTJAhR A, ChAn s, Chen y, xiAo R, ACTon Tb, MonTelione gT, Tong l. Structure determination and biochemical characterization of a putative HNH endonuclease from Geobacter metallireducens GS-15. PLoS One 2013; doi:10.1371/journal.pone.0072114

[95] zhAng f, MAeDeR Ml, ungeR-wAllACe e, hoshAw JP, Reyon D, ChRisTiAn M, li x, PieRiCK CJ, Do-bbs D, PeTeRson T, Joung JK, voyTAs Df. High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases. PNAS 2010; 107(26): 12028-12033

[96] zhAng f, voyTAs Df. Targeted mutagenesis in Arabidopsis using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol 2011; 701: 167-177

[97] zhAng y, zhAng f, li x, bAlleR JA, qi y, sTARKeR Cg, bogDAnove AJ, voyTAs Df. Transcr ipt ion activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering. Plant Physiol 2013; 161: 20-27

[98] zou J, MAeDeR Ml, MAli P, PRueTT-MilleR s, ThiboDeAu-begAnny s, Chou bK, Chen g, ye z, PARK ih, DAley gq, PoRTeus Mh, Joung JK, Cheng l. Gene targeting of a disease-related gene in human induced plutipotent stem and embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2009; 5(1): 97-110

[99] zou J, sweeney Cl, Chou bK, Choi u, PAn J, wAng h, Dowey sn, Cheng l, MAleCh hl. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease–mediated safe harbor targeting. Blood 2011; 117(21): 5561-5572

[100] Recent patent applications in CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnol 2014; 32(4): 334 doi:10.1038/nbt.2883

Redaktor prowadzący – Michał Nowicki

Otrzymano: 27.05.2014Przyjęto: 10.08.2014Anna Linkiewicz, Laboratorium Kontroli GMO, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowietel.: (22) 733 45 17fax: 22 733 46 81e-mail: a.linkiewicz@ihar.edu.pl