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MANUALE D’USO
“ Genikon” (Cariotipizzazione, FISH analisi, C.G.H. ,Multiplex Fish, Spot Counting, Ricercatore metafasi )
“Dicembre 2013 ”
Prodotto: Genikon
Genikon è costruito e distribuito da:
Nikon Instruments S.p.A.
Tel. 055/300951 Fax 055/300995
SCOPO DI UTILIZZO: PER RICERCA E NON PER APPLICAZIONI IN ROUTINE
Le informazioni contenute all’interno di questo manuale sono soggette a variazioni senza preavviso.
Nessuna parte di questo manuale può essere copiata, distribuita o trasmessa senza il consenso di Nikon
Instruments S.p.A.
Versione: 3.8
Via di San Quirico N.300 - Campi Bisenzio (Firenze)www.genikon.it
Copyright: 2013 Nikon Instruments S.p.A
Genikon
SOMMARIO
1 INTRODUZIONE AL SISTEMA 1-1
1.1 Hardware 1-1
1.2 Software 1-1
2 INTRODUZIONE ALLA SICUREZZA 2-1
2.1 La figura dell’ “Amministratore” 2-1
3 AVVIO DEL PROGRAMMA 3-1
3.1 “Login” 3-1
3.1.1 Primo accesso 3-1
3.1.2 Registrazione di un archivio 3-1
3.2 Il mouse di Genikon 3-3
3.2.1 Il tasto centrale 3-3
3.2.2 Il tasto sinistro 3-3
3.2.3 Il destro del mouse 3-8
3.3 Gestione degli utenti 3-9
3.4 Chiusura del programma 3-10
4 AMBIENTE PRINCIPALE 4-1
4.1 Gestione dei casi 4-1
4.1.1 Caso corrente 4-2
4.1.2 Mostra la lista dei casi 4-3
4.1.3 Creazione di un nuovo caso 4-5
4.1.4 Modifica del nome del caso 4-8
4.1.5 Eliminazione di un caso 4-8
4.1.6 Ricerca di un caso 4-8
4.1.7 Scheda paziente (scheda esame). 4-9
4.1.8 Elenco dei vetrini 4-11
4.1.9 Elenco delle cellule 4-11
4.1.10 Immagini 4-13
4.2 Unità Rimovibili 4-15
4.2.1 Definizione delle unità rimovibili 4-15
4.2.2 Archiviazione di un caso 4-17
4.2.3 Ripristino dei casi da Unità rimovibile 4-20
4.2.4 Esportazione di un caso 4-21
4.2.5 Importazione di casi da Archiviazione 4-22
4.3 Gestione immagini 4-25
5 ACQUISIZIONE IMMAGINI 5-29
5.1 Come si “fotografano” nuove cellule 5-30
5.2 Scelta della modalità di lavoro 5-31
5.3 Setup della telecamera 5-32
5.4 Acquisizione di una nuova immagine 5-34
5.5 Acquisizione immagini da telecamere ad alta riso luzione 5-35
5.6 Sottrazione del fondo dalle immagini acquisite 5-36
5.6.1 Soglia manuale 5-37
5.6.2 Soglia automatica con contrasto 5-40
5.6.3 Soglia automatica Adattiva 5-41
5.7 Fusione di cromosomi esterni al campo 5-43
5.8 Controllo automatico del fuoco sull’immagine 5-44
6 ANALISI ED ELABORAZIONE DELLE IMMAGINI 6-1
6.1 Ambiente d’Analisi delle metafasi 6-1
6.1.1 Conta dei cromosomi 6-2
6.1.2 Appaiamento degli omologhi 6-2
6.2 Ambiente di Elaborazione 6-3
6.2.1 Gestione immagini in Ambiente d’Elaborazione 6-4
6.2.2 Toolbar d’elaborazione dei cromosomi 6-5
6.2.3 Identificazione delle strutture sulla metafase e\o sul cariotipo 6-6
6.2.4 Selezione e deselezione di cromosomi 6-7
6.2.5 Pseudocolore 6-8
6.2.6 Separazione di cromosomi uniti 6-9
6.2.7 Unione di frammenti di cromosoma 6-14
6.2.8 Funzione unione oggetti rapida 6-15
6.2.9 Selezione di tutte le strutture 6-15
6.2.10 Deselezione di tutte le strutture 6-15
6.2.11 Eliminazione di strutture 6-16
Genikon
6.2.12 Ripristino di una struttura eliminata 6-16
6.2.13 Correzione sfondo e luminosità 6-16
6.2.14 Funzione di affinamento dei contorni 6-17
6.2.15 Ripristino dei cromosomi 6-18
6.2.16 Profilo 6-18
6.2.17 Ideogrammi di confronto 6-18
6.2.18 Aggiustamento dimensione ideogrammi a cromosomi 6-23
6.2.19 “Undo” 6-23
6.2.20 Salvataggio 6-24
6.2.21 Uscita dall’ambiente d’elaborazione 6-24
6.2.22 Creazione e modifica del cariotipo 6-24
6.2.23 Formato del cariotipo e posizione dei centromeri 6-26
6.2.24 Modifica dei cromosomi 6-27
6.2.23 Ritocco dei cromosomi 6-28
6.2.26 Conteggio delle bande 6-28
6.2.27 Aggiunta di testo e frecce 6-29
6.2.28 Creazione d’immagini “composizione” 6-29
6.2.29 Confronto tra omologhi 6-30
6.2.30 Raddrizzamento di un cromosoma 6-31
7 ANALISI IN FISH 7-1
7.1 Acquisizione d’immagine in FISH 7-1
7.1.1 Creazione della lista d’acquisizione dei fluorocromi 7-1
7.1.2 Creazione nuovi fluorocromi 7-2
7.1.3 Trasferimento fluorocromi alla lista 7-3
7.1.4 Memorizzazione della lista dei fluorocromi 7-4
7.1.5 Acquisizione dei fluorocromi 7-5
7.2 Sottrazione della soglia per immagini Fish 7-7
7.2.1 Zone di interesse 7-7
7.3 Acquisizione 3D focus in Fish 7-11
7.4 Analisi della FISH 7-15
7.5 Selezione delle motorizzazioni 7-18
7.6 Valutazione dell’intensità delle fluorescenze 7-19
8 CGH 8-1
8.1 Introduzione 8-1
8.2 Acquisizione immagini in CGH 8-2
8.3 Sottrazione della soglia in CGH 8-2
8.4 Aggiustamento dello shift 8-3
8.5 Parametri di controllo per Acquisizione in CGH 8-4
8.6 Elaborazione d’immagini in CGH 8-5
8.7 Analisi dei risultati in CGH 8-6
8.8 Interpretazione dei profili 8-11
9 ANALISI IN MULTIPLEX FISH 9-1
9.1 Acquisizione d’immagini in Multiplex 9-1
9.1.1 Definizione della lista dei fluorocromi e della mappa associata 9-1
9.2 Acquisizione dei fluorocromi 9-4
9.3 Elaborazione ed analisi Multiplex FISH 9-6
9.4 Analisi dei singoli cromosomi in MFISH 9-11
10 IDEOGRAMMI 10-1
10.1 Anomalie 10-1
10.1.1 Editing anomalie 10-2
10.1.2 Archiviazione anomalie 10-3
11FOGLIO DI LAVORO 11-1
12STAMPA IMMAGINI E DATI 12-1
12.1 Finestra di controllo 12-1
12.2 Come creare un nuovo Layout di stampa 12-1
12.2.1 Barra delle funzioni 12-2
12.2.2 Barra di stato 12-9
12.2.3 Righello e linee guida 12-10
12.2.4 Gestione delle immagini del report 12-10
13PERSONALIZZAZIONE DELL’ARCHIVIO 13.1
14EDITOR DI SPECIE 14.1
Genikon
14.1 Creazione di una nuova specie 14-2
14.2 Disegno del “Formato” del cariotipo 14-2
14.2.1 Come posizionare una classe all’interno dell’area di lavoro 14-2
14.2.2 Rimozione di una classe dall’area di lavoro 14-2
14.2.3 Raggruppamento di classi 14-3
14.3 Caricamento di una specie 14-3
14.4 Cancellazione di una specie 14-3
14.5 Uscita 14-3
15OPZIONI 15-1
15.1 Generale (impostazioni) 15-1
15.1.1 Posizione del server 15-2
15.1.2 Specie di appartenenza dei nuovi casi 15-2
15.2 Impostazioni per l’ambiente principale 15-2
15.3 Impostazioni per l’Acquisizione 15-3
15.3.1 “Telecamera principale” 15-3
15.3.2 “Ruota fitri” 15-4
15.3.3 Microscopio motorizzato 15-6
15.3.4 Configurazione filtri dei microscopi 15-6
15.3.5 Configurazione ruota filtri 15-8
15.3.6 Tavolini motorizzati 15-10
15.3.7 Soglia adattiva ed informazioni su singola cellula 15-10
15.4 Impostazioni di visualizzazione 15-11
15.5 Personalizzazione dei colori 15-19
16COMANDI DA TASTIERA 16-1
16.1 Associazione di funzioni a tastiera 16-1
16.2 Modifica di una combinazione 16-2
16.3 Eliminazione di una combinazione 16-2
16.4 Eliminazione di tutte le combinazioni impostate 16-3
16.5 Memorizzazione e richiamo di impostazioni prede finite 16-3
16.6 Memorizzazione di un elenco di impostazioni 16-3
16.7 Richiamo dell’elenco di impostazioni 16-3
16.8 Impostazioni per la stampa dei report 16-3
16.9 Impostazione per l’esecuzione di macro 16-4
17MACROROUTINE 17-5
17.1 Creazione della macroroutine 17-5
17.2 Nomina della macroroutine 17-5
17.3 Memorizzazione della macroroutine 17-6
17.4 Associazione di una macro a tastiera 17-6
18SPOT COUNTING 18-1
18.1 Archivio 18-1
18.2 Ambiente di Acquisizione immagini 18-3
18.3 Calibrazione del sistema 18-4
18.4 Definizione del tipo di analisi 18-7
18.5 Inizio della scansione 18-8
18.6 Elaborazione 18-9
19RICERCATORE DI METAFASI 18-1
20RIEPILOGO 20-1
20.1 Procedura di Acquisizione - Analisi - Elaborazione 20-1
20.2 Funzioni accessibili tramite Menu 20.2
19.1 19-1/20
Genikon
1-1
1 Introduzione al sistema
Genikon utilizza come sistema operativo Microsoft® Windows® 98, NT, 2000, XP. Per
eventuali informazioni relative al sistema operativo è possibile utilizzare la “guida in linea”
(da “Start” in basso a sinistra del monitor scegliere “Guida in linea”)
1.1 Hardware
Genikon è costituito da un computer, monitor, scheda di acquisizione, tastiera, mouse (a
tre tasti funzione che illustreremo in seguito), telecamera (differente secondo le
applicazioni), supporto per archivio (alternativo al disco rigido), stampante ed altre varie
periferiche °(tavolini motorizzati, ruote filtri..
Il microscopio è collegato mediante un adattatore passo C alla telecamera.
Le immagini che osserviamo al microscopio passano alla telecamera ed il segnale
analogico viene digitalizzato mediante la scheda di acquisizione collocata all’interno del
computer; nel caso di camere digitali non sono necessarie schede di acquisizione.
Genikon lavora in Campo chiaro(GTG), Fluorescenza (QFQ), FISH, MULTIPLEX FISH e
C.G.H.. Per le applicazioni in campo scuro è sempre buona norma accendere prima la
fluorescenza del microscopio e poi il PC, il monitor e le altre periferiche (stampanti). Per
quanto riguarda la chiusura non esiste invece una particolare sequenza.
1.2 Software
Genikon è costituito da un software principale che può essere integrato con più moduli
opzionali, in modo da soddisfare ogni tipo di applicazione. I moduli opzionali sono riportati
in Tabella 1.1.
Modulo Nome Descrizione
A Archivio Memorizzazione casi su un archivio centrale
B Acquisizione Possibilità di acquisire immagini dal microscopio
C Alta risoluzione Acquisizione in alta risoluzione
D Software per PGD Acquisizione secondo la tecnica PGD
E Cariotipo manuale Funzione per effettuare manualmente il cariotipo
F Cariotipo automatico Possibilità di eseguire il cariotipo in automatico
G Software per FISH Analisi di immagini FISH
H Ruota dei filtri Controllo da PC della ruota dei filtri
J Comparative Genomic Hybridization Analisi di immagini CGH
T Ricercatore Ricercatore metafasi
Tabella 1.1: I Moduli di Genikon
I Motorizzazione per Nikon Controllo da PC del microscopi Nikon
Genikon
2-1
2 Introduzione alla sicurezza
Genikon si utilizza sia come programma su un’unica stazione di lavoro (“stand alone”)
oppure se si dispone di una rete locale, è possibile attrezzare più stazioni in modo da
lavorare contemporaneamente sugli stessi casi, che risiedono fisicamente su una delle
stazioni collegate alla rete, (architettura “client-server”). Normalmente la stazione sulla
quale risiede l’archivio è un server e deve essere dedicato all’archivio e non utilizzato per
Analisi od Elaborazioni.
2.1 La figura dell’ “Amministratore”
In entrambi i casi è consigliabile che una sola persona si faccia carico di tenere sotto
controllo la situazione degli utilizzatori di Genikon. Costui viene detto “amministratore” del
sistema, e si occupa di effettuare il primo accesso al programma e di definirne gli
utilizzatori.
Genikon
3-1
3 Avvio del programma
3.1 “Login”
Facendo doppio-click sull’icona di Genikon
Fig. 3.1: Icona di Genikon
il programma si avvia, e mostra la finestra di “login” (Fig.3.2).
Riempire le caselle “Nome utente” e “Password” con i propri parametri di accesso, come
concordato con l’amministratore.
Fig. 3.2: Finestra di “login”
3.1.1 Primo accesso
La prima volta che si avvia il programma deve essere l’amministratore ad accedere: solo
lui potrà creare gli utenti che lo utilizzeranno. Come “Nome utente” mettere “GKAdmin”, e
premere il tasto , senza inserire alcuna password.
Si ottiene così l’accesso al programma.
3.1.2 Registrazione di un archivio
Con il primo accesso il programma richiede di registrare un archivio (cioè di predisporre il
sistema per utilizzarne uno).
3-2
Fig..3.3: Registrazione di un archivio
S lezioniamo un modello di archivio (un modello “Standard” viene fornito con Genikon ed
e è denominato tipico.gkm altrimenti, è possibile creare modelli personalizzati per mezzo
dell’applicazione esterna di “Personalizzazione archivi”: vedi capitolo 13) e digitiamo “Apri”
Premere il tasto di assenso per confermare.
Una volta terminata la fase di registrazione dell’archivio, Genikon si presenta come in
Figura 3.4. NESSUN CASO E’ APERTO, nulla è selezionato tranne la lista di casi che con
un sistema nuovo non dovranno essere presenti.
Fig. 3.4: Ambiente principale
Genikon
3-3
3.2 Il mouse di Genikon
Al mouse del sistema GENIKON sono associate numerose funzioni:
In generale è necessario considerare che il mouse da utilizzare con Genikon deve essere
a tre tasti: sinistro, centrale, destro.
3.2.1 Il tasto centrale
1. Quando lavoriamo su una metafase o su un cariotipo, posizionati sulla finestra
principale del menu’ di elaborazione, se digitiamo il tasto centrale automaticamente si
otterrà un valore di zoom del doppio. Se digitiamo nuovamente il tasto ritorniamo
all’ingrandimento originale.
La stessa funzione si ottiene se digitiamo due volte il tasto di sinistra del mouse.
2. Quando dividiamo due oggetti manualmente e tracciamo la linea di separazione se
desideriamo torniamo indietro con la linea possiamo utilizzare il tasto centrale.
3.2.2 Il tasto sinistro
1. Il tasto sinistro è quello più utilizzato e generalmente si utilizza per selezionare con un
semplice click o per attivare o per lanciare un programma con un doppio click.
Al tasto sinistro sulla seguente icona sono associate tutte le funzioni di assenso e
conferma .
Vediamo cosa è associato ad un semplice o ad un doppio click.
� Con doppio click possiamo lanciare genikon dal pannello di controllo digitando
sull’icona di GENIKON.
3-4
� Con il tasto di sinistra selezioniamo o deselezioniamo oggetti singoli o a gruppi.
Se con il mouse passiamo sopra agli oggetti compare un rettangolo tratteggiato che
visualizza come sono composti i gruppi; se desideriamo selezionarlo dobbiamo digitare il
tasto di sinistra del mouse. Il gruppo o l’oggetto singolo verrà circoscritto da una linea
continua. Da questo momento in poi tutte le funzioni saranno attive su quel gruppo o
oggetto singolo selezionato.
Se digito con il tasto sinistro su un nome di un caso specifico dalla lista dei casi, il sistema
apre automaticamente il caso e mostra il contenuto sulla galleria delle immagini:
Fig.3.5: Galleria immagini
Se digitiamo un altro nome automaticamente il caso si chiude e viene aperto quello nuovo
selezionato.
� Il tasto di sinistra si utilizza per muovere tutti i cursori di controllo:
Fig.3.6: Cursori
E’ necessario premere il tasto di sinistra e spostarlo fino al valore desiderato.
Genikon
3-5
� Il tasto di sinistra è necessario anche per disegnare delle ROI (regioni d'interesse)
durante la fase di sogliatura del campo chiaro o FISH. Digitando il tasto di sinistra si
inizia a scrivere e ci si muove fino al punto successivo. Per terminare digitiamo il tasto
di destra.
Fig.3.7:Disegno delle R.O.I.
� Nella fase di fusione per trasferire degli oggetti possiamo utilizzare la funzione
specifica associata alla seguente icona , uno alla volta o tutti insieme; possiamo
anche trasferirli digitando il tasto di sinistra sul cromosoma prescelto e mantenendo
premuto si porta il mouse sulla finestra dove si desidera trasferire l’oggetto.
Fig.3.8:Trasferimento dei cromosomi da fusione
L’operazione di trasferimento dei cromosomi si può anche eseguire dalla metafase al
collage.
3-6
� Il tasto di sinistra si utilizza per posizionare un punto sui cromosomi durante la
conta, si leva dalla conta digitando nuovamente il tasto di destra.
� Il tasto di sinistra si utilizza per iniziare il taglio manuale tra due oggetti. Digitiamo il
tasto di sinistra e tracciamo una linea lungo il punto di contatto, terminiamo con il tasto
di destra.
Fig.3.9: Taglio semi_manuale
� Durante la dissovrapposizione manuale è possibile posizionare 4 punti sull’incrocio col
tasto di sinistra o levarli con quello di destra.
Fig.3.10: Posizionamento dei punti di incrocio
� Se anche la dissovrapposizione manuale non ha funzionato possiamo procedere a
disegnare gli assi dei singoli cromosomi. Per disegnare l’asse iniziamo con il tasto di
sinistra e tenendolo premuto procediamo fino al termine dell’asse. Per terminare il
.
Fig.3.11: Disegno dell’asse di un cromosoma
� Per spostare i cromosomi sul foglio del cariotipo teniamo premuto il tasto sx e
posizionandoci al numero corretto della classe d' appartenenza.
� Di nuovo il tasto di sinistra serve per correggere la posizione del centromero dopo
attivazione della funzione specifica.
Genikon
3-7
� Il tasto di sinistra entra in funzione per cancellare porzioni del cromosoma dopo avere
attivato la funzione specifica.
� Nella M_fish dopo avere costruito il cariotipo e dopo avere aperta la mappa dei
fluorocromi se ci si posiziona sul cromosoma anche sulla metafase il sistema mostra il
numero preciso del cromosoma.
Fig.3.12: Visualizzazione della Lista dei fluorocromi
� Negli ideogrammi il tasto di sinistra mostra l’etichetta della banda se si passa sopra
all’immagine. Digitando il tasto di sinistra l’etichetta verrà assegnata con possibilità di
trasferimento sul collage.
Fig.3.13: Posizionamento della banda
� Nella stampa durante la creazione di un referto stampa, se scegliamo nuova immagine
con il tasto si sinistra premuto (sul foglio di stampa) è possibile un’immagine di una
dimensione specifica.
.
Fig.3.14: Definizione della dimensione di un’immagine sulla stampa
� Sempre nel referto stampa il tasto sinistro si utilizza per inserire un testo specifico.
3-8
3.2.3 Il tasto destro del mouse
Generalmente il tasto di destra del mouse serve per terminare operazioni iniziate con
quello di sinistra.
1. Se abbiamo ingrandito l’immagine col tasto centrale possiamo muoverci lungo l’area
digitando il tasto di destra più volte.
2. Il tasto destro serve per terminare la definizione delle Regioni d'Interesse (ROI).
3. Si utilizza per terminare la divisione di due oggetti.
4. Nell’analisi visiva si utilizza per assegnare il numero di coppia d'appartenenza.
5. Nella conta per eliminare dalla conta un cromosoma.
6. Durante il taglio semiautomatico per posizionare ed iniziare tale operazione.
7. Nella galleria immagini per visualizzare a dimensioni superiori una data immagine.
Genikon
3-9
3.3 Gestione degli utenti (utilizzatori)
Gli utenti di Genikon sono definiti scegliendo la voce “Gestione utenti …” dal menù “File”.
N.B.: l’utilizzo di questa funzione è permesso solo all’amministratore del sistema.
Si apre la finestra di Fig.3.15 mediante cui è possibile creare un nuovo utilizzatore.
Fig. 3.15: Gestione utenti
Premendo il tasto “nuovo” è possibile creare un ulteriore profilo. Riempire la casella “Nome
utente” con il nome dell’utilizzatore. E’ consigliabile assegnare una password ad ogni
utente, in modo da controllare gli accessi (questa possibilità è utile in particolare nel caso
di un sistema di rete): riempire la casella “Password” con una parola chiave (per conferma,
la chiave deve essere ripetuta nella casella “Conferma password”). Selezionare i permessi
concessi al nuovo utente. Premere il bottone di conferma per creare il nuovo profilo,
oppure chiudere la finestra con la � in alto a destra.
3-10
Fig. 3.16: Nuovo utente
Per eliminare un utente definito in precedenza è sufficiente selezionarlo e digitare elimina.
Per modificare la password di un utente, oppure per assegnarne una all’amministratore,
selezionare l’utente dalla lista inserire la vecchia password (se esistente) riempire la
casella “Password” con una parola chiave (per conferma, la parola chiave deve essere
ripetuta nella casella “Conferma password”).
Fig. 3.17: Modifica della password
3.4 Chiusura del programma
Il programma si chiude tramite la voce “Uscita” del menù “File”, oppure con la � in alto a
destra.
Genikon
4-1
4 Ambiente principale
4.1 Gestione dei casi
La schermata principale di Genikon consente di gestire i casi e di analizzare il contenuto
dei dati e delle immagini.
Sulla parte alta troviamo la “Barra strumenti” principale attraverso la quale, oltre ad
accedere ai vari ambienti di Genikon, possiamo utilizzare funzioni di lavoro per gestire
periferiche o connessioni con altre stazioni di lavoro:
Fig. 4.1: “Barra strumenti” della finestra principale
Gestione Archivio dati ed immagini
Ambiente d'Acquisizione
Acquisizione Spot
Ambiente d'Elaborazione
Fusione di cromosomi
Analisi visiva e conta
4-2
Ricerca automatica delle metafasi
Menu di Stampa
Menu di Stampa veloce
Macroroutine
Menu Opzioni
Associazione tra tasti della tastiera e funzioni toolbar
Sotto alla barra principale lo schermo si suddivide in varie parti: Caso corrente, Scheda
paziente, Elenco dei vetrini, Elenco delle cellule, Galleria delle Immagini.
4.1.1 Caso corrente
Fig. 4. 2: Caso corrente
Mostra quale caso è stato selezionato e quindi quello sul quale stiamo lavorando. E’ da
questa finestra che possiamo selezionare un altro caso per aprirlo ed eventualmente
modificarlo.
I casi sono quelli presenti sull’hard disk del sistema ed è possibile:
• Scorrerli uno alla volta in avanti e indietro ;
Genikon
4-3
• Andare in fondo alla lista ;
• Posizionarsi all’inizio della lista .
L’indicatore mostra il numero del caso rispetto al totale (terzo caso su un totale di
10), l’icona indica se il caso è libero (colorazione verde) oppure se è aperto da un altro
utente su di un’altra stazione (colorazione rossa) oppure se è archiviato su unità rimovibile
(colorazione blu).
4.1.2 Mostra la lista dei casi
Si tratta di una funzione ON/OFF che si attiva o disattiva con un click del mouse sul tasto
.
Il sistema mostra la lista dei casi in ordine alfa-numerico; selezionando un caso con il
mouse (tasto di sinistra) viene chiuso il caso precedente e si apre quello scelto.
Fig.4.3: Elenco dei casi presenti sull’hard disk
I casi presenti sull’hard disk sono visualizzati premendo il pulsante ; il caso attivo è
evidenziato in blu, i casi trasferiti su supporti rimovibili sono identificabili premendo il
4-4
pulsante: . La selezione contemporanea delle due icone e consente di avere
una visione completa dei casi presenti sul disco rigido e su rimovibile.
Digitando nuovamente l’icona , scompare la lista e appare nuovamente la scheda del
paziente.
L’ultima funzione di questo menu’ consente di eseguire la stampa dei nomi dei casi
presenti sull’hard disk.
4.1.3 Stampa dati anagrafici dei casi
Se lo desideriamo possiamo anche stampare la lista dei nomi dei casi e dei dati associti ai
casi selezionati se preceentemente abbiamo selezionato un’anagrafica Per accedere a
tale selezione prima di digitare la stampa selezioniamo la voce Importa anagrafica come
indicato in Fig. 4.4:
Fig.4.4: Esportazione anagrafica/stampa
Il sistema apre il seguente sottomenu’ mediante il quale possiamo selezionare le voci dei
dati che desideriamo stampare associate al nostro/i caso/i.
Fig.4.5: Selezione dei casi e voci dell’anagrafca per stampa
Genikon
4-5
Selezioniamo i casi col tatso di sinistra ed inviamoli mediante la freccia sulla parte dx.
Selezioniamo con un check le voci che desideriamo stampare della’anagrafica. Se ora
utilizziamo l’icona di stampa con l’anteprima:
Il sistema mostra i dati ed i casi prima dell’eventuale stampa
Fig.4.6: Anteprima di stampa
4.1.4 Creazione di un nuovo caso
Premendo l’icona si apre una finestra nella quale dobbiamo introdurre il nome del
caso. E’ possibile introdurre fino a 50 caratteri alfanumerici.
Una volta digitato il nome dobbiamo premere sul tasto di accettazione.
Fig. 4.7: Creazione nuovo caso
4-6
Nel caso in cui il nome del caso sia già presente ell nostro sistema il sistema avverte con
il seguente messaggio:
Fig. 4.8 Nome del caso già presente
Esiste anche la possibilità di verificare se oltre ad un caso con lo stesso nome ma anche
con lo stesso nome del paziente o che presenti un’altra qualsiasi voce nell’anagrafica
identica è presente nel sistem . Per utilizzare questa possibilità prima creiamo il nome del
nuovo caso.Digitiamo poi l’icona scheda paziente, il sistema mostra il seguente menu’.
Fig. 4.9 Controllo dati già presenti
Introduciamo ora i dati da controllare e digitiamo la seguente icona , per esempio il nome
Rossi:
Se un altro caso con il nome Rossi esiste il sistema lo mostra insieme a quelo nuovo
credato ((test123 nel caso nostro)
Genikon
4-7
Fig. 4.10 Duplicazione nome del paziente
La stessa operazione effettuata sul nome del paziente può essere effettuata su una
qualsiasi altra voce dell’anagrafica.
4.1.5 Associazione immagini al caso
Nel menu’ precedente è inoltre presente un’altra icona che consente invece di associare al
caso creato immagini provenienti da fuori.:
Utilizzando questa funzione si presenta un ulteriore Menu di visualizzazione delle
immagini associate o per associare immagini a quel particolare caso:
Fig. 4.11 Visualizzazione immagini associate al caso
Per associare nuove immagini andiamo a caricarle da dove sono state eventualmente
salvate(i formati accettati sono TIFF,Jpeg , Bmp .
4-8
Possiamo anche salvare le immagini oppure cancellare immagini associate
precedentemente.
4.1.6 Modifica del nome del caso
Selezioniamo il caso e nel menù “Archivio” (in alto a sinistra) scegliere la voce “Modifica
nome del caso”, inseriamo il nuovo nome, automaticamente sarà variato.
4.1.7 Eliminazione di un caso
L’eliminazione del caso corrente avviene per mezzo del tasto: .
N.B.: Con questa operazione cancelliamo tutto il caso ed il suo contenuto in maniera
irreversibile; è buona norma quindi assicurarsi che non desideriamo più il caso in
maniera definitiva, selezionando la forbice il sistema comunque invia un messaggio
di attenzione prima di procedere all’eliminazione definitiva.
4.1.8 Ricerca di un caso
Prima di effettuare una ricerca è necessario impostare un criterio. Premendo il Tasto
compare la lista dei campi dell’archivio con le scritte in blu. In ogni spazio dedicato ai dati
relativi alla scheda paziente, possiamo introdurre delle chiavi di ricerca per ritrovare ed
eventualmente rianalizzare dei casi analizzati in precedenza. E’ sufficiente inserire le voci
negli spazi specifici del database per definire le chiavi di ricerca.
La barra per la gestione dei casi si integra con queste nuove icone:
: serve per cancellare le chiavi inserite;
: tasto di tipo ON/OFF che permette di includere/escludere i casi esportati su unità
rimovibile;
: tasto di tipo ON/OFF consente di includere/escludere i casi importati da unità
rimovibile.
Premere il tasto per eseguire la ricerca (rimane schiacciato: ON). Il sistema seleziona i
casi in base alle chiavi che sono state immesse.
Le chiavi possono essere parziali mediante l’impiego del carattere speciale “%” (se per
esempio abbiamo bisogno di ricercare casi con 47,+21 e vogliamo ricercare tutti i casi
Genikon
4-9
+21, dobbiamo introdurre nel campo dove è stata immessa tale informazione :%+21%; il
sistema mostra tutti i casi con tale informazione).
Se osserviamo la lista dei casi saranno presenti solo quelli che presentano le chiavi di
ricerca che abbiamo appena inserito; se è presente un solo caso con quelle caratteristiche
il sistema lo apre direttamente.
Per terminare, premere nuovamente il tasto (ritorna normale: OFF). Le chiavi di ricerca
inserite resteranno a disposizione per il futuro.
4.1.9 Scheda paziente (scheda esame).
Fig.4.12: La scheda paziente
La scheda paziente consente di introdurre tutte le informazioni relative al paziente ed
all’esame in corso. La struttura della scheda si crea durante l’installazione del sistema,
utilizzando un programma esterno all’applicativo di Genikon che consente di soddisfare
perfettamente le esigenze del laboratorio. Con questo programma i tecnici Nikon
definiscono le intestazioni, il numero delle caselle e le dimensioni, per riflettere in pieno
quelle del referto abituale. E’ buona norma creare un archivio, all’inizio durante
l’installazione del sistema, per poi non dovere apporre nuove modifiche che potrebbero
causare problemi in seguito quando vogliamo imporre dei criteri di ricerca tra i nostri casi.
Indipendentemente dal numero, intestazione e dimensioni delle caselle esistono due
differenti tipi di caselle. Un tipo fisso, nel senso che per ogni scheda paziente dobbiamo
introdurre dei dati variabili. Un secondo tipo definito “tabella” che presenta sulla destra i
simboli sotto elencati:
4-10
Apre una lista di informazioni frequenti (create in precedenza dall’operatore) ed uguali
per casi diversi. La lista può per esempio contenere il tipo di campione: liquido
amniotico, sangue periferico, midollo osseo, tessuto; nel momento in cui introduciamo
i dati di una specifica scheda paziente sarà sufficiente aprire la lista e selezionare la
voce appropriata senza doverla riscrivere.
Apre il menù per creare un nuovo elemento della lista:
Fig.4.13: Codifica dei valori possibili per i campi "a scelta"
Consente di creare una nuova voce per il campo.
Consente di modificare una voce introdotta precedentemente.
Cancella la voce selezionata.
La scheda paziente può essere costituita da più “fogli” se le informazioni da inserire per
ogni caso sono numerose.
Con “completo” immettiamo un’informazione che consentirà in seguito di filtrare i casi
quando dovremo trasferirli su un altro supporto, nel caso in cui si desideri trasferire solo
quelli completi (finiti).
N.B. Attenzione all’introduzione dei dati sul campo data.
Se infatti la data non è introdotta con la barra come 15/12/74 ma con 15\12\74 non viene
accettata da sistema e non consente il salvataggio dei dati del caso
Fig.4.14: Errore nell’introduzione dati “data”
Genikon
4-11
4.1.10 Elenco dei vetrini
Fig.4.158: Rappresentazione dei vetrini e delle Composizioni
E’ possibile analizzare il singolo, o tutti i vetrini in contemporanea.
Se con il mouse selezioniamo un solo vetrino automaticamente sono mostrate le cellule
appartenenti a quel vetrino. Selezionando “Tutti i vetrini”, si aprono tutte le cellule
appartenenti a tutti i vetrini. Ogni vetrino è caratterizzato da un colore specifico che
circoscrive anche le immagini delle cellule rappresentate sulla destrasecondo il vetrino di
appartenenza. Quando siamo in modalità “Tutti i vetrini”, le cellule vengono etichettate
secondo lo schema [vx; cx], dove vx è il nome del vetrino a cui appartiene al cellula cx.
E’ possibile assegnare un nome al vetrino selezionato, diverso da quello proposto,
semplicemente facendo click sulla scritta che compare sotto; la scritta cambierà aspetto,
indicando che n'è possibile la modifica. Inserire ora il nuovo testo.
Il tasto serve per ed aggiungere un nuovo vetrino alla lista. La lista può contenere al
massimo dieci vetrini.
Il tasto consente di eliminare il vetrino selezionato e tutte le sue cellule.
N.B.: l’operazione di eliminazione di un vetrino implica la cancellazione di tutte le
immagini di tutte le cellule di quel vetrino; l’operazione è irreversibile.
4.1.11 Elenco delle cellule
Fig.4.16: Rappresentazione grafica delle cellule
La modalità di selezione è identica a quella del vetrino se seleziono con il mouse una
cellula a destra sulla galleria si mostra solo quella cellula con tutte le immagini ad essa
appartenenti (metafase, cariotipo, fusione).
4-12
Fig.4.17 Barra di scorrimento immagini nella modalità "Singola cellula"
Selezionando invece “Tutte le cellule” si osservano tutte le cellule appartenenti al vetrino in
esame.
Fig.4.18: Barra di scorrimento immagini nella modalità "Tutte le cellule"
Poichè è attiva la funzione “Tutti i vetrini” il sistema mostrerà tutte le cellule appartenenti a
tutti i vetrini di quel dato esame o caso.
Fig.4.19: Barra di scorrimento immagini nella modalità “Tutti i vetrini” e “Tutte le cellule”
Il passaggio rapido dalla modalità “Singola cellula” a “Tutte le cellule” si può effettuare
tramite il tasto , mentre apre l’elenco delle cellule disponibili per il vetrino
selezionato, dove è possibile passare alla cellula che più ci interessa (Fig.4.12). Questa
soluzione è molto utile quando siamo in altri ambienti dove non si ha visione diretta della
struttura vetrini-cellule.
Fig.4.20: Scelta della cellula dall'anteprima delle immagini
Il passaggio rapido dalla modalità “Singolo vetrino” a “Tutti i vetrini” e l’accesso all’elenco
dei vetrini disponibili per il caso selezionato, avviene in modo analogo a quanto descritto
per la gestione delle cellule.
L’operazione di modifica del nome d'ogni cellula è analoga a quella per i vetrini.
E’ possibile eliminare le cellule semplicemente premendo il bottone dopo aver
selezionato la cellula da eliminare.
Genikon
4-13
N.B.: anche in questo caso l’operazione di eliminazione di una cellula è irreversibile.
L’eliminazione di una cellula comporta la cancellazione di tutte le immagini di quella
cellula.
4.1.12 Immagini
Sulla parte destra dello schermo sono visualizzate le immagini.
Ogni immagine può raffigurare una metafase, un cariotipo, una composizione, una fusione
marcati ognuno con una sigla specifica (in basso a destra):
M – metafase;
M+F– metafase con fusione
K – cariotipo;
C – immagine “composizione”;
F – immagine di fusione;
FH – immagine FISH (risultante dalla combinazione di fluorocromi);
CGH – immagine CGH (immagine ratio in falsi colori)
mFISH – immagine Multiplex Fish
xxx – fluorocromo: indicato con le prime tre lettere del nome se la lunghezza supera
quattro lettere (p. es.: DAPI - DAPI,FITC FITC, TRI. etc…).
La dicitura sotto ogni immagine ne indica la posizione, secondo lo schema [vx; cx], dove
vx è il nome del vetrino e cx è il nome della cellula. Inoltre se le cellule appartengono al
medesimo vetrino sono identificate da una barra in alto nella finestra del medesimo colore
(in modalità “Tutte le cellule”).
In basso, il sistema informa se stiamo lavorando con singola cellula o con tutte le cellule.
Sempre in basso troviamo delle frecce che consentono di scorrere avanti ed indietro le
immagini della cellula oppure in fondo o all’inizio della lista.
Digitando il tasto dx del mouse su un’anteprima di un’immagine, compare un menù che
permette principalmente di visualizzare in grande l’immagine, di eliminare un’immagine, e
di eseguire nuovamente la soglia. Altre funzioni sono disponibili a seconda del tipo di
immagine che abbiamo selezionato.
Importazione d'immagini
4-14
Sempre in questa sezione dello schermo troviamo l’icona che consente di importare
immagini esterne a Genikon: .Con questa funzione è possibile leggere ed
eventualmente rianalizzare immagini in diversi formati (TIFF, JPeg, Bitmap, TGA),
richiamati da altri sistemi. Il sistema apre la lista dei file che si desiderano importare; dopo
avere scelto il nome del file è necessario sogliare per poi immettere nella nostra galleria
all’interno di un caso la nuova immagine. L’immagine importata genera una nuova cellula.
Per importare invece immagini in una cellula già esistente,utilizzare la seguente icona
: .
4.2 Trasferimento immagini da un vetrino (caso) all ’altro
Apriamo il caso sul quale sono selezionate le immagini acquisite in posizione errata
digitiamo poi la seconda delle icone che consente di salvare l’immagine corrente
,possiamo memorizzarla temporaneamente dove desideriamo anche sul desktop
Fig.4.22 Memorizzazione di una copia dell’immagine da trasferire
Posizioniamoci ora sul vetrino o sul nuovo caso dove desideriamo trasferire l’immagine e
digitiamo l’icona di importazione il sistema si posiziona dove l’imagine è stata salvata.
Genikon
4-15
N.B. è bee ricordarsi di cancellare l’immagine dall vetrino/caso precedente perché
abbiamo un duplicato.
4.3 Unità Rimovibili
(CDROM-DVDRAM-DISCHI OTTICI ed altri)
E’ possibile esportareed archiviare su unità rimovibili i casi che non vengono più utilizzati
ma che devono essere mantenuti nel caso in cui desideriamo rianalizzarli in un secondo
tempo. Esistono due diverse modalità di trasferimento dei casi molto diverse tra loro:
a- Archiviazione _ b- Esportazione
A- Archiviazione trasferisce il caso su una qualsiasi periferica ed automaticamente lo
cancella dall’archivio.
B-Esportazione copia il caso su una qualsiasi periferica ma non lo cancella
4.3.1 Definizione delle unità rimovibili
Qualsiasi procedura si desideri utilizzare è in ogni caso necessario definire l’unità sulla
quale si desidera trasferire i casi o il caso. Per prima cosa bisogna tenere presente che le
unità codificate mediante le utility del menu seguente, sono valide per l’archivio al quale
siamo correttamente collegati. Ciò significa che in una configurazione di rete, per la quale
sia stata preventivamente definita lamacchina su cui risiede l’Archivio di lavoro, è
possibile, da qual si voglia macchina CLIENT, codificare e dunque far conoscere
all’ARCHIVIO CENTRALE, unità removibili residenti sulle macchine CLIENT. In Fig.4.13 si
illustra la situazione sopra descritta:
Fig.4.23: Gestione unità rimovibili
La macchina di lavoro, nell’esempio in esame, è GENIKON2 ed in questo caso anche
l’archivio di lavoro è GENIKON2 mentre le unità disponibili sono raffigurate sotto la voce
4-16
Unità locale. Occorre definire una volta il tipo d'unità rimovibili che si hanno a
disposizione. Per definire una nuova unità rimovibile, digitare nella sezione “Codifica
unità rimovibili”.
Fig.4.24 Creazione nuova unità
Specificare l’unità locale tra una di quelle proposte; se si desidera, inserire una breve
descrizione sul supporto. Nella casella “Nome” inserire un'etichetta identificativa per il
supporto scelto. Per confermare, premere (l’unità viene codificata e viene inserita
nell’elenco). Alle successive riaperture della finestra per la gestione delle unità rimovibili, le
unità codificate saranno elencate nella casella “Unità codificate” Trasferimento dei casi su
unità rimovibile. E’ anche possibile eliminare un’unità (se ancora non sono stati archiviati
casi) o modificare la descrizione di un’unità, con le icone accanto a quella della nuova
creazione.
Modifica
Eliminazione di un’unità rimovibile
Per chiudere invece il menu è sufficiente utilizzare la funzione seguente
Nel caso precedente abbiamo introdotto unità USB sul GENIKON2.
N.B. Può accadere che in fase di creazione il sistema visualizzi un Messaggio informativo
in cui afferma l’impossibilità di codifica. Questo accade poiché il sistema associa in
automatico un nome di condivisione all’unità definita. Il nome di condivisione è un numero
a partire dalla data ed ora corrente. L’evento descritto avviene se e solo se si è definito
due unità in un tempo inferiore ad un minuto. L’univocità del nome di condivisione impone,
infatti, una differenza di nome.
Genikon
4-17
Fig.4.25 Creazione di due unità
Nel caso in fig.4.15 abbiamo l’archivio residente su XPGE il nostro computer client è
DEBORAXP ed abbiamo disponibile in locale l’unità DVDRAM e CDRW che mostrano
correttamente un nome di condivisione differente. A questo punto possiamo decidere se
Esportare od Archiviare il caso. Se scegliamo la modalità d’archiviazione di un caso:
4.3.2 Archiviazione di un caso
Fig.4.26Archiviazione di un caso
Per prima cosa teniamo presente che quando siamo in archiviazione esiste sempre una
sorgente che è l’archivio di lavoro, ed una di Destinazione, cioè una cartuccia su unità
removibile. Nell’esempio in fig.4.16 l’archivio di lavoro è GENIKON2 e l’unità ad esso
selezionata è un USB. Poichè l’unità è attiva oppure se si tratta di un magneto ottico e la
cartuccia è inserita il sistema recupera in automatico il nome della cartuccia e l’elenco dei
casi presenti sulla stessa. Scegliamo dunque l’unità di archiviazione e selezioniamo i casi
che decidiamo trasferire. Per selezionare i casi possiamo digitare il tasto sx del mouse sul
singolo nome e con il tasto CTRL possiamo eseguire una selezione multipla a salti,
oppure con le frecce nere possiamo decidere di trasferirli tutti in una sola volta
Fig.4.27 Selezione dei casi ed informazione di occupazione di memoria
4-18
per trasferire solo i casi selezionati.
Una volta selezionati i casi e trasferiti sulla destra, il sistema informa su quanto occupano
in memoria e quanto spazio è disponibile sull’unità di archiviazione:
Al termine di queste selezioni utilizziamo il tasto d’assenso il sistema procederà al
trasferimento al termine, comunica l’esito.
Fig.4.28 Trasferimento in atto del caso
Fig. 4.29 Esito di trasferimento avvenuto
� Chiusura del form
� BROWSER. La pressione del pulsante abilita un’interfaccia di selezione
mediante cui è possibile scegliere una qualche unità rimovibile di rete NON codificata e
dunque NON nota all’ARCHIVIO DI LAVORO. Quest’UTILITY può essere utile nei casi di
temporanea indisponibilità (esempio guasto) delle unità usualmente impiegate
dall’ARCHIVIO e correttamente codificate.
• Pulsante di REFRESH per aggiornare la lista dei casi su cartuccia.
Nell’ipotesi in cui il sistema incorra in errori d’archiviazione è fornito
Nell’ipotesi in cui il sistema incorra in errori d’ARCHIVIAZIONE è fornita all’utente, sempre e in
ogni modo, una messaggistica indicante il tipo di problema incontrato:
Genikon
4-19
Figura 4.30 Errori incontrati in archiviazione
� Al termine del processo d’archiviazione il sistema abilita in automatico un FORM
che indica quali casi siano stati correttamente archiviati e quali no:
Figura 4.31 Riepilogo archiviazione
OSSERVAZIONE: La rimozione dei casi da archivio è sempre subordinata al
favorevole esito di una serie di controlli di match fra il caso in archivio e la copia
eseguita sulla cartuccia. Nell’ipotesi di eventi non prevedibili né controllabili quale
la rottura del dispositivo di archiviazione durante il trasferimento o il suo
spegnimento (cessazione dell’alimentazione di rete), il sistema “dovrebbe” (sulla
base della progettazione eseguita e dei test realizzati) garantire una preservazione
dei dati o al più una duplicazione degli stessi all’interno della cartuccia senza che i
casi sorgenti risultino archiviati per il data base.
� E’ opportuno precisare che nella cartuccia di destinazione, al termine
dell’ARCHIVIAZIONE casi, il sistema trasferisce una copia del MODELLO d’ARCHIVIO
corrente. Il modello in oggetto si distingue da quello salvabile mediante PERSARC,
poiché il suo impiego permette il recupero delle TABELLE costruite dall’utente. Il
nome associato al modello coincide con quello posseduto dall’ARCHIVIO.
Nell’esempio corrente il file si chiamerebbe: XPGE.gkm
La chiusura del FORM d’ARCHIVIAZIONE comporta un aggiornamento dell’elenco casi
attiva nell’ambiente principale. Per una corretta procedura d’ARCHIVIAZIONE
sono da applicarsi le seguenti linee guida:
4-20
1. Eseguire l’ARCHIVIAZIONE di un caso solo quando quest’ultimo può considerarsi
“ragionevolmente” concluso.
2. Eseguire sempre e in ogni modo un’ESPORTAZIONE dei casi che s’intende archiviare.
L’operazione di COPIA dei dati che si stanno per rimuovere dall’ARCHIVIO salvaguarda
l’utente finale da problemi di rottura, guasto, smagnetizzazione o altro del supporto
fisico (cartuccia) impiegato per l’ARCHIVIAZIONE.
3. Durante la fase di ARCHIVIAZIONE è vivamente CONSIGLIATO sospendere le attività
lavorative svolte dai CLIENT sull’archivio server.
4. Eseguire un’ARCHIVIAZIONE a step, ovvero trasferire sottogruppi di casi (esempio 5 –
10 – 15 casi per volta) al fine di avere un controllo più diretto sull’operazione in
esecuzione.
I casi trasferiti su unità rimovibile possono essere visti nell’elenco dei casi premendo il
tasto .
N.B.: i casi che vengono trasferiti su un’unità rimovibili vengono fisicamente spostati,
quindi la loro consultazione è impossibile se non si inserisce il supporto nell’unità
senza supporto è solo possibile consultare i dati dell’archivio ma non le immagini.
4.3.3 Ripristino dei casi da Unità rimovibile
Per riportare nell’archivio centrale un caso trasferito su un supporto rimovibile, occorre
scegliere la voce “Trasferisci caso da UR …” del menù “File” dell’ambiente principale di
Genikon. Sarà chiesto di inserire un supporto specifico (in base all’etichetta che abbiamo
dato in fase di trasferimento).
Fig.4.32 Ripristino casi da Unità rimovibile
Il sistema mostra a sinistra i casi presenti sulla cartuccia; anche in questo caso possiamo
selezionarli ed accettare.
Il tasto seguente:
Consente di visualizzare differenti periferiche sulle quali sono stati archiviati casi:
Genikon
4-21
Fig.4.33 Visualizzazione delle periferiche disponibili
Come per l’archiviazione il sistema al termine del ripristino conferma se avvenuto
positivamente il trasferimento dal supporto all’hard disk
Fig.4.34 Termine del trasferimento
4.3.4 Esportazione di un caso
Nel caso in cui desideriamo invece copiare senza cancellare dall’hard disk un caso
scegliamo la voce Esportazione di un caso e procediamo con il seguente menu:
Fig.4.35 Menu d’esportazione casi
Il menu è molto simile a quello d’archiviazione e la selezione dei casi avviene come
l’archiviazione. Per default il sistema seleziona Caso corrente se invece desideriamo
selezionare altri casi dobbiamo deselezionare l’icona di caso corrente ed eseguire
selezioni multiple seguendo la stessa modalità dell’archiviazione.
4-22
4.3.5 Importazione di casi da Archiviazione
Fig.4.36 Importazione casi
I casi possono essere importati da Esportazione da Archiviazione o ripresi da un archivio
specifico.
o Esportati : con tale termine ci si riferisce a casi preventivamente esportati da altro
ARCHIVIO. I casi sono in formato compresso con estensione GXP.
o Archiviati/altro… : con tale termine ci si riferisce a casi presenti su cartuccia poiché
preventivamente archiviati oppure presenti in una qualche FOLDER locale o di rete. I casi in
oggetto sono delle semplici copie delle cartelle indicizzate recuperabili all’interno della
cartella ARCHIVE.
o Da Archivio : con tale termine ci si riferisce a casi attualmente presenti e attivi su un
ARCHIVIO di rete.
OSSERVAZIONE: E’ lecito supporre che le ultime due forme di recupero dati siano
riservate all’assistenza tecnica piuttosto che all’utente finale.
Nel caso in cui siano ripresi da un’esportazione semplicemente devono essere selezionati
con la solita modalità (singola multipla o in totale con le frecce) seguendo al termine il
tasto d’assenso. Se invece sono ripresi da archivio automaticamente si abilita una nuova
funzione che consente di associare o no dati. Nel caso in cui i casi provengano da un
archivio che ha campi diversi da quello in possesso.
Fig.4.37 Selezione per associazione di campi
Genikon
4-23
� Il trasferimento di uno o più casi nella lista di selezione, abilita in automatico il
pulsante di creazione MAPPA . La pressione del pulsante in oggetto attiva la
sezione di definizione MAPPA. Nell’ipotesi in cui i casi selezionati e presenti in lista
siano stati creati a partire dallo stesso modello d’archivio residente sul DATA BASE di
destinazione, il sistema visualizza il recupero dell’anagrafica. Nell’esempio di figura
4.24 i modelli d’archivio sono totalmente discordanti ciò significa che in automatico,
è eseguito il recupero del solo nome caso:
Fig. 4.38 Correlazione tra archivi
Nella colonna di sinistra (VOCI ARCHIVIO) sono elencate le voci del modello d’archivio
corrente. Nella colonna di destra (DATI ANAGRAFICI ) sono visualizzati i dati del caso
evidenziato all’interno della lista di selezione e associati in modo automatico.
L’utente, interessato al recupero di tutta l’anagrafica, può a questo punto procedere
con la costruzione dei LINK:
� Un semplice CLICK eseguito sulla colonna di destra in corrispondenza della voce di
ARCHIVIO da associare, abilita una COMBO di selezione al cui interno sono presenti
TUTTI i dati anagrafici associati al caso che si desidera importare:
Fig. 4.39 Rappresentazione associazione
La selezione di una delle voci in elenco abilita il LINK fra quella VOCE d’ARCHIVIO e
il DATO ANAGRAFICO. La VOCE D’ARCHIVIO associata è visualizzata in grassetto.
Nell’ipotesi in cui sia assente, fra quelli in lista, il dato anagrafico d’interesse, si
annulla il tentativo d’associazione scegliendo l’ultima voce d’elenco vuota.
4-24
Fig.4.40 Associazione Dati archivio a casi
Le associazioni eseguite restano attive fino a che il FORM non viene chiuso. La
selezione dei casi successivi presenti in lista consente di testare la veridicità dei
LINK eseguiti ed eventualmente di modificarle e/o rimuoverle. Per una pulizia
completa di tutte le associazioni eseguite premere il pulsante , per il
salvataggio della mappa creata premere il pulsante ed infine per il caricamento
di una mappa precedentemente costruita premere il pulsante . Queste ultime
due operazioni hanno senso se si desidera importare i casi in tempi diversi
(chiusura e riapertura del FORM), senza perdere il lavoro di LINK eseguito.
� E’ opportuno precisare che i dati anagrafici del caso sorgente restano sempre e in ogni
modo fruibili per il caso importato, indipendentemente dalla costruzione o meno della
mappa di LINK. I dati sono accessibili nell’ambiente principale dell’ARCHIVIO nel
momento in cui si seleziona un caso importato, si accede all’anagrafica e quindi si
preme il pulsante
Fig. 4.41 Possibile successiva importazione dati
� Per il significato dei pulsanti fare riferimento a quanto detto per i precedenti FORM.
L’unica eccezione è rappresentata dal pulsante che in questo contesto avvia
l’operazione d’IMPORTAZIONE. In quest’operazione, durante la fase di trasferimento,
Genikon
4-25
è attivo il FORM di progressione precedentemente descritto ed il FORM riepilogativo
finale:
Fig.4.42 Esito importazione casi
� La chiusura del FORM d’IMPORTAZIONE comporta un aggiornamento della lista casi attiva
nell’ambiente principale.
Generalmente questa funzione si utilizza per eseguire assistenza poiché normalmente i
casi hanno lo stesso archivio di quelli trasferiti sul supporto.
Esiste un’ulteriore possibilità di ripristinare casi da un altro archivio che risiede su un
supporto diverso e magari su un’altra macchina in questo caso utilizzo l’ultima funzione di
ripristino casi da archivio ed il sistema chiede su quale postazione è collocato tale archivio
Fig.4.43 Selezione di una nuova postazione per trasferire casi
4.4 Gestione immagini
Sulla schermata iniziale di Genikon la gestione delle immagini avviene principalmente
dalla galleria. Automaticamente quando il caso è aperto il sistema mostra la prima
immagine del primo vetrino. Già abbiamo visto che è possibile selezionare una sola cellula
(in questo caso il sistema mostra tutti i dettagli relativi a questa cellula) oppure se siamo
nella modalità tutte le cellule mostra tutte le cellule appartenenti a quelle di uno o di tutti i
vetrini. Se desideriamo vedere a maggiore ingrandimento le cellule della galleria è
sufficiente digitare il tasto di destra sulla cellula e selezionare VISUALIZZA:
Fig.4.44 Galleria immagini
4-26
Se vogliamo richiamare in sequenza le immagini digitiamo sulla freccia della tastiera
oppure se ne desideriamo un’immagine specifica digitiamo il tasto di sinistra del mouse
sull’immagine piccola della galleria. La stessa operazione è possible a grande schermo.
In quest’ultimo caso saranno operative solo le frecce da tastiera.
Ricordiamo che da questa modalità si accede anche alla possibilità di esportare
l’immagine di Genikon come Tiff,Jpeg,Bmp su un qualsiasi supporto. Il sistema offre 2
modalità di salvataggio con e senza TXT. Naturalmente nel caso di cariotipo è bene
salvare con Txt per esportare anche il numero relativo alle coppie di omologhi.
Fig.4.45 Salvataggio immagini inn formati diversi
Cliccando con il tasto di dx sull’immagine è possibile attivare altre 2 funzioni: a)
Introduzione di nuovi dati sulla singola immagine ed al nuovo thresholding dell’immagine:
Fig.4.46 Funzioni su singola cellula
a)Modifica informazioni aggiuntive:
Genikon
4-27
Fig.4.47 Introduzione informazioni aggiuntive
Consente, nel caso in cui sia stato introdotta ON la voce di introduzione di informazione su
singola cellula.
b)Se invece digitiamo su singola cellula di modificare il thresholding, potremo nuovamente
cambiare la sottrazione del fondo già effettuata in precedenza con il processo di
acquisizione. A questo livello se modifichiamo la sogliatura ad una metafase collegata ad
un cariotipo il sistema cancellerà il cariotipo a modifica della sogliatura.
Se sempre dalla galleria digitiamo su singola cellula il tasto dx sull’immagine del cariotipo
si aggiunge una nuva voce relativa all’eliminazione della sola immagine del cariotipo
Fig.4.48 Eliminazione immagine del cariotipo
4.5 Gestione immagini
Sempre nel menu di gestione del caso sulla galleria delle immagini il simbolo seguente
consente di selezionare o no le informazioni sottostanti alla cellla.
4-28
Se
Abbiamo selezionato la funzione sotto all’immagine compaiono le informazioni
Fig.4.49 Informazioni sul vetrino e tipo di cellula
Fig.4.50 Immagine cellula senza informazioni
L’opportunità di mantenere le informazioni sulla parte bassa della cellula si ritrova anche
nel menu’ di processazione. In tale enu se l’icona è selezionata in basso a destra si
vedono o non si vedono il numero di conta delle strutture presenti sull’immagine.
Genikon
5-29
5 Acquisizione immagini
Per acquisire immagini, si seleziona dalla Toolbar Principale la seguente icona:
Fig.5.1: Menu di Acquisizione
Dall’ambiente di acquisizione possiamo comunque visualizzare le informazioni relative al
caso in esame:
il tasto permette di visualizzare l’elenco dei casi e la scheda dati per il caso in corso
(Fig.5.2).
Fig.5.2: Visualizzazione dell'elenco dei casi in fase d’acquisizione
Il tasto mostra i vetrini e le cellule del caso in corso (Fig.5.3);
Fig.5.3: Visualizzazione degli elenchi vetrini e cellule in fase di acquisizione
5-30
mostra le immagini delle cellule acquisite (Fig.5.4): se stiamo acquisendo la prima
cellula tutte le finestre saranno vuote (nere).
Fig. 5.4: Visualizzazione delle immagini in fase di acquisizione
L’ambiente di acquisizione mostra 11 finestre dedicate alla visualizzazione delle immagini;
le 2 (a minore dimensione) + 1 (a dimensione maggiore) finestre sono utilizzate per la
gestione dell’immagine durante la fase di acquisizione e successivamente in quella di
elaborazione. La finestra più grande, mostra l’immagine della metafase sia “live” che
memorizzata e consente la perfetta messa a punto del fuoco e della luminosità
dell’immagine.
Le due finestre più piccole in basso servono per collocare eventuali fuse, collage, cariotipi.
Le otto finestre sulla sinistra consentono di osservare a piccolo ingrandimento tutte le
cellule associate a quel dato vetrino. Per scambiare un’immagine con l’altra facciamo click
con il tasto di sinistra del mouse sull’immagine desiderata automaticamente le immagini
saranno invertite.
Durante questa fase è possibile osservare le immagini della galleria a maggiore
ingrandimento se digitiamo il tasto di destra sull’immagine prescelta.
5.1 Come si “fotografano” nuove cellule
Le due icone che seguono consentono di passare a fotografare immagini. L’icona
consente di acquisire una nuova cellula, mentre cattura una cellula già “fotografata”
nel caso in cui si sia errata la procedura precedentemente o nel caso in cui si desideri
aggiungere delle fusioni a cellule precedentemente acquisite.
Se selezioniamo la prima icona avremo sulla finestra maggiore l’immagine “live”
corrispondente alla metafase che abbiamo posizionato sotto al microscopio a 100x.
Le altre icone del menu’ d’acquisizione hanno funzioni diverse.
Genikon
5-31
E’ una funzione di “undo” in altre parole di annullo dell’ultima operazione eseguita.
Consente di effettuare il salvataggio della cellula, in ogni modo il sistema salva
sempre in automatico l’immagine della metafase.
Esce dall’ambiente d’acquisizione.
Seleziona l’acquisizione con modalità in campo chiaro.
Seleziona l’acquisizione con modalità in fluorescenza (bande Q/R/DAPI).
Seleziona l’acquisizione con modalità in FISH.
Seleziona l’acquisizione con modalità in CGH.
Seleziona la ricerca automatica degli spot su nuclei interfasici
Prima di passare ad acquisire immagini dobbiamo eseguire un controllo del microscopio.
5.2 Scelta della modalità di lavoro
Se lavoriamo in campo chiaro, è buona regola che il microscopio sia correttamente
allineato; è dunque necessario eseguire il controllo dell’illuminazione secondo il principio di
Koheler; controlliamo inoltre che non siano inseriti nel percorso ottico i filtri della
fluorescenza; generalmente un filtro che può essere tenuto lungo il percorso è quello DAPI
che risulta essere inefficace con il campo chiaro, capita talvolta di non avere più posizioni
libere per lavorare in campo chiaro se il microscopio è dotato di tutti gli accessori
necessari per la FISH. E’ invece utile utilizzare un filtro verde, come per la fotografia, che
esalta i contrasti dei cromosomi; tale filtro può essere posto sul diaframma di campo del
microscopio nel caso in cui non sia stato dato come accessorio fisso nel corpo del
microscopio. Dobbiamo assicurarci che almeno il 50% della luce vada alla telecamera
oltre che agli oculari. Ciò dipende dal modello di microscopio che abbiamo in dotazione.
Alcuni microscopi consentono di vedere in contemporanea agli oculari ed alla telecamera.
Altri modelli invece inviano il 100% della luce agli oculari oppure il 100% è inviato alla
Seleziona l’acquisizione in Multiplex FISH.
5-32
telecamera. Assicuriamoci dunque che almeno il 50% vada alla telecamera proprio come
si fa normalmente per inviare la luce alla macchina fotografica.
Se lavoriamo in fluorescenza è fondamentale che la lampada della fluorescenza sia
centrata. Controlliamo inoltre che lungo il percorso ottico sia posizionato il blocchetto di
filtri corretto per osservare il fluorocromo (quinacrina o arancio di acridina); anche in
questo caso come per il campo chiaro assicuriamoci che almeno il 50% della luce vada
alla telecamera. Scegliamo ora la modalità di lavoro: campo chiaro o fluorescenza (la
FISH sarà presa in esame successivamente). E’ fondamentale scegliere la modalità
corretta perché se scegliamo fluorescenza e poi lavoriamo in campo chiaro saremo in
saturazione se invece lavoriamo in fluorescenza e scegliamo il campo chiaro saremo in
assenza o bassa luminosità.
5.3 Setup della telecamera
Dopo avere selezionato la modalità di lavoro e con l’immagine live della metafase
possiamo almeno per la prima volta controllare il Setup della telecamera :
per acquisizioni in campo chiaro:
Fig.5.5: Regolazioni per Acquisire in campo chiaro
per acquisizioni in fluorescenza:
Fig.5.6: Set up acquisizione in fluorescenza
Se lavoriamo in campo chiaro, potremo gestire la luminosità e il contrasto dell’immagine; è
l’operatore che deve decidere la quantità di luce o di fondo che desidera sull’immagine;
variando le due regolazioni devo potere ottenere il massimo del contrasto. E’ sempre bene
prima osservare al microscopio con la quantità di luce corretta e l’apertura del
condensatore corretta secondo il tipo d’obiettivo col quale stiamo lavorando
Genikon
5-33
successivamente, aggiustiamo il sistema mantenendo la stessa quantità di luce in maniera
tale da non dovere cambiare ogni volta da microscopio a sistema. In fluorescenza potremo
gestire luminosità e contrasto ma a queste due voci si aggiunge la possibilità di integrare
(esposizione) la telecamera per consentire di osservare anche fluorescenze molto basse.
Alzando il valore d’esposizione si osservano strutture anche poco fluorescenti ed è
possibile raggiungere ugualmente un ottimo contrasto. I valori fissati dall’operatore si
possono ottenere anche lavorando sul controllo automatico della telecamera: se
selezioniamo regolazione automatica, da ora in poi è il sistema che controlla i valori di
contrasto e luminosità e cerca di trovare il massimo del contrasto dell’immagine senza
intervento dell’operatore. Se non desideriamo più tale controllo è sufficiente utilizzare il
tasto sinistro del mouse per deselezionare il controllo automatico. In entrambi i casi
dobbiamo avere l’immagine “live” sul monitor e naturalmente il percorso della telecamera
aperto. Con entrambe le modalità di lavoro (controllo manuale e/o automatico) il sistema
presenta una barra di controllo di colore verde (Fig.5.3) che rappresenta la quantità di luce
che proviene dal microscopio ed arriva alla telecamera ed indica il contrasto rilevato dal
sistema.
Fig.5.7: Barra della dinamica del segnale in ingresso
Se abbiamo immagini molto scure, la barra verde sarà disposta verso il basso; viceversa,
se le immagini sono molto chiare, la barra verde occupa tutto lo spazio. Agendo sulle
regolazioni dobbiamo rendere la banda verde più grande possibile, senza però che questa
sia troppo vicina ai bordi (si noterà che se la barra oltrepassa il limite superiore, comparirà
una tacca rossa in alto; una tacca blu comparirà se è il limite inferiore ad essere
oltrepassato).
N.B.: Nel caso in cui si lavori con l’integrazione della telecamera, è bene cercare di
tenere il valore di esposizione il più basso possibile e quindi giocare magari di più
con la luminosità poiché tempi alti di integrazione ritardano lo spostamento
dell’immagine ed anche la messa a fuoco.
5-34
Per entrambe le modalità abbiamo comunque l’opportunità di eseguire un salvataggio del
setup , oppure possiamo richiamare l’ultimo salvataggio effettuato .
5.4 Acquisizione di una nuova immagine
• Apriamo un vecchio caso o creiamo un caso nuovo;
• entriamo nell’ambiente d’acquisizione
• selezioniamo la modalità di lavoro per esempio campo chiaro ;
• controlliamo il fuoco sul microscopio;
• controlliamo eventualmente i valori di luce e contrasto.
• selezioniamo l’icona per acquisire l’immagine .
A questo livello esistono due modi diversi di procedere a seconda se la cellula rientra o no
per intero nel campo del microscopio.
Tutti i cromosomi sono presenti nella prima immagine memorizzata
Possiamo subito premere il tasto per terminare l’acquisizione ed eventualmente
passare al processo successivo d’elaborazione (conta, analisi visiva o separazione dei
cromosomi per una successiva cariotipizzazione).
L’acquisizione è finita possiamo procedere ad acquisire o un’altra cellula o ad elaborare
l’immagine appena digitalizzata.
Mancano uno o alcuni cromosomi che sono posti esternamente al campo appena
fotografato
Dobbiamo procedere come segue:
• abbiamo già acquisito gran parte di cromosomi;
• spostiamo sul microscopio al centro del campo i cromosomi esterni;
• facciamo click nuovamente sull’icona per memorizzare la nuova immagine ;
• se ancora mancano cromosomi possiamo spostarci nuovamente e procedere come ai
punti due e tre;
• Una volta fotografati tutti i (anche se su immagini diverse)
possiamo fare click sull’icona seguente per terminare la fase d’acquisizione .
Genikon
5-35
Avremo così un’immagine principale descritta come metafase, più una certa quantità
d’immagini definite F1, F2, Fn, secondo quanti frame abbiamo fotografato.
5.5 Acquisizione immagini da telecamere ad alta ris oluzione
Nel caso in cui sia collegata al sistema una telecamera digitale ad alta risoluzione il
sistema lavora in live alla stessa risoluzione del monitore cioè 1024x1280.
L’alta risoluzione si ottiene con l’impiego di telecamere quali:
� HAMAMATSU ORCA 285
� COOLSNAP
� HESPFIRMA
� NIKON DS2 MONOCROMATICA RAFFREDDATA
è consentito solo in modalità ALTA RISOLUZIONE . Questo significa che sulla chiave hardware
del programma GENIKON deve essere attivo il relativo modulo. Il FORM LIVE in modalità ALTA
RISOLUZIONE consente una visione d’immagine pari a 1280x1024 pixel. Le SCROLLBAR
laterali permettono in ogni modo la visione dell’intera immagine così come acquisita dalla
telecamera d’impiego.
Fig.5.8 “LIVE” ad alta risoluzione
Al termine dell’acquisizione, determinata dalla pressione del pulsante di STOP ,
si attiva un FORM di SOGLIATURA, l’immagine è visualizzata nella classica dimensione
768x576. Per visualizzarla nel suo formato originale è necessario lavorare in
modalità GRANDE SCHERMO.
5-36
Al LIVE AD ALTA RISOLUZIONE può essere associato l’impiego dell' E1000 e/o RUOTA
FILTRI, in modo analogo con quanto avveniva nelle precedenti versioni a BASSA
RISOLUZIONE.
� L’ingresso nell’ambiente LIVE con una modalità di lavoro CGH o MFISH comporta in
automatico il caricamento dell’ultimo profilo di acquisizione, impiegato e
memorizzato sui registri. Per la FISH il caricamento avviene se e solo se l’ingresso in
LIVE è avvenuto a partire da un vetrino vuoto, altrimenti il sistema carica il profilo
associato alla cellula d’ingresso per consentirne la sogliatura nuovamente.
5.6 Sottrazione del fondo dalle immagini acquisite
Al termine di ogni acquisizione, il sistema esegue in automatico la sottrazione del fondo, o
sogliatura, per ogni immagine catturata. Questa fase è molto delicata perché corrisponde
alla quantità di background che desideriamo eliminare dalla nostra immagine. E’
necessario controllare che insieme al fondo non siano eliminate parti appartenenti ai
cromosomi.
Fig.5.9: Sogliatura delle immagini acquisite (manuale)
Sul sistema Genikon esistono diverse modalità di sogliatura più o meno complesse e con
diversa efficienza selezionabili dalla voce opzioni della Main Tool Bar
Genikon
5-37
Fig.5.10: Selezione diverse modalità di sogliature
5.6.1 Soglia manuale
La prima soglia MANUALE indicata in figura 5.9 è quella che lascia maggiore libero
arbitrio all’utente.
Con tale menu è infatti possibile modificare il contrasto sull’imagine non solo abbassando
il livello massimo al di sotto di 255 ma anche il minimo sopra 0
Fig.5.11: Selezione diverso contrasto
Tale funzione leva il rumore di fondo alzando il livello minimo o schiarisce l’immagine
abbassando il massimo.
Fig.5.12: Aumento del filtro
Se invece aumentiamo il valore del filtro (circa 7) aumenterà la differenza dei livelli di
grigio determinando ua “messa a fuoco “ migliore dell’immagine.
La voce luminosità consente di schiarire o scurire l’immagine
5-38
Fig.5.13: Variazione luminosità
L’icona seguenete abilita la possibilità di osservare quanto fondo verrà sottratta
all’immagine
. Fig.5.14: Visualizzazione della soglia
In questo caso è possibile aumentare o diminuire la sottrazione, muovendo la barra
seguente:
Fig.5.15: Slider per gestione soglia
Genikon
5-39
Quando agiamo sulla soglia è anche possibile definire delle ROI disegnando col tasto sx
del mouse intorno agli oggetti di interesse ed utilizzare i tasti +e- per aumentare o
diminuire la soglia sulle regioni identificate in manuale. E’ possibile definre quante regioni
l’utente ritiene necessarie.
Fig.5.16: Thresholding su ROI
Fig.5.17: Modifica soglia su ROI
5-40
In questo caso in figura 5.17 abbiamo diminuito la sogliatura su una regione specifica
Digitando più volte il segno +.
L’icona seguente consente di cancellare ROI disegnate in maniera erronea
Terminate queste operazioni se decidiamo che debbano essere definitive anche sulle
piastre successive , per memorizzare i valori identivicati digitiamo il seguente tasto.
Le modifiche, saranno memorizzate anche nei casi successivi. Se invece desideriamo
apporre e modifiche solo sulla piastra che è in analisi in questo momento digitaimo il tasto
di assenso senza salvare:
Il sistema esce dal menu di thresholding e passa a quello di elaborazione. L’immagine è
pronta per essere processata.
Se abbiamo compiuto errori e decidiamo di ripristinare il valore di sogliatura originale
cliccando sull’icona seguente riportiamo il sistema ai valori originali:
5.6.2 Soglia automatica con contrasto
Dal Menu opzioni selezioniamo la voce soglia automatica con contrasto
Fig.5.18: Selezione soglia automatica
Genikon
5-41
Rispetto alla modalità precedente la funzione è molto più limitata perchè nei contrasti
consente solo di modificare la luminosità dell’immagine e come per la precedente modalità
la sogliatura.
Rispetto alla precedente ha però il beneficio di modificare anche la luminosità su singole
regioni. Le altre icone hanno la stessa funzionalità prevista dalla precedente procedura
.
Fig.5.19: Soglia automatica
5.6.3 Soglia automatica Adattiva
Anche in questo caso la modalità è selezionabile dalla voce OPZIONI del menu principale.
Fig.5.20: Selezione Soglia automatica adattiva
La soglia adattiva rispetto alla precedente tende a uniformare il contrasto sull’immagine
5-42
Fig.5.21: Selezione Soglia automatica adattiva
Inoltre sempre rispetto all’automatica consene di imporre un filtro graduato sull’immagine
che generalmente modifica il contrasto dell’immagine ed apporta benefici al punto di
fuoco. Anche per questa modalità le icone restanti presentano sempre lo stesso significato
della soglia manuale. La scelta della diversa modalità di sogliatura è a discrezione
dell’operatore. In generale l’adattiva è la più semplice da utilizzare ma anche più restrittiva
della manuale che invece dà piena disponibilità di funzioni all’operatore.
N.B.: durante questa operazioni di sogliatura controllare attentamente che una soglia
troppo alta non provochi la frammentazione dei cromosomi: in particolare
controlliamo i satelliti dei cromosomi della classe D che sono più chiari e più critici. Il
controllo è semplice poiché la diversa colorazione dei contorni consente di
intravedere quando stiamo dividendo un cromosoma. E’ bene comunque non
tenere la soglia troppo bassa perché rischiamo di dover eseguire successivamente
troppi tagli di cromosomi in manuale in quanto il sistema riconoscerà più gruppi che
cromosomi singoli.
Nel caso in cui si siano fatte delle fusioni il sistema automaticamente presenta tutte le
immagini che costituiscono la cellula (immagine principale più fusioni, sulle quali,
singolarmente secondo il contrasto dell’immagine, dobbiamo sottrarre il fondo).
Genikon
5-43
5.7 Fusione di cromosomi esterni al campo
Dopo avere confermato la soglia per l’immagine principale e per ogni fusione (vedi avanti
come acquisire cromosomi esterni al campo) dobbiamo passare alla fusione dei
cromosomi .
L’immagine dei cromosomi esterni al campo è sulla finestra principale e dobbiamo
trasferire i cromosomi mancanti nell’immagine principale. Selezioniamo tutti i cromosomi
mancanti con il tasto di sinistra del mouse e facciamo click sull’icona di trasferimento
automatico , oppure trasferiamoli uno ad uno selezionandoli e tenendo premuto il tasto
di sx del mouse dalla finestra grande del fuse a quella della metafase minore in basso; se
dei cromosomi rimangono da separare possiamo utilizzare le funzioni di taglio offerte
dall’ambiente di fusione.
Fig.5.22: Fusione dei cromosomi nella metafase
I cromosomi passano sulla piastra principale in alto a sinistra in fila e sono caratterizzati da
una “F”; il numero sulla “F” indica da quale fusione provengono. Nel caso in cui si desideri
spostare un cromosoma, è sufficiente posizionarsi sopra con il tasto di sinistra del mouse
e, tenendo premuto, è possibile posizionarlo su una nuova collocazione.
Altrimenti con il tasto di sinistra del mouse i cromosomi possono essere trasferiti uno per
volta dall’operatore semplicemente selezionando il cromosoma sulla fusione e con il tasto
di sinistra premuto trasferire sull’immagine della metafase nella posizione desiderata. Al
termine invertiamo le due immagini per avere a schermo maggiore l’immagine della
metafase completa digitando col tasto sinistro del mouse sull’immagine della metafase.
L’acquisizione è finita possiamo procedere ad acquisire un’altra cellula o ad elaborare
l’immagine appena digitalizzata.
5-44
5.8 Controllo automatico del fuoco sull’immagine
Sempre in ambiente d’acquisizione, Genikon offre una funzione importante che si può
utilizzare anche se il microscopio non è dotato di un controllo elettronico del fuoco.
Digitando sull'icona del controllo automatico del fuoco il sistema chiede di seguire la
seguente procedura:
Fig.5.23: procedura per la cattura d’immagini utilizzando la funzione di fuoco automatico
Al termine il sistema mostra l’immagine della sequenza che ritiene essere la più a fuoco.
Genikon
6-1
6 Analisi ed Elaborazione delle immagini
Genikon offre due ambienti per analizzare le immagini acquisite.
Il primo, definito “Analisi ”, è dedicato all’analisi visiva ed alla conta dei cromosomi .
Il secondo, definito di “Elaborazione ”, offre invece tutte le funzioni per separare e
cariotipizzare le metafasi . Se non siamo soliti contare o analizzare a vista le metafasi
possiamo direttamente passare alla separazione dei cromosomi ed alla relativa
cariotipizzazione. Ad entrambe le procedure si accede dalla toolbar principale.
Alla fase di elaborazione si accede anche dalla videata dell’ambiente principale di Genikon
con un doppio-click analizzare sul tasto di sinistra del mouse nella finestra relativa
all’immagine. Entrambe le procedure prevedono che sia stato aperto il caso e che sia stata
caricata o acquisita almeno una metafase.
6.1 Ambiente d’Analisi delle metafasi
Il processo d’analisi delle metafasi consente di contare in automatico e /o manuale e di
appaiare manualmente gli omologhi.
Fig.6.1 Toolbar d’Analisi
Fig.6.2: Analisi delle metafasi a pieno schermo
6-2
6.1.1 Conta dei cromosomi
Nell’”Ambiente Analisi” troviamo una finestra principale di lavoro associata ad altre otto
finestre della galleria.
Posizioniamoci sulla finestra principale la cellula che dobbiamo analizzare.
Ci sono due possibilità di conta:
Abilita a contare in automatico i cromosomi. Un cromosoma identificato presenta un punto
rosso. Per rimuovere un dot, se la conta è errata, è sufficiente digitare il tasto di destra del
mouse, la conta automaticamente si aggiorna
Abilita a contare in manuale i cromosomi utilizzando il tasto di sinistra del mouse.
Sui singoli cromosomi compare un punto rosso (nel campo chiaro) o verde (nella
fluorescenza); per eliminarlo è sufficiente posizionarsi sopra e digitare il tasto di destra del
mouse, automaticamente la conta è aggiornata.
Sulla parte destra in basso all’ immagine è infatti indicato il numero degli oggetti contati
dall’operatore e dal sistema, (la conta eseguita può essere diversa se eseguita
dall’operatore o dal sistema che considera cromosomi si come un oggetto singolo).
Per annullare la conta eseguita ed iniziarne una nuova è sufficiente premere il tasto .
6.1.2 Appaiamento degli omologhi
Fig.6.3 Appaiamento degli omologhi
Con la funzione: ,si appaiano gli omologhi e si esegue un’Analisi Visiva.
Sono offerte una serie d’icone corrispondenti ad ogni coppia d’omologhi. Si seleziona il
cromosoma e si digita il tasto dx del mouse sul numero di coppia corrispondente.
Genikon
6-3
Per tornare all’inizio della fase di riconoscimento si utilizza l’icona seguente , che
cancella tutti i numeri collocati in precedenza. E’ possibile procedere in sequenza ed il
sistema presenta a due a due le coppie; oppure se desideriamo passare da una coppia di
cromosomi ad un’altra senza seguire alcun ordine, dobbiamo digitare il tasto di sinistra del
mouse sul numero corrispondente alla coppia specifica sulla toolbar del menu infine è
possibile selezionare il numero d’interesse dalla legenda attivata mediante il tasto destro
del mouse. Il sistema assegna colori ben precisi alla casella del numero d’appartenenza.
Se i cromosomi identificati sono due, la casella si colora di verde, se il cromosoma è
singolo blu ed infine se i cromosomi sono tre il colore sarà rosso.
6.2 Ambiente di Elaborazione
Offre le funzioni per separare, analizzare e cariotipizzare i cromosomi. L’ambiente è
identico nelle diverse modalità di lavoro quali campo chiaro, fluorescenza o FISH.
Fig.6.4: Menu d’Elaborazione in primo piano cariotipo
Le funzioni variano a seconda se stiamo visualizzando la metafase o il cariotipo
Fig.6.5: Menu d’Elaborazione con in primo piano metafase
6-4
6.2.1 Gestione immagini in Ambiente d’Elaborazione
Il sistema mostra, nel menu’ di elaborazione, 8 immagini in galleria che possono essere
spostate in primo o secondo piano digitando il tasto di sx sull’immagine che si desidera, a
queste si aggiungono altre tre immagini di dimensione maggiore. Le otto immagini della
galleria possono essere visualizzate a maggior ingrandimento digitando il tasto di destra
del mouse sull’immagine prescelta seguito dalla voce visualizza. Con questa modalità
possiamo confrontare metafasi tra loro e se desideriamo possiamo caricare a sinistra
anche un altro caso consentendo così di confrontare immagini provenienti da casi
differenti. Nel caso in cui sulla finestra a maggiore ingrandimento ci sia il collage, è
possibile trasferire dall’immagine della galleria un cromosoma per copiarlo sul collage
semplicemente selezionando il cromosoma e, tenendo premuto il tasto di sinistra del
mouse. Dobbiamo inoltre ricordare che sull’immagine principale possiamo ingrandire
Fig.6.6 Barra Elaborazione su cariotipo o metafase
digitando con il tasto centrale del mouse; se desideriamo muoverci sull’area ingrandita
possiamo digitare il tasto destro nel punto sul quale desideriamo muoverci. Abbiamo già
Genikon
6-5
osservato che una volta ingradita l’immagine con “visualizza” possiamo scorrere a
maggiore ingrandimento tutte le immagini della galleria utilizzando le frecce di avanti ed
indietro della tastiera.
6.2.2 Toolbar d’elaborazione dei cromosomi
Abbiamo visto che si tratta di due diverse Toolbar con funzioni diverse e specifiche. In
particolare se abbiamo in primo piano la metafase avremo anche la funzione della
creazione del cariotipo mentre se in primo piano è posizionato il cariotipo compariranno le
funzioni di allineamento degli omologhi e raffronto degli ideogrammi. Vediamo comunque
in dettaglio le singole funzioni.
La barra strumenti, in particolare per le operazioni di separazione dei cromosomi, è
rappresentata da funzioni che lavorano in manuale o in automatico secondo la
complessità dei raggruppamenti degli oggetti.
Vediamo in sequenza le diverse funzioni associate alla Barra Strumenti d’Elaborazione:
Selezione di tutti gli oggetti Deselezione di tutti gli oggetti Colorazione oggetti
Eliminazione oggettiRipristina oggetti eliminati
Aumenta contrasti con filtri Modifica luminosità Ripristina contrasti originali
Valutazione dei profili
Divisione automatica Divisione manuale Dissovrapposizione Auto Dissovrapposizione manuale
Auto Divisione di più gruppi Disegno assi Unione oggetti Annotazione e testi
Creazione collage Eliminazione collage Invio oggetti al collage Modifica fondo collage
Creazione manuale Cariotipo Creazione automatica Cariotipo
6-6
Con la creazione del cariotipo si aggiungono le seguenti Icone:
6.2.3 Identificazione delle strutture sulla metafas e e\o sul cariotipo
Sia sulla metafase che sul cariotipo, gli oggetti uniti si identificano mediante contorni a
colori continui. Il numero di cromosomi uniti sulla metafase dopo il processo di
acquisizione dipende dal valore di soglia che abbiamo immesso sulla nostra immagine;
tanto più alto è il valore imposto della soglia e tanto più divisi risulteranno i cromosomi. In
alcuni casi è comunque impossibile separare tutto con la sola sottrazione del fondo e
Allineamento centromeri
Posizione centromeri
Allineamento per lunghezza
Ingrandimento Raddrizzamento
Aggiustamento cromosoma ad
ideogramma Confronto omologhi
Inversione livelli Conta numero di bandePulizia dei cromosomi
Ideogrammi in manuale Ideogrammi in automatico
Genikon
6-7
dobbiamo necessariamente procedere ai tagli manuali o automatici; rischieremmo di
perdere informazioni importanti relative ai cromosomi (per esempio satelliti).
Fig.6.6: Agglomerati
Il sistema consente di identificare subito ed in toto quali sono gli agglomerati da separare
(Fig.6.6) comunque per analizzare in dettaglio quali sono i cromosomi uniti e disgiunti è
necessario passare con il mouse sulle strutture alle quali siamo interessate ed il sistema
mostra contorni continui o separati che evidenziano eventuali gruppi o cromosomi singoli.
6.2.4 Selezione e deselezione di cromosomi
Se dunque passiamo sui cromosomi senza digitare il mouse il sistema mostra dei quadrati
tratteggiati che indicano se i cromosomi appartengono o no allo stesso gruppo.
Fig.6.7: Oggetti evidenziati dal cursore del mouse prima della selezione
Nel caso precedente il rettangolo è tratteggiato ma unico per i due cromosomi, ciò indica
che dovranno essere separati.
Per selezionarli dobbiamo digitare il tasto di sinistra del mouse sull’oggetto desiderato.
Fig.6.8: Oggetto selezionato
6-8
In questo caso il rettangolo è continuo ed indica che i due cromosomi sono uniti ed è su
questi che possiamo lavorare per effettuare la separazione.
N.B.: Nelle divisioni è possibile selezionare contemporaneamente più gruppi ed il sistema
lavorerà su tutti in una volta.
6.2.5 Pseudocolore
Un’altra funzione, appartenente sempre al menu di elaborazione, aiuta l’operatore a
controllare quali sono i cromosomi separati e non: è la funzione dello pseudocolore: .
I cromosomi sono mostrati in colori differenti se sono separati, stesso colore se sono uniti.
Possiamo agire su quelli da dividere anche lasciando ON la funzione dello pseudocolore
ma non è raccomandabile poiché è difficile analizzare gli oggetti.
Fig.6.9: Oggetti senza pseudocolore
Fig.6.10: Oggetti con pseudocolore
La funzione dello pseudocolore ha un diverso effetto se dal “menu’ preferenze”
selezioniamo “attiva” la funzione indicata in Fig. 6.10
Fig.6.11 Opzione che applica colori casuali ai contorni
Genikon
6-9
In questo caso il sistema evidenzia con colori uguali i contorni di cromosomi uniti come
rappresentato in Fig.6.9.
Fig.6.11 Identificazione unioni mediante contorni
6.2.6 Separazione di cromosomi uniti
Esistono due tipi d’unione:
a) unione con contatto;
b) unione con sovrapposizione.
La procedura di separazione è completamente diversa.
A Separazione di cromosomi uniti per contatto
Dalla barra strumenti dell’ambiente d’analisi possiamo scegliere se separare in manuale o
in semi–automatico o in automatico (la scelta dipende dal grado di complessità
dell’unione).
Separazione manuale
Procedere come segue:
1. Selezionare la funzione di separazione manuale e semi - automatica dalla toolbar: ;
2. Selezionare il gruppo di cromosomi da separare;
3. Con il tasto di sinistra del mouse tracciamo la poligonale passante per i punti di contatto
tra i cromosomi. Mantenendo premuto il tasto del mouse, la poligonale è tracciata in
modo continuo, eseguendo invece dei click successivi con il tasto di sinistra è possibile
tracciare una poligonale a tratti. Il sistema agisce solo sui cromosomi selezionati
dall’operatore;
6-10
4. Terminare la poligonale facendo click con il tasto di destra del mouse;
5. E’ possibile effettuare nuovi tagli, ripetendo i passi tre e quattro;
6. Eseguire un ultimo click sul tasto di destra del mouse se tutti i cromosomi del gruppo
selezionato sono separati.
Il sistema mostra i contorni dei cromosomi separati ed aggiorna la conta in basso a
destra.
Se si desidera annullare l’operazione di taglio è possibile tornare indietro con la
funzione di “undo” .
Separazione semi – automatica
Per il taglio manuale e semi – automatico risulta utile la funzione di ingrandimento di
porzioni dell’immagine; tale funzione si attiva digitando due volte il tasto di sinistra del
mouse sul particolare dell’immagine che desideriamo ingrandire oppure utilizzando il tasto
centrale del mouse. Per tornare alle condizioni originali è sufficiente eseguire doppio click
sull’immagine ingrandita oppure premere il tasto centrale del mouse.
Procedere come segue:
1. Selezionare all’inizio la funzione di separazione manuale e semi – automatica dalla
toolbar: ;
2. Selezionare il gruppo di cromosomi da separare;
Fig.6.12 Selezione di un oggetto
3. Posizionarsi con il puntatore del mouse nel punto di taglio desiderato.
Fig.6.13 Posizionamento sul punto di taglio
4. Eseguire un singolo click con il tasto di destra del mouse;
Genikon
6-11
Fig.6.14 Separazione semi - automatica
Il sistema mostra i contorni dei due cromosomi separati ed aggiorna la conta in basso a
destra.
Separazione automatica
Procedere come indicato:
1. Selezionare i gruppi che si desidera separare in automatico. E’ possibile selezionare più
gruppi di cromosomi in contemporanea. In questo caso è necessario prestare
attenzione a tutte le separazioni che effettua il sistema ed al fine di rilevare tagli scorretti
su cui intervenire successivamente;
Fig.6.15: Seleziona multipla
2. Utilizzare l’icona di taglio automatico: oppure eseguire un click sul tasto di destra
del mouse;
3. Il sistema ad ogni click sul tasto destro del mouse separa un cromosoma dal gruppo,
circoscrivendolo con un colore differente dal resto del gruppo.
Fig.6.16: Cromosomi generati dalla separazione
6-12
Nel caso in cui non funzioni la separazione automatica o nel caso in cui non sia stata
precisa, possiamo utilizzare l’“undo” per procedere poi con il taglio manuale.
B Separazione di cromosomi uniti in sovrapposizione
Come per la divisione per contatto possiamo scegliere dalla barra strumenti se separare in
manuale o in automatico.
Dissovrapposizione manuale
Come per il taglio se non funziona la separazione automatica (si seleziona il gruppo e si
attiva la precedente funzione di dissovrapposizione automatica) possiamo utilizzare la
modalità manuale.
Nel caso in cui si presenti una situazione molto complessa è bene utilizzare la funzione di
disegno degli assi dei singoli cromosomi (vedi avanti).
Come si procede:
1. selezioniamo il gruppo;
2. Selezioniamo l’icona di separazione manuale: ;
3. Con il mouse, usando il tasto di sinistra posizioniamo quattro punti sugli angoli
dell’incrocio;
Fig.6.17: Dissovrapposizione manuale
4. Al termine digitiamo il tasto di destra del mouse.
Anche in questo caso il sistema mostrerà il tipo di taglio circoscrivendo i cromosomi con
un bordo colorato.
Fig.6.18: Cromosomi dopo dissovrapposizione
Genikon
6-13
Dissovrapposizione automatica
Per prima cosa è necessario selezionare i cromosomi da separare; in questo caso è
possibile lavorare su più gruppi di cromosomi in contemporanea.
Come si procede:
1. si seleziona il gruppo (o più gruppi);
2. si preme il tasto di dissovrapposizione.
Nel caso in cui il sistema non riesca ad agire in automatico (avverte l’operatore con un
messaggio) procediamo in manuale.
N.B.: il sistema non ricrea in maniera arbitraria le bande del cromosoma sottostante ma
lascia quelle del cromosoma posizionato superiormente.
Separazione di gruppi complessi di cromosomi median te disegno degli assi
Utilizziamo il disegno degli assi se si tratta di un’unione complessa:
Fig.6.19: Disegno dell'asse
1. Selezioniamo sul gruppo sul quale desideriamo agire;
2. Selezioniamo l’icona per disegnare gli assi;
3. Procediamo con il tasto di sinistra del mouse nel disegno dell’asse su ogni cromosoma
(anche in questo caso possiamo procedere in continuo tenendo premuto il mouse o a
tratti digitando più volte il tasto di sinistra del mouse).Vedremo comparire insieme
all’asse il contorno dei cromosomi identificato dal sistema;
4. Al termine di ogni cromosoma digitiamo il tasto di destra;
5. Disegnati tutti gli assi digitiamo nuovamente il tasto destro per terminare.
Per questa particolare separazione l’utente può decidere, utilizzando il menù di
personalizzazione, quanto margine può portarsi dietro un dato cromosoma e quindi quanto
è lo spessore dei cromosomi. Si consiglia di tenere questo valore un po’ più largo perché
questo faciliterà l’identificazione sul foglio del cariotipo dei cromosomi che provengono da
un overlapping (generalmente 125 % è un valore medio buono per cromosomi non troppo
allungati.
6-14
Fig.6.20 Definizione nelle "Opzioni" dello spessore dei contorni
N.B.: Se lavoriamo con un valore di spessore troppo basso è possibile che con il disegno
degli assi, se non siamo estremamente precisi e non passiamo esattamente nella
parte centrale del cromosoma, vengano eliminate delle porzioni di cromosoma.
Dovremo selezionare nuovamente i frammenti e riunirli al cromosoma mediante la
funzione d’unione oppure possiamo utilizzare la funzione di “undo” per ritornare
all’inizio della divisione degli assi.
Nell’immagine seguente è illustrato il caso in cui lo spessore medio dei cromosomi sia
basso rispetto ai cromosomi che stiamo analizzando.
Fig.6.21:Frammenti di cromosoma
Separazione completamente automatica
Genikon offre un’ulteriore funzione di separazione dei cromosomi da utilizzare nel caso in
cui si lavori con piastre non troppe complesse. Come si procede:
1. Selezioniamo tutti i gruppi da dividere;
2. Premiamo l’icona seguente .
E’ necessario che l’operatore controlli attentamente tutte le separazioni effettuate dal
sistema per correggere eventuali errori.
6.2.7 Unione di frammenti di cromosoma
Sempre dalla Barra principale possiamo utilizzare la funzione di unione di due cromosomi
rappresentata dalla seguente icona: .
E’ necessario selezionare uno per volta con il tasto di sinistra del mouse, i due frammenti
che desideriamo unire;
Genikon
6-15
1. Digitiamo l’icona per unire i due frammenti.
2. Attenzione Genikon consente di riunire solo due oggetti alla volta e solo quelli
selezionati tutto ciò è dovuto ad un controllo interno del sistema.
6.2.8 Funzione unione oggetti rapida
Nel caso in cui desideriamo unire due frammenti possiamo utilizzare il tasto di sinistra del
mouse tenuto premuto tra i punti che sono da congiungere, rilasciando il tasto di sinistra
automaticamente i due frammenti saranno uniti
Fig.6.22 Unione oggetti tramite mouse
6.2.9 Selezione di tutte le strutture
Consente di selezionare tutti i cromosomi in una sola volta .
Se desideriamo modificare il contrasto su tutti i cromosomi con un solo passaggio,
possiamo utilizzare l’icona di selezione di tutti e poi scegliamo il valore di contrasto.
Esiste un’altra possibilità per selezionare più oggetti in una sola volta. Se utilizziamo il
tasto di sinistra e poi trasciniamo il mouse (tenendo premuto il tasto di sinistra) viene
disegnato un rettangolo che ingloba e seleziona in automatico le strutture in esso
contenute. E’ una funzione utile per selezionare e cancellare in una sola volta tanti piccoli
frammenti.
6.2.10 Deselezione di tutte le strutture
Con questa funzione possiamo deselezionare in una sola volta tutti gli oggetti selezionati
sull’immagine: .
E’ l’esatto opposto della funzione precedente. Deseleziona tutto ciò che è stato
selezionato.
6-16
6.2.11 Eliminazione di strutture
La funzione consente di eliminare tutti gli oggetti selezionati sull’immagine. Come già
detto gli oggetti possono essere selezionati uno per volta, a gruppi utilizzando il mouse e
disegnando rettangoli d’inclusione, tutti insieme con l’icona già sopra descritta.
Le strutture eliminate possono essere rese invisibili se nelle opzioni di personalizzazione
abbiamo selezionato di non voler mostrare gli oggetti eliminati. Se invece abbiamo
selezionato di mostrarli, gli oggetti rimarranno visibili ma circoscritti con un bordo rosso
che indica la loro eliminazione dalla conta e quindi dal successivo cariotipo.
6.2.12 Ripristino di una struttura eliminata
Se erroneamente abbiamo cancellato una struttura che è invece essere un cromosoma
possiamo utilizzare questa funzione per ripristinarla: .
Dobbiamo selezionare l’oggetto eliminato (come detto risulta circoscritto di rosso) e
digitiamo il tasto di ripristino. Automaticamente l’oggetto ricompare anche sul cariotipo e si
aggiorna anche la conta cromosomica.
6.2.13 Correzione sfondo e luminosità
E’ la funzione che consente di scurire o schiarire gli oggetti selezionati. E’ possibile
decidere se si desidera lavorare su tutti i cromosomi o su singoli o su alcuni.
Si apre un sottomenu che consente di operare con due funzioni: luminosità e sfondo
(Fig.6.23).
Le due funzioni lavorano in combinata e l’effetto è complessivo è dunque meglio agire
prima con una, studiare l’effetto e poi con entrambe associate.
Fig.6.23: Correzione luminosità e sfondo
Luminosità
Consente di schiarire i cromosomi se portiamo il cursore verso valori positivi, o scurire se
andiamo verso il negativo. Il valore centrale zero non ha naturalmente effetto. L’intervallo
Genikon
6-17
di valori validi va da –10 a 10. Questa funzione si utilizza se abbiamo cromosomi troppo o
poco contrastati. La funzione agisce solo sui cromosomi selezionati; per procedere
possiamo prima vedere l’effetto dopo aver selezionato i cromosomi da variare, spostando
il cursore, quando raggiungiamo un buon contrasto, dobbiamo digitare il tasto d’assenso
verde per rendere la modifica effettiva. Solo dopo quest’operazione la modifica sarà
mantenuta e sommata alle operazioni successive. Se dunque desidero schiarire i
cromosomi devo lasciare il fondo tra i valori 0 e 255 mentre il cursore della luminosità si
sposterà da 0 a +10.
Sfondo
Agisce invece sul fondo della nostra piastra: permette di ottenere cromosomi con più o
meno fondo. I valori possibili per i due cursori sono tra 0 e 255. L’effetto del fondo è molto
utile se abbiamo metafasi con molto citoplasma. Anche se con l’effetto della soglia il fondo
si pulisce è possibile che i singoli cromosomi rimangano circoscritti di una patina grigia che
viene anche riportata poi sul cariotipo. Se dunque per esempio stiamo lavorando in campo
chiaro possiamo eliminare questo contorno selezionando i cromosomi sui quali
desideriamo lavorare ed alzando in positivo il valore del fondo.Se invece lavoriamo in
fluorescenza selezioniamo i cromosomi sui quali desideriamo lavorare e diminuiamo il
valore del fondo. Con questa modalità parte del fondo dovrebbe scomparire. Anche in
questo caso la funzione agisce solo sui cromosomi selezionati; per osservare come agire
possiamo prima vedere l’effetto spostando il cursore e quando raggiungiamo un buon
contrasto possiamo digitare il tasto d’assenso verde. Solo dopo quest’operazione la
modifica sarà mantenuta e sommata alle operazioni successive.
6.2.14 Funzione di affinamento dei contorni
Anche questa funzione apre una finestra che offre differenti modalità di affinamento dei
contorni. Consente di utilizzare filtri specifici a seconda della modalità di lavoro:
G/R/Q/dapi. Per ogni serie di filtri possiamo avere tre livelli di potenza. Oltre alle due serie
specifiche per le bande G/Q è offerta anche la possibilità standard di utilizzare filtri
affinamento o smorzamento che possono essere combinati per ottenere algoritmi specifici.
6-18
Fig.6.24: filtri disponibili e potenza
Anche l’aumento o diminuzione del contrastoo agisce unicamente sui cromosomi
selezionati.
6.2.15 Ripristino dei cromosomi
Riporta i valori di contrasto, luminosità e di affinamento dei cromosomi alle condizioni
originali: . Non è un “Undo” poiché non annulla solo l’ultima funzione ma riporta i
contrasti dell’immagine così com’era stata acquisita dopo la sottrazione della soglia.
6.2.16 Profilo
Consente di osservare la distribuzione dei livelli di grigio lungo l’asse del cromosoma. In
teoria cromosomi omologhi dovrebbero mostrare lo stesso profilo; in realtà il profilo varia
secondo il livello di despiralizzazione del cromosoma. Un esempio di profilo è riportato in
Fig.6.25.
Fig.6.25: Profilo di un cromosoma
6.2.17 Ideogrammi di confronto
Esistono due diverse modalità di costruzione d’ideogrammi. Una modalità manuale ed
un’automatica. Qualunque sia la modalità gli ideogrammi che si ottengono possono essere
trasferiti sulle immagini del collage, cariotipo o metafase per eseguire confronti.
6.2.17.1 Modalità manuale
Il tasto apre il menu degli ideogrammi per la costruzione manuale.
Per l’ideogramma trasferito su cariotipo, metafase o composizione sono disponibili una
serie d’utility accessibili mediante legenda (fig. 6.23). Per accedervi è sufficiente
posizionarsi sull’ideogramma e premere il tasto destro del mouse.
NB: La lista delle funzioni si mostra solo con ideogramma NON SELEZIONATO. In caso
Genikon
6-19
contrario la pressione del tasto destro del mouse comporta la separazione
dell’ideogramma nel punto di posizionamento del cursore.
Fig.6.26 Lista funzioni dell’ideogramma
Utility ideogramma
Voce legenda Descrizione
Bande RLa selezione della voce in oggetto consente un aggiornamento in tempo reale della
visualizzazione. Nel rispetto della risoluzione scelta si può visualizzare il bandeggio
di tipo G oppure quello di tipo R.
MOSTRA BANDE
La selezione della voce
comporta la visualizzazione
delle etichette NOME BANDA al
passaggio del cursore sulla
banda dell’ideogramma NON
SELEZIONATO. Per etichettare
in modo permanente una
banda è sufficiente eseguire
un click con il tasto sinistro
del mouse sulla banda
d’interesse. Per la rimozione
è sufficiente un secondo click.
Le etichette inserite
permangono anche in seguito
alla deselezione della voce
MOSTRA BANDE.
400 L’immagine dell’ideogramma è aggiornata in tempo reale al variare della risoluzione
6-20
550
850
scelta.
COLORE…
La voce in oggetto apre
una tabella colori su cui
è possibile scegliere o
creare un nuovo colore
da associare al
bandeggio.
MODIFICA
ETICHETTA…
E’ possibile inserire una
stringa descrittiva
dell’ideogramma
oppure modificare
quella esistente.
RUOTA
La selezione di questa voce di legenda comporta una rotazione dell’ideogramma
nella direzione indicata dal cursore del mouse. Lo spostamento del cursore causa un
incremento o diminuzione dell’angolo di rotazione. Un click sul tasto sinistro del
mouse convalida l’angolo di rotazione visualizzato.
NB: Nell’ipotesi in cui sia desiderabile eseguire una rotazione di 180° o ribaltamento
dell’ideogramma in esame è consigliabile l’impiego dell’apposita funzione accessibile
dal tasto
Per l’oggetto ideogramma sono attive le seguenti funzioni:
Separazione
Un ideogramma può essere separato in qualsiasi punto. La funzione si attiva selezionando
l’ideogramma d’interesse con il tasto di sx del mouse, ci si posiziona in un punto interno
Genikon
6-21
alla banda in corrispondenza del quale si desidera eseguire il taglio e quindi digitando il
tasto destro del mouse si effettua la divisione in due frammenti.
Unione
Per eseguire l’operazione d’unione non è necessario allineare i due oggetti da unire. E’
sufficiente selezionare i due elementi e quindi premere il tasto d’unione
Fig.6.24 Unione di due frammenti d’ideogramma
L’ideogramma risultante assume come angolo di rotazione quello eventualmente
posseduto dall’oggetto di testa. L’unione è sempre eseguita mantenendo le posizioni
relative.
6.2.17.2 Modalità automatica
Il tasto apre la finestra d’editing delle anomalie ideogrammi in modalità automatica
Per prima cosa è possibile la risoluzione di banda alla quale desideriamo lavorare e la
scelta è da 400-55-850 digitando sulla finestra seguente il valore prescelto
Fig.6.27 Identificazione risoluzione di bandeggio
E’ inoltre possibile rappresentare gli ideogrammi normalmente in G ma se si desidera
possiamo selezionare la modalità in R
Fig.6.28 Selezione bande R
6-22
Possiamo inoltre selezionare il colore che desideriamo imporre ai frammenti che indicano
l’aberrazione (nella figura è rappresentato il rosso)
Fig.6.29 Definizione colore
E’ anche possibile eliminare il colore deselezionando il flag. Per iniziare a costruire
l’anomalia è necessario specificare quale anomalia stiamo analizzando. E’ possibile
scegliere fra traslocazioni, delezioni, inversioni, duplicazioni selezionando la finestra
seguente
Fig.6.30 (a/b) descrizione del tipo d’aberrazione
Dobbiamo ora indicare al sistema quali sono i cromosomi interessati:
Fig.6.31 Segnalazione cromosomi
E’ necessario posizionarsi con il mouse sull’ideogramma e spostarsi lungo l’asse per
vedere scorrere il numero di banda ci fermiamo alla banda d’interesse. Eseguiamo la
stessa cosa sul secondo cromosoma interessato. A questo punto per rappresentare gli
ideogrammi con l’anomalia digitiamo mostra sul menu seguente:
Fig.6.32 Risultato Ideogrammi
Genikon
6-23
Questi due ideogrammi possono essere trasferiti sull’immagine della finestra maggiore nel
menu d’elaborazione, utilizzando il tasto di sinistra mantenuto premuto e trascinando il
mouse sulla finestra interessata. Possiamo decidere se mantenere nel nostro archivio
Fig.6.33 Archiviazione Anomalie
questo tipo d’anomalia digitando “Aggiungi” nel menu seguente. Nel riaprire il menu
successivamente noteremo che il tipo d’anomalia rimane e possiamo richiamarla senza
dover ricreare gli ideogrammi corrispondenti.
6.2.18 Aggiustamento dimensione ideogrammi a cromos omi
Accade spesso di dovere ingrandire il cromosoma e dover poi, per analizzare le bande,
aggiustarlo alla stessa dimensione dell’ideogramma. Dopo aver trasferito sul collage
cromosoma ed ideogramma selezioniamo entrambi e digitiamo la funzione di
autoaggiustamento:
Fig.6.34 Senza auto_aggiustamento Fig.6.35Con auto_aggiustamento
6.2.19 “Undo”
La funzione di “undo” consente di tornare indietro dall’ultima operazione eseguita: .
6-24
6.2.20 Salvataggio
Consente di salvare le modifiche effettuate sull’immagine ( ).
6.2.21 Uscita dall’ambiente d’elaborazione
Esce dall’ambiente d’elaborazione e salva le modifiche effettuate.
Ogni volta che esco da questo menu il sistema chiede all’utente se si desidera salvare le
modifiche effettuate sull’immagine.
6.2.22 Creazione e modifica del cariotipo
Fig.6.36 Modalità automatica Fig.6.37 Modalità manuale
Terminata la separazione dei cromosomi possiamo procedere alla creazione del cariotipo.
Il cariotipo può essere creato in automatico o in manuale; la differenza fondamentale tra le
due procedure consiste nel fatto che mentre col cariotipo automatico è il sistema che
mostra una proposta del riconoscimento dei cromosomi, nel caso del cariotipo manuale è
l’operatore che assegna ad ogni cromosoma il numero specifico di classe.
Il sistema in automatico appaia gli omologhi in base alla lunghezza, posizione del
centromero e distribuzione dei livelli di grigio.
Nel caso di creazione del cariotipo in modalità automatica il sistema discrimina, in
base alla modalità di acquisizione impiegata, il tipo di bandeggio ed il tipo di cromosomi
(corti, medi lunghi) in analisi. Unica eccezione: l’acquisizione in CAMPO chiaro, in questo
caso l’utente è tenuto ad indicare se trattasi di un bandeggio di tipo G oppure R.
A creazione avvenuta l’immagine della metafase passa nella finestra in basso a sinistra ed
il cariotipo si sposta sulla finestra principale.
Genikon
6-25
Fig.6.38: Cariotipo
Aggiustamento del cariotipo
Genikon può commettere errori nel riconoscimento di alcuni cromosomi, in questo caso è
opportuno eseguire un aggiustamento del cariotipo. La gestione delle finestre delle
immagini è la seguente: per spostare la finestra della metafase sulla finestra principale
facciamo click con il tasto di sinistra del mouse sull’immagine della metafase; per
visualizzare un’altra metafase e cariotipo (le immagini delle metafasi e dei cariotipi sono
sempre legate insieme) digitando il tasto sinistro due volte sulla metafase della galleria, la
carichiamo insieme al cariotipo. Se vogliamo aumentare il valore d’ingrandimento
digitiamo il tasto centrale del mouse digitando nuovamente il tasto centrale torniamo a
fattore d’ingrandimento uno. La possibilità di spostare le due immagini della metafase
con il cariotipo è una funzione molto comoda. Se non abbiamo separato due cromosomi
che risultano uniti sul cariotipo possiamo selezionare la coppia unita, invertire l’immagine
del cariotipo con quella della metafase dove automaticamente risultano selezionati e
procedere come al solito alla divisione Automaticamente ciò che facciamo sulla metafase
si esegue anche sul cariotipo e viceversa (consideriamo comunque che i cromosomi
possono essere divisi direttamente anche sul cariotipo). Vediamo ora come aggiustare la
posizione dei cromosomi sul foglio del cariotipo. Per spostare un cromosoma :
selezioniamo il cromosoma da spostare con il tasto sinistro del mouse; teniamo premuto e
spostiamo il mouse fino al raggiungimento della posizione corretta; il cromosoma si sposta
seguendo i movimenti del mouse. Rilasciamo il tasto del mouse quando il cromosoma è
posto nella giusta posizione. Se desideriamo invertire due cromosomi uno con l’altro è
6-26
sufficiente selezionare il primo e sovrapporlo al secondo automaticamente saranno
scambiati.
Per rovesciare completamente un cromosoma (di 180°) è sufficiente digitare tasto di
destra del mouse sul cromosoma da invertire.
Per ruotare parzialmente un cromosoma è sufficiente tenere premuto il tasto di destra del
mouse e muovere il mouse sul cromosoma interessato: il sistema mostra lo mantenendo
sul fondo il cromosoma originale, rilasciando il mouse il sistema lascia l’ultima angolatura.
6.2.23 Formato del cariotipo e posizione dei centro meri
Esistono funzioni ulteriori che consentono di aggiustare il formato del cariotipo e la
posizione dei centromeri.
Queste funzioni sono attive nel momento in cui è stato creato il cariotipo e solo ora
compaiono sulla toolbar.
La prima funzione ( ) si utilizza per allineare tutti i cromosomi rispetto al
centromero . Normalmente i cromosomi sono tutti allineati alla base (Fig.6.20); con questa
funzione il sistema allinea tutti i cromosomi di una stessa riga sul centromero più alto
(Fig.6.37).
Fig.6.39: Allineamento cromosomi alla base Fig.6.40:Allineamento cromosomi per centromero
Quando i cromosomi sono allineati sul centromero, la posizione del centromero individuata
dal sistema è evidenziata con dei tratti orizzontali. Qualora il sistema non avesse
individuato correttamente il centromero, è possibile intervenire manualmente per mezzo
della funzione che si attiva con l’icona . Il cursore del mouse cambia in , ed ora è
possibile fissare la posizione corretta dei centromeri.
Genikon
6-27
La seconda funzione è l’autoallineamento : consente di riaggiustare il formato del
cariotipo a seconda della lunghezza dei cromosomi ( ).
Può essere utilizzata contemporaneamente alla funzione d’allineamento sui centromeri
Fig.6.41: Cariotipo non autoallineato Fig.6.42: Cariotipo autoallineato
Tra la prima immagine e la seconda si nota che il sistema varia l’utilizzo dello spazio in
basso sfruttando tutto il foglio. Se dunque abbiamo cromosomi particolarmente allungati il
sistema consente di riaggiustare il foglio del formato per fare collocare correttamente
anche cromosomi di tale tipo.
6.2.24 Modifica dei cromosomi
I tasti e servono per ribaltare i cromosomi selezionati nei due sensi.
E’ anche possibile ingrandire i cromosomi selezionati per mezzo della funzione
(scalatura). Si apre la finestra di Fig.6.43, dove è possibile scegliere un ingrandimento tra
50 e 200 %.
Fig.6.43: Modifica della geometria
6-28
6.2.25 Ritocco dei cromosomi
Fig.6.44 La gomma ha dimensioni differenti selezionabili
E’ possibile ritoccare eventuali cromosomi che presentano alcune parti sgradevoli alla
vista, come residui dovuti a delle separazioni approssimative. Si può utilizzare la funzione
della gomma , dopo aver selezionato un cromosoma. Quando il tasto è in posizione ON,
se ci si avvicina con il cursore del mouse, tenendo il bottone di sinistra premuto, si noterà
che la parte di cromosoma prossima al cursore scompare. La sequenza di Fig.6.45 mostra
un cromosoma che necessita di un ritocco, e come la funzione suddetta cancelli il
cromosoma modificando in maniera appropriata il contorno.
Fig.6.45:Cromosoma prima e dopo il ritocco
6.2.26 Conteggio delle bande
Genikon presenta una funzione che calcola automaticamente il numero di bande di un
cariotipo. L’icona da selezionare è . Il risultato del conteggio è espresso in basso a
destra dell’immagine cariotipo usando una notazione che riduce il risultato all’intervallo di
valori più probabile. La funzione è di tipo ON/OFF. La funzione è attiva e presente quando
in primo piano è collocato il cariotipo.
Genikon
6-29
6.2.27 Aggiunta di testo e frecce
E’ possibile inserire testi e frecce nella metafase, nel cariotipo e nel collage, premendo il
tasto .
Fig.6.46: Strumenti d’editing
La finestra che si apre (Fig.6.46) permette anche di scegliere il tipo di carattere e il colore.
Permette inoltre l’introduzione di Frecce. Una volta introdotte le frecce sull’immagine
possono essere anche successivamente modificate digitando il tasto dx del mouse.
Fig.6.47 Editing d’immagine
6.2.28 Creazione d’immagini “composizione”
Per trasferire gli oggetti selezionati, per fare dei confronti o per “incollare” oggetti di diversa
natura, premere il tasto . In questo modo è creata (se non c’è già) un’immagine
“composizione” (s’inizia con C1). Per “incollare” oggetti provenienti da altre immagini,
digitare il tasto destro del mouse sull’anteprima dell’immagine che ci interessa, scegliere la
6-30
voce “Visualizza …” dal menù che compare, e trascinare gli oggetti che ci interessano
sulla “composizione”, utilizzando il tasto di sinistra premuto.
Mediante il tasto è possibile aggiungere una o più composizioni vuote. La loro
eliminazione è eseguibile mediante l’icona seguente .
consente di invertire il colore di sfondo della “composizione” corrente; se per
esempio dobbiamo trasferire cromosomi da Fish possiamo imporre alla composizione il
fondo nero.Le composizioni a corredo di un caso sono visibili in galleria selezionando:
nell’ELENCO DEI VETRINI. La visualizzazione della singola composizione nell’AMBIENTE
D’ELABORAZIONE IMMAGINI è resa possibile dall’organizzazione in FOLDER. Un semplice click
con il tasto sinistro del mouse sull’etichetta della composizione d’interesse, la dispone in
primo piano.
Fig.6.48: Composizione C1 in primo piano
6.2.29 Confronto tra omologhi
E’ possibile confrontare tra loro tutti i cromosomi del caso corrente che sono stati attribuiti
alla medesima classe utilizzando la seguente funzione:
Si apre la finestra mostrata in Fig.6.49.
Fig.6.49: Finestra per il confronto tra omologhi
Nelle caselle bianche è necessario inserire il numero della classe di omologhi che
desideriamo visualizzare; sarà così possibile confrontare in contemporanea 2 coppie di
omologhi relative a tutti i cariotipi creati in precedenza ed appartenenti a quel caso
specifico. Se selezioniamo la voce mostra ideogramma il sistema visualizza sulla sx anche
l’ideograma relativo alla coppia selezionata. I cromosomi possono essere anche modificati
dimensionalmente utilizzando la seguente icona:
Genikon
6-31
Se spostiamo da dx a sx diminuiremo la dimensione.
Con la seguente icona invece possiamo spostare da sx a destra i cromosomi nel caso in
cui non sia possibile visualizzarli tutti perché sono stati fatti molti cariotipi.
Anche in questo caso il tasto: ,serve per trasferire i cromosomi selezionati nel
“collage”.
6.2.30 Raddrizzamento di un cromosoma
Fig.6.50 Cariotipo non raddrizzato Fig.6.51 Cariotipo raddrizzato
Per rendere attiva la funzione sono stati selezionati tutti i cromosomi e selezionata la
funzione di raddrizzamento. Naturalmente lo scopo maggiore si ottiene quando lavoriamo
su un collage e desideriamo eseguire un confronto con gli ideogrammi.
Fig.6.52 Raddrizzamento cromosomi su collage
Genikon
7-1
7 Analisi in FISH
Genikon anche per l’analisi in FISH acquisisce immagini monocromatiche per piano di
fluorescenza ed impone ad ogni singola componente uno colore scelto dall’operatore.
Fig.7.1: Analisi in FISH
Il programma della FISH è integrato nella stazione con quello della cariotipizzazione ed
utilizza, infatti, gran parte delle funzioni che abbiamo già esaminato per il campo chiaro e
la fluorescenza. La gestione dei casi è identica all’altro due modo (campo chiaro e
fluorescenza); nella fase d’acquisizione si osservano alcune peculiarità che facilitano
l’operatore ad acquisire sequenze d’immagini corrispondenti ai singoli fluorocromi.
7.1 Acquisizione d’immagine in FIS
L’ambiente della FISH si abilita nel momento in cui in fase d’acquisizione si seleziona
l’icona della FISH: .
7.1.1 Creazione della lista d’acquisizione dei fluo rocromi
Rispetto alla fase d’acquisizione standard in campo chiaro e/o fluorescenza il programma
consente di creare una lista di fluorocromi che corrisponde alla sequenza con la quale li
desideriamo fotografare.
7-2
Fig.7.2: Creazione di un profilo
Introduciamo il nome della lista, o nel caso in cui si sia già lavorato col Sistema, possiamo
richiamare la lista dalla memoria del Sistema
Fig.7.3: Ricarica di una sequenza precedentemente impostata
7.1.2 Creazione nuovi fluorocromi
Se il Sistema è vergine dovremo introdurre noi i fluorocromi e definirne anche il colore
( ). Fig.7.4 Inserimento nuovo fluorocromo
Introduciamo il nome del nostro fluorocromo e definiamo ora il colore, nel caso del DAPI è
per esempio azzurro
Fig.7.5 definizione del colore
Fig.7.6 selezione del colore
Per scegliere il colore corretto, ci posizioniamo con il tasto di sx del mouse sul colore
prescelto, digitiamo poi OK per accettare.
Genikon
7-3
Possiamo scegliere il nome del filtro associato sul microscopio, nel caso in cui al sistema
sia interfacciato un microscopio motorizzato.
Fig.7.7 Selezione del filtro corrispondente sul microscopio
E’ inoltre possibile per ogni fluorocromo scegliere il numero di piani d’acquisizione e la
distanza fra ognuno nel caso in cui sia presente sul microscopio un controllo automatico
del fuoco. Generalmente la definizione del numero di piani e lo spessore è a discrezione
dell’operatore.
Fig.7.8 Definizione del numero di piani per singolo fluorocromo
7.1.3 Trasferimento fluorocromi alla lista
Una volta definiti i fluorocromi, possiamo trasferirli alla lista.
7-4
Fig.7.9Trasferimento dei fluorocromi sulla lista
Teniamo premuto il tasto di sinistra del mouse sul nome e trasciniamolo a sinistra,
consideriamo che la lista della sequenza corrisponde a quella d’acquisizione. Nel caso in
figura il primo fluorocromo da acquisire sarà il dapi e seguiranno FITC e Trita.
Automaticamente il Sistema definisce il primo fluorocromo come counterstain ma questo
sarà modificabile in ogni momento. Da questo momento in poi nella lista rimarranno
memorizzati: colore, filtro e piani focali mentre i valori di set UP della telecamera devono
essere testati durante la fase d’acquisizione ed ogni volta memorizzati all’interno della
lista. Se invece il fluorocromo è stato inserito nella lista per la prima volta consideriamo
che i valori del set up sono tutti al minimo.
7.1.4 Memorizzazione della lista dei fluorocromi
Per rendere la lista attiva salviamola per poterla utilizzare altre volte.
Fig.7.10 Memorizzazione della lista
Abbiamo visto che nel caso in cui ci sia una motorizzazione (ruota o microscopio) è nella
definizione del fluorocromo che dobbiamo assegnare il filtro.
N.B. le opzioni di collegamento a ruota o Microscopio motorizzato si mostrano
automaticamente a questo livello solo se nel Menu’ delle personalizzazioni abbiamo
selezionato di interfacciare una specifica periferica al sistema. Se per esempio è stato
selezionato il microscopio E1000 il sistema mostrerà sotto alla lista del colore la lista dei
filtri da associare a quel fluorocromo. In particolare poiché l’installazione di un microscopio
motorizzato è fatta all’origine a questo livello sarà già nominato il nome del fluorocromo
specifico con la sistemazione del corretto blocchetto per la fluorescenza.
Per definire il counterstain della lista utilizziamo l’icona seguente:
Genikon
7-5
Per cambiare la posizione della selezione del counterstain è sufficiente digitare due volte il
tasto di sinistra del mouse sulla sx del nome del fluorocromo:
Fig.7.11 Definizione del counterstain
Il profilo della lista può essere salvato in maniera tale che tutte le volte che desideriamo
lavorare con quella specifica sequenza dovremo semplicemente richiamarla dalla
memoria.
Fig.7.12: Conferma di aggiornamento del profilo
E’ sufficiente premere su “Sì”. Ogni volta che variamo qualcosa sul profilo se desideriamo
salvare la modifica dovremo nuovamente aggiornarlo.
7.1.5 Acquisizione dei fluorocromi
Possiamo ora procedere all’acquisizione dei fluorocromi.
N.B.: Con i sistemi di cariotipizzazione e FISH automatici è fondamentale che i microscopi
siano completi dei filtri corretti per i fluorocromi che vengono utilizzati.
In particolare è indispensabile che i filtri siano selettivi per ogni fluorocromo.
7-6
E’ impossibile lavorare con filtri a doppia o a tripla banda a meno che non si spostino le
eccitazioni d’ogni fluorocromo. Con questa tecnica si ottengono ugualmente fluorescenze
singole ma di intensità luminosa ridotta rispetto ai singola banda poiché comunque sia
stiamo lavorando con un dicroico ed un barriera a tripla banda.
E’ inoltre necessario precisare che con il sistema è possibile lavorare con microscopi in
manuale oppure in automatico (se al microscopio sono collegate ruote filtri o microscopi
motorizzati). Se il microscopio è manuale l’operatore dopo ogni acquisizione di un singolo
fluorocromo deve spostare il blocchetto corrispondente alla sonda successiva presente
nella sequenza. Se invece ho una ruota filtri o un microscopio motorizzato è il sistema che
seleziona la lunghezza d’onda e presenta sul monitor l’immagine live dei fluorocromi
appartenenti alla sequenza. Per iniziare ad acquisire le immagini dobbiamo selezionare
le icone di acquisizione:
( oppure ).
A differenza delle altre modalità dobbiamo poi però utilizzare nuove funzioni per
memorizzare le singole fluorescenze, in particolare il simbolo della macchina fotografica
collocato sulla destra del nome d’ogni fluorocromo.
Prima di digitare il tasto di acquisizione dell’immagine è necessario che le immagini siano
ben contrastate ed eventualmente se necessario variamo i valori di set UP della TV
CAMERA utilizzando le regolazioni a disposizione. Come per la fluorescenza dobbiamo
valutare che l’esposizione sia corretta (nella finestra delle regolazioni) altrimenti non
vedremo sul monitor nessun’immagine. Una volta ottenuto il contrasto corretto e messo a
punto il fuoco dobbiamo salvare il set-up per il particolare fluorocromo in maniera tale che
la successiva sequenza che andremo ad acquisire non avrà più bisogno di alcun
aggiustamento. Se digitiamo sull’icona della telecamera il sistema memorizza l’immagine
del primo fluorocromo (DAPI) mostra l’immagine a destra in piccolo e passa al fluorocromo
successivo. A questo punto è necessario spostare il blocchetto della fluorescenza (se il
sistema è automatizzato lo farà da solo) e nuovamente dobbiamo controllare le regolazioni
per il secondo fluorocromo. Anche in questo caso memorizziamo il valore delle regolazioni
come abbiamo fatto per il primo fluorocromo. Dovremo fare queste operazioni per tutti i
fluorocromi presenti nella sequenza poiché Genikon deve, almeno per la prima volta,
memorizzare i valori di luce corretti per ogni “probe”. Al termine digitiamo sul simbolo di
termine di acquisizione come accadeva per le altre modalità di acquisizione.
Genikon
7-7
Il sistema mostra subito l’immagine di composizione (denominata FH) che però se il
preparato non è molto buono dovrà essere elaborata nella sottrazione della soglia.
7.2 Sottrazione della soglia per immagini Fish
E’ importante eliminare il fondo da ogni fluorocromo (immagine) acquisito nella sequenza.
Fig.7.13: Sottrazione del fondo da un'immagine acquisita sul counterstain
Lo slide del contrasto funziona esattamente come nel campo chiaro o QFQ. Le altre icone
invece hanno il seguene significato: :
� Annulla le zone definite in precedenza
� Aggiunge nuove ROI all’immagine selezionata
� Cancella una ROI
� Quesa funzione rispetto al campo chiaro consente di
disegnare le regioni di interesse con modalità diversa dalla mano libera E’ dunque
possibile disegnare rettangoli , cerchi che facilitano la selezione di piccole spot.
� Questa icona consente di identificare con una sogliatura le soglie sottraendo
in modalità automatica tutto il fondo.
7-8
Iniziamo dal counterstain poiché il sistema tiene in considerazione il fondo come soglia
massima sul quale verrano poi “adesi” gli altri piani di fluorescenza.
Fig.7.14: Sottrazione del fondo da un'immagine acquisita sul counterstain
Solo sul counterstain è visibile tutta l’immagie e solo sul counterstain possiamo filtrare e
vedere il controno. Sempre e solo sul counterstain è possibile memorizzare il default per le
cellule successive. Tutto ciò che non rientra nel counterstain e presente invece negli altri
piani di fluorescenza verrà comunque non considerato dal sistema. Il sistema mostra i
contorni relativi alla soglia ed al grado di separare degli oggetti presenti nel counterstain
con la stessa modalità già osservata nel campo chiaro e per la fluorescenza (bande Q).
Anche in questo caso possiamo aumentare il valore di soglia facendo attenzione a non
sottrarre troppo dal contorno perché questo equivale ad eliminare anche segnali che
stanno sui bordi dei cromosomi. (per esempio nel caso dei Telomeri). Una volta accettata
la soglia per il counterstain possiamo analizzare quella relativa agli altri piani di
fluorescenza.
Fig.7.15: Selezione dei fluorocromi non COUNTERSTAIN
A differenza del DAPI se andiamo a selezionare le singole componenti (in alto a sx
dell’immagine principale). Possiamo o agire in toto sull’immagine muovendo lo slider o
selezionando il range di lavoro. Invece sulle immagini dei singoli piani possiamo
Genikon
7-9
selezionare singole regioni di interesse ed aggiungerle al piano singolo del fluorocromo
intenificando o diminuendo la potenza di singoli spot.
Per disegnare una regione disegnamo con il mouse lo spot ed agiamo successivamente
sul contrasto.
Fig.7.16: Prima della definizione della ROI
Fig.7.17: definizione della singola ROI
Quando la regione ha il giusto contrasto possiamo procedere ad aggiungerla utilizzando
l’apposita icona:
Il sistema aggiunge solo le due spot della componente della fluorescina.
7-10
Possiamo disegnare altre zone ed aggiungere via via le singole spot. Al termine quando
tutte le spot di nostro interesse sono trasferite digitiamo il tasto di assenso.
Nel caso in cui non si desideri lavorare su singole spot è sufficiente sogliare tutta
l’immagine relativa a quello specifico piano di fluorescenza per modificare con un solo
passaggio il contrasto ad esso relativo
Quando tutte le componenti appartenenti alla lista di acquisizione sono state modificate ed
elaborate accetiamo definitivamente la sogliatura utilizzando il tasto di consenso:
In particolare e solamente su quest’immagne (FISH) è possibile aggiustare eventuali shift
avvenuti sull’immagine causati da errori dell’operatore o del microscopio. Se lo shift è fisso
Fig.7.17 Calibrazione degli “offset”
possiamo memorizzarlo sulla lista di acquisizione per avere la correzione effettiva ogni
volta che catturiamo un’immagine. In particolare l’utilizzo delle frecce nere consente
di spostare a dx,sx, alto e basso le spot sul counterstain. Quando è avvenuta la correzione
possiamo selezionare la lista (SPECORANGE in questo caso) e salvare la variazione con
il tasto di assenso.
Fig.7.18 salvataggio delle modifiche
Fig.7.19 Prima del riallineamento Fig.7.20 Dopo il riallineamento
Genikon
7-11
Dobbiamo ricordare che Genikon consente di ritornare sempre sulla sogliatura. Per fare
questo, è sufficiente ritornare al menu’ principale e digitare il tasto di destra con visualizza
Fig.7.21 Sogliatura di immagini memorizzate
E’ necessario fare attenzione poiché nel caso in cui sia stato eseguito il cariotipo
l’operazione di sogliatura cancella il cariotipo precedentemente creato.
7.3 Acquisizione 3D focus in Fish
Questa funzione della Fish consente di eseguire acquisizioni in fluorescenza su più piani
per i singoli fluorocromi immessi nella lista. L’operatore deve decidere a priori quanti piani
ed il relativo spessore che desidera acquisire; il sistema al termine dell’acquisizione dei
fluorocromi mostra le immagini dei singoli fluorocromi ognuna delle quali sarà costtuita
dalla somma di tutti i piani focali identificati.
La procedura è simile all’acquisizione in FISH standard e per iniziare come per la FISH
dobbiamo entrare nel menu’ di aquisizione dala Main toolbar:
Fig.7.22 Introduzione alla Fish automatica
7-12
Prima di fare questo dobbiamo considerare che il sistema ricerca una telecamera che
supporta il modulo (attualmente:COHU–DS2Mcooled,HamamtsuORCA) ed un
microsocpio che abbia lo spostamento automatico dei filtri (90i-Testa digitale +80i- 80i con
fuoco prior); sarà dunque necessario che sotto al menu’ OPZIONI tali periferiche siano
selezionate ed attive, altrimenti non sarà possibile procedere oltre.
Fig.7.23 Configurazione hardware per FISH automatica 3Dfocus
Digitando l’icona seguente si entra in acquisizione
e si apre il menu relativo alla sequenza dei fluorocromi alla quale si aggiunge una
nuova voce:
Fig.7.24 Attivazione fuoco automatico
L’attivazione del fuoco automatico prevede la creazione di fluorocromi ai quali l’operatore
ha assegnato :
• Colore
Genikon
7-13
• Filtro corrispondente di fluorescenza
• Numero di piani e spessore da acquisire
Come in precedenza, nella fish standard, introduciamo le prime due voci relative al colore
e filtro e decidiamo il numero di piani e lo spessore tra un piano e l’altro da acquisire per
quel particolare fluorocromo.
Fig.7.25 Definizione numero di piani di acquisizione
Quando il sistema si apre generalmente propone su un fluorocromo nuovo come default
un numero di piani pari a 6 ed uno spessore tra un piano e l’altro pari a 200 micron.
Questi valori possono essere modificati dall’operatore stesso in virtu’ del tipo di campione
che desidera analizzare. Sarà infatti di solito necessario uno spessore maggiore sui tessuti
ed uno minore sui campioni citologici.
Al termine salviamo come sempre il fluorocromo.
Possiamo ora creare una lista di acquisizione all’interno della quale metteremo i piani di
fluorescenza decisi.
Prima di passare ad una acquisizione automatica dobbiamo però tenere conto di alcune
cose:
Quando il sistema passerà alla fase automatica non consentirà di modificare i livelli della
camera che, come già sappiamo dalla FISH, per la prima volta che si inserisce un nuovo
fluorocromo sono posizionati a zero.
E’ dunque fondamentale richiamare la lista che abbiamo appena creato , disabilitare il
fuoco automatico e procedere in manuale per ogni fluorocromo appartenente alla lista.
7-14
Controlliamo per ogni fluorescenza l’immagine “live” e salviamo il set up della telecamera
per fluorocromo.
Ora siamo pronti per procedere con la fase automatica. Possiamo riabilitare l’acquisizione
su più piani di fuoco.
Digitando l’icona di fuoco automatico , in realtà si accede a tre distinte funzioni.
La prima funzione serve per visualizzare in falsi colori, la seconda è relativa al fuoco
automatico su più piani . La terza ed ultima funzione (individua spot) effettua una
sottrazione automatica del fondo direttamente sull’immagine somma di tutti i piani di fuoco.
Fig.7.26Attivazione fuoco automatico
A QUESTO PUNTO SIAMO PRONTI PER PROCEDERE CON UNA ACQUISIZIONE AUTOMATICA:
Digitiamo la seguente Icona pe procedere:
. Il programma in automatico farà le seguenti operazioni:
• Seleziona il filtro
• Apre lo shutter del microscopio
• Seleziona l’esposizione e contrasto della camera
• Ricerca il piano focale migliore
• Acquisisce uno stack di immagini
• Elabora la serie di immagini e crea l’immagine fusione dei diversi piani focali.
• Seleziona il fluorocromo successivo nella lista e ripete tutti i passi effettuati per il primo
fluorocoromo.
• Durante la fase di acquisizione si mostra come viene svolto il processo ed è possibile,
se l’operatore lo ritiene opportuno, annullare con il tasto di “STOP” la sequenza.
• Quando tutti i fluorocromi appartenenti alla lista sono stati acquisiti il sistema si ferma e
mostra l’immagine di merge elaborata. Il trattamento di questa immagine sarà identica
in tutte le fasi alla “fish standard non automatica”.
Genikon
7-15
Fig.7.27 Visualizzazione del processo di acquisizione Fish 3D
7.4 Analisi della FISH
L’ambiente d’analisi presenta in gran parte le stesse funzioni del campo chiaro e/o
fluorescenza; una delle differenze fondamentali consiste invece nella presentazione delle
immagini poiché nel caso della FISH si tratta di sequenze d’immagini e non di singole
immagini. Per spostare le immagini della metafase e dell’immagine in pseudocolore o
dell’eventuale collage digitiamo il tasto di sinistra sull’immagine che desideriamo invertire.
Fig.7.28 Analisi d’immagini FISH
7-16
Il programma consente di lavorare sulle due immagini principali:
a) Immagine di Fusione che mostra tutte le componenti della sequenza insieme in overlay a
colori. Su quest’immagine se desideriamo lavorare possiamo anche selezionare le singole
componenti utilizzando la lista dei fluorocromi in basso a destra. Se per esempio
selezioniamo il DAPI possiamo modificare nel contrasto solo il DAPI oppure possiamo
variare il colore nella barra strumenti che mostra la lista dei fluorocromi;
Immagine contenente la somma delle tre singole. In questo caso il programma mostra
un’immagine alla volta secondo ciò che selezioniamo in alto a sinistra sulla finestra.
Queste immagini possono essere in bianco e nero e/o a colori utilizzando la funzione di
colore dalla toolbar d’analisi. Anche in questo caso possiamo agire sulle singole
componenti in modalità separata per aumentare il contrasto o migliorare il fuoco
dell’immagine. Solo su queste immagini singole e non su quella di fusione possiamo
eseguire dei tagli e divisioni di cromosomi. E’ possibile inoltre eliminare delle strutture
semplicemente selezionandole ed utilizzando la funzione "elimina". Esistono invece due
funzioni che sono particolari dell’ambiente d’elaborazione d’analisi FISH:
Questa funzione ( ) consente di ottenere sull’immagine di fusione il DAPI invertito (e
comunque il fluorcoromo definito counterstain) con sopra i singoli segnali colorati:
Fig.7.29 Immagine DAPI reverse
La funzione abilitata dalla seguente icona:( ) consente di spostare la posizione di un
fluorocromo rispetto ad un altro nel caso in cui ci sia stato dello shift durante la fase di
acquisizione, già visto con la precedente funzione di calibrazione degli offset in
acquisizione.
E’ necessario selezionare (dalla lista dei fluorocromi) la componente che desideriamo
spostare e poi digitare sulle frecce per muoverci lungo gli assi x ed y.
Genikon
7-17
Nella FISH inoltre la funzione della gomma assume nuove peculiarità:
Fig.7.30 Funzione della gomma
Abilitando la funzione della gomma è possibile nell’immagine in FISH agire su singole
componenti del blu,verde e rosso per evitare di cancellare elementi gendo su una sola
componente; per fare questo dobbiamo digitare col tasto sx del mouse sulla componente
desiderata. Agendo così l’eliminazione di elementi visibili è facilitata:
Fig.7.31 Prima di agire sulla componente TRITC
Fig.7.32 Dopo l’azione sulla componente TRITC
Terminata l’elaborazione il sistema memorizza l’immagine della FISH come FH anche se,
quando andiamo ad analizzare la singola cellula dall’ambiente di gestione del caso,
potremo osservare l’immagine di fusione più tante immagini quanti sono i fluorocromi
acquisiti. Se per esempio la sequenza è DAPI, FITC, TRITC avremo:
a) immagine di fusione (FH) b)immagine DAPI (DAPI) c) immagine FITC (FITC)d)TRITC
Le singole componenti non sono eliminabili poiché appartengono alla stessa cellula.
L’immagine della FISH come quella del campo chiaro può essere stampata.
E’ necessario però avere creato in precedenza un report di stampa dove sia stata caricata
l’immagine della FISH anziché quella del cariotipo o metafase o collage. Sull’immagine
della Fish è possibile costruire il cariotipo nella stessa modalità vista con il campo chiaro.
7-18
Fig.7.33Costruzione del cariotipo in FISH
7.5 Selezione delle motorizzazioni
Nel caso in cui siano presenti dispositivi di motorizzazione è necessario selezionare
quale è attivo. Utilizziamo nella sezione dedicata alle impostazioni la voce
“Acquisizione”. Utilizziamo dunque la funzione OPZIONI dal menu principale ed apriamo il
sotto menu d’Acquisizione.
Fig.7.34Menu d’acquisizione delle OPZIONI
Per valutare gli altri menu ed avere maggior dettagli vedere il capitolo N.15 delle
personalizzazioni.Il menu consente di selezionare la telecamera con la quale stiamo
lavorando, il microscopio, la ruota filtri ed è possibile inoltre direttamente configurare sia la
ruota filtri che il microscopio motorizzato (vedi capitolo N.15). In questa fase d’acquisizione
in FISH è sufficiente selezionare le varie voci. Se abbiamo una ruota filtri è necessario
comunicare al sistema che modello è presente e selezionare la porta di connessione.
In presenza di un microscopio motorizzato selezioniamo il modello, come nell’esempio 90i.
Nel caso in cui il sistema sia collegato con un microscopio motorizzato non dovremo
cambiare posizione ai blocchetti passando da un fluorocromo ad un altro perché è il
sistema che si sposta in automatico. Non sarà neppure necessario chiudere il percorso
Genikon
7-19
della fluorescenza al termine della sequenza perché anche lo shutter è gestito
automaticamente. La stessa cosa accade con la ruota motorizzata che posiziona i filtri
d’eccitazione per ogni fluorocromo ed al termine si mette in posizione di blank (chiuso).
N.B.:Nel setup della telecamera è anche possibile mettere ON_OFF la ruota filtri nel caso
in cui si desideri lavorare con un blocchetto a singola banda anziché con il filtro
dicroico e barriera della ruota.
Per quanto riguarda la Configurazione dei filtri andiamo al capitolo N.15.
7.6 Valutazione dell’intensità delle fluorescenze
L’accesso è reso possibile dalla pressione della seguente icona: , la funzione risulta
attiva solo con l’immagine FISH disposta in primo piano, sia a piccolo schermo che a grande
schermo. La pressione del pulsante in oggetto provoca l’apertura del form DENSITÀ OTTICA
INTEGRATA IN FISH:
Fig.7.35 valutazione delle fluorescenze
Il form in esame è così strutturato:
ELEMENTO FORM DESCRIZIONE
7-20
Visualizzazione, in formato ALBERO GERARCHICO,
delle coppie VETRINO-CELLULA del caso corrente per
le quali esistono delle misure di densità
memorizzate. Al momento dell’apertura del form, il
FOCUS è disposto in automatico sulla cellula e vetrino
corrente.
Prospetto delle misure eseguite e/o memorizzate. Le
prime tre colonne, in colore nero, mostrano la misura
di TRASMISSIONE (T = LUCE TRASMESSA/ LUCE
INCIDENTE) eseguita per ciascuna componente del
profilo all’interno della regione d’interesse. Le
seconde tre colonne, in colore rosso, mostrano le
misure di DENSITÀ OTTICA INTEGRATA (OD = - LOG10
T). Il numero di colonne visualizzato dipende dal
numero di fluorocromi che compone il profilo
d’acquisizione della cellula. Il sistema NON consente
l’impiego del modulo con cellule acquisite con profili
composti da più di sei fluorocromi.
Pannello di selezione della modalità di tracciamento
della ROI d’interesse.
Pulsante per salvataggio dati. Il salvataggio è relativo
alle sole ROI tracciate per la cellula corrente.
Pulsante per accesso al REPORT riassuntivo del caso
in oggetto.
Pulsante per esportazione, in formato PDF o EXCEL
del REPORT.
L’apertura del form abilita il tracciamento delle ROI sull’immagine FISH secondo la modalità
impostata su pannello. Al termine del tracciamento il sistema esegue in automatico il
calcolo delle misure e la loro visualizzazione nella lista. Per ogni nuova ROI tracciata, la
Genikon
7-21
lista si incrementa di una riga, nell’ipotesi in cui i dati ottenuti non siano d’interesse è
possibile rimuoverli deselezionando il check associato e quindi premendo il pulsante di
salvataggio.
Fig.7.36 Memorizzazione dei valori di densità ottica
La rimozione dei dati comporta in automatico un aggiornamento dell’immagine FISH sulla
quale viene mantenuta traccia delle sole ROI memorizzate.
La selezione di una fra le righe in lista comporta l’evidenziazione con colore rosso della
ROI associata sull’immagine FISH. La funzione in oggetto, così come la possibilità di
tracciare ROI su immagine FISH e il salvataggio dati, è attiva solo ed esclusivamente
nell’ipotesi in cui si mantenga il FOCUS, a livello di ALBERO GERARCHICO, sulla cellula
corrente. Nel caso in cui l’utente desideri visualizzare le misure eseguite a livello vetrino o
a livello di caso, esso è tenuto spostare il FOCUS all’interno dell’ALBERO GERARCHICO. La
lista visualizzata, poiché non è più riferita alla cellula corrente, sarà priva dei check di
selezione.
Il REPORT associato in automatico dal sistema organizza al suo interno i dati relativi
all’intero caso suddividendoli per vetrino e cellula:
7-22
Eventuali elaborazioni incrociate sui dati memorizzati sono rese possibili esportando il
tutto in formato EXCEL e quindi elaborando i dati nel foglio elettronico di lavoro ottenuto.
Genikon
8-1
8 CGH
8.1 Introduzione
L’Ibridazione Genomica Comparativa è una tecnica citogenetica relativamente nuova
utilizzata per individuare aberrazioni cromosomiche sbilanciate. La CGH permette di
analizzare, per mezzo di una singola ibridazione l’intero genoma evidenziando
amplificazioni o delezioni di regioni cromosomiche in cui potrebbero essere localizzati geni
aventi un ruolo nello sviluppo e nella progressione dei tumori. La CGH consiste dunque
nell’ibridazione competitiva di metafasi di cromosomi umani normali con due differenti
DNA genomici (DNA tumorale e DNA normale), marcati con due diversi fluorocromi per
esempio verde (fluorescina) e (rosso rodammina).Per mezzo di tale ibridazione la
differenza delle quantità dei DNA legati ai cromosomi ,viene evidenziata dal rapporto
dell’intensità della fluorescenza lungo ogni cromosoma metafasico, mostrando quali
regioni del genoma tumorale sono guadagnate o perse. Per eseguire la tecnica è possibile
utilizzare DNA genomico estratto da campioni criopreservati o da tessuti inclusi in
paraffina, permettendo così di effettuare studi di tipo retrospettivo utili per evidenziare
marcatori biologici correlabili con la prognosi della malattia. Tale metodica ha inoltre il
vantaggio di impiegare quantità minime di DNA estratto da biopsie o da agospirati. Con il
programma devono essere dunque acquisite per ogni singola cellula le immagini del DAPI,
della FITC e della Rodammina sulle quali automaticamente il sistema esegue sottrazione
del fondo e valutazione del rapporto delle fluorescenze del DNA test e di riferimento, sui
cariotipi delle cellule. Generalmente per convenienza si marca il counterstain in DAPI, la
FITC si utilizza per il TEST e la rodammina per il DNA di riferimento. Risulta dunque
evidente che per procedere ad analizzare campioni in CGH, l’operatore deve avere
familiarità con il programma di cariotipizzazione e con quello della FISH per
procedere oltre. Inoltre le nozioni base su come gestire il caso in esame devono essere
ben chiare; si consiglia dunque di esaminare i primi capitoli del manuale (gestione del
caso, acquisizione e cariotipizzazione) prima di procedere oltre con il programma della
CGH.
8-2
8.2 Acquisizione immagini in CGH
Fig.8.1: Menu’ d’Acquisizione per CGH
Nella Comparative Genomica Hybridisation è necessario acquisire tre fluorocromi,
dobbiamo procedere dunque come per una normale acquisizione in FISH. Dopo aver
creato il caso (controlliamo che siano contenute solo cellule per analisi in CGH poiché non
è corretto mescolare la CGH con altri tipi di immagine per la seguente media sui profili
delle cellule), passiamo al menu di Acquisizione e selezioniamo l’icona della CGH.
Normalmente per evitare “shift” avremo delle periferiche (ruote o motorizzazioni)
controlliamo che la lista dei fluorocromi creati sia definita correttamente ed i fluorocromi
siano associati alla periferica idonea; carichiamo dunque la lista corretta per la CGH. (sarà
DAPI – FITC e TRITC). A questo punto digitiamo, come in FISH, prima sul DAPI poi sulla
FITC ed infine sulla TRITC, terminiamo quindi l’acquisizione. Il sistema passa a mostrare
la soglia da sottrarre dall’immagine del DAPI.
IN LIVE: esiste la possibilità d’interruzione ACQUISIZIONE in qualsiasi momento. Non è
necessario acquisire TUTTI i fluorocromi presenti nel profilo. L’interruzione del processo di
acquisizione è resa possibile dalla pressione del pulsante e comporta
l’annullamento dell’intera sequenza.
8.3 Sottrazione della soglia in CGH
La sottrazione della soglia segue le solite procedure di sottrazione del fondo. Spostiamo la
barra verso destra per aumentare il fondo, il sistema mostra i bordi dei contorni dei
cromosomi più vicini. E’ possibile anche selezionare ROI.
Genikon
8-3
Fig.8.2: Sottrazione soglia in CGH
8.4 Aggiustamento dello shift
Fig.8.3:Immagine prima della correzione Fig.8.4:Immagine dopo correzione
E’ fondamentale almeno per la prima volta controllare che le immagini non siano spostate
(shift) e per ovviare sono forniti gli offset che consento di centrare nuovamente i due
fluorocromi (TRITC e FITC) rispetto al DAPI. Sull’immagine del DAPI, possiamo definire la
soglia (è il fondo che si sottrae a tutte le immagini) e la luminosità. Il sistema
automaticamente normalizza tutte e tre le acquisizioni.
8-4
Digitando il tasto d’assenso comunichiamo al sistema di procedere alla valutazione
dell’acquisizione. Al termine il sistema mostra se accetta o no la metafase acquisita e
consente di valutare i parametri d’acquisizione.
8.5 Parametri di controllo per Acquisizione in CGH
Fig. 8.5: Parametri di controllo della CGH
Con la voce Distribuzione, per quanto riguarda il counterstain, si valuta la bontà della
metafase acquisita. Una metafase è buona per l’analisi CGH se i cromosomi sono ben
separati ed il rapporto tra lunghezza dei cromosomi e larghezza è elevato.
Sia per il DNA test che per quello di riferimento avremo i seguenti controlli:
Granularità indica che un valore alto è dato da un rumore ad alta frequenza che affligge
l’immagine e si verifica con scarsa omogeneità d’ibridazione.
La voce Variazione valuta il coefficiente di variazione dell’intensità della fluorescenza
dell’immagine. Per una buona analisi in CGH i cromosomi devono risultare intensi ed
omogenei, quindi la varianza deve essere la più bassa possibile.
Rapporto segnale/fondo valuta il rapporto tra l’intensità degli oggetti rispetto all’intensità
dello sfondo.
Omogeneità’ valuta l’omogeneità del campo che indica normalmente la corretta
illuminazione del campo.
L’operatore può decidere se la valutazione del sistema è corretta oppure se desideriamo
forzare il sistema nel caso in cui il sistema abbia scartato una cellula digitiamo ugualmente
l’assenso e procediamo all’analisi.
Genikon
8-5
8.6 Elaborazione d’immagini in CGH
Fig.8.5 Menu d’Elaborazione della CGH
Per ottenere i profili relativi al rapporto del DNA Test e del DNA di riferimento per prima
cosa dobbiamo eseguire sull’immagine della metafase del DAPI (lo standard) REVERSE
il cariotipo utilizzando gli stessi tools del campo chiaro. In vero il cariotipo può essere
anche costruito e si può lavorare sull’immagine della metafase in fluorescenza senza
invertire il DAPI. Questo dipende da come l’operatore è abituato a riconoscere i
cromosomi.Per separare (le sovrapposizioni nel caso della CGH devono essere scartate
in quanto non idonee ad un successivo esame) i cromosomi, utilizziamo tutte le funzioni
già viste per cariotipizzare campioni di campo chiaro. Creiamo poi il cariotipo ed
aggiustiamo eventuali errori. Se vogliamo lavorare sull’immagine del fluorocromo DAPI
reverse digitiamo la seguente l’icona :
Utilizzando sull’immagine il filtro dei contrasti per bande Q l’immagine sarà ulteriormente
migliorata:
Fig.8.6:Immagine DAPI Fig.8.7 Dapi Reverse
8-6
8.7 Analisi dei risultati in CGH
Fig.8.8: Menu’ d’Analisi dei profili della CGH
Selezioniamo sul foglio del cariotipo la voce Risultati della CGH, la Toolbar Principale
varia e mostra nuove ICONE che consentono di analizzare i dati ottenuti in maniera
dettagliata. (stanno tutte sotto la voce aspetto poiché consentono di visualizzare in
modalità diverse i profili ).Esistono diverse modalità per visualizzare i dati utilizzando i
folder posti in alto a sinistra del cariotipo.
Digitando le voci DAPI-FITC e TRITC è possibile visualizzare le singole acquisizioni dei tre
fluorocromi. Con gli altri possiamo invece analizzare i risultati in modalità differenti:
Fig.8.9 Ratio Fig.8.10 Ratio in reverse
Genikon
8-7
Nella Fig.8.9 ed 8.10il sistema mostra il materiale in amplificazione o delezione
direttamente sui cromosomi e in DAPI reverse. Si accede a quest'immagine selezionando
RATIO dal folder in alto sulla finestra principale.
RATIO2 mostra invece l’immagine dei cromosomi in FISH standard con blu verde e rosso
sovrapposti è presente anche il DAPI ma le componenti possono essere selezionate
singolarmente.
Fig.8.11 Pseudocolore (Ratio2)
Nella a figura 8.9 si mostrano i valori del ratio rappresentato in blu come normale, rosso
perdita di materiale e verde aumento. (l’esempio in figura è una leucemia).
Infine in figura 8.12 sono rappresentati i risultati della CGH con i profili delle distribuzioni
dei rapporti lungo l’asse del cromosoma; si accede attraverso la voce RISULTATI della
CGH:
Fig.8.12 Profili del RATIO lungo l’asse
8-8
Nell’immagine 8.11 i profili sono estratti da una media eseguita su un complessivo di 23
cellule. Ricordiamo che per la tecnica CGH è importante eseguire la media su un alto
numero di cellule infatti da questo deriva il valore di confidenza dell’esame che varia dal
95% (meno di 15 cellule) al 99% se si lavora con 100 cellule. Anche in quest’immagine si
nota che i profili passano dalla parte centrale del grafico senza espandersi né verso il
rosso né verso il verde in quanto il campione è normale. Esistono diverse modalità di
visualizzazione dei profili. A tali modalità si accede mediante le nuove icone che si aprono
selezionando appunto la voce “Risultati CGH”.
La prima icona consente di definire il SET UP:
Fig.8.13 Impostazioni grafici dei profili
Selezionando la voce Profili :
Il sistema consente di mostrare i profili dei rapporti delle fluorescenze lungo l’asse del
cromosoma :
a- cromosoma rappresentato sul cariotipo a sinistra
b- cromosoma rappresentato sul cariotipo a destra
c- media della coppia dei due omologhi
d- Media sui due omologhi della classe di tutte le cellule del vetrino
e- Media delle cellule di tutti i vetrini
Sulla parte sinistra viene invece si mostra in anteprima il grafico della distribuzione del
profilo.
L’Ampiezza consente di ingrandire il profilo
Centro di posizionare il profilo
Genikon
8-9
La voce Intervallo consente di definire il range dei valori da 0 a 2. I valori di default sono
da 0,75 ad 1,25.
Il posizionamento del profilo su uno indica perfetta normalità senza né amplificazione né
delezione. La modifica di questo valore influenzerà unicamente la visualizzazione dei
profili senza modificare il valore della fluorescenza rilevata.
Il range di confidenza può essere fissato al 99% o 95% (indica il range all’interno del
quale si ritrovano il 95% o il 99% degli oggetti esaminati).
La seconda icona consente di analizzare singolarmente ogni classe d’omologhi
mostrando le singole fluorescenze (Dapi,FITC,TRITC) e l’immagine del ratio.
Fig.8.13 Icona visualizzazione dei singoli cromosomi
Il colore blu indica normalità con ratio 1, rosso i ndica ratio<1 delezione e verde >1
amplificazione. Per ultimo si mostra invece come appare il ratio del profilo appartenente
alla singola classe d’omologhi.
E’ inoltre possibile mostrare anche in contemporanea l’ideogramma della classe in esame.
Nella visualizzazione è consentito analizzare in contemporanea 2 differenti cromosomi in
contemporanea.
La terza icona consente di eseguire un’analisi statistica dei profili relativi ai vetrini
acquisiti.
Fig.8.14 Analisi dei profili
Apre automaticamente il seguente menu:
8-10
E’ necessario introdurre la classe del cromosoma che desideriamo analizzare per esempio
classe 3, specifichiamo il valore del range di lavoro, da 0,75 a 1,25 sarà lo standard.
Sullo stesso grafico sono mostrate in contemporanea la perdita ed il guadagno. Con la
barra (utilizzando il tasto di sinistra del mouse) possiamo portarci su quella che
desideriamo analizzare e controllare per osservare se esiste perdita o aumento del DNA.
Se desideriamo osservare separatamente le perdite o l’aumento del DNA è necessario
digitare l'icona seguente che mostra alternativamente valori.
Fig.8.16 Separazione a dx e sx aumenti e perdite
Per analizzare insieme o separatamente i due omologhi dobbiamo utilizzare l’icona
seguente (vale anche per i profili):
Fig.8.18Unione aumenti e guadagni
Infine per analizzare i profili del ratio utilizziamo:
Fig.8.17 Visualizzazione dei profili
Automaticamente il sistema mostra i profili delle distribuzioni delle fluorescenze.
Genikon
8-11
Anche sui profili è possibile posizionare la barra di controllo per vedere su quale banda
esiste la variazione.
I profili inoltre possono essere analizzati separatamente tra cromosoma di destra e quello
di sinistra.
Il profilo sul singolo cromosoma mostra l’andamento del rapporto. Se il profilo infatti passa
tutto dalla linea centrale vorrà dire che il cromosoma è normale. Se invece il profilo si
sposta verso il verde o il rosso avrà aumento o perdita di DNA.
8.8 INTERPRETAZIONE DEI PROFILI
E’ importante definire il livello di confidenza. Se lavoriamo con oltre cento cellule
cariotipizzate possiamo avere il 99% se invece lavoriamo con un numero di 15 cellule, il
livello di confidenza scenderà a 95%.
Il profilo sul singolo cromosoma mostra l’andamento del rapporto. Se il profilo infatti passa
tutto dalla linea centrale vorrà dire che il cromosoma è normale ed il rapporto è 1. Se
invece il profilo si sposta verso il verde o il rosso avrà aumento o perdita di DNA.
Se per esempio abbiamo una trisomia sul DNA TEST, un ratio di 3(test):2(controllo) o
1.5:1 dobbiamo allora aspettarci 1.5:1 dobbiamo allora aspettarci nell’area amplificazione.
Nel caso di una monosomia invece dovrebbe essere 0.5:1.
Questi ratio lavorano con DNA puramente tumorale ed i valori del default di 1,25 per
amplificazione e 0,75 per delezione sono fissati per compensare questa contaminazione.
Se invece il rapporto del campione è 50:50 di tumorale rispetto al normale dobbiamo
calcolare nuovamente il ratio.
La CGH, come il campo chiaro la fluorescenza e FISH, è gestibile anche a FULL SCREEN
utilizzando l’icona seguente:
Genikon
9-1
9 Analisi in Multiplex FISH
La tecnica della Multiplex Fish si avvale dell’acquisizione di 5 immagini di una metafase
marcata in fluorescenza con fluorocromi specifici (+ dapi per il counterstain). Le immagini
acquisite singolarmente, mediante l’utilizzo di filtri specifici sul microscopio, sono
successivamente fuse mediante sistemi computerizzati per realizzare una singola
immagine composta. All’interno dell’immagine di fusione, ad ogni singola coppia
d’omologhi è associato un colore specifico derivante dalla sua composizione nei
flurorofori. La composizione in % di fluorocromo per la singola coppia di cromosomi è
assegnata in base al KIT che si utilizzato.Per l’analisi in Multiplex Fish valgono le
considerazioni svolte nell’ambito dell’analisi in FISH.Anche in questo tipo d’analisi, il
sistema acquisisce immagini monocromatiche per ogni singolo fluorocromo imponendo ad
ogni componente uno pseudocolore definito in precedenza dall’operatore.Il programma
della multiplex Fish è integrato nella stazione con quello della cariotipizzazione e FISH
standard ed utilizza infatti gran parte delle funzioni che abbiamo già esaminato per il
campo chiaro la fluorescenza e la FISH. La gestione dei casi è identica alle altre due
modalità d’acquisizione mentre nella fase d’acquisizione si osservano alcune peculiarità
che facilitano l’operatore ad acquisire sequenze d’immagini corrispondenti ai singoli
fluorocromi.
9.1 Acquisizione d’immagini in Multiplex
L’ambiente della MULTIPLEX FISH si abilita nel momento in cui in fase d’acquisizione si
seleziona la seguente icona :
9.1.1 Definizione della lista dei fluorocromi e del la mappa associata
Per la creazione e definizione della lista fluorocromi si procede in modo analogo a quanto
descritto nel paragrafo 7.1.1 nell’ambito della FISH.
Alla lista dei fluorocromi il sistema associa in automatico una mappa in cui l’operatore è
tenuto a trascrivere le combinazioni dei fluorocromi valide per l’identificazione delle classi
d’appartenenza dei cromosomi. La documentazione a corredo del KIT impiegato fornisce
all’utente tutte le indicazioni necessarie.
9-2
Nell’ ipotesi in cui siano specificate nella documentazione le componenti RGB degli
pseudocolori da associare ai fluorocromi è possibile, in fase di definizione del fluorocromo,
selezionare il corretto colore richiamando l’apposito menu (fig. 9.1 ):
Fig. 9.1. – Selezione del colore dei fluorocromi
Una volta definita la lista dei fluorocromi si accede alla finestra d’impostazione del KIT
mediante il tasto .
Per ogni classe d’omologhi, l’utente deve indicare la corretta combinazione dei
fluorocromi. Sulle colonne sono indicate le etichette di classe valide per la specie in
esame, sulle righe sono riportati i nomi dei fluorocromi costituenti la lista attiva. Un
semplice click con il tasto sinistro del mouse sulla casella d’intersezione RIGA – COLONNA
inserisce un DOT di selezione (Fig.9.2.).
Fig.9.2 Dot di selezione della componente sulla coppia d’omologhi
Fig.9.3 – Impostazione del kit per la Multiplex Fish
Il tasto:
è da utilizzarsi al termine per convalida.
Genikon
9-3
Nell’ipotesi in cui l’operatore abbia commesso un errore d’impostazione della tabella, il
sistema indica l’errata o parziale configurazione del KIT al momento della convalida. Il
sistema non permette di introdurre la stessa composizione in fluorocromi per due diverse
coppie d’omologhi.
Il tasto di sinistra del mouse digitato su un singolo quadrato in colore consente di
associare un colore specifico ad ogni classe d’omologo
Fig.9.4 Impostazione colore specifico per ogni classe d’omologhi
Fig.9.5 Selezione del colore specifico
Con quest’operazione si associa a ciascuna classe un falso colore calcolato sulla base
dei fluorocromi marcatori e degli pseudocolori ad loro associati. La scelta di quest’opzione
di lavoro permette di mantenere una congruenza fra i colori visualizzati nelle immagini in
pseudocolore e quelle ottenute per elaborazione.
Il ripristino dei colori di DEFAULT è reso possibile dalla pressione del tasto
La cancellazione delle impostazioni è eseguibile mediante il pulsante
Nell’ipotesi in cui il KIT impiegato preveda una diversa combinazione dei fluorocromi per il
braccio p e q di una stessa classe, è possibile scindere le due componenti eseguendo un
click con il tasto sinistro del mouse sull’etichetta della colonna (Fig. 9.6).
9-4
Fig.9.6 – Kit con distinzione braccio p e braccio q
9.2 Acquisizione dei fluorocromi
Per l’acquisizione dei fluorocromi si procede in modo analogo a quanto indicato,
nell’ambito della FISH. La lista dei fluorocromi è creata in base al Kit d’utilizzo è chiaro che
se non si ha una lista di fluorocromi corretti anche la mappa non potrà essere creata e in
ogni modo la mappa utilizza gli stessi fluorocromi inseriti nella lista.
Nel caso del KIT Vysis i fluorocromi sono :
DAPI-Spectrum green-Spectrum Orange-Far red-Aqua-Gold.
E’ importante creare la lista con una sequenza che consenta di acquisire per primo il
GOLD, sarà il fluorocromo col qual è possibile ricercare le metafasi. Non dobbiamo
osservare o ricercare mai con il DAPI poiché fa’ decadere irreversibilmente il FAR RED.
Primo dunque Gold, secondo segue sempre il FAR red per evitare il decadimento ed infine
è consigliabile ma non obbligatorio mettere in sequenza Spectrum green, Spectrum
orange, Aqua ed infine DAPI. Ricordiamoci comunque, anche se viene acquisito per
ultimo, di assegnare DAPI come counterstain, perché è l’immagine DAPI quella di
riferimento ed è quella sulla quale il sistema andrà ad unire i 5 successivi fluorocromi. Per
cambiare il counterstain è sufficiente digitare due volte col tasto sinistra del mouse sulla sx
del fluorocromo prescelto. Per un KIT VYSIS la sequenza sarà dunque la seguente:
Genikon
9-5
Fig.9.7 Lista fluorocromi KIT Vysis
Una volta creata la lista possiamo procedere ad acquisire come una normale FISH
selezionando i 6 fluorocromi e terminando come per una normale FISH.
Al termine dell’acquisizione la pressione del tasto di stop dell’operazione d’acquisizione
apre una sessione di lavoro in cui l’operatore definisce il corretto valore di soglia
dell’immagine DAPI e l’eventuale SHIFT da applicare ad ogni fluorocromo :
Fig.9.8 Definizione della soglia in Multiplex fish
Una volta corretta la soglia (normalmente si esegue una sola volta) ed eventualmente il
posizionamento degli shift come avevamo visto anche per la CGH, possiamo dare
l’assenso al sistema per creare l’immagine della metafase in Multicolor. Generalmente lo
9-6
shift non è presente in quanto per la Multifish abbiamo un microscopio motorizzato che
normalmente non contiene aberrazioni. L’allineamento eventuale deve essere fatto su
ogni singolo piano di fluorescenza.
Il sistema impiega qualche secondo per associare ad ogni coppia le giuste componenti di
colore. Al termine mostra nel Menu’ d’elaborazione l’immagine della metafase in Multicolor
9.3 Elaborazione ed analisi Multiplex FISH
Fig.9.9 Immagine in M-fish (MFISH2)
La visualizzazione non è molto diversa dalla FISH.
Sulla finestra principale si possono scambiare per la visualizzazione le sei singole
immagini relativi ai piani di fluorescenza mentre nella galleria già sono visualizzate in
singola immagine. Ciò che personalizza la Mfish, è la presenza di due nuove
visualizzazioni che corrispondono alla MFISH1 e MFISH2. MFISH1 è lo pseudo-colore
associato dal sistema ad ogni coppia d’omologhi in base al criterio del kit in uso. MFISH2
è l’immagine della sovrapposizione dei sei fluorocromi in base ai colori assegnati nella lista
d’acquisizione.
E’ importante deselezionare (utilizzando l’icona in alto a dx sulla finestra principale) la
componente del DAPI che non apporta informazione ma serve solo per riconoscere e
separare successivamente i cromosomi. La selezione della componente del DAPI in
questa fase di visualizzazione introduce solo motivo di disturbo e falsa l’immagine.
Genikon
9-7
Fig.9.10 Immagine in Mfish (MFISH1)
La MFISH1 è invece l’immagine in colori assegnati dal sistema che non corrispondono
necessariamente a quelli della MFISH2. Sono falsi colori e spesso consentono di
evidenziare parti di cromosomi in maniera rapida e sicura.
A questo livello in ogni modo ciò che interessa è passare alla creazione del cariotipo. La
procedura standard prevede di selezionare l’acquisizione del DAPI e di utilizzare il
REVERSE per facilitare il riconoscimento e la divisione dei cromosomi. Comunque se
l’utente lo desidera è possibile cariotipizzare anche sul DAPI a colore.
Fig.9.11 Immagine in DAPI reverse
La procedura di separazione dei cromosomi è sempre la stessa già utilizzata con il campo
chiaro, la fluorescenza e la CGH. Il sistema offre la Toolbar completa per migliorare
l’aspetto dei cromosomi ed effettuare la separazione.
9-8
Fig.9.12 Toolbar d’Elaborazione in M-FISH
N.B. Come per la CGH è ovvio che non sia corretto utilizzare cromosomi in
sovrapposizione poiché nei punti d’overlapping il risultato è falsato.
Una volta separati tutti i cromosomi possiamo procedere alla creazione del cariotipo
utilizzando la funzione di cariotipo automatico.
L’operatore può aggiustare in qualsiasi momento la posizione dei cromosomi.
Fig.9.13 Cariotipo in M-FISH
Al termine della creazione del cariotipo sono offerte alcune funzioni speciali per analizzare
il cariotipo di una M-FISH. In particolare si offre nella toolbar una nuova icona che
consente di aprire la Mappa dei fluorocromi:
Genikon
9-9
Questa funzione è importante perché apre sotto all’immagine del cariotipo la mappa dei
fluorocromi. L’abilitazione della mappa dei fluorocromi abilita nuove funzioni specifiche per
la M-FISH.
a)Sia che si sia in visualizzazione della MFISH1 che MFISH2 se eseguo una selezione su
una coppia di omologhi, il sistema mostra l’immagine in bianco e nero con in overlay il
colore di appartenenza di quel dato cromosoma. Per esempio in figura 9.14 abbiamo
selezionato la Coppia d’omologhi N.2 ed il sistema mostra che una parte del braccio p del
N.2 è traslocata sul q del 3.
Fig.9.14 Selezione di una coppia di omologhi in multicolor
Tenendo premuto il tasto “ctrl” possiamo selezionare più di 2 cromosomi alla volta
Fig.9.14 Selezione multipla
9-10
b)Inoltre se passiamo sui singoli cromosomi sia in metafase che sul cariotipo si visualizza
il numero di appartenenza, nel caso in cui sia aperta la “Mappa”
Fig.9.15 Visualizzazione della componente d’appartenenza
b) Se infine selezioniamo in basso il colore possiamo variare lo pseudocolore di
appartenenza della classe
In particolare possiamo osservare il default relativo al kit
Fig.9.16 Visualizzazione del default
Oppure quello previsto dallo pseudocolore
Fig.9.17 Visualizzazione del colore reale
Genikon
9-11
Se vogliamo variare alcuni cromosomi dobbiamo utilizzare la solita voce del colore relativa
ad un singolo cromosoma . Clicchiamo sul tab del colore sotto ai singoli cromosomi .
Fig.9.18 Variazione dello pseudocolore della classe d’appartenenza
9.4 Analisi dei singoli cromosomi in MFISH
Anche per la multicolor come per la CGH e la FISH viene data l’opportunità di analizzare i
singoli crosmomi in dettaglio utilizzando l’icona seguente dalla Toolbar principale:
La visualizzazione è simile alla CGH. Il sistema consente di analizzare in contemporanea
2 coppie di omologhi e di rappresentare rispettivamente tutti i singoli piani della
fluorescenza, l’immagine della MFISH1 della MFISH2 ed il profilo somma di tutti i piani di
fluorescenza:
9.18 Analisi dei singoli cromosomi
9-12
Anche per la Mfish come per la CGH possiamo variare la dimensione dei cromosomi,
scambiare il cromosoma dx col sx ed analizzare con la linea bianca ogni singola banda.
9.19 identificazione delle bande
Genikon
10-1
10 Ideogrammi
Gli ideogrammi possono essere visualizzati con tre differenti valori di risoluzione (450,
550, 850). Ad ogni click per impostare la risoluzione, gli ideogrammi sono aggiornati in
automatico nella finestra di visualizzazione.
La selezione dell’opzione consente di visualizzare gli stessi ideogrammi in bande R.
Fig.10.1.: Ideogrammi
E’ possibile visualizzare in automatico tutte le
bande presenti sull’ideogramma oppure in
alternativa possiamo vedere le bande singole
passando con il mouse sull’ideogramma a
sinistra.
E’ possibile copiare un ideogramma sul cariotipo
o su un’immagine di composizione per
confrontare cromosomi all’ideogramma.
10.1 Anomalie
Nell’ambiente in esame è possibile creare e successivamente archiviare le aberrazioni
cromosomiche d’interesse.
10-2
Fig.10.2 Anomalie ideogrammi
Per trasferire l’anomalia ottenuta al collage o metafase o cariotipo è sufficiente utilizzare il
tasto di sx premuto sull’ideogramma e spostare il mouse da sx a dx.
10.1.1 Editing anomalie
1. Nella sezione ANOMALIE selezionare l’aberrazione da comporre.
2. Sulla base dell’aberrazione scelta selezionare nelle sezioni IDEOGRAMMA 1 e IDEOGRAMMA 2
la classe dei cromosomi coinvolti. La banda o l’intervallo di bande interessate sono
identificate dalle frecce ETICHETTA BANDA MOBILI presenti a lato degli ideogrammi. Le scelte
eseguite nelle due sezioni di editing comportano un aggiornamento in automatico
dell’etichetta descrittiva dell’anomalia.
Fig.10.3. Etichetta anomalia
La pressione del pulsante "mostra" nella sezione RISULTATO mostra l’aberrazione
Il sistema esegue in automatico la composizione dell’ideogramma o degli ideogrammi
risultanti per le anomalie di seguito indicate:
Anomalia Espressioni Descrizione
Genikon
10-3
del (Cl) (Bnd1) Eliminazione terminale
DELEZIONE
del (Cl) (Bnd1 Bnd2)Eliminazione interstiziale ovvero del tratto di
bande comprese fra Bnd1 e Bnd2
INVERSIONE inv (Cl) (Bnd1 Bnd2)Inversione del tratto di bande comprese fra
Bnd1 e Bnd2
TRASLOCAZIONE t (Cl1; Cl2) (Bnd1; Bnd2) Traslocazione
dup (Cl) (Bnd1) Duplicazione unica banda
dup (Cl) (Bnd1 Bnd2)Duplicazione del tratto di bande comprese fra
Bnd1 a Bnd2DUPLICAZIONE
inv dup (Cl) (Bnd1 Bnd2)Duplicazione ed inversione del tratto di bande
comprese fra Bnd1 a Bnd2
ins (Cl1; Cl2) (Bnd; Bnd1 Bnd2)Inserzione del tratto da Bnd1 a Bnd2 di Cl2 al
posto della banda Bnd in Cl1INSERZIONE
inv ins (Cl1; Cl2) (Bnd; Bnd1 Bnd2)Inserzione ed inversione del tratto da Bnd1 a
Bnd2 di Cl2 al posto della banda Bnd in Cl1
Tabella 10 Aberrazione automatiche
E’ possibile trasferire su cariotipo, metafase o su composizione l’ideogramma ottenuto
nella sezione RISULTATO. Per l’ideogramma copiato è attiva in automatico la
visualizzazione dell’etichetta descrittiva dell’anomalia. In base alle esigenze è possibile
modificare in tempo reale la visualizzazione degli ideogrammi selezionando la risoluzione
desiderata (400, 550, 850), il tipo di bandeggio (R) oppure il colore da associare alla
sezione anomala dell’ideogramma risultante.
10.1.2 Archiviazione anomalie
Nella sezione ARCHIVIO ANOMALIE è possibile memorizzare l’anomalia ideogrammi
avvalendosi del pulsante “aggiungi”. La selezione del tipo d’aberrazione eseguita nella
sezione ANOMALIE, attiva una ricerca automatica il cui esito è visualizzato nella finestra
della sezione d’ARCHIVIO. Nell’elenco visualizzato la selezione di una delle voci comporta la
generazione dell’ideogramma anomalo.
L’eliminazione di una delle voci d’elenco è resa possibile, previa selezione, dall’impiego
del tasto elimina.
Genikon
11-1
11 Foglio di lavoro
Il foglio di lavoro è un documento correlato alla Conta cromosomica, all’Analisi visiva
(appaiamento degli omologhi) ed al Cariotipo eseguito sul caso specifico.
L’icona seguente abilita l’apertura del foglio di: ed è collegata al Menu’ principale.
Tale icona è in ogni modo accessibile anche dal Menu’ d’Elaborazione e da quello
d’acquisizione.
Fig.11.1: Il Foglio di lavoro
L’inserimento dei dati sul modulo è eseguito manualmente dall’operatore ed il foglio
costituisce il corrispettivo di quello cartaceo che normalmente è utilizzato nei laboratori di
citogenetica. Il foglio di lavoro di lavoro è strettamente associato all’archivio infatti è
possibile digitando col tasto sx del mouse su una delle voci di intestazione delle colonne
selezionare un campo specifico:
Fig.11.2 Associazione dei campi al foglio di lavoro
11-2
Se le voci sono associate le intestazioni delle colonne diventano rosse.
Fig.11.3: Associazione dei campi al foglio di lavoro
Se anziché digitare il tasto sx utilizziamo il dx sull’intestazione , il sistema consente di
introdurre una specifica personalizzata dall’operatore aprendo un menu specifico:
Fig.11.4 Associazione a discrezione dell’utente
All’interno delle colonne possiamo scrivere informazioni o anche in questo caso utilizzare
le tabelle se sono state associate:
Fig.11.5: Utilizzo delle tabelle
Genikon
11-3
L’icona di stampa consente un’anteprima del foglio e la stampa del medesimo.
Fig. 11.6 Anteprima della stampa foglio di lavoro
Naturalmente tutti i dati associati o scritti sul foglio di lavoro verranno automaticamente
salvati e saranno accessibili ogni qual volta che verrà aperto il foglio di lavoro da un
qualsiasi menu.
.
Genikon
12-1
12 Stampa immagini e dati
Digitando l’icona della stampante ( ) nella toolbar principale, si apre la finestra per
creare o richiamare il report del paziente.
12.1 Finestra di controllo
Fig.12.1: Finestra di controllo delle stampe
Tale finestra consente di eseguire tutte le operazioni possibili a carico di un report.
Con “Crea /Modifica” è possibile creare o modificare visivamente un report.
“Carica” consente di caricare da disco un report precedentemente salvato. Quando si apre
il pannello di controllo è automaticamente caricato l’ultimo report utilizzato.
“Stampante” permette di scegliere la stampante da utilizzare e la modifica delle sue
proprietà.
Con “Anteprima” si visualizza l’anteprima di stampa del report corrente in base alla
stampante selezionata.
“Stampa” permette la stampa del report.
Il Tasto permette di gestire le immagini dell’archivio presenti nel report.
12.2 Come creare un nuovo Layout di stampa
Fig.12.2: barra degli strumenti dell'ambiente per la generazione di report
12-2
12.2.1 Barra delle funzioni
Per creare un report si dispone di varie funzioni. In ordine da sinistra a destra abbiamo:
• nuovo: crea un nuovo report;
• apri: carica un report salvato in precedenza su un disco;
• salva: salva su disco il report corrente;
• anteprima: mostra l’anteprima di stampa;
• seleziona: consente di selezionare all’interno del report uno o più oggetti. Se passiamo
con il puntatore del mouse su un dato oggetto questo assume la forma di mano;
l’oggetto è selezionato con il tasto di sinistra del mouse è delimitato da un rettangolo.
Se durante la selezione si tiene premuto il tasto [Ctrl] sulla tastiera, è effettuata una
selezione multipla. Gli oggetti selezionati in modalità multipla possono essere spostati
insieme in un’altra posizione. Tenendo premuto il mouse si sposta il rettangolo in una
nuova posizione. Al momento del rilascio gli oggetti sono trasferiti nella nuova
posizione. Per deselezionare è sufficiente fare click su una zona vuota del report o su
un altro oggetto senza premere [Ctrl];
• testo: con il cursore del mouse, tenendo premuto il tasto sinistro, si traccia un
rettangolo(tratteggiato) che indica la zona all’interno della quale verrà inserito il testo.
Rilasciando il mouse il bordo del rettangolo diventa solido ed all’interno è visualizzato
un cursore di testo lampeggiante. Si può ora scrivere il testo desiderato all’interno del
rettangolo. Una volta terminata la scrittura si deve premere all’esterno del quadro. E’
possibile variare le dimensioni del rettangolo si scrittura tramite i quadrati di selezione.
E’ sempre possibile cambiare il carattere premendo il tasto di destra del mouse;
• linea: è utile per tracciare delle linee. Si deve premere il pulsante sinistro del mouse in
un punto e tenendolo premuto si traccia una retta fino alla posizione desiderata.
Genikon
12-3
Tenendo premuto il tasto [Ctrl] sulla tastiera, la linea sarà tracciata solo nelle direzioni
cartesiane. E’ possibile variare il colore della retta agendo sulle barre degli strumenti;
• rettangolo: traccia degli oggetti rettangolo. Si preme il tasto sinistro del mouse in un
punto desiderato e si traccia un rettangolo delle dimensioni desiderate. Rilasciando il
pulsante è creato il rettangolo. Il colore si varia agendo sui controlli della barra degli
strumenti. Il rettangolo si può successivamente ingrandire o ridurre agendo sui vertici
del medesimo;
• immagine: permette l’inserimento di immagini all’interno del report. Premiamo il tasto di
sinistra del mouse in un punto del report e teniamo premuto; automaticamente si
traccia un rettangolo delle dimensioni desiderate (che rappresenta le dimensioni
dell’immagine una volta inserita). Rilasciando il mouse appare un menù a discesa con
il quale si può sceglie se inserire un’immagine da file oppure dall’archivio. Se
scegliamo di prendere un’immagine da file, si mostra una finestra di dialogo che
consente di caricare un’immagine tipo Bitmap, Tiff, Jpeg, Targa o Gif. (teniamo
presente che il report non include l’immagine all’interno, ma mantiene solo il
collegamento con essa); in caso di rimozione del file dalla posizione originale il report
non sarà più in grado di visualizzarla e mostrerà, al suo posto, un rettangolo di colore
chiaro visibile solo in fase di editing). Scegliendo l'inserimento dell’immagine
dall’archivio si apre un sottomenu dal qual è possibile selezionare il tipo d’immagine
che sarà inserito in quella posizione (metafase, cariotipo, collage ed altre)
12-4
Fig.12.3Tipi d’immagini trasferibili sul foglio di stampa
E’ visualizzata l’immagine del tipo selezionato relativa al caso, vetrino ed alla cellula
selezionati.
In dettaglio dunque possiamo scegliere che tipo di immagine :
• Metafase , In automatico viene visualizzata la METAFASE corrispondente alla cellula
visualizzata in elaborazione nella finestra maggiore
Genikon
12-5
• Cariotipo, si visualizza il cariotipo della cellula selezionata
• Composizione , il sistema se selezioniamo questa voce chiederà anche il numero di
composizione desideriamo collocare in stampa (questo anche se è stata effettuata una
sola composizione).
• Metafase Fish , Immagine della fish in metafase
• Analisi visiva (mostra l’immagine della metafase con i numeri relativi alla valutazione
fatta dall’operatore)
• Conta , valutazione del numero dei cromosomi
• Risultati della CGH mostrati con i Profili della CGH
• Immagine della MFISH1
• Immagine della MFISH2
• Immagine della Metafase originale
• Immagine della fusione
• Immagine del cariotipo in FISH
Un’immagine inserita nel report può essere ridimensionata tramite i quadrati di selezione;
Fig.12.4 Ridimensionamento di un’immagine
12-6
Utilizzando i quadrati ai vertici, l’immagine è ridimensionata mantenendo le proporzioni
originali. Se si tiene premuto il tasto [Ctrl] è possibile ridimensionare l’immagine senza
mantenere le proporzioni.
Sull’immagine inserita se utilizziamo sul riquadro il tasto di destra il sistema consente di
inserire un LABEL; il label corrisponde alle informazioni inserite dopo la fase
d’acquisizione (numero cellula vetrino e seguenti se sono state inserite dall’operatore).
Fig.12.5 Inserimento di un label sull’immagine in stampa
Fig.12.6 Label inserito
Il label varia a seconda delle informazioni inserite sulla cellula in fase di acquisizione
Genikon
12-7
Fig.12.7 Informazioni relative alla cellula
Se dunque la funzione delle informazioni della cellula è attiva in fase di acquisizione e se
abbiamo introdotto tali informazioni allora il label sarà maggiormente descrittivo, in caso
contrario si limiterà ad introdurre solo il numero del caso , della cellula e del vetrino.
La funzione “Label” è una funzione ON-OFF e si abilita semplicemente selezionandola
o deselezionandola.
Fig.12.8 Rappresentazione dell’Etichetta inserita
• Associazione alla stampa dei dati dell’archivio.
Digitando l’icona precedente si apre la lista dei campi dell’archivio. Se desideriamo
posizionare sul report di stampa delle informazioni relative al caso possiamo trasferirle
utilizzando premuto il tasto di sx del mouse sul campo prescelto e trascinarlo sul report di
stampa
• annulla: consente di annullare l’ultima operazione compiuta;
12-8
• fattore di zoom: è possibile selezionare il fattore di zoom da tastiera;
• dati da archivio: premendo questo pulsante si mostra una finestra che contiene la lista
dei campi dell’archivio; tenendo premuto possiamo trasferire i singoli campi sul report;
Fig.12.9 Trasferimento dei dati dall’archivio al layout di stampa
Fig.12.10 Settaggio dei dati sulla stampa
I dati trasferiti dall’archivio possono essere spostati sul foglio di stampa, se li abbiamo
selezionati con il tasto di sx del mouse, oppure variati dimensionalmente muovendo le
barre rosse a dx o sx .
In relazione ai dati possiamo inoltre variare:
• grassetto, italico, sottolineato: impostano lo stile per il testo;
• allinea a sinistra, centra, allinea a destra: impostano l’allineamento del testo;
• allineamento degli “oggetti”: con una multi selezione possiamo poi allineare gli oggetti a
sinistra destra o centrare;
Genikon
12-9
• porta sullo sfondo: consente di trasferire l’oggetto sullo sfondo od in primo piano
rispetto agli altri oggetti;
• carattere: imposta il tipo di carattere;
• dimensione: imposta la dimensione;
• colore: imposta il colore;
• spessore: imposta lo spessore applicabile a linee e rettangoli;
• cancella: elimina gli oggetti selezionati.
Sulla stampa possiamo anche introdurre testi liberi per l’operatore od importare da archivio
anche immagini diverse dando l’opportunità di immettere sul foglio stampa anche per
esempio il LOGO del laboratorio.
Al termine della creazione possiamo controllare con l’anteprima di stampa il tipo di report
creato.
Fig.12.11 Anteprima di stampa
12.2.2 Barra di stato
Fig.12.12: Barra di stato dell'ambiente per la generazione di report
12-10
Nella parte inferiore, la barra di stato comunica le seguenti informazioni:
• numeri di pagina: ci indica su quale pagina ci troviamo rispetto al totale;
• vai a pagina: sul campo “numero pagina” facendo doppio-click posso inserire la pagina
sulla quale desidero andare;
• gestione pagine: consentono di scorrere le pagine;
• data del sistema: è la data di sistema.
12.2.3 Righello e linee guida
Premendo con il pulsante destro del mouse sopra uno dei due righelli appare un menu a
tendina che consente di impostare la scala del righello stesso. E’ possibile impostare la
scala in centimetri o in pollici.
Con un click con il tasto con il tasto sinistro del mouse sopra ad uno dei due righelli e
rilasciando subito il mouse si attiva l’inserimento di una linea guida. Muovendo il cursore
del mouse sulla pagina si può notare che questo viene seguito da una linea tratteggiata di
colore blu (orizzontale o verticale a seconda del righello sul quale si è agito). Tale linea
può essere portata nella posizione desiderata della pagina, facendo un altro click con il
tasto di sinistra la linea è rilasciata. Le linee così create sono utilizzabili per effettuare
l’allineamento di più oggetti. Spostando un oggetto, quando si giunge ad una delle
estremità in prossimità di una linea guida, l’oggetto stesso è agganciato alla linea. Per
spostare una linea guida è sufficiente premere il mouse e mantenerlo premuto; la linea
seguirà il cursore e quando si è raggiunta la posizione desiderata si rilasci il pulsante del
mouse. Per rimuovere una linea guida è necessario prelevarla e trascinarla all’esterno
della pagina.
Facendo click su questo campo il cursore assume la forma di una mano che tiene un
foglio; tenendo premuto il mouse spostiamoci sulla pagina, il cursore cambia di nuovo
forma specificando che il foglio può essere rilasciato. Rilasciando il mouse è inserito un
oggetto.
Premendo il tasto di destra su qualsiasi oggetto compare un menu a tendina comune a
tutti gli oggetti.
12.2.4 Gestione delle immagini del report
Fig.12.13 Accesso al confronto immagini
Genikon
12-11
Per effettuare stampa fra immagini appartenenti a vetrini e cellule diverse dello stesso
caso è necessario utilizzare la funzione di gestione delle immagini presente nel pannello di
controllo del report. Si accede premendo il presente tasto:
Generalmente a questo menu’ si accede quando abbiamo creato un layout di stampa con
ad esempio almeno due immagini di metafasi di cellule o vetrini o casi diversi.
Fig.12.14 layout di stampa di due metafasi diverse
Nel momento in cui apriamo il pannello è offerta la possibilità di introdurre la prima
immagine della metafase
Fig.12.15 Pannello di controllo
Generalmente il sistema mostra la cellula rappresentata e selezionata dalla galleria
(Fig.12.15) se però vogliamo in stampa immagini di cellule diverse dobbiamo utilizzare il
cursore per selezionare cellule diverse :
Automaticamente il sistema mostra la nuova cellula sulla finestra di destra, se la cellula è
confermata digitiamo il tasto di assenso, automaticamente il sistema definisce la nuova
cellula come prima immagine del foglio di stampa.
12-12
Fig.12.15 Selezione di altre cellule
La cellula è selezionata perché appare in rosso.
Per selezionare la seconda immagine digitiamo sulla freccia Immagine Metafase
Per fissarla come prima metafase dobbiamo digitare il tasto di assenso. L’immagine passa
a sinistra ed è memorizzata sulla stampa. Compare rossa la scritta Immagine 1 Metafase.
Fig.12.17 Metafase memorizzata sulla stampa
Procediamo sulla scelta della seconda immagine; possiamo selezionare un’altra cellula o
vetrino o caso. Dobbiamo prima scambiare a sinistra utilizzando l’apposita freccia
l’immagine della cellula 1 con una vuota.
Fig.12.18 Selezione seconda immagine
Genikon
12-13
A questo punto procediamo nella scelta della seconda cellula che sarà visualizzata sulla
destra. Se va bene la scelta digitiamo il tasto di assenso.
Fig.12.19 Memorizzazione della seconda cellula
Il sistema visualizza a destra l’immagine se va bene tasto di assenso (il sistema inverte
con la nuova immagine la finestra a sx).Procediamo ora come per la prima immagine alla
selezione del caso, vetrino e numero di cellula. Nuovamente il sistema mostra a destra la
nuova immagine e se è corretta digitiamo il tasto di assenso. In anteprima immagine il
sistema mostrerà le due immagini di metafasi. Naturalmente se nel LAYOUT di stampa
Fig.12.20 Anteprima di due cellule diverse
abbiamo cariotipi o FISH o altro il sistema cambierà l’informazione e comunicherà:
Immagine 1= cariotipo/metafase o altro. Con la stessa modalità possiamo scambiare
cellule appartenenti a vetrini diversi o casi diversi e naturalmente se nel layout di stampa
sono presenti altri tipi di immagini (FISH CARIOTIPO o CGH o MFISH o Collage), potremo
combinare tra loro anche diversi tipi di immagini
Fig.12.21 Anteprima cariotipo e metafase in FISH
Genikon
13-1
13 Personalizzazione dell’archivio
Normalmente l’archivio si stabilisce con i tecnici Nikon al momento dell’installazione della
strumentazione poiché modifiche avanzate nel tempo potrebbero causare problemi nel
caso in cui si utilizzino chiavi di ricerca che scompaiono o sono modificati nel tempo.
Generalmente dunque la modifica è eseguita al momento dell’installazione e variazioni nel
tempo devono essere fatte con estrema cautela. Per eseguire modifiche sull’archivio
bisogna entrare in un programma accessorio chiamato PERSARCH.
Il programma è sempre contenuto nella cartella GENIKON.
N.B. E’ molto importante, se vogliamo effettuare de lle modifiche all’archivio, che
l’applicativo di GENIKON non sia lanciato né sulla stazione di lavoro né su altre
eventuali stazioni in rete.
L’icona lancia l’applicativo è la seguente nel caso in cui sia stato inviato al desktop:
Il sistema mostra un nuovo ambiente col quale possiamo modificare la scheda.
Fig.13.1: Creazione di un archivio personalizzato
Le funzioni principali sotto illustrate consentono di:
13-2
Fig.13.2: Barra di gestione degli archivi
� 1-creare una scheda ex novo;
� 2-richiamare una scheda dalla rete;
� 3-salvare una nuova scheda;
� 4-Salvare con altro nome
� 4-richiamare la scheda presente sull’applicativo.
Generalmente si richiama la scheda dall’applicativo e si procede alla sua modifica.
Fig.13.3: Barra di gestione dei campi
Fig.13.4 Caricamento dell’archivio esistente sull’applicativo
Fig.13.5 Inserimento di un nuovo campo
E’ possibile:
Genikon
13-3
� creare un nuovo campo: per aggiungere un nuovo campo a quelli già esistenti. Si apre
una nuova finestra che ne consente la sua definizione.
Fig.13.6: Finestra di definizione del nuovo campo
Inseriamo quindi il nome del nuovo campo, il tipo (testo, numerico, note oppure data), e
le dimensioni (in caratteri, nel caso di un campo testo). Indichiamo infine se si tratta di
una tabella (avevamo spiegato l’utilità delle tabelle e ricordiamo appunto che si tratta di
quei campi nei quali possiamo inserire una lista di informazioni standard che possono
essere richiamate dalla scheda paziente senza dover essere digitate ogni volta per
un’analisi specifica);
Possiamo ora decidere la posizione e le dimensioni dei campi. Utilizzando il tasto di
sinistra del mouse selezioniamo il caso e lo spostiamo tenendo premuto il tasto di sinistra.
Se invece selezioniamo con il destro (sempre tenuto premuto), possiamo modificare,
posizionandoci lateralmente sulla finestra del campo interessato, le dimensioni in
lunghezza ed in larghezza.
E’ infine possibile aggiungere una nuova pagina (Folder), alla quale possiamo dare un
nuovo nome (p. es.: la prima pagina può essere relativa all’analisi che stiamo
conducendo e la seconda ai dati veri e propri del paziente).
� eliminare un campo indesiderato: è sufficiente selezionare il campo con il mouse e
digitare l’icona delle forbici;
� accettare le modifiche: per terminare la fase di creazione o cancellazione dei campi.
� E’ possibile inoltre creare un campo particolare denominato VERO o FALSO.
E’ introdotto questo nuovo tipo di campo per poter inserire sull’archivio un controllo sui
casi completi e non. Tale modalità consente di filtrare solo i casi completi ed archiviarli in
una sola selezione
13-4
Fig.13.8 Introduzione di un campo tipo V/F Fig.13.9 Caso completo
� Possiamo inoltre voler introdurre un nuovo folder nel nostro archivio utilizziamo le
frecce per spostarci fino all’ultimo folder aggiungendone un altro il sistema chiede se
desideriamo introdurre un altro che definisce folder. Digitando su folder possiamo
introdurre un nome particolare
A questo punto l’operatore può uscire dalla personalizzazione e salvare le modifiche.
In vero il sistema chiede se si desidera salvare le modifiche. Se si decide di modificarle al
termine della memorizzazione il sistema invia un messaggio di salvataggio effettuato
positivamente.
Genikon
14-1
14 Editor di specie
L’editor di specie è una funzione alla quale si accede dal Menu principale di GENIKON ed
è un sotto menu che permette di codificare nuove specie su cui lavorare, e di disegnarne il
“layout” del cariotipo (). A questo ambiente si accede tramite la voce “Editor di specie …”
del menù “Strumenti”, nell’ambiente principale.
Fig.14.1 Strumenti sulla Barra principale
Fig.14.2 Accesso menu di Editor di specie
Fig.14.3: Editor di specie
14-2
14.1 Creazione di una nuova specie
La creazione di una nuova specie avviene premendo il tasto , oppure scegliendo la
voce “Nuova …” dal menù “Specie”. Si apre la finestra per la definizione della nuova
specie. Nella casella “Nome della specie” indicarne il nome (p. es.: “Uomo”); nella casella
“Descrizione” inserire un breve commento inerente la specie (p. es.: “Specie umana”);
infine indicare il numero di classi nella casella “Numero di classi”(nel caso dell’uomo
dobbiamo introdurre 24 per 22 omologhi ed i 2 eterologhi.
Fig.14.4: Definizione di una nuova specie
Premendo il tasto di conferma, la finestra di Fig.14.2 mostrerà tutte le classi nella parte
inferiore, ed il nome della specie saranno mostrati sopra l’area di lavoro.
Ogni classe è indicata simbolicamente con un rettangolo. Possiamo spostare ogni coppia
nella posizione desiderata.
14.2 Disegno del “Formato” del cariotipo
Ora è il momento di definire graficamente come sarà il cariotipo della specie in questione.
14.2.1 Come posizionare una classe all’interno dell ’area di lavoro
Per trasferire una classe nell’area di lavoro occorre trascinarla (anche a gruppi, con la
selezione multipla). Si può utilizzare il menù “Modifica” che permette di allineare ed
equidistanziare le classi. Lo stesso menù si ottiene facendo click con il tasto destro del
mouse sull’area di lavoro.
14.2.2 Rimozione di una classe dall’area di lavoro
Per rimuovere le classi selezionate dall’area di lavoro premere il bottone oppure
scegliere la voce “Rimuovi” dal menù “Modifica”. La stessa cosa avviene se si preme il
Genikon
14-3
tasto [Canc] sulla tastiera. Per rimuovere tutte le classi premere il bottone oppure, dal
menù “Modifica”, scegliere la voce “Rimuovi tutto”.
14.2.3 Raggruppamento di classi
Per attribuire una medesima caratteristica alle classi selezionate, scegliere la voce
“Raggruppa …” del menù “Strumenti”. Verrà chiesto di inserire la caratteristica, che poi
comparirà a fianco di ciascuna classe.
14.3 Caricamento di una specie
Per caricare una specie fare click sul bottone , oppure utilizzare il menù “Specie” (voce
“Apri …”). Si apre la finestra di , nella quale possiamo scegliere la specie da caricare tra
quelle codificate. Caricata la specie, il suo nome compare sopra l’area di lavoro.
Fig.14.5: Caricamento di una specie
14.4 Cancellazione di una specie
La cancellazione è effettuata sempre sulla specie che abbiamo caricato nell’area di lavoro
(il cui nome è riportato sopra la stessa). Per eliminare la specie, premere il bottone ,
oppure scegliere la voce “Elimina” dal menù “Specie”.
N.B.: la cancellazione di una specie risulta essere un’operazione irreversibile.
14.5 Uscita
L’editor di specie si chiude tramite la voce “Uscita” del menù “Specie”, oppure con la � in
alto a destra.
14-4
N.B. I nuovi formati creati sono utilizzabili e ricaricabili solo per la creazione del cariotipo
in manuale . Per rendere attivo il formato del cariotipo è necessario caricare il nuovo
formato dal menu’ opzioni e creare un nuovo caso. Il sistema per ogni caso riconosce il
medesimo formato di cariotipo e non accetta per uno stesso caso di utilizzare formati
differenti.
N.B.
E’ importante precisare che la variazione dell’editor diventa operativa quando si
acquisiscono nuove cellule e dal menu’ opzioni è stata caricata la specie . Il sistema del
resto quando carico un altro caso acquisito con una specie diversa automaticamente
rispristina per quel caso tale specie, questo per ovviare che sullo stesso caso si mescolino
specie differenti.
Genikon
15-1
15 OPZIONI
Genikon può essere personalizzato dall’utente premendo il tasto nella barra degli
strumenti dell’ambiente principale, oppure scegliendo la voce “Opzioni …” del menù
“Strumenti”. Il menu Opzioni si divide in Generale, Visualizzazione, Personalizzazione,
Ambiente principale, Acquisizione.
Fig.15.1 Menu delle OPZIONI
15.1 Generale (impostazioni)
Le impostazioni generali sono quelle mostrate in Fig.15.2
Fig.15.2: Impostazioni generali
15-2
15.1.1 Posizione del server
Serve ad indicare al programma dove si trova l’archivio centrale (se si dispone di più
stazioni collegate in rete).
15.1.2 Specie di appartenenza dei nuovi casi
Specifica la classe quando si fanno dei casi nuovi.
15.2 Impostazioni per l’ambiente principale
Fig.15.3: Impostazioni per l'ambiente principale
L’ambiente principale di GENIKON è diviso in tre parti: a sinistra la scheda con i dati del
caso, al centro la struttura vetrini-cellule, e a destra le anteprime delle immagini. Per
effettuare tali modifiche è sufficiente trascinare la parte che vogliamo spostare al di sopra
di un’altra utilizzando il tasto di sinistra del mouse.
Genikon
15-3
Fig.15.4: dati e struttura invertiti
15.3 Impostazioni per l’Acquisizione
Fig.15.5: Impostazioni per l'acquisizione
Il menu’ di acquisizione consente di definire diverse periferiche che possono essere
presenti su Genikon. A seconda dell’hardware presente su questo menu è necessario
definirne il tipo .
15.3.1 “Telecamera principale”
Il sistema consente di interfacciare diversi modelli di telecamere;digitando sotto la
voce telecamere i modelli disponibili sono:
� Una Tv camera generica: normale analogica senza integrazione
� TV CAMERA DIGITALE Hesp Firma
� TV camera analogica COHU che si differenzia dalla precedente in quanto viene gestita
anche l’integrazione.
� Telecamere serie Photometrics (CoolsnapCF-Coolsnap FX)
� Telecamere serie Hamamatsu
15-4
� Telecamera digitale JAI.
� Camera digitale DS2Mcooled e Ds5 a colori
15.3.2 “Ruota fitri”
Consente di selezionare la presenza di una ruota filtri.
Fig.15.6 Selezione ruota filtri
Genikon gestisce tre tipi diversi di ruote filtri.
� Una ruota filtri NIKON a 10 o 12 Filtri di eccitazione
Fig.15.7 Ruota filtri NIKON
Genikon
15-5
� Ruota filtri PRIOR
Fig.15.7 Ruota filtri Prior
� Ruota filtri rappresentata dal FAD ad otto posizionI del microscopio E1000
Fig.15.8 Ruota filtri VFAD
15-6
15.3.3 Microscopio motorizzato
Fig.15.7 Selezione diversi microscopi
Consente di selezionare diversi microscopi motorizzati tra i quali:
� E1000 NIKON
� Leica DMRA-2 nuova serie
� Nikon 90i
� Nikon 80i dgital head
� Olympus BX61
15.3.4 Configurazione filtri dei microscopi
L’utilizzo dell’icona :
consente di definire le posizioni dei filtri sia sui microscopi che sulle ruote.
Se dunque abbiamo selezionato per esempio la A-presenza del microscopio E1000 a 5
posizioni e digitiamo configura i filtri otterremo l’apertura del seguente menu:
Genikon
15-7
Fig.15.8 Definizione dei filtri su E1000
E’ necessario introdurre il nome del filtro e la posizione. Utilizzando questa modalità
quando andremo a richiamare i fluorocromi sulla lista direttamente sapremo che filtro è
posizionato nelle 5 collocazioni.
Sempre nel menu’ precedente sono fornite i test necessari per controllare la presenza del
microscopio E1000.
Se digitiamo la voce test il sistema controlla il collegamento dell’E1000 e se le connessioni
sono corrette avvisa il corretto funzionamento. Controlliamo sempre che il cavo sia
collegato correttamente e la porta seriale sia corretta.
Se desideriamo inoltre vedere gli spostamenti lungo i filtri di fluorescenza è necessario
digitare le singole posizioni (1,2,3,4,5).
Una volta inseriti i singoli filtri e l’eventuale posizione di CLEAR cioè libero dobbiamo
salvare la configurazione
Fig.15.9 salvataggio della configurazione
Nel menu dobbiamo utilizzare la voce “salva configurazione” utilizzando il file di default. Da
questo momento in poi avremo nei controlli la gestione del microscopio E1000.
15-8
Per interfacciare il microscopio LEICA utilizziamo la voce corretta:
B-LEICA DMR ed il sistema mostra come è accaduto per il NIKON il menu’ di interfaccia:
Fig.15.10 Interfaccia LEICA
Dobbiamo procedere come per l’E1000 selezionando e nominando i singoli filtri. Anche in
questo caso al termine della definizione è necessario salvare la configurazione.
C_Nikon 90i
Non serve configurare poiché Genikon recupera direttamente i dati dal software
accessorio di settaggio NIKON I toools pe quanto riguarda la configurazione dei filtri
D_Olympus BX61
Stessa cosa del 90i
Configurazione ruota filtri
a-Ruota Nikon
Fig.15.11 Ruota NIKON
E’ necessario definire se la ruota è a 10 o 12 posizione perché il ricollocamento dei filtri sia
corretto.
Genikon
15-9
Come per i microscopi motorizzati dobbiamo definire le posizioni dei filtri di eccitazione, la
posizione di CLEAR ,lo shutter e la porta seriale. Salviamo infine la configurazione come
per i microscopi
b-Ruota filtri Prior
La procedura di configurazione della ruota è esattamente identica alla NIKON
Fig.15.12 Ruota filtri Prior
c_Vfad E1000
Nel caso in cui sia presente un microscopio E800 od E1000 con una motorizzazione ad 8
posizioni dobbiamo considerare la fluorescenza motorizzata come una ruota filtri poiché il
controllo è esterno alla motorizzazione del microscopio.
Fig.15.13 Fluorescenza ad 8 posizioni NIKON
La procedura è poi identica alla definizione delle ruote.
E’ necessario salvare come nelle precedenti configurazioni.
15-10
15.3.6 Tavolini motorizzati
Dal menu’ di personalizzazione è consentito introdurre il tavolino merzauser mentre sul
menu’ dello Spot counting è interfacciabile quello della Prior
Fig.15.14 tavolino Merzauser
15.3.7 Soglia adattiva ed informazioni su singola c ellula
Sotto al sottomenu di acquisizione (sempre nelle personalizzazioni ) sono collocate altre
due voci relative alla fase di cattura immagine
Fig.15.15 Selezione della soglia adattiva e note
La voce attiva su l’inserimento di informazioni su singola cellula , comporta che al
momento di acquisizione dll’immagine , una volta sogliata il sistema presenta un form
speciale di note sull’immagine specifiche. Tali informazioni le ritroveremo se desideriamo
in stamap quando all’immagine della cellula viene aggiunta un’etichetta Tali informazioni
sono inoltre editabili dall’utente successivamente andando sul menu’ principale, in
modalità singola cellula e digitando il tasto di dx del mouse sull’immagine prescelta
Fig.15.16 Accesso alle note su singola cellula
Genikon
15-11
Fig.15.17 Modifiche note su singola cellula
La selezione della soglia adattiva comporta che, al momento di sottrazione della soglia
dall’immagine, dopo la fase di acquisizione il sistema dia la possibilità di inserire dei filtri di
normalizzazione sull’immagine in modalità automatica. Avevamo già trattato nel menu’ di
sottrazione della soglia questa funzione che è di notevole importanza e consente un
aumento del contrasto.
Se l’operatore non ritiene mai utile avere tale filtro imposto sull’immagine può
deselezionare la soglia adattiva.
Sempre sotto questo menu troviamo la possibilità di scegliere tra la sogliatura manuale e
quella automatica. Anche queste funzioni sono ON-OFF
15.4 Impostazioni di visualizzazione
15-12
Fig.15.18: Impostazioni di visualizzazione
A questo menu di visualizzazione sono associate numerose funzioni definite in gran parte
ON \OFF cioè che se selezionate sono attive e deselezionate disattive.
1. “Durante la visualizzazione di tutte le cellule, riserva una posizione in archivio per il
cariotipo”.
Nella modalità “tutte le cellule” permette di mantenere accanto all’immagine della metafase
una posizione che associa sempre un cariotipo. Nel caso in cui non sia stato costruito
ancora il cariotipo il sistema lascia uno spazio vuoto a destra della metafase. Se invece la
funzione è disabilitata tutte le cellule verranno messe una di seguito all’altra senza lasciare
spazi vuoti.
Genikon
15-13
Fig.15.19: Immagini senza l'opzione contrassegnata
Fig.15.20: Immagini con l'opzione attivata
• “Nella visualizzazione a singola cellula, mostra an che le immagini originali”
Permette di vedere l’anteprima delle immagini originali (solo in modalità “singola
cellula”).
15-14
Fig.15.21: Visualizzazione della “Raw”
• “Visualizza i fluorocromi a colori”
Se l’opzione è contrassegnata in anteprima i fluorocromi sono mostrati a colori,
altrimenti si vedranno in bianco e nero.
• “Mostra gli oggetti eliminati”
Permette di mostrare/nascondere gli oggetti che sono stati eliminati.
Nel caso in cui la funzione sia attiva gli oggetti eliminati sulla metafase compaiono
ma sono circoscritti da un contorno rosso (o di altro colore se nella persoalizzazione
lo abbiamo scelto diverso)che indica che l’oggetto anche se visibile non è
considerato nella conta e non sarà presente nel cariotipo.
Se la funzione invece è disattivata l’oggetto non compare proprio. Nel a caso in cui
abbiamo cancellato un oggetto che desideriamo ripristinare sarà necessario
selezionare la funzione, tornare sulla metafase ed includere nuovamente nella conta
la struttura. Se non utilizziamo come ON la funzione non potremo riselezionarla ed
attivare nuovamente la presenza dell’oggetto con la funzione “ripristina”.
Genikon
15-15
Fig.15.22: Oggetti eliminati con contorno rosso
Fig.15.23: Oggetti eliminati non visualizzati
• Oggetti eliminati non presenti in stampa
La funzione consente di non vedere gli oggetti eliminati solo nella stampa mentre durante
l’elaborazione sono visibili ma eliminati perché circoscritti di rosso.
• “Evidenzia gli oggetti trasferiti dalle fusioni”
Gli oggetti trasferiti dalle fusioni sono evidenziati con un rettangolo e con una “F” se
l’opzione è contrassegnata.
15-16
Fig.15.24: Oggetti da fusione contrassegnati
Il numero accanto alla F dipende dal numero relativo alla fusione associata.
• “Evidenzia gli agglomerati”
Se la casella è contrassegnata, gli agglomerati sono evidenziati da un’ellisse.
Fig.15.25: Oggetti evidenziati come gruppo
• “Evidenzia oggetti dopo le separazioni”
Dopo qualunque operazione di separazione, gli oggetti sono evidenziati da un bordo
colorato per controllare come è avvenuta la separazione.
Fig.15.26: Oggetti contornati dopo divisione
Genikon
15-17
• “Seleziona automaticamente gli agglomerati dopo le separazioni”
Dopo qualunque operazione di separazione, gli oggetti che sono degli agglomerati
sono automaticamente selezionati.
Fig.15.27: Selezione automatica di gruppi dopo separazione
Questa operazione consente di non dovere nuovamente selezionare per separare
ancora i gruppi ma diversamente procedere con l’operazione per esempio di
sissovrapposizione (vedi Fig5.26)
• “Cariotipo: evidenzia cromosomi già classificati du rante la classificazione
manuale”
Se l’opzione è contrassegnata, i cromosomi già classificati sono evidenziati da un
bordo colorato.
Fig.15.28: Evidenzia cromosomi nel cariotipo manuale
In particolare se sono due i cromosomi trasferiti il contorno sarà verde (OK) se
invece >di due blu e se <2 rosso.
• “Sfuma i cromosomi in zoom”
In fase di editing, se è applicato un fattore di zoom per ingrandire l’immagine, i
15-18
cromosomi risulteranno leggermente più sfumati (opzione contrassegnata).
Applica in automatico un filtraggio
• “Mostra linee quando viene impostato l’allineamento per centromero”
La funzione attiva consente di visualizzare e stampare le linee sul centromero.
Fig.15.29Cariotipo allineato per centromero Fig.15.30 Carioitpo allineato per linee
• “Applica colori casuali ai cromosomi”
La funzione attiva consente di utilizzare un colore coprente o solo contorni per
evidenziare gruppi di cromosomi
Fig.15.31 colore casuale Fig.15.32 Senza colore ma solo conorno
Tale funzione serve per evidenziare i cromosomi uniti in due diverse modalità.
La prima copre i cromosomi , la seconda pur evidenziando i gruppi lascia intravedere
i cromosomi.
• “Spessore medio dei cromosomi”
Questa barra serve per impostare lo spessore utilizzato durante il disegno degli assi
come percentuale rispetto allo spessore medio dei cromosomi della cellula.
E’ necessario aumentare il valore se osserviamo che durante i tagli sono eliminate
parti dei cromosomi. Fig.15.33 Definizione spessore cromosomi
Genikon
15-19
Generalmente un valor medio di 100% è buono.
• “Distanza tra i cromosomi all’interno della classe”
Imposta la distanza tra i cromosomi all’interno della classe, durante la costruzione
del cariotipo.Un valore basso intorno ad 1 è comodo per osservare bene appaiati i
cromosomi
Fig.15.34 Distanza omologhi
• “Mostra box per classe”
La funzione attiva mostra le griglie che definiscono lo spazio riservato ad ogni cooppia di
omologhi
Fig.15.35 Box sul cariotipo
• Forza ingresso in modalità Reverse
E’ la funzione che consente di lavorare sempre in Q-REVERSE automaticamente una
volta acquisita l’immagine
15.5 Personalizzazione dei colori
La personalizzazione dei colori riguarda la fase di analisi e cariotipizzazione delle
metafasi.
15-20
Per mezzo dei tasti: è possibile associare un colore per ognuna delle categorie
Fig.15.36 Personalizzazione dei colori
riportate in Fig.15.36.
Genikon
16-1
16 Comandi da tastiera
E’ possibile associare alle funzioni della toolbar di elaborazione i tasti della tastiera, in
modo da rendere più veloce il compito dell’operatore. La pressione del bottone
permette di aprire la finestra mostrata in Fig.16.1.
Fig.16.1: finestra per la definizione dei comandi da tastiera
16.1 Associazione di funzioni a tastiera
Come associare una funzione ad un tasto della tastiera
Se questa finestra viene aperta durante la fase di elaborazione, è possibile effettuare le
associazioni semplicemente premendo sulla funzione che vogliamo utilizzare (ad esempio
i colori casuali).
Fig.16.2: Associazione di comandi a tastiera
16-2
Comparirà una piccola finestra con il simbolo e la descrizione del comando
prescelto. Premiamo ora il tasto della tastiera al quale vogliamo attribuire quella funzione
(ad esempio la barra spaziatrice). Ripetuta questa operazione per le funzioni di uso più
comune, o comunque quelle che si preferiscono, la finestra si arricchirà con la descrizione
dei comandi ed il tasto scelto a lato.
Fig.16.3: Alcune delle possibili combinazioni di tasti
E’ possibile utilizzare tutti i tasti della tastiera più comuni (fatta eccezione per i caratteri
strani, le lettere accentate, ed altri tasti particolari quali [Esc], [F1], ecc…).
Come si vede dalla è possibile utilizzare anche i tasti [Ctrl], [Alt], [Maiusc] e loro
combinazioni. Se si chiude la finestra, si nota che le combinazioni di tasti sono già attive.
16.2 Modifica di una combinazione
E’ possibile modificare un’ impostazione (dopo averla selezionata nella lista) premendo il
tasto . Verrà chiesto di premere una nuova combinazione di tasti, che andrà a
sostituire quella precedente.
16.3 Eliminazione di una combinazione
L’eliminazione di una combinazione selezionata avviene per mezzo del bottone .
16-3Genikon
16-3
16.4 Eliminazione di tutte le combinazioni imposta te
Il bottone rimuove tutte le combinazioni impostate.
16.5 Memorizzazione e richiamo di impostazioni pre definite
Il tasto ha una duplice funzione: memorizzare un elenco di impostazioni e richiamarlo
successivamente.
16.6 Memorizzazione di un elenco di impostazioni
Una volta che abbiamo definito un elenco di combinazioni, per memorizzarlo premere il
tasto .
N.B.: la memorizzazione ha effetto solo la prima volta; assicurarsi che l’elenco che si sta
per memorizzare sia il più esauriente possibile.
16.7 Richiamo dell’elenco di impostazioni
Il richiamo dell’elenco memorizzato si effettua tramite il bottone . L’elenco che viene
ripristinato va a sostituire quello corrente.
16.8 Impostazioni per la stampa dei report
Fig.16.4 Impostazione stampa report
16-4
Ad Alcuni Layout è possibile associare tasti della tastiera potremo direttamente stampare
dei layout semplicemente digitando un tasto.
16.9 Impostazione per l’esecuzione di macro
Come per il menu precedente possiamo associare dei tasti della tastiera a delle
macroroutine.
17-5Genikon
17-5
17 Macroroutine
La funzione delle macroroutine serve per associare alla tastiera dei tasti ai quali abbiamo
egato una serie di funzioni ripetitive.
Mettiamo per esempio il caso che desideriamo ogni volta imporre un filtro (Enhance) ad
una metafase e vogliamo anche contrastare (schiarire ) ogni volta i cromosomi della
stessa di un valore di +1, dobbiamo procedere come segue dopo aver selezoinato l’icona
delle macro:
17.1 Creazione della macroroutine
Il sistema apre il menu specifico
Fig.17.1 Menu Macroroutine
In questo caso il sistema è nuovo e non è mai stata registrata alcuna macroroutine per
incominciare a registrare utilizziamo il tasto rosso. Automaticamente il sistema consente di
entrare in elaborazione e svolgere le operazioni che desideriamo memorizzare.
17.2 Nomina della macroroutine
E’ prima necessario dare un nome alla macroroutine. In automatico il sistema propone un
default (Macro001) che è possibile editare, semplicemente scrivendo il nome che
desideriamo
Fig.17.2 Nomina della macro
17-6
17.3 Memorizzazione della macroroutine
Procediamo ora in elaborazione come al solito e per esempio eseguiamo le operazioni di
selezione di tutti i cromosomi, utilizziamo i filtri di sharpen (GTG debole) e contrastiamo
con il valore di +1
Fig.17.3 Creazione della macroroutine
Si osserva che accanto al nome della macroroutine che stiamo creando il sistema mentre
l’operatore utilizza le funzioni memorizza ogni singolo passaggio.
A questo punto se abbiamo concluso fermiamo la registrazione digitando il tasto in verde
Fig.17.4 Chiusura di una macroroutine
Il sistema ora ha in memoria una macroroutine ma non è stato associato alcun tasto da
tastiera. Chiudiamo comunque il tasto del menu delle macro con il solito tasto di assenso.
17.4 Associazione di una macro ad un tasto
Per associare un qualsiasi tasto della tastiera utilizziamo la procedura già vista
nell’associazione dei tasti a singole funzioni. Utilizziamo l’icona solita:
17-7Genikon
17-7
Fig.17.5 Associazione di un tasto alla macroroutine
Apriamo l’ulltimo folder e selezioniamo la Macro001 , utilizziamo la funzione di
associazione e digitiamo il tasto della tastiera (F6 per esempio)
Il sistema mostra subito che tasto viene associato alla nuova macro:
Fig.17.6 Tasto associato alla macroroutine
Da questo momento in poi , quando siamo in elaborazione, ogni volta che digitiamo il tasto
F6 il sistema eseguirà tutte le funzioni che sono state associate in automatico.
Come si vede dalla figura 17.6 una macroroutine può essere eliminata singolarmente
oppure con il pennello possono essere eliminate tutte in una sola volta:
17-8
Se torniamo ancora sul menu di creazione di una macroroutine abbiamo a disposizione
altre funzioni
Fig.17.7 Menu di editing delle macroroutine
Partendo da sx , possiamo lanciare, creare, eliminare, importare, esportare una
macroroutine ed infine eseguire un comando specifico associato ad una macroroutine.
18-1Genikon
18-1
18 Spot counting
18.1 Archivio
Fig.18.1 Gestione casi Spot
La gestione dei casi è simile alle modalità viste in precedenza.
Le differenze sono:
� Nella main tool bar compare una nuova icona che consente di accedere
all’acquisizione in modalità spot counting. La modalità di acquisizione è
completamente diversa e sarà descritta qui di seguito in maniera dettagliata.
� La selezione di un vetrino specifico per spot counting determina queste modifiche:
18-2
o Nella galleria delle immagini vengono visualizzati campi acquisiti su ogni
specifico vetrino. Se abbiamo selezionato un singolo vetrino nella galleria
immagini compaiono i campi acquisiti su quel vetrino (FOV=field of view) . Se
siamo in modalità singola cellula nella galleria compaiono due immagini
associate a quella cellula: la prima è quello originale del fuoco, la seconda è
invece l’immagine elaborata. Se abbiamo selezionato la modalità tutte le
cellule, nella galleria compaiono tutte le cellule elaborate.
o Se digitiamo due volte sul FOV dalla galleria immagini si accede alla fase
d’elaborazione immagini
o Quando si seleziona un vetrino acquisito in modalità Spot counting non è
possibile importare alcun’immagine su quel vetrino specifico ed i tools
normalmente attivi appaiono non selezionabili: ( ).
Se digitiamo l’icona nella toolbar principale l’utilizzatore può accedere alla finestra
del set up.
Fig.18.2 Set up del modulo Spot counting
In particolare il set up consente di specificare le periferiche hardware connesse al sistema.
Dobbiamo infatti considerare che per lo spot counting sono necessarie delle nuove
componenti.
18-3Genikon
18-3
• tavolino motorizzato :Genikon gestisce il PRIOR e l’OPTISCAN
• Controllo del fuoco : Optiscan ed E1000
• Filtri : Non è ancora utilizzata:
Tal selezione dell’hardware specifico consente di abilitare una o più componenti .
E’ fondamentale ora controllare che le porte seriale siano indirizzate correttamente
Una configurazione di default si può comunque sempre richiamare digitando l’apposita
icona: .In particolare il default è così rappresentato:
� Tavolino motorizzato – Optiscan prior
� focus drive – prior optiscan
� com1 porta seriale
L’ultimo elemento importante è rappresentato dalla camera . Il modulo spot counting
module lavora con camera a colori in particolare ad oggi sono interfacciate le seguenti
Camere:
� nikon dxm1200f
� hesp firma Fire ware digital camera
� nikon ds-5mc
18.2 Ambiente di Acquisizione immagini
Digitando l'icona dal Menu principale, è possibile accedere al menu Live solo se
possibile accedere e se sono soddisfatte tutte le seguenti condizioni:
1. Che sia abilitato il modulo spot counting sulla chiave
2. Che il vetrino sul quale vogliamo iniziare ad acquisire sia vuoto
3. Che la camera digitale sia connessa ed interfacciata correttamente.
4. Che il tavolo motorizzato ed il controllo del fuoco siano connessi correttamente.
Se una o più di queste condizioni non sono soddisfatte il programma genera un
messaggio dove viene indicato l’errore riscontrato.
18-4
Fig.18.3 Menu Acquisizione
Nella barra di acquisizione compaiono ora tre nuove icone:
18.3 Calibrazione del sistema
� Icona di calibrazione. Consente di accedere alla menu relativo alla
calibrazione del sistema. Questa operazione viene eseguita solo quando si installa per la
prima volta la strumentazione e non dovrebbe essere necessaria in futuro a meno che lo
strumento non venga spostato. E’ necessario prendere immagini a seconda dell’obbiettivo
che desideriamo
o La telecamera in uso deve essere allineata correttamente .o L’adattatore passo C non deve cambiare a calibrazione avvenutao Calibrazioni diverse devono essere fatte per ogni obbiettivo(100x 60x)
Fig.18.4 Calibrazione ottica
Per creare una nuova calibrazione dobbiamo digitare la seguente icona: : .
L’operatore potrà editare il nome ed introdurre anche una nota specifica alla calibrazione.
18-5Genikon
18-5
Fig.18.5 Nome e note sulla calibrazione
Digitando l’icona relativa all’immagine della camera possiamo avere l’immagine dal vivo
con il micrometro di riferimento. Durante questa operazione premiamo il tasto centrale per
disegnare la regione di interesse:
Fig.18.6 Selezione della misura di calibrazione
� Settaggio dello Spot counting : è costituito da 3 tasti
• Definizione dell’area:
Fig.18.7 Definizione dell’area di scansione
Per definire l’area procediamo come segue:
1. Digitare nel form due punti che definiscono l’area rettangolare di lavoro. Poiché l’immagine
è live possiamo controllare da questa operazione i livelli di controllo della telecamera.
18-6
Step 1 Controllo set up camera
Step 2Controllo set up camera sul secondo punto
Step 3 Accettazione dei due punti relativi all’area di scansione
Al termine il sistema mostra che l’area è stata definita
Fig.18.8 visualizzazione dell’area di scansione
All’interno dell’area di scansione è comunque possibile selezionare una specifica area di
lavoro (subregione).Per effettuare ciò è sufficiente digitare il tasto di sx del mouse e
tenerlo premuto fino all’angolo opposto o dell’area desiderata.
Fig.18. 9 regioni interne all’area totale scansione
Se invece l’operatore ritiene di volere lavorare sull’area intera , digitiamo il tasto Area
intera di scansione.
18-7Genikon
18-7
18.4 Definizione del tipo di analisi
Prima di procedere alla scansione è necessario indicare al sistema quale tipo di campione
si desidera analizzare. Attualmente Genikon è in grado di eseguire su campioni del tipo
raffigurati in fig.18.9
Fig.18. 9 regioni interne all’area totale scansione
Per ogni fluorocromo è possibile definire il colore utilizzando la seguente icona:
Che abilita il seguente menu:
Fig.18. 10 definizione del colore del fluoroforo
Sempre dal menu precedente possiamo accedere ad un altro form definito opzioni che
consente di definire funzioni specifiche per il tipo di analisi che desideriamo svolgere.
18-8
Fig.18. 11 definizione del tipo di analisi
18.5 Inizio della scansione
Inizio scansione immagine. Il sistema esegue una prescansione durante la quale è
richiesto eseguire una correzione del punto di fuoco in manuale. Sempre durante questa
fase è inoltre necessario eseguire un controllo delle seguenti funzioni:
o Tempo di esposizione
o contrasto
o luminosità
o gain
o : le due icone consentono di trovare il primo campo valido.
o : di salvare i settaggi della telecamera
o : di richiamare i settaggi di default della telecamera
o : di iniziare la scansione
Durante il processo di scansione l’utilizzatore può controllare come sta lavorando il
sistema .
18-9Genikon
18-9
Fig.18. 12 Visualizzazione del processo della scansione
La procedura di scansione può essere interrotta utilizzando il tasto centrale della toolbar.
18.6 Elaborazione
Al termine della scansione è possibile analizzare i risultati entrando nel menu di
Elaborazione.
Fig.18.13 Menu di Elaborazione
Nel Menu di Elaborazione troviamo una galleria specifica per lo Spot counting relativa alla
visualizzazione dei nuclei. I nuclei sono divisi in tre categorie principali:
Normali
Anomali
Non Classificati
18-10
I gruppi nella finestra possono essere visualizzati insieme o singolarmente ed è possibile
editare ogni singola categoria quando si esegue un preview sul singolo nucleo:
Fig.18.14 Visualizzazione ed analisi del singolo nucleo
Possiamo decidere di classificare diversamente il nucleo in esame come:
o Anomalo
o normale
o Non classificato
In figura 18.14 osserviamo che il nucleo selezionato è quello in esame ed è quello sul
quale si apportano le modifiche eventuali.
Fig.18.15 Selezione del nucleo in esame
I tasti e permettono di cambiare le pagine
Nella parte finale della finestra della galleria dei nuclei esiste un’area dedicata ad
analizzare i risultati:
Fig.18.16 rappresentazione del Field of View (FOV)
18-11Genikon
18-11
Sulla finestra di sx si mostra l’immagine del nucleo originale senza sottrazione del fondo.
Volendo l’immagine può essere ingrandita usando il tasto centrale del mouse.
Nella toolbar prncipale ci sono tre tasti:
o : Digitando questa icona il sistema rilocalizza il tavolino sul campo dove è
collocato il nucleo.
o : Digitando questa icona vengono invece mostrate le misure sull’immagine.
Fig.18.17 rappresentazione delle misure
E’ possibile disegnare delle misure di lunghezze che si ottengono in micron associando la
calibrazione eseguita su quel specifico vetrino. E’ sufficiente disegnare la linea per avere il
valore di misura ad esso relativo.
Ricercatore di metafasi
Concetti di base Il ricercatore di metafasi (Metaphase Finder) è un modulo opzionale di Genikon che permette la
localizzazione e l’acquisizione in automatico di metafasi all’interno di uno o più vetrini.
Occorre disporre della necessaria strumentazione hardware. Nello specifico:
Microscopio provvisto di motorizzazione obiettivi e filtri
Tavolino motorizzato
Fuoco motorizzato
Oil dispenser (facoltativo)
Per ottenere l’acquisizione delle metafasi occorre procedere attraverso più fasi di lavoro, che possono
essere schematizzate in questo modo:
Impostazioni preliminari
Anteprima dei vetrini
Individuazione metafasi
Acquisizione
A parte la configurazione delle impostazioni preliminari, le altre fasi di lavoro prevedono l’utilizzo di un
obiettivo specifico, da indicare con gli strumenti di configurazione. In particolare si parla di:
Basso ingrandimento: solitamente 2x o 4x, per la creazione delle anteprime
Medio ingrandimento: solitamente 10x o 20x, per l’individuazione delle metafasi
Alto ingrandimento: solitamente 60x o 100x ad olio, per l’acquisizione delle metafasi
19-Genikon Metaphase Finder
19_1
Opzioni La finestra di opzioni di Genikon presenta una sezione dedicata al ricercatore di metafasi.
In questa finestra è possibile specificare di quale strumentazione si dispone.
Barcode Reader: spuntare la casella se è installato un dispositivo di lettura dei codici a barre.
Revolver: spuntare la casella in presenza di un revolver motorizzato non integrato nel microscopio.
Tavolino Prior
Selezionare il tipo di tavolino installato (1 o 4 vetrini) oppure caricatore PL-200.
PLOIL Dispenser: spuntare la casella se è installato un dispositivo dispensatore di olio.
Tavolino Marzhauser
Selezionare il tipo di tavolino installato (4, 5 o 8 vetrini).
Impostazioni preliminari
Per iniziare ad utilizzare il ricercatore di metafasi, fare click sull’apposito bottone della toolbar
principale di Genikon.
Disposizione dei vetrini sul piatto del tavolino L’utilizzatore deve disporre i vetrini pronti per la scansione sui “bay” del piatto del tavolino. Ciascun bay
ospiterà un vetrino.
Attenzione: tutti i vetrini disposti sul piatto devono appartenere ad un’unica modalità di lavoro (campo
chiaro, oppure fluorescenza, oppure FISH, oppure SPOT COUNTING)… Non sono possibili sessioni di lavoro
in modalità mista es. campo chiaro e fluorescenza.
L’utilizzatore dovrà associare i vetrini su piatto ai corrispettivi casi presenti in archivio creandoli di nuovi se
necessario.
19_2
Predisposizione dei casi e creazione dei vetrini in archivio Occorre predisporre uno o più casi dove verranno salvate le metafasi. In base ai vetrini disposti sul piatto
del tavolino, creare un numero sufficiente di casi e/o vetrini.
E’ possibile creare i casi ed i vetrini direttamente nell’ambiente principale di Genikon, oppure utilizzare gli
appositi strumenti del ricercatore di metafase.
I bottoni del riquadro “Caso” servono per:
per creare un nuovo caso;
per eliminare il caso evidenziato.
I bottoni del riquadro “Vetrino” servono per:
per creare un nuovo vetrino nel caso selezionato;
per eliminare il vetrino selezionato.
Selezione della modalità di lavoro La modalità di lavoro si sceglie tramite la toolbar evidenziata in figura.
Attenzione: la scelta della modalità di lavoro influenza tutti i vetrini sul piatto del tavolino.
19_3
Campo Chiaro
Fluorescenza
Fish
Spot Counting
Pulsante che consente di salvare, per la modalità di lavoro selezionata, il profilo evidenziato come
default.
Associazione di ciascun vetrino da scansionare ad uno specifico vetrino
nell’archivio con profilo di scansione
Selezione del caso e del vetrino in archivio
Si selezioni il caso a cui appartiene il vetrino da scansionare. Successivamente, si selezioni il vetrino che
riceverà le metafasi trovate, all’interno del caso selezionato. Per questa fase, si utilizzino lo liste del
riquadro “Elenco dei casi”.
19_4
Selezione del profilo
Esistono diversi profili di scansione pre-impostati, mostrati nella lista evidenziata in figura.
Un profilo di scansione è formato da una serie di impostazioni specifiche che possono differire in base al
tipo di preparato di ciascun vetrino.
Per la descrizione dettagliata dei parametri che compongono un profilo, si consulti la sezione dedicata in
questo manuale, oppure si contatti l’assistenza tecnica Nikon.
Associazione del vetrino fisico al vetrino dell’archivio
Per associare il vetrino fisico al relativo vetrino nell’archivio dei casi, e per indicare al sistema di utilizzare il
profilo selezionato, occorre premere il bottone “Associa” corrispondente al bay del vetrino scelto.
19_5
Una volta associato, sotto al bay del vetrino scelto vengono riportate le seguenti impostazioni:
Nome del caso
Nome del vetrino
Profilo di scansione
Per modificare anche solo una di queste impostazioni, occorre premere il bottone “Annulla” per annullare
l’associazione.
Successivamente occorrerà modificare le scelte (come visto in precedenza) ed effettuare l’associazione
nuovamente (tramite il bottone “Associa”).
Nella figura mostrata sotto, viene mostrato come i vetrini 3 e 4 sono stati associati a casi diversi, con un
diverso profilo di scansione.
19_6
Procedura interamente automatica Contrassegnare la casella “Abilita procedura automatica” per abilitare l’acquisizione automatica di uno
specifico numero di metafasi all’alto ingrandimento.
Questa procedura prevede che dopo l’anteprima, il sistema inizi l’individuazione delle metafasi, e, in
automatico, ne acquisisca all’alto ingrandimento, il numero specificato nella relativa casella di testo.
Per procedere con le anteprime dei soli vetrini associati, si prema il bottone di ok:
Per annullare, e tornare all’ambiente principale di Genikon, premere il bottone di annullamento:
Anteprima Una volta che l’anteprima è iniziata, l’ambiente del ricercatore di metafasi è mostrato nella figura
sottostante.
Prima della creazione dell’anteprima, il sistema esegue alcune inizializzazioni:
19_7
Inizializzazione del tavolino
E’ un’operazione che prevede la completa movimentazione del tavolino. Viene eseguita solo la
prima volta, e non viene ripetuta fino a che il programma Genikon non viene riavviato.
Al termine delle anteprime sono eseguite alcune operazioni di autoregolazione a basso ingrandimento
che avranno effetto per le anteprime successive:
Rifocalizzazione
Viene individuato il fuoco di riferimento a basso ingrandimento per ogni vetrino, reimpostando lo
0.
Regolazione telecamera
Viene effettuata un’auto regolazione dei parametri della telecamera.
L’anteprima che viene composta, è mostrata nel riquadro in alto a sinistra.
Inizialmente, la toolbar è completamente disabilitata. Dopo un breve periodo, viene abilitato il bottone di
stop per consentire l’annullamento dell’operazione.
Il bottone permette di riprendere l’operazione.
Al termine della fase di anteprima di tutti i vetrini selezionati, la parte in alto a destra mostra il piatto del
tavolino con le anteprime.
Individuazione e modifica delle aree di scansione all’interno del vetrino Il sistema applica ad ogni anteprima l’area di scansione predefinita per il profilo selezionato.
E’ possibile modificare l’area semplicemente andando a ridimensionare il rettangolo con il mouse.
In alternativa, facendo click con il tasto destro del mouse sull’anteprima si apre un menù che permette di
eliminare una o tutte le aree impostate.
Anche con il bottone della toolbar si possono eliminare tutte le aree.
Con i bottoni e si sceglie la forma dell’area di scansione che si vuole aggiungere.
19_8
Per aggiungere un’area, semplicemente si traccia la figura direttamente sull’anteprima del vetrino con il
mouse, premendo il tasto sinistro.
Per maggiore comodità, si possono visualizzare le anteprima in grande facendo doppio click con il pulsante
sinistro del mouse sopra l’anteprima di un vetrino.
Si possono tracciare così le aree nella nuova finestra mostrata sotto.
E’ possibile utilizzare i bottoni per passare in rassegna le anteprime dei vetrini, qualora sia
stata effettuata l’anteprima di più di un vetrino.
Premere il bottone per chiudere la finestra e convalidare le modifiche alle aree.
Premere il bottone per chiudere la finestra annullando le modifiche.
Una volta che le aree sono state definite, si può procedere all’individuazione delle metafasi.
19_9
Scansione e ricerca delle metafasi
Per procedere all’individuazione delle metafasi al medio ingrandimento si prema il bottone .
Il sistema avvia la scansione dalla prima area del primo dei vetrini selezionati. Durante la ricerca delle
metafasi, la finestra si modifica come indicato sotto.
Nella parte in basso della finestra sono mostrate le metafasi trovate.
19_10
Il bottone della toolbar consente di mostrare o nascondere le anteprime delle metafasi.
Attenzione: in questa fase le metafasi sono disposte in ordine temporale (nell’ordine in cui sono state
individuate), e non sono ordinate secondo alcun criterio di ‘bellezza’.
E’ possibile visualizzare le metafasi per ciascuno dei bay (o vetrini) selezionati, ed anche per area di
scansione. Nel primo caso si agirà sulle linguette poste sopra alle metafasi, nel secondo caso si selezionerà
una delle voci “Area” a destra, a fianco delle metafasi.
La visualizzazione delle metafasi è comunque a pagine, e sarà possibile ‘sfogliarle’ agendo sui bottoni
sempre a destra delle metafasi.
L’area che viene correntemente scansionata è evidenziata in blu.
Le aree già scansionate sono contrassegnate in verde.
Le aree che devono ancora essere scansionate sono evidenziate in rosso.
E’ possibile ancora modificare le aree da scansionare, e perfino l’area in fase di scansione. Per fare questo,
premere il bottone di pausa scansione e procedere alla modifica delle aree come descritto
precedentemente. Premere ancora il bottone per continuare con la scansione.
Attenzione: se si modifica l’area in fase di scansione, si perdono inevitabilmente tutte le metafasi trovate.
Il bottone di stop serve per terminare il processo di scansione. Verranno mantenute le metafasi
trovate per le aree completamente scansionate, mentre verranno perse quelle dell’area in fase di scansione
al momento della pressione del bottone di stop.
Il bottone permette di terminare la scansione dell’area corrente, e passare a scansionare l’area
successiva. Questo bottone è abilitato solo se c’è un’area di scansione successiva a quella corrente.
19_11
Uno specifico bottone della toolbar permette di scegliere se il fuoco ottimale deve essere calcolato
automaticamente, oppure se si necessita di inserire manualmente una serie di punti di fuoco.
= fuoco automatico (AF – Automatico).
= fuoco manuale (MF – Manuale).
La modalità iniziale di questo bottone è impostabile tramite le opzioni di scansione (vedi menù “Opzioni
scansione”).
Acquisizione delle metafasi
Premere il bottone per acquisire le metafasi all’alto ingrandimento.
Se invece si preme il bottone si torna all’ambiente principale avendo salvato la scansione al medio
ingrandimento, ma senza effettuare alcuna acquisizione all’alto ingrandimento, acquisizione che potrà
essere eseguita in un momento successivo.
Inserimento manuale dei punti di fuoco Se è stata scelta la modalità manuale per quanto riguarda la ricerca del fuoco ottimale, si apre l’ambiente
mostrato in figura.
19_12
A sinistra è riportata l’anteprima del vetrino. I punti evidenziati in blu sono già stati aggiornati, mentre il dot
rosso indica il punto corrente.
A destra c’è l’immagine in live, così com’è vista dalla telecamera, con l’obiettivo impostato per il medio
ingrandimento.
Si aprono anche altre due finestre: una è il joystick software, l’altra mostra i punti di fuoco.
Il sistema sceglie un certo numero di punti sui quali mettere a fuoco. Il numero di punti dipende dalla
grandezza dell’area. I punti scelti sono visualizzati nella finestra sottostante.
I punti sono indicati da una coppia di coordinate X,Y. Il valore per l’asse Z inizialmente non è assegnato. E’
quello che deve fare l’utente manualmente.
19_13
Si selezioni il primo punto della lista. Il tavolino si sposta in quella posizione, e l’immagine in live mostra il
preparato.
L’utilizzatore a questo punto deve mettere a fuoco l’immagine, agendo sul joystick di corredo al
microscopio oppure sull’interfaccia del joystick software.
Una volta che l’immagine è a fuoco, si prema il bottone “Aggiorna punto”. Il sistema riporterà nella colonna
della Z il valore corrispondente a quella posizione sull’asse Z. E’ la posizione di fuoco per quel punto.
Premendo il bottone “AutoFocus” il sistema cerca di calcolare il valore sull’asse Z ottimale per quel punto.
Il bottone “Auto Expo” consente di effettuare l’auto esposizione della telecamera.
Il bottone “>>” permette di passare al punto di fuoco successivo.
Per aggiungere ulteriori punti di fuoco, spostarsi con il tavolino su un nuovo punto, mettere a fuoco, e
premere il bottone “Aggiungi punto”.
Acquisizione vera e propria delle metafasi Si apre la finestra mostrata sotto.
19_14
Sulla parte sinistra è mostrata l’anteprima del vetrino. Sono ben visibili, nella banda blu, i riferimenti del
bay in scansione, e del vetrino così come viene registrato in archivio.
Anteprime delle metafasi
Nella parte inferiore sono riportate le anteprime delle metafasi trovate.
E’ possibile mostrare o nascondere le anteprime delle metafasi utilizzando il bottone della toolbar.
Selezionando un’area, nella lista a fianco sulla destra, vengono visualizzate solo le metafasi di quell’area di
scansione. Selezionando il vetrino, vengono visualizzate tutte le metafasi di tutte le aree.
Visualizzazione delle metafasi dell’area 1
Visualizzazione delle metafasi dell’area 2
Visualizzazione delle metafasi delle aree 1 e 2
19_15
Attenzione: le anteprime delle metafasi sono disposte per ordine di ‘bellezza’ decrescente, quindi le prime
mostrate sono le più belle, fino ad arrivare alle meno belle.
La visualizzazione è a pagine, e possono essere sfogliate tramite i bottoni .
Il bottone serve per eseguire la procedura di ‘matching’ ovvero di centratura delle metafasi per il
vetrino corrente.
Selezione delle metafasi
Se è stata impostata la procedura automatica, il sistema selezionerà le prime metafasi (tante quante
specificato in precedenza).
In caso di procedura manuale, sarà l’utilizzatore a selezionare le metafasi che intende acquisire all’alto
ingrandimento.
La selezione avviene facendo click con il tasto destro del mouse sull’anteprima della metafase. L’anteprima
selezionata per l’acquisizione viene evidenziata con un bordo blu.
Passando con il cursore del mouse sopra le anteprime, si apre una finestra che mostra la metafase più in
grande. Questa finestra resta visibile fin tanto che il cursore resta sopra un’anteprima.
Rilocalizzazione
Facendo click con il tasto sinistro del mouse su di una anteprima, il sistema si posizionerà su quella
metafase utilizzando l’alto ingrandimento. La metafase che viene rilocalizzata avrà l’anteprima evidenziata
con un bordo magenta.
Contestualmente il sistema si porta in live, con l’immagine vista dalla telecamera mostrata in alto, sopra le
anteprime.
19_16
Attenzione: se non è stato fatto in precedenza, il sistema richiederà di procedere al ‘matching’.
Strumenti di selezione
Utilizzando questi strumenti è possibile eliminare le anteprime indesiderate.
Dopo aver selezionato un certo numero di anteprime, se si contrassegna la voce “Mantieni” e si preme il
bottone di conferma il sistema eliminerà tutte le metafasi eccetto quelle selezionate.
Se invece si contrassegna la voce “Cancella” e si preme il bottone di conferma il sistema eliminerà
solo le metafasi selezionate.
Il bottone cancella la selezione effettuata.
19_17
Acquisizione
Per procedere all’acquisizione, premere il bottone di avvio “macro” del pannello di strumenti
mostrato sotto.
Il sistema mostrerà il seguente messaggio.
Premere “Si” per acquisire solo le metafasi selezionate.
Premere “No” per acquisire tutte le metafasi (selezionate e non selezionate).
Premere “Annulla” per annullare l’acquisizione.
Durante la fase di acquisizione le metafasi già acquisite sono evidenziate da un bordo verde, la metafase in
fase di acquisizione avrà un bordo magenta, mentre le metafasi ancora da acquisire avranno un bordo blu.
Al termine dell’acquisizione, le metafasi acquisite all’alto ingrandimento sono già disponibili in archivio.
E’ possibile visualizzare le immagini acquisite oppure visualizzare l’anteprima del vetrino tramite il bottone
della toolbar.
19_18
Menù La finestra di anteprima e di scansione dispone del seguente menù, per le impostazioni e gli strumenti.
Ricercatore Questo menù permette di accedere ad alcune finestre per la configurazione del ricercatore di metafasi.
Calibrazione obiettivi
Selezionando la voce “Calibrazione obiettivi” si apre la finestra mostrata sotto.
19_19
E’ possibile impostare l’obiettivo da utilizzare selezionandolo dalla lista.
Premere il bottone “Autocalibra con rotazione” per effettuare la verifica dell’allineamento della telecamera
relativamente all’obiettivo impostato.
Viene effettuata una serie di spostamenti lungo gli assi X ed Y. Al termine dell’operazione il sistema calcola i
due valori di rotazione della telecamera. Entrambi i valori devono essere il più vicino possibile a 0.000.
Attenzione: se uno dei due valori è maggiore di 0.500 è assolutamente necessario contattare l’assistenza
tecnica.
Opzioni preview
Selezionando la voce “Opzioni preview” si apre la finestra mostrata sotto.
Spuntare la casella “Fuoco manuale iniziale” per impostare manualmente il fuoco prima di iniziare
un’anteprima.
Spuntare la casella “Abilita inizio scansione dopo preview” per avviare la procedura di ricerca delle metafasi
al termine delle preview.
Per definire le aree di anteprima, premere il bottone “Precedura Guidata Preview”. Verrà iniziata una
procedura guidata che porterà l’utilizzatore a definire le zone su cui eseguire l’anteprima (affinché
coincidano esattamente con la posizione dei vetrini nel piatto).
Per regolare le impostazioni della telecamera, premere il bottone “Regolazioni”.
Per effettuare comunque una regolazione automatica della telecamere dopo le operazioni di anteprima,
spuntare la casella “Auto regola”.
Opzioni scansione
Selezionando la voce “Opzioni scansione” si apre la finestra mostrata sotto.
19_20
Queste impostazioni sono rivolte, per la maggior parte, al personale tecnico. Per l’utilizzo consueto, è
raccomandato che siano settate le seguenti impostazioni:
“Tipo scansione” = “Fast Standard”
“Fuoco” = “AF – Automatico”
“Accelerazione rampa Z” = “Slow”
“Utilizza fuoco di riferimento calcolato a basso ingrandimento” = Si
“Ricerca AUTOMATICA da preview” = Si (che prevede di calcolare il fuoco ottimale sul campo con
maggior contenuto di preparato)
“Regolazione automatica e telecamera e shading” = Si
E’ inoltre possibile selezionare l’obiettivo di scansione, ed effettuare le regolazioni della telecamera.
Profili
E’ possibile regolare i parametri dei profili di acquisizione.
Questo TOOL è riservato alla’assistenza tecnica ed è impiegarsi in fase di configurazione iniziale del sistema.
Esci
Esce dall’ambiente di ricerca delle metafasi.
Strumenti Nel menù, selezionare la voce “Strumenti”. Premere sulla voce “Modalità avanzata”. Il suddetto menù
viene arricchito con una serie di voci che consentono di aprire delle finestre per l’utilizzo di strumenti di
regolazione e controllo.
Regolazioni della telecamera
Apre una finestra che permette di regolare la telecamera. E’ una finestra ad uso esclusivo del personale
tecnico.
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Joystick software
Apre una finestra che permette di muovere il tavolino motorizzato attraverso un ‘joystick virtuale’.
Tramite questa finestra è possibile spostare il tavolino lungo gli assi X e Y usando il ‘pomello’ giallo.
Per gli spostamenti sull’asse Z (fuoco) si agisce sulla barra posta sulla destra della finestra.
Info XYZ
Apre una finestra che mostra in tempo reale le informazioni sul tavolino motorizzato (posizione negli assi X,
Y e Z).
Tavolino motorizzato
Apre una finestra ad uso esclusivo del personale tecnico.
19_22
Fuoco
Apre una finestra ad uso esclusivo del personale tecnico.
19_23
20-1Genikon
20-1
20 Riepilogo
20.1 Procedura di Acquisizione - Analisi - Elaboraz ione
Per un utilizzo ottimizzato dello strumento, si può seguire lo schema riportato di seguito.
Premere“Nuova cellula”
Acquisire la metafase
Trasferire icromosomi sulla
metafase
Acquisire leimmagini di fusione
Ci sono tuttii cromo-somi?
Analisi dellametafase
Cariotipizzazione
ACQUISIZIONE FUSIONE
ANALISI
ELABORAZIONE
SI
NO
