MANUAL TOXICOLOGÍA 2012-I · PDF fileManual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología (clave 1614) ... Farmacología, Química Analítica,

Laboratorio de Toxicología 2012-I

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Manual de guiones experimentales para la enseñanza y

aprendizaje del laboratorio de Toxicología (clave 1614)

Alejandra Quijano Mateos Araceli Pérez Vázquez

Bernardo Lucas Florentino Carlos Pérez Muñoz

Claudia Rivera Guevara Daniel Rosas Ramírez

Eduardo Hernández Vázquez Francisco Hernández Luis Francisco Juárez González Francisco Sánchez Bartez

Jorge Cornejo Garrido

José Alberto Rivera Chávez Juan Francisco Palacios Espinosa

Manuel Gutiérrez Aguilar María Elena Bravo Gómez

Mariana Flores Torres Martha Leyte Lugo

Paulina del Valle Pérez Perla Carolina Castañeda López

Silvia G. Dávila Manzanilla Sitlali del Rosario Olguín Reyes

Sol Cristians Niizawa Viridiana Morales Sánchez

Facultad de Química, UNAM México, D.F. 2010



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ÍNDICE

Página PRÓLOGO

3

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE LA FACULTAD DE QUÍMICA

6

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA

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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE 9

HOJA DE SEGURIDAD DE REACTIVOS 10 HOJA DE VALORACIÓN PARA LA EVALUACIÓN DEL BIENESTAR DE LOS ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

12

IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLÁTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

13

CUANTIFICACIÓN DE CIANURO DE HIDRÓGENO, COMO TÓXICO VOLÁTIL, A PARTIR DE GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS

27

PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO

37

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL ÁCIDO NORDIHIDROGUAYARÉTICO

45

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GENOTÓXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TÉCNICA DE MICRONÚCLEOS EN MÉDULA ÓSEA

51

EFECTO TÓXICO DE LA ADMINISTRACIÓN DE PLOMO EN RATAS

61

EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIÓN DE PLOMO POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO

74

DETERMINACIÓN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA

80

GUIONES COMPLEMENTARIOS 87 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLÁTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

88

DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL 101



3

PROLOGO En noviembre de 2004, el H. Consejo Técnico de la Facultad aprobó las modificaciones al plan de estudios de la carrera de Química Farmacéutico Biológica (QFB) y en junio de 2005 fue aprobado por el Consejo Académico de las Ciencias Biológicas y de la Salud (CAABYS). De tal manera, que a partir del semestre 06-I se inició la implantación gradual del mapa curricular del plan de estudios 2005. En este nuevo mapa curricular, la asignatura teórico-experimental de Toxicología, con clave 1614, quedó ubicada en el 6° semestre para la carrera de QFB. El diseño del actual contenido programático de la asignatura, consideró revisar los conocimientos básicos de toxicología como son citotoxicidad, bioactivación tóxica, estrés oxidante, mutagénesis, carcinogénesis y teratogénesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposición, toxocinética y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobioticos —fármacos, metales pesados y sustancias de abuso. A través del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al perfil del egresado en el diseño, evaluación y producción de medicamentos, producción de reactivos para diagnóstico, diagnóstico de laboratorio, investigación biomédica y conservación del medio ambiente. En consecuencia, el grupo de profesores de toxicología, en forma colegiada, decidió realizar la actualización y modificación del curso práctico, incluyendo algunos temas de interés actual en esta asignatura, y rediseñando los existentes de acuerdo a la reforma a la enseñanza experimental (Hernández y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prácticas con el apoyo del proyecto PE202006 a través del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME), lo cual permitió la adquisición de equipos, materiales y reactivos para la enseñanza experimental de esta asignatura. Con base a lo anterior, los autores presentamos el “Manual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología”. Este manual está constituido por ocho guiones experimentales que cubren las unidades temáticas del curso teórico (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar los conocimientos teóricos adquiridos en la asignatura. Estos guiones propician también la integración de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como Bioquímica, Farmacología, Química Analítica, y Química Orgánica, así como su correspondiente aplicación a la resolución de problemas de esta área. Finalmente, es importante mencionar que el manual incluye una sección de “Guiones experimentales complementarios” los cuales refuerzan los conocimientos en toxicología analítica. Se considera que ambos guiones se podrían realizar en función del calendario escolar correspondiente.



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Tabla 1. Relación entre las unidades temáticas del curso teórico y los guiones experimentales.

Curso laboratorio Guión experimental

Curso teórico Unidad temática

Identificación y cuantificación de tóxicos no volátiles en una muestra problema

Introducción a la Toxicología

Cuantificación de cianuro de hidrógeno, como tóxico volátil, a partir de glucósidos

cianogénicos

La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica.

Producción de metahemoglobina por nitritos y efecto protector del azul de metileno in vivo

La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica.

Determinación de la capacidad antioxidante de la quercetina y el ácido

nordihidroguayarético. El estrés oxidante

Cuantificación de micronúcleos en eritrocitos de médula ósea como indicador de

genotoxicidad

Mutagénesis, Carcinogénesis y Teratogénesis

Efecto tóxico de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados Efecto del pH en la liberación de plomo por

utensilios de barro vidriado Toxicidad de metales pesados

Determinación de etanol en una muestra problema

Toxicidad de sustancias de abuso

GUIONES COMPLEMENTARIOS Extracción y cuantificación de tóxicos no

volátiles en una muestra problema Introducción a la toxicología

Determinación de malatión residual La biotransformación de xenobióticos y

su importancia toxicológica Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la Enseñanza Experimental, donde la adquisición del conocimiento se da a la luz de las evidencias observables o medibles de los fenómenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos a través de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto de éstos a través del trabajo experimental. Cada uno de los guiones está estructurado de la siguiente manera: OBJETIVO ACADÉMICO. Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases teóricas, así como el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y técnicas



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analíticas empleadas comúnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobióticos. PROBLEMA Se plantea con la intención de enfrentar al estudiante con fenómenos relacionados con el área que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADÉMICO a través del trabajo experimental; encontrando las relaciones causa-efecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicación y/o el potencial toxicológico.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Describe el procedimiento y técnicas utilizadas para el desarrollo y obtención de resultados que permitan resolver el PROBLEMA.

CUESTIONARIO Se incluye con la intención de dirigir al estudiante hacia la resolución del PROBLEMA, resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo.

APÉNDICE I : CONOCIMIENTOS PREVIOS Éste apéndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guión y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.

APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS En este apéndice se indican las cantidades necesarias para la preparación de los reactivos a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL.

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Considerando que en cada sesión de laboratorio se generan un número importante de residuos se contempló la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos así como la manera en que deberán ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento. Los autores consideramos importante también incluir en el presente material el Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los alumnos de la relevancia y carácter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de actitudes apropiadas para un profesionista en el área de las ciencias biológicas y de la salud.

Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a través del proyecto PAPIME No. PE202006 de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la UNAM. Hernández Luna, M. y Llano Lomas, M. “Propuesta de Reforma de la Enseñanza Experimental”. Revista del IMIQ, Año XXV, vol. 07, 1994, pp. 5-7.



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Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química ARTÍCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos de la Facultad de Química en donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigación. Estos sitios, para efectos del presente Reglamento, serán denominados laboratorios. Su observancia es obligatoria para el personal académico alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentación que resulte aplicable. ARTÍCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuación, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas en cada laboratorio. ARTÍCULO 3. Los laboratorios deberán estar acondicionados, como mínimo con lo siguiente: a) Un control maestro para energía eléctrica b) Un botiquín de primeros auxilios c) Extintores d) Un sistema de ventilación adecuado e) Agua corriente f) Drenaje g) Un control maestro para suministro de gas h) Señalamientos de protección Civil ARTÍCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios deberán estar supervisadas por un responsable. Los Departamentos académicos respectivos nombrarán a dicho responsable en sus áreas correspondientes. ARTÍCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deberá estar una persona sola en los laboratorios. El mínimo de personas deberá ser, invariablemente, de 2. ARTÍCULO 6. Los usuarios deberán abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista y cerrar las puertas de cubículos y laboratorios, así como cajones y archiveros, siempre que se ausente del laboratorio. ARTÍCULO 7. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. En el caso del personal académico y administrativo, el equipo de protección personal, lo dictaminará la Comisión Mixta de Higiene y Seguridad. Este equipo será de uso obligatorio. El alumno que no tenga protección no podrá permanecer en el laboratorio, siendo su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Además no podrá trabajar ni permanecer dentro de los laboratorios, si no se encuentra su profesor o alguien responsable que los sustituya. ARTÍCULO 8. En los laboratorios queda prohibido: fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos abiertos (tipo huarache). ARTÍCULO 9. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo, así como la obtención del dosímetro correspondiente. ARTÍCULO 10. Todas las substancias, equipos, materiales, etc., deberán ser manejados con el máximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los manuales de seguridad, según el caso. ARTÍCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencias deberán de estar siempre libres de obstáculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del área deberá verificar esto, al menos una vez cada semana. ARTÍCULO 12. Las regaderas deberán contar con el drenaje correspondiente, funcionar correctamente, estar lo más alejadas que sea posible de instalaciones o controles eléctricos y libres de todo obstáculo que impida su correcto uso. El responsable del área deberá verificar esto, por lo menos una vez cada semana. ARTÍCULO 13. Los controles maestros de energía eléctrica y suministros de gas para cada laboratorio deberán estar señalados adecuadamente, de manera tal que sean identificados fácilmente. ARTÍCULO 14. En cada laboratorio deberá existir al alcance de todas las personas que en él trabajen, un botiquín de primeros auxilios. El responsable del área deberá verificar, al menos una vez cada semana, e contenido del botiquín, para proceder a reponer los faltantes. ARTÍCULO 15. Los extintores de incendios deberán ser de CO2, y de polvo químico seco, según lo determine la Subcomisión Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; deberán de recargarse cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisión o por haber sido utilizados.



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ARTÍCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo: Identifíquese: Nombre y Puesto. Ubicación: Dé el mayor número de referencias físicas posibles y las vías de acceso. Tipo de siniestro. Número de lesionados. Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia. Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del área y a la Coordinación de Seguridad. ARTÍCULO 17. Los sistemas de extracción de gases deberán de mantenerse siempre sin obstáculos que impidan que cumplan con su función, deberán de evaluarse al menos una vez cada mes, y deberán recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada área soliciten. ARTÍCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, deberán de recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada área soliciten. ARTÍCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarán sujetos a este Reglamento en su totalidad. ARTÍCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio sin autorización del responsable del área correspondiente. Los manuales de prácticas correspondientes deberán incluir la forma correcta de desechar los residuos. ARTÍCULO 21. Para transferir líquidos con pipetas, deberá utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca. ARTÍCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del área deberá verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vacío, tanques de gases y aire, según sea el caso; apagadas las bombas de vacío, circuitos eléctrico, luces, etc. En caso de requerir que algún equipo trabaje de manera continúa, deberá dejarse en el interior y en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la información acerca del tipo de reacción o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo. ARTÍCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias tóxicas, deberá identificarse plenamente el área correspondiente. Nunca deberán tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre deberán tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Además se deberá trabajar en área con sistema de extracción y equipo de protección personal (según el manual correspondiente). ARTÍCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deberá existir, de manera clara, visible y legible, la información acerca de los teléfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo. ARTÍCULO 25. Todas aquellas cuestiones que no estén específicamente señaladas en el presente Reglamento, deberán ser resueltas por la Dirección de la Facultad con la opinión de la Coordinación de Seguridad, Prevención de Riesgos y Protección Civil. ARTÍCULO 26. Cualquier alteración en las condiciones de seguridad o en el cumplimiento del presente reglamento, deberá ser reportado al responsable correspondiente. ARTÍCULO 27. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc. propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el artículo 2 del presente Reglamento, o de las señalizaciones instaladas para protección civil, serán sancionadas conforme a la Legislación Universitaria, según la gravedad de la falta cometida. ARTÍCULO 28. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables serán las que decida el H. Consejo Técnico, conforme a las disposiciones de la Legislación Universitaria. ARTÍCULO 29. Tratándose de personal académico y administrativo, se levantarán las actas correspondientes y se dictarán las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo. ARTÍCULO 30. Cada área académica deberá tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad y será de observancia obligatoria, siendo este complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan. TRANSITORIO ÚNICO. El presente reglamento entrará en vigor el día siguiente de su publicación en la gaceta de la propia Facultad.



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Reglamento de Higiene y Seguridad de los Laboratorios del Departamento de Farmacia ARTÍCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad, para Laboratorios de la Facultad de Química de la UNAM, aprobado por el H. Consejo Técnico el 28 de abril de 1994. Su observancia es obligatoria para el personal académico, alumnos y trabajadores administrativos, y no excluye otra reglamentación que resulte aplicable. ARTÍCULO 2. REGLAS DE SEGURIDAD 2.1 Seguir todas las indicaciones de seguridad que se señalan en cada equipo o reactivo, así como las señaladas en cada práctica. 2.2 Queda prohibido correr dentro del laboratorio. 2.3 Todas las lesiones sufridas dentro del laboratorio, no importa qué tan insignificantes sean, deberán darse a conocer al coordinador del laboratorio. 2.4 Antes de desarmar o limpiar un aparato eléctrico, debe asegurarse de que esté desconectado de la corriente eléctrica. Nunca opere un equipo que desconoce, pregunte primero al laboratorista o al profesor. 2.5 No debe usarse material de vidrio roto o despostillado. 2.6 Si en su área o equipo se va a efectuar algún servicio de mantenimiento, asegúrese de dar aviso oportuno a todos los involucrados y comuníquelo a la Coordinación de Seguridad. 2.7 El alumno que necesite salir por cualquier motivo, deberá comunicarlo a los profesores. 2.8 El alumno que actúa como supervisor de cada equipo de trabajo, deberá verificar, al finalizar la práctica, el orden y la limpieza de cubículos y equipos. 2.9 Al finalizar cada sesión práctica, los alumnos entregarán al profesor responsable de la asignatura o al laboratorista en turno, los cubículos y equipos empleados, limpios y en buen estado; asimismo deberán informar cualquier defecto o anomalía detectada en los mismos. 2.10 Deberá colocar sus artículos personales en el sitio que para tal efecto se asignará en cada laboratorio. ARTÍCULO 3. MANUFACTURA DE MEDICAMENTOS 3.1 Todo el personal involucrado en la manufactura de medicamentos, deberá cubrir totalmente su cabello con una cofia limpia y en buen estado. 3.2 Deberá usar guantes de cirujano y cubrebocas limpios, en buen estado, cuando el proceso lo indique (por ejemplo, surtido y pesado de materias primas, etc.). 3.3 De preferencia debe portar zapatos cerrados con suela antiderrapante. 3.4 Queda prohibido introducir alimentos, bebidas o golosinas, excepto cuando así se requiera (Biofarmacia). 3.6 Quedan prohibidas las visitas. 3.7 Las puertas de los cubículos deben permanecer cerradas. ARTÍCULO 4. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS BIOLÓGICOS 4.1 En caso de romper o derramar material contaminado, se deberá agregar fenol al 5% y dejar actuar el desinfectante por 10 minutos. 4.2 Queda estrictamente prohibido arrojar medio de cultivo, disolventes orgánicos o productos biológicos, al sistema de drenaje, así como a los colectores de basura; estos residuos se deberán incorporar a recipientes que se localizan en cada laboratorio, para ser dispuestos adecuadamente. 4.3 Los cultivos deben esterilizarse antes de ser desechados; si se encuentran en material desechable, éste debe depositarse en los recipientes que se localizan en cada laboratorio. Estos residuos serán reciclados. 4.4 Otros desechos orgánicos (alimentos, animales, muestras biológicas) se depositarán en los recipientes etiquetados que para este propósito se encuentran en cada laboratorio. 4.5 El material de plástico se depositará en otro recipiente especial. 4.6 El material de vidrio se colectará aparte, en el recipiente indicado. 4.7 El papel limpio de desecho se depositará en otra caja para ser reciclado. ARTÍCULO TRANSITORIO ÚNICO. El presente Reglamento entrará en vigor al día siguiente de su aprobación por el H. Consejo Técnico de la Facultad.



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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE Fecha: Grupo : Equipo: Responsable: Guión: Integrantes: UTILIZACIÓN DE REACTIVOS

Reactivo Cantidad empleada (por equipo)

Observaciones anormales (contaminado, más de una fase, coloración anormal,

precipitados)

VIGILANCIA DE EQUIPO

Equipo

Hora de inicio de

uso/ término

Condiciones de uso (Cantidad pesada1, longitud

de onda2, rpm3, tiempo4, temperatura5, disolvente

utilizado6, aumento7, volumen8)

Observaciones (Sucio, no funciona

adecuadamente, sin observaciones, anotar el número de equipo o

inventario cuando considere que requiere mantenimiento)

Balanza1 Espectrofotómetro2 Centrífuga3,4 Microcentrífuga3,4 Estufa4,5 Rotaevaporador5,6 Microscopio7 Lámpara de luz UV Micropipeta8

TRATAMIENTO DE RESIDUOS

Residuo Observaciones (contenido, estado físico, si hay más de una fase o tiene precipitado) CRETIB+

R0 C R E T I B R1 C R E T I B R2 C R E T I B R3 C R E T I B R4 C R E T I B

+ Marque con una X, la(s) letra(s) correspondiente de acuerdo al sistema CRETIB (Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Tóxico, Inflamable, Biológico-Infeccioso)

_______________________________________________________________ (Nombre y firma del encargado de seguridad)



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HOJA DE SEGURIDAD DE REACTIVOS Investigue los siguientes datos (MSDS, Merck Index) y complete las siguientes tablas para cada sustancia a emplear. Posteriormente, en el “Rombo de comunicación de riesgos”, indique el valor de 0 a 4, correspondiente a cada riesgo (Salud, Inflamabilidad, Reactividad y Características específicas) de acuerdo a la Clasificación y grados de riesgo de las sustancias peligrosas (ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE). Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignición: Reactividad / Incompatibilidad: Características específicas: Equipo de protección personal:

Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignición: Reactividad / Incompatibilidad: Características específicas: Equipo de protección personal:



Reactivo: DL50/CL50 (rata): Punto de ignición: Reactividad / Incompatibilidad: Características específicas: Equipo de protección personal: En “Equipo de protección personal” indique la(s) letra(s) de identificación correspondiente(s) con base en la tabla del ANEXO 1.



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ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE CLASIFICACIÓN Y GRADOS DE RIESGO DE LAS SUSTANCIA QUÍMICAS

LETRAS DE IDENTIFICACIÓN PARA EL EQUIPO DE PROTECCIÓN

PERSONAL

Letra Equipo de protección personal A Anteojos de seguridad B Anteojos de seguridad y guantes C Anteojos de seguridad, guantes y mandil D Careta, guantes y mandil E Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos F Anteojos de seguridad, guantes, mandil y respirador para vapores G Anteojos de seguridad, guantes y respirador para vapores H Gafas de seguridad para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para vapores I Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos y vapores

J Gafas de seguridad para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para polvos y vapores

K Capucha con línea de aire o equipo SCBA, guantes, traje completo de protección y botas

X Consulte con el supervisor las indicaciones especiales para el manejo de estas sustancias

Hoja de valoración para la evaluación del bienestar de los animales de experimentación

Debido a que el trabajo experimental del guión se desarrollará en cuatro sesiones de laboratorio y en tres de ellas los animales de experimentación serán administrados con acetato de plomo vía intraperitoneal, por recomendación expresa del CICUAL, se realizará la revisión de los mismos posterior a la administración del xenobiótico. Para tal efecto, deberán reportar las características enunciadas en los recuadros presentados a continuación con la finalidad de identificar a los animales que puedan presentar daño provocado por una inadecuada administración del acetato de plomo. En caso de detectar cualquier daño se deberá reportar a los Profesores de laboratorio así como al responsable del bioterio, para que se realice la eutanasia del animal.

Fecha de inicio: Fecha de término: Fecha

Macroequipo responsable Hora

Actividad* Aislado¤ Pelo Erizado¤ Frecuencia de respiraciónɟ Acicalamiento en el punto de administración¤

Presencia de herida o irritación en la zona de aplicación¤

Inquisitivo o alerta al momento de sujetarlo¤

Orificios sucios (diarrea u orina)

¤

Coloración anormal de los ojos¤ Extremidades azules¤ Observaciones adicionales:

Nombre del revisor Firma del responsable del bioterio

* En caso de que una o varios animales presente poca actividad con respecto a la del control, anote los números de las correspondientes. ¤ En caso de que la respuesta sea “Sí”, anote el Número de rata. Compare con los animales control. ɟ (#Rata) + R = rápida; D = débil; N = normal. Compare con los animales control. Medidas Científicas: Si se procede a la eutanasia de algún animal, favor de avisarle al profesor para que lleve a cabo este procedimiento. Se recomienda recuperar 3 mL de sangre y guardarla en un tubo heparinizado.



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IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLÁTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVOS ACADÉMICOS

Que el alumno emplee métodos de extracción ácida y básica para separar tóxicos no

volátiles de naturaleza ácida y básica en una muestra problema.

Que el alumno emplee reacciones coloridas y cromatografía en capa fina (CCF) para la

identificación de tóxicos no volátiles en una muestra problema.

Que el alumno cuantifique un tóxico no volátil en una muestra problema. PROBLEMA

Separar e identificar escopolomina, paracetamol, ácido 4-hidroxibenzoico y ácido

barbitúrico de una muestra problema; y cuantificar el ácido barbitúrico presente.

REACTIVOS

Hidróxido de amonio (NH4OH) Solución de NaOH al 10%*

Metanol (MeOH) Acetato de etilo (AcOEt)

Ácido acético glacial (AcOH) Escopolamina

Reactivo de Dragendorff * Diclorometano (CH2Cl2)

Reactivo de Dille-Koppanyi * Ácido barbitúrico

Paracetamol Ácido 4-hidroxibenzoico

Ácido tartárico * Solución acuosa de ácido acético 2 M*

Solución saturada de nitrito de sodio (NaNO2) * Ácido clorhídrico (HCl)

Solución de ácido clorhidrico 1N* Sulfato de sodio anhidro

Acetato de etilo (AcOEt) Solución de NaHCO3 al 10%

*Ver APÉNDICE II



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EQUIPO

Rotaevaporador Bomba de aspersión

Lámpara de luz ultravioleta Espectrofotómetro

MATERIAL POR E QUIPO (Primer sesión)

Embudo de separación de 250 mL 2 Agitador de vidrio 1

Embudo de cola corta 2 Probeta de 10 mL 2

Matraz Erlenmeyer de 125 mL 6 Pipeta graduada de 10 mL 2

Matraz de bola de 50 mL 2 Anillo metálico 2

Vaso de precipitados de 250 mL 5 Tubos de ensayo 8

Vaso de precipitados de 100 mL 4 Anillos de corcho 2

Vidrio de reloj de 9 cm 2 Pipeta Pasteur 4

MATERIAL POR E QUIPO (Segunda sesión)

Cromatoplacas 1 Tubos capilares 3

Vaso de precipitados de 100 mL 4 Pipeta graduada de 10 mL 2

MATERIAL PARA LA CURVA (Segunda sesión)

Matraz volumétrico de 25 mL 1 Pipeta volumétrica de 4 mL 1

Matraz volumétrico de 10 mL 4 Micropipetas de 100-1000 L 1

Pipetas volumétricas de 5 mL 2

NOTA: El profesor proporcionara las celdas para las lecturas



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DESARROLLO EXPERIMENTAL

El profesor proporcionará una muestra problema de 30 mL, la cual contiene los tóxicos no

volátiles escopolamina, paracetamol, ácido 4-hidroxibenzoico y ácido barbitúrico.

PRIMERA SESION

A) EXTRACCION ÁCIDA

1. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solución acuosa de ácido tartárico al

10% hasta un pH = 2.

2. La solución ácida se trasvasa a un embudo de separación y se extrae con dos porciones

de 15 mL de AcOEt, separando las fases orgánicas y reuniéndolas en un matraz.

3. La fase orgánica se extrae con dos porciones de 15 mL de una solución de bicarbonato

de sodio (NaHCO3) al 10%, separando las fases acuosas y reuniéndolas en un matraz.

4. En un embudo de cola corta se coloca un algodón en el fondo, posteriormente se

adiciona sulfato de sodio anhidro hasta formar una capa de alrededor de 1 cm sobre el

algodón. Filtrar la fase orgánica a través de este dispositivo (proceso de secado sobre

sulfato de sodio anhídro). La fase orgánica se concentra in vacuo y el residuo final se

reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fracción A1.

5. A la fase acuosa que se obtuvo en el inciso 3 se le adiciona HCl concentrado hasta pH

= 1 y posteriormente se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt, separando las

fases orgánicas y reuniéndolas en un matraz.

6. La fase orgánica obtenida en el inciso 5 se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se

concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con dos mL de AcOEt. Etiquetar

como fracción A2.

7. A la fase acuosa obtenida en el inciso 2 se le adiciona gota a gota (aproximadamente

25 gotas) de una solución de NaOH al 10% hasta pH = 10.



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8. La solución básica se trasvasa a un embudo de separación y se extrae con dos

porciones de 15 mL de CH2Cl2, separando las fases orgánicas y reuniéndolas en un

matraz.

9. La fase orgánica se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se concentra in vacuo y el

residuo final se reconstituye con 2 mL de CH2Cl2. Etiquetar como fracción A3.

10. A la fase acuosa obtenida en el inciso 8 se le adiciona HCl concentrado gota a gota

hasta pH = 2. Etiquetar como fracción A4.

11. Tomar 2 mL de la fracción A4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de

calentamiento; el residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de metanol y se conserva

para su posterior análisis con las pruebas de identificación.

12. El remanente de la fracción A4 se conserva para la cuantificación de ácido barbitúrico

en la muestra en la segunda sesión.

B) EXTRACCION BÁSICA

1. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solución de NaOH al 10% hasta un

pH = 10 (aproximadamente 1 mL).

2. La solución básica se trasvasa a un embudo de separación y se extrae con dos

porciones de 15 mL de CH2Cl2, separando las fases orgánicas y reuniéndolas en un

matraz.

3. La fase orgánica obtenida en el inciso 2 se seca sobre sulfato de sodio anhídro y se

lleva a sequedad a presión reducida. El residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de

MeOH. Etiquetar como fracción B3.

4. A la fase acuosa obtenida en el punto 2 se le adiciona gota agota una solución de HCl

1N hasta pH = 7.

5. La fase acuosa neutra se trasvasa a un embudo de separación y se extrae con dos

porciones de 15 mL de AcOEt. La fase orgánica obtenida se seca sobre sulfato de



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sodio anhidro, se concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye en 2 mL de

AcOEt. Etiquetar como fracción B1.

6. La fase acuosa neutra se lleva a pH = 2 adicionando HCl 1N, posteriormente, esta

fase se trasvasa a un embudo de separación y se extrae con dos porciones de 15 mL

de AcOEt.

7. La fase orgánica obtenida en el inciso 6 se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se

concentra a presión reducida y el residuo final se reconstituye en dos mL de AcOEt.

Etiquetar como fracción B2.

8. La fase acuosa resultante del punto 6 se etiqueta como fracción B4.

9. Tomar 2 mL de la fracción B4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de

calentamiento; el residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de metanol y se conserva

para su posterior análisis.

10. El remanente de la fracción B4 se conserva para la cuantificación de ácido

barbitúrico en la muestra durante la siguiente sesión.

NOTA: El disolvente recuperado al final de la concentración in vacuo se depositará en el contenedor etiquetado como R1 para A3 y B3 y en R2 para A1-2, 4 y B1-2, 4. R3. Los residuos de sulfato de sodio anhidro se depositan en el contenedor etiquetado como R3.

SEGUNDA SESION

C) IDENTIFICACIÓN

Cromatografía en capa fina

Solicitar a los profesores dos placas para cromatografía en capa fina (CCF). Los análisis

por CCF se realizan en cromatoplaca de 5 cm X 2.5 cm, que consisten en placas de

aluminio recubiertas con una capa de gel se sílice (sílica Kieselgel 60 F254 Merck)

1. Previamente, se aplicará en el lado izquierdo de una cromatoplaca (placa 1) la referencia

de escopolamina, en la placa 2 la de ácido barbitúrico, en la placa 3 la referencia de



18

paracetamol y en la 4 la de ácido 4-hidroxibenzoico. Colocar la muestra de los residuos

reconstituidos previamente aplicándolas en el lado derecho de cada una de las placas de

acuerdo al siguiente esquema.

Esquema 1. CCF de las muestras en estudio.

2. Para la identificación de la escopolamina emplear como sistema de elución una

mezcla de CH2Cl2-MeOH- NH4OH (9:1:0.1). NOTA: Para preparar este sistema

de elución es necesario mezclar bien el hidróxido de amonio y metanlo primero, y

posteriormente verter la mezcla resultante en el CH2Cl2.

3. Para la identificación del ácido barbitúrico emplear como sistema de elución una

mezcla de AcOEt-MeOH-AcOH (7:2:1). Agitar vigorosamente la mezcla de elución

antes de eluir la placa.

4. Para la identificación de paracetamol utilizar como sistema de elución una mezcla

CH2Cl2-MeOH (9:1).

5. Para la identificación de ácido 4-hidroxibenzóico utilizar como sistema de elución

una mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 10 gotas de AcOH, por cada 10 mL de mezcla.

6. Saturar las cámaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las

cromatoplacas.

7. Eluir hasta la línea “limite de elución” indicada en el esquema 1.



19

8. Visualizar la presencia de las sustancias con una lámpara de luz U.V. a 254 nm y

posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solución etiquetada como

“solución reveladora de reactivo de Dragendorff” para el caso del alcaloide

(escopolamina), con una cámara de yodo para el ácido barbitúrico, y con sulfato

cérico amoniacal/H2SO4 para el paracetamol y ácido 4-hidroxibenzoico.

9. Calcular el factor de retención (Rf) para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y

comparar el valor obtenido con el de la referencia correspondiente.

10. Una vez identificados los componentes de sus fracciones desechar los sistemas de

elución de la siguiente forma: depositar la mezcla CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1)

en el contenedor etiquetado como R4; depositar la mezcla AcOEt-MeOH-AcOH

(7:2:1) en el contenedor etiquetado como R5; depositar las mezclas que contengan

CH2Cl2-MeOH-AcOH en el contenedor etiquetado como R6. Depositar las

cromatoplacas en una bolsa de plástico etiquetada como R7

Identificación por reacciones de color

Con el excedente de las fracciones reconstituidas realizar los ensayos respectivos.

Escopolamina: reactivo de Dragendorff

1. Colocar 10 gotas de la fracción reconstituida correspondiente a escopolamina en un tubo

de ensayo y agregar 2 gotas de “solución reveladora de Dragendorff”.

2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con

CH2Cl2 para esta reacción.

Barbitúricos: reactivo de Dille-Koppanyi

1. Colocar 10 gotas de la fracción reconstituida correspondiente a barbitúricos en un tubo y

agregar dos gotas del reactivo A y una gota del reactivo B (Dille-Koppanyi).

2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con

MeOH para esta reacción.



20

3. Una vez identificadas TODAS las fracciones desechar de la siguiente manera: Depositar

las fracciones A4, B4 y los residuos de la reacción de Dille-Koppanyi en el contenedor

etiquetado como R8. Depositar las fracciones A3, B3 y los residuos de la reacción de

Dragendorff en el contenedor etiquetado como R9.

Nota: Los residuos de paracetamol y ácido 4-hidroxibenzoico se depositarán en los

contenedores etiquetados como R10 y R11, respectivamente.

D) CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO BARBITÚRICO

PREPARACIÓN DE LA CURVA PATRÓN DE ÁCIDO BARBITÚRICO

La curva patrón de ácido barbitúrico se prepara colocando en matraces volumétricos de 10

mL los volúmenes de la solución patrón de ácido barbitúrico indicados en la Tabla 1 y

llevando al aforo con agua destilada:

Tabla 1. Curva patrón de ácido barbitúrico

No. de tubo Alicuota de la

solución patrón de ácido barbitúrico (mL)

Concentración

de ácido barbitúrico (mg/mL)

1 0.0 BLANCO

2 1.5 0.45

3 3 0.90

4 6 1.80

5 8 2.40



21

TRATAMIENTO DE LAS FRACCIONES QUE CONTIENEN ÁCIDO

BARBITÚRICO: MUESTRA PROBLEMA, CURVA PATRÓN Y BLANCO

1. Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen ácido

barbitúrico (muestra problema, patrón y blanco).

2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solución saturada de NaNO2,

0.1 mL de la solución de AcOH 2M y 2.4 mL de agua destilada.

3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotómetro a 530

nm, utilizando como blanco el tubo número 1 de la curva (ver Tabla 1).

4. Después de haber realizado la lectura de cada una de las muestras colocarlas en un

contenedor etiquetado como R12.



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CUESTIONARIO.

1. En el caso de emplear una muestra biológica indique ¿cuál es el objetivo de adicionar

ácido tartárico además de ajustar el pH?

2. Una vez desarrollado el guión ¿qué puntos del proceso y propiedades fisicoquímicas

considera que son críticos para una eficiente extracción de un xenobiótico?

3. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificación.

Marque con una cruz si la reacción fue positiva y un guión si fue negativa.

Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificación

Referencia escopolamina

Residuo reconstituido

de escopolamina

Referencia barbitúrico

Residuo reconstituido

de ácido barbitúrico

Dragendorff Dille-

Koppanyi

Rf

4. Indique si su muestra contenía ácido barbitúrico. Explique su respuesta.

5. Indique si su muestra contenía escopolamina. Explique su respuesta.

6. Indique si su muestra contenía ácido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. Explique su

respuesta.

7. En la extracción en medio ácido cual es la finalidad de utilizar la solución de NaHCO3 al

10%.

8. ¿Cuáles son los puntos que considera críticos para la adecuada identificación de los

componentes en la muestra problema? Explique su respuesta.

9. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores

de la regresión lineal.



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Tabla 1. Absorbancias de la curva patrón

Concentración de ácido

barbitúrico [mg/mL] Absorbancia

0.0

0.45

0.9

1.8

2.4

Pendiente (m)

Ordenada al origen (b)

Coeficiente de correlación (r)

10. Interpole los valores de absorbancia en la curva y calcule la concentración de ácido

barbitúrico en la muestra, indicando el procedimiento realizado para este cálculo.

11. Calcule el porcentaje de recobro de ácido barbitúrico.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972.

Bowman W.C. y Rand M.J. Farmacología. Bases Bioquímicas y Patológicas. (2ª ed). Ed. Interamericana, México, 1984. pp 42.2542.32.

Blanke R.V. y Decker W.J. Analysis of Toxic substances. En Burtis C.A., Edward R.A. (Eds.) Textbook of clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986. pp 16701744.

Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal of Forensic Sciences 30, 708714,

Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood and Tissues. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154159.

Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica, Plantas Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, España, 2001, pp 775792.

Aydın, A., Ercan Ö., Taşcıoğlu S. (2005). A novel method for the spectrophotometric determination of nitrite in water. Talanta 66, 1181–1186.



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APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS.

1. Efectos tóxicos de la escopolamina y del ácido barbitúrico, ácido 4-hidroxibenzoico

y paracetamol.

2. Relación del grado de disociación de una sustancia con el pH del medio en el que

se encuentra disuelto en función del valor de su pKa.

3. Valores de pKa de la escopolamina y el ácido barbitúrico, ácido 4-hidroxibenzoico

y paracetamol.

4. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.

5. Solubilidad de una sustancia iónica en medio acuoso y en un disolvente orgánico.

6. Densidad de los disolventes a emplear.

7. Fundamento de una extracción múltiple y selectiva.

8. Sustancias que pueden precipitar proteínas.

9. Especificar las especies químicas que se encuentran en cada una de las fases

obtenidas en los tratamientos ácido y básico

10. Objetivo de adicionar una solución de NaOH 2.5 N en el proceso de extracción

ácida.

11. Objetivo de adicionar una solución de HCl 1N en el proceso de extracción básica.

12. Fundamento y esquema de la reacción de Dragendorff.

13. Fundamento y esquema de la reacción de Dille-Koppanyi.

14. Fundamento de la cromatografía en capa fina como herramienta de identificación de

sustancias químicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como

agentes reveladores.

15. Reacción involucrada en la cuantificación de ácido barbitúrico.

16. Ley de Lambert y Beer



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APENDICE II: PREPARACION DE REACTIVOS

Solución de sulfato sérico amoniacal en ácido sulfúrico.

Pesar 12 g de sulfato sérico amoniacal y adicionarlos lentamente y con agitación constante

sobre 350 g de hielo, posteriormente, adicionar 12.5 mL de H2SO4 concentrado

manteniendo la agitación. Una vez obtenida la solución se filtra a través de algodón.

Guardar la solución anterior en un frasco ámbar.

Reactivo de Dragendorff (Solución reveladora)

Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 mL de ácido

acético glacial, calentar por 10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar

por 12 horas y posteriormente filtrar la solución. 20 mL del filtrado (solución rojo-café) se

mezclan con 8 mL de acetato de etilo, la solución anterior guardarla en un frasco ámbar (la

cual es estable por 6 meses).

Reactivo A (Dille-Koppanyi)

Solubilizar 1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de metanol absoluto.

Reactivo B (Dille-Koppanyi)

Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 95 mL de metanol absoluto

Solución de hidróxido de sodio al 10%

Disolver 10 g de NaOH en 100 mL de agua destilada.

Solución de ácido clorhídrico 1 N

Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.



26

Solución de ácido tartárico al 10%

Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.

Solución patrón de ácido barbitúrico 3 mg/mL

Pesar 75.0 mg de ácido barbitúrico y transferir la pasada cuidadosamente a un matraz

volumétrico de 25 mL, llevar al aforo con agua destilada.

Solución saturada de nitrito de sodio. (NaNO2)

Pesar 82 g de NaNO2 y disolver en 100 mL de agua destilada.

Solución de ácido acético 2 M.

Medir 1.14 mL de ácido acético glacial (densidad 1.049 g/mL) y agregarlos a 5 mL de

agua, vaciar en un matraz volumétrico de 10 mL y aforar en seguida con agua destilada.

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

R1: Residuos de escopolamina en diclorometano.

R2: Residuos de acetato de etilo.

R3: Sulfato de sodio anhidro.

R4: Mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 7 gotas de NH4OH

R5: Mezcla MeOH-acetato de etilo-ácido acético

R6: Mezcla Diclorometano-MeOH-Ácido acético

R7: Cromatoplacas

R8: Reactivo de Dille-Koppanyi, ácido barbitúrico (fracciones A4 y B4), acetona y MeOH

R9: Reactivo de Dragendorff, escopolamina (fracciones A3 y B3), CH2Cl2 y MeOH

R10: Residuos de paracetamol.

R11: Ácido 4-hidroxibenzóico.

R12: Ácido barbitúrico, NaNO2, AcOH, acetona y MeOH

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