Manual de Anlisis Bsico de SemenEdicin en espaol Noviembre 2004

Edicin original en ingls Junio 2002

EditoresU. Kvist y L. Bjrndahl

Este manual ha sido revisado para adaptarse a la edicin de 1999 del manual de la OMS

Monografas de la ESHREEditor en Jefe de la serie de monografas

Maas Jan Heineman

La Serie de Monografas ESHRE

Las revistas de la ESHRE (Sociedad Europea de Reproduccin Humana y Embriologa), HumanReproduction, Molecular Human Reproduction, y Human Reproduction Update, son bien conocidas portodos los que trabajan en las reas de la ciencia de la reproduccin y la medicina de la reproduccin. Lacalidad de estas publicaciones ha sido ampliamente reconocida, las tres revistas tienen una posicin sobre-saliente en las listas de factor de impacto en las reas temticas de Biologa Reproductiva y Obstetriciay Ginecologa.

Anteriormente, se publicaron diversos suplementos junto con la revista Human Reproduction, loscuales fueron muy apreciados. Estos suplementos estaban a menudo basados en los textos de las sesionesde trabajo de la ESHRE, simposios, congresos y otras reuniones cientficas. Los suplementos trataron unamplio espectro de temas relacionados con las ciencias reproductivas bsicas y con la medicina clnicareproductiva.

El Comit de Publicaciones de la ESHRE discuti la cuestin de la publicacin de suplementos.En estrecha colaboracin con nuestros editores en Jefe y con el total compromiso del Comit Ejecutivo sedecidi detener este tipo de publicacin y aadir una nueva publicacin hermana de nuestras tres revistas.Recibir el nombre de Monografas ESHRE y sustituir a los suplementos de Human Reproduction.

La serie de Monografas ESHRE se centrar en la publicacin de directrices de la ESHRE y deponencias de encuentros cientficos en los campos de la ciencia y la medicina reproductiva. Nuestro pro-psito es producir una serie de monografas de acuerdo con los elevados estndares de las revistas ESHREexistentes. La aceptacin de los manuscritos estar sujeta al acuerdo del Comit de Publicaciones de laESHRE. Cada ejemplar de la serie de Monografas ESHRE tendr un editor invitado que ser responsablede controlar el proceso de revisin por pares independientes con la ayuda del Editor en Jefe y delAdministrador de la serie de Monografas. La serie de Monografas ESHRE ser patrocinada por laESHRE y/o por patrocinadores externos.

Los primeros dos nmeros de las Monografas ESHRE sern las Guas para asesoramiento enInfertilidad y el Manual de Anlisis Bsico de Semen. Invito a nuestros lectores a identificar otrostemas y actividades en nuestro mbito de inters que puedan ser propuestos para un nmero de la serieMonografas ESHRE.

Las Monografas ESHRE suponen un desarrollo nuevo e interesante para la Sociedad. Confo enque los miembros de la Sociedad y los lectores de las revistas ESHRE aprecien esta iniciativa.

Maas Jan HeinemanEditor en Jefe de la Serie de Monografas

Presentacin de la Versin EspaolaEl grupo de trabajo de Seminologa y Tcnicas de Reproduccin Asistida de la SEQC se marc como unode sus objetivos prioritarios la estandarizacin y unificacin de mtodos en el anlisis de semen. Para ellose plante inicialmente la publicacin de documentos que desarrollaran los mtodos propuestos en elmanual de la OMS [1].

Sin embargo, tras la publicacin del manual conjunto de la NAFA y la ESHRE, pareci ms acertado defen-der un texto que comparta unos objetivos similares a los de nuestro grupo, con unas recomendaciones deta-lladas, y que adems haba sido consensuado por varias sociedades cientficas internacionales. La SEQC, atravs del grupo de trabajo de Seminologa y Tcnicas de Reproduccin Asistida, se propone colaborar conla NAFA-ESHRE en las actualizaciones y nuevos manuales que se puedan elaborar en el futuro.

Las personas que hemos trabajado en esta traduccin agradecemos al Profesor Lars Bjrndahl su conti-nuo y desinteresado apoyo y habernos propuesto esta interesante colaboracin.

[1] WHO (1999) WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus interaction. 4th edn. CambridgeUniversity Press, Cambridge, UK

La traduccin de este documento ha sido dirigida por Carmen Mar Medina

Traductores:Manuel Ardoy VilchesLicenciado en Biologa. Responsable del Laboratorio de FIVHospital Universitario La Paz, Madrid

Llus Bassas ArnauDoctor en Medicina. Especialista en Endocrinologa y Androloga (UAB)Jefe del Laboratorio de Seminologa y Embriologa Fundaci Puigvert, Barcelona

Jos Antonio Castilla AlcalDoctor en Medicina. Facultativo Especialista de Anlisis Clnicos Unidad de Reproduccin. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada

Rosa Mara Magn PalomaresLicenciada en BiologaIVI Almera

Carmen Mar MedinaLicenciada en Farmacia. Facultativa de Anlisis ClnicosLaboratorio de Bioqumica. Hospital de Galdakao

Inmaculada Martn NavasDoctora en Farmacia. Facultativo Especialista en Anlisis ClnicosLaboratorio de Anlisis Clnicos. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca

Coordinador de la edicin: Felipe Antoja Rib

Grupo de trabajo de Seminologa y tcnicas de reproduccin asistida: Jose Antonio Castilla Alcal, Amparo Galn Ortega, Maria Luisa Hortas, Carmen Mar Medina (presidenta), Isabel Snchez Prieto, Maria del Valle Lozano Vera, Inmaculada Martn Navas, Mercedes Marcos, Carlos Aulesa Martnez y Maria del Carmen Gonzalvo Lpez.

Comit de Publicaciones: Felipe Antoja Rib, Francisco Caizares Hernndez, Jos M. Egea Caparrs, RomnGalimany Sol Miguel Garca Montes, Luis Gregorio Gmez-Cambronero Lpez, Jos M. Gonzlez de Buitrago, Jos M. Hernndez Prez, Jordi Huguet Ballester (presidente), Joan B. Ortol Devesa, Anna Padrs Fluvi y Eullia Urgell Rull.

Editado por: Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa MolecularPadilla, 323, desp. 68 - 08025 Barcelona - http://www.seqc.es/ - secre@seqc.esImpresin: Talleres Grficos VigorISBN 84-89975-16-7Dep. Legal: 42.778

iESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis p.i, 2002

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

Prefacio

Manual de Anlisis Bsico de Semen

Este Manual de Anlisis Bsico de Semen es el resultado de un esfuerzo de colaboracin entre los miem-bros de la Asociacin Nrdica de Androloga (NAFA) y del Grupo de Inters Especial en Androloga(SIGA) de la ESHRE.

Este manual est dirigido a todos aquellos que trabajan en el campo de la biologa y la medicinade la reproduccin, y especialmente a los que tienen responsabilidad en el control y garanta de calidad enel laboratorio de Seminologa.

El manual detalla los fundamentos y principios bsicos del anlisis de semen en la actualidad. Losprimeros seis captulos se centran en la concentracin espermtica, movilidad, vitalidad, morfologa, y losanticuerpos antiespermatozoide. Se pone especial nfasis en los procedimientos, clculos, resultados, reac-tivos, equipos y materiales. El captulo final se dedica al control y garanta de calidad. El manual conclu-ye con algunos apndices tiles.

Aunque el Manual de Anlisis Bsico de Semen se publica en las pginas web de la NAFA(http://www.ki.se/org/nafa) y la ESHRE (http://www.eshre.com)* se consider til disponer tambin deuna versin del mismo en Monografas ESHRE. Espero que este manual sea de utilidad tanto en la clni-ca como en el laboratorio. Se invita a aquellos clnicos que no estn familiarizados con la actividad dellaboratorio de semen a conocer los principios bsicos del anlisis de semen. Para otros puede ser de ayudaen la revisin de sus tcnicas.

Agradezco a los miembros del grupo de trabajo NAFA-ESHRE por este valioso Manual de AnlisisBsico de Semen.

Maars Jan HeinemanEditor en Jefe de las Monografas

La versin en ingls se encuentra tambin disponible de forma gratuita en el sitio de internet: http//eshremonographs.oupjournals.org

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ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis p.ii, 2002

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

Prlogo

La Asociacin Nrdica de Androloga (NAFA) decidi en Turku en Agosto de 1995 crear el Grupo deCalidad de Laboratorio de Androloga en Anlisis de Semen. La misin de este grupo fue desarrollar unmanual tcnico detallado con mtodos basados en las recomendaciones de la Organizacin Mundial de laSalud (WHO 1992). El objetivo era que el manual pudiera constituir la base para un control de calidadexterno y para la colaboracin cientfica en este campo.

Los miembros del grupo NAFA fueron : Ulrik Kvist (coordinador), Alexander Giwercman, TrineB. Haugen, Jyrfki Suominen, y Lars Bjrndahl (secretario). Otros colaboradores fueron: Birute Zilaitiene,Margus Punab, ystein Magnus, se Strutz, Trine Henrichsen, Turid Vollen, Ingmarie Sundgren, IngerSderlund, Maiken Simonsen, Lene Andersen, Majbrit Kvist y Antero Horte.

La primera edicin de este manual se public en 1997. La segunda edicin se public en 1998 y latercera, reeditada con el fin de adaptarse a la edicin de 1999 de las recomendaciones de la OMS, en elao 2000.

Durante la reunin de trabajo anual del Grupo de Inters Especial en Androloga (SIGA) de laESHRE en Bolonia, en Julio de 2000, se decidi aunar esfuerzos para realizar un Manual de AnlisisBsico de Semen conjunto NAFA-ESHRE. Se constituy un grupo de trabajo con representantes de laESHRE SIGA, formado por Usha Punjabi, David Mortimer, Chistopher Barrat y Lars Bjrndahl por partede la ESHRE, y el Grupo de Calidad de Laboratorio de Androloga en Anlisis de Semen de la NAFA.Ulrik Kvist coordin el trabajo y Lars Bjrndahl actu como secretario.

Este manual NAFA-ESHRE constituye una aplicacin de las directrices de la OMS (WHO 1999)para facilitar el establecimiento de mtodos y materiales comunes y estandarizados en los laboratorios deandrologa de los pases europeos, como requisito previo para la colaboracin cientfica y el control exter-no de calidad. No existe ningn mtodo nico que resulte ideal, y el grupo ha discutido diferentes posibi-lidades para alcanzar un consenso en mtodos, que sea posible usar en los laboratorios de androloga cl-nica, y a la vez sean aceptables desde el punto de vista metodolgico (eliminacin de las fuentes de error).

Los mtodos en el manual tambin se adecuan con el currculo del curso estandarizado para ense-anza de Anlisis Bsico de Semen desarrollado e implementado por el SIGA. Estos cursos se han cele-brado como cursos conjuntos ESHRE-NAFA en Estocolmo (1995, 1996 y 2001), arhus (1997),Gothenburg (1998), Oslo (1998) y Helsinki (2001).

Referencias

WHO (1992) WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 3rd edn.Cambridge University Press, Cambridge, UK.WHO (1999) WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus interaction. 4th edn.Cambridge University Press, Cambridge, UK.

Direcciones

ESHRE: Sociedad Europea de Reproduccin Humana y Embriologa. Pgina web: http://www.eshre.comNAFA: Asociacin Nrdica de Androloga, Presidente Marita Rsnen. Pgina web: http://www.ki.se/org/nafaSIGA: Grupo de Inters Especial en Androloga, coordinador Herman Tournaye. Pgina web: http://www.eshre.com

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ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis p.iii, 2002

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

Contenido

Editorial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi

1. Anlisis de semen: visin general. . . . . . . . . 1Conceptos y principios bsicos. . . . . . . . . . . . . . 1Seguridad en el laboratorio de androloga. . . . . . 1La muestra de semen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2Calibracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5Equipo y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2. Concentracin espermtica . . . . . . . . . . . . . 7Principios bsicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7Determinacin de la dilucin apropiada . . . . . . . 7Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8Clculos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11Equipo y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11La confianza de los recuentos espermticos . . . 12

3. Movilidad espermtica . . . . . . . . . . . . . . . . 15Principios bsicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Movilidad espermtica en el monitor de vdeo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Determinacin de la motvlidad espermtica . . . 16Clculos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17Grabacin de vdeo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4. Vitalidad espermtica. . . . . . . . . . . . . . . . . 19Principios bsicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19Clculos y resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19Equipo y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

5. Morfologa espermtica . . . . . . . . . . . . . . . 21Principios bsicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Consideraciones para la evaluacin de la morfologa espermtica . . . . . . . . . . . . . . 22Preparacin de las extensiones . . . . . . . . . . . . . 23Evaluacin de la morfologa espermtica . . . . . 26Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Clculos y resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Equipo y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

6. Anticuerpos antiespermatozoide . . . . . . . . 29Principios bsicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Anticuerpos antiespermatozoide . . . . . . . . . . . . 29Prueba SpermMAR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30Prueba immunobead . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Control de calidad para las pruebasspermMAR e Immunobead. . . . . . . . . . . . 33

Equipo y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

7. Control de calidad y garanta de calidad. . 35CC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35CCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Control a nivel intra-anlisis. . . . . . . . . . . . . . . 35Programa bsico de CCI. . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Media mensual de los resultados . . . . . . . . . . . 36Control del equipo y los instrumentos . . . . . . . 36CCE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36GC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Apndice I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Apndice II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

For any citations from this Manual, the source must be given as the original chapter with full bibliographic details as given as the top of thefirst page of each chapter.Cualquier cita de este Manual deber mencionar la fuente de la versin original en ingls, con todos los detalles bibliogrficos tal como semencionan en la cabecera de la primera pgina de cada captulo.

vESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis p.v-vii 2002

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

Histricamente, el anlisis de semen ha surgidocomo una disciplina que acompaa a aquellas quese ocupan del hombre o de la pareja infrtil. En lamedicina moderna, el anlisis de semen es por tantorealizado en una amplia variedad de circunstancias.En consecuencia, el microscopio para el anlisis desemen puede estar en la poyata del urlogo, gine-clogo, dermatlogo o endocrinlogo, en el labora-torio de urologa, patologa o anlisis clnicos, en eldepartamento de medicina del trabajo y actualmen-te tambin en gran medida en el creciente nmerode clnicas que ofrecen tratamientos para la inferti-lidad. Un tcnico a tiempo parcial puede realizaralgunos anlisis al ao, mientras que los facultati-vos experimentados de los centros de andrologapueden realizar varios miles de anlisis. Comoresultado de esta amplia variedad de tradiciones ysituaciones, el anlisis de semen no ha alcanzadosiempre la atencin y desarrollo tcnico que lamedicina moderna exige de la buena prctica en ellaboratorio.

Ha habido diversas e importantes contribu-ciones a los esfuerzos para mejorar los estndaresen el anlisis bsico de semen. Slo para mencionaralgunos hitos: Freund y Carol sugirieron mejorasfundamentales en los mtodos de recuento esper-mtico (Freund y Carol, 1964). MacLeod y Freundrealizaron mejoras relacionadas con la morfologaespermtica (MacLeod, 1964; Freund, 1966). El

extenso trabajo de Eliasson, que public directricespara los mtodos y la buena prctica del laborato-rio, y Mortimer, que aadi guas para adiestra-miento orientado a objetivos y control de calidad enlos laboratorios de androloga (Eliasson, 1971a,b,1975, 1977, 1981; Mortimer, 1994). Los manualesde anlisis de semen de la Organizacin Mundial dela Salud (WHO 1987, 1992, 1999; Belsey y cols.,1980) han sido fundamentales para iniciar la estan-darizacin global del anlisis de semen. Sin embar-go, al inicio de un curso de anlisis bsico de semen(Bjrndahl y cols., 2002), una muestra de semenfue examinada por 20 participantes que trabajabanen anlisis de semen y usaban mtodos recomenda-dos por la OMS. Sus resultados fueron tan disparescomo 1-71 x 106/mL, aunque el valor diana obteni-do por tcnicos entrenados utilizando mtodos con-trolados fue de 41 x 106/mL.

La falta de exactitud en los resultados deanlisis bsicos de semen es todava un problemaurgente. El origen de esta situacin se encuentra enla falta de una estandarizacin global y detallada delos mtodos para el anlisis de semen (De Jonge yBarrat, 1999). Un slo laboratorio puede controlarsu propia calidad y proporcionar atencin adecuadaa sus propios pacientes, pero cuando hay que com-parar entre laboratorios y publicaciones cientficase interpretar publicaciones de laboratorios que apli-can variantes de los mtodos recomendados por la

Editorial

Ulrik Kvist1 y Lars Bjrndahl2

1Department of Women and Child Health, Andrology Center, Karolinska Hospital and Institute, Box 140,SE-171 76 Stockholm, Sweden and 2Assisted Conception Unit, Birmingham Womens Hospital, andReproductive Biology and Genetics Group, University of Birmingham, Birmingham B15 2TG, UK

OMS- los resultados son raramente aplicables aotros laboratorios.

Adems de disponer de mtodos comunes,resulta fundamental que el personal que realiza an-lisis de semen est bien entrenado para realizarlosdel mismo modo. El Grupo de Inters Especial enAndrologa (SIGA) de la ESHRE tom la iniciativade crear en 1994 un curso estandarizado de apren-dizaje en el anlisis bsico de semen (Bjrndahl ycols., 2002). Estos cursos han tenido mucho xito yse celebran regularmente, sobre todo en Holanda,Blgica, los pases nrdicos [en estos ltimos comocursos conjuntos de la Asociacin Nrdica deAndrologa (NAFA) y la ESHRE] y Sudfrica. Enlos ltimos aos tambin han aparecido muchaspublicaciones valiosas que abarcan el control decalidad interno y externo, y el uso de entrenamien-to intensivo para conseguir consistencia en losresultados intra e inter laboratorios (Dunphy ycols., 1989; Neuwinger y cols., 1990; Clements ycols., 1995; Franken y cols., 2000; Keel y cols.,2000).

Sin embargo, result obvio que las reco-mendaciones de la OMS no eran lo suficientemen-te detalladas tanto para asegurar la estandarizacinde los mtodos y las rutinas de trabajo, como parapermitir un aprendizaje completamente estandari-zado durante y despus de los cursos.

Con el fin de mejorar esta situacin, y esta-blecer los fundamentos para la estandarizacinentre laboratorios, en 1995 la NAFA comision ungrupo de trabajo sobre la calidad del laboratorio deanlisis de semen. El grupo de trabajo tena queescribir un manual de laboratorio detallado quedebera ser recomendado por la NAFA a todos loslaboratorios que realizan anlisis de semen en lospases nrdicos. La base para este manual fue la ter-cera edicin del manual de laboratorio de la OMS.La primera versin estuvo disponible en 1997, y lasegunda versin se edit en 1998. Cuando la OMSpublic su cuarta edicin en 1999, la NAFA decidihacer nuevas revisiones para adaptarse a este nuevomanual de laboratorio de la OMS. En el ao 2000,el SIGA sugiri que la NAFA y la ESHRE deberanrealizar un manual conjunto que pudiera recomen-darse a todos sus miembros. Se constituy un grupode trabajo conjunto de la NAFA (AleksanderGiwercman, Trine B. Haugen, Jyrfki Suominen, yUlrik Kvist, coordinador) y del SIGA (Usha

Punjabi, David Mortimer, Chistopher Barrat y LarsBjrndahl, secretario) y este manual se present alas dos organizaciones en el verano de 2001.

Se han hecho esfuerzos para crear unasrecomendaciones claras y detalladas para el trabajoprctico en el laboratorio de androloga. En la elec-cin entre diversos mtodos, el grupo de trabajo haprocurado usar procedimientos simples y controla-bles, con el menor nmero posible de fuentes deerror. Adems, se han integrado elementos bsicosde control de calidad en los procedimientos paradisminuir la aparicin de errores. El resultado, estemanual de anlisis bsico de semen, est ahora dis-ponible a travs de la NAFA y la ESHRE SIGApara ser usado en los laboratorios y en los cursos deanlisis bsico de semen en todo el mundo, comobase para la estandarizacin, mejora de la calidaden el anlisis de semen e intercambio de resultadoscientficos relativos a los anlisis de semen.

ReferenciasBelsey M.A., Eliasson R., Gallegos A.J., Moghissi K.S.,Paulsen C.A. y Prassad A.M.N. (1980) Laboratory Manualfor the Examination of Human Semen and Semen-CervicalMucus Interaction. Press Concern, Singapore.

Bjrndahl L., Barratt C.L.R., Fraser L., Kvist U. yMortimer D. (2002) ESHRE basic semen analysis courses1995-1999: immediate beneficial effects of standardizedtraining. Hum. Reprod., 17, 1299-1305.

Clements, S., Cooke, I.D. y Barratt, C.L.R. (1995)Implementing comprehensive quality control in the andro-logy laboratory. Hum. Reprod., 10. 2096-2106.

De Jonge, C.J. y Barratt, C.L.R. (1999) WHO manual. Whoshould care? Hum. Reprod., 14, 2431-2433.

Dunphy, B.C., Kay, R., Barratt, C.L.R. y Cooke, I.D.(1989) Quality control during the conventional analysis ofsemen, an essential exercise. J. Androl., 10, 378-385.

Eliasson, R. (1971a) Standards for the investigation ofhuman semen. Andrologie, 3, 49-84.

Eliasson. R. (1971b) Interlaboratory coordination and con-trol in andrology, Andrologie, 3, 113-115.

Eliasson, R. (1975) Analysis of semen. In Behrman S.J.and Kistner R.W. (eds) Progress in Infertiliy, 2nd edn.Little, Brown, Boston, USA, pp. 691-714.

Eliasson, R. (1976) Semen analysis and laboratory workup.In Cockett A.T.K. and Urry R.L. (eds) Male infertility.Workup, Treatment and Research. Grune and Stratton,

vii

Orlando, FL, USA, pp. 169-188.

Eliasson, R. (1981) Analysis of semen. In Burger H. and deKretser D.M. (eds) The Testis. Raven Press, New York,USA, pp. 381-399.

Franken, D.R., Smith, M., Menkveld, R. Kruger, T.F.,Sekadde-Kigondu, C., Mbizvo, M. y Akande, E.O. (2000)The development of a continuous quality control program-me for strict sperm morphology among sub-SaharanAfrican laboratories. Hum. Reprod., 15, 667-671.

Freund, M. (1966) Standards for rating of human spermmorphology. A cooperative study. Int. J. Fertil., 2, 97-118.

Freund, M. y Carol, B. (1964) Factors affecting haemocy-tometer counts of sperm concentration in human semen. J.Reprod. Fertil., 8, 149.

Keel, B.A., Quinn, P., Schmidt, C.F. Jr, Serafy, N.T. Jr,Serafy, N.T. Sr y Schlaue, T.K. (2000) Results of theAmerican association of bioanalysts national proficiencytesting program in andrology. Hum. Reprod, 15, 680-686.

MacLeod, J. (1964) Human seminal cytology as a sensitiveindicator of the germinal epithelium. Int. J. Fertil., 9, 281.

Mortimer D. (1994) Laboratory standards in routine clini-cal andrology. Reprod. Med. Rev., 3, 97-111.

Neuwinger, J., Behre, H. y Nieschlag, E. (1990) Externalquality control in the andrology laboratory: an experimen-tal multicenter trial. Fertil. Steril., 54, 308-314.

WHO (1987) WHO Laboratory Manual for theExamination of Human Semen and Semen-Cervical MucusInteraction, 2nd edn. Cambridge University Press,Cambridge, UK.

WHO (1992) WHO Laboratory Manual for theExamination of Human Semen and Sperm-Cervical MucusInteraction, 3rd edn. Cambridge University Press,Cambridge, UK.

WHO (1999) WHO Laboratory Manual for theExamination of Human Semen and Sperm-Cervical MucusInteraction, 4th edn. Cambridge University Press,Cambridge, UK.

viii

Conceptos y principios bsicosA partir de los resultados del anlisis de semen nopodemos predecir nunca si un determinado hombrepuede ser padre biolgico o no. No hay propiedadesespecficas que se puedan medir en toda la pobla-cin espermtica que reflejen especficamente lacapacidad fecundante del reducido nmero deespermatozoides que son capaces de alcanzar ellugar de fecundacin. Sin embargo, el anlisis delsemen puede darnos informacin acerca de proble-mas en los rganos genitales del varn; el anlisisde semen puede por tanto ser usado para enfocar lainvestigacin continuada de la infertilidad. No obs-tante, los resultados del anlisis de semen se hanusado para categorizar los hombres en grupos condistintas posibilidades de conseguir embarazodurante un perodo de tiempo determinado.

El objetivo del anlisis de semen bsico esevaluar los parmetros descriptivos de eyaculadosobtenidos mediante masturbacin. Las cualidadesque se evalan son el aspecto visual, olor, licuefac-cin, viscosidad, volumen, concentracin esperm-tica y nmero total de espermatozoides, movilidady vitalidad espermtica. Adems, tambin se realizael recuento diferencial segn la morfologa esper-mtica, la estimacin de la aglutinacin/agregacin,y la evaluacin de la presencia de detritus y otrostipos celulares en semen.

Seguridad en el laboratorio de andrologaTodo el personal debe saber que las muestras desemen pueden contener virus nocivos y debenpor tanto ser tratadas con el debido cuidado. Lasrecomendaciones de seguridad sealadas en elapndice II del Manual de la OMS de 1999

deben ser seguidas estrictamente.

La muestra de semenEl anlisis de un eyaculado, obtenido mediantemasturbacin, empieza en el laboratorio 30 minutosdespus de la eyaculacin. Deben existir habitacio-nes especiales para la obtencin de la muestra. ElManual de la OMS recomienda un intervalo mxi-mo de abstinencia entre 2 y 7 das antes de la reco-leccin de la muestra, pero recomienda que dichointervalo sea lo ms constante posible. En conse-cuencia, se aconseja vivamente la estandarizacindel tiempo de abstinencia a 3-4 das. El tiempo deabstinencia sexual, expresado en das, es muyimpreciso. Resulta ventajoso por tanto que el tiem-po de abstinencia se exprese en horas. Cuando losresultados han de ser usados en estudios relaciona-dos con el tiempo de abstinencia es obligatorioregistrarlo en horas. Algunos hombres tienen difi-cultades para producir una muestra de semen en ellaboratorio. En estos casos, el hombre puede obte-ner una primera muestra en casa y entregarla en ellaboratorio antes de 1 hora. En algunos casos puedeser necesario para el hombre usar preservativosespeciales, sin espermicidas, para recoger unamuestra de semen durante el coito.

Instrucciones a los pacientesUna hoja de solicitud apropiada conteniendo deta-lles clnicos relevantes deber acompaar a lamuestra. Antes de producir una muestra de semen,el paciente ha de recibir informacin verbal y escri-ta acerca del propsito de la investigacin y otroshechos importantes, con el fin de evitar problemascon los anlisis. Puede incluirse en el material

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ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.1-4, 2002

1. Anlisis de semen: visin general

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

Anlisis del semen: visin general

escrito una pequea explicacin de los rganosreproductivos masculinos, comprensible para noexpertos. El paciente debe ser informado sobre larelevancia del tiempo de abstinencia sexual y de laimportancia de recoger el eyaculado completo. Si lamuestra no puede ser obtenida en el laboratorio, hade ser transportada protegida del fro (cerca delcuerpo) y entregada al laboratorio preferiblementeen 30 minutos, pero como mucho 1 hora despus dela eyaculacin.

CalibracinLa calibracin debera realizarse siempre despuscualquier cambio en el equipo o en cualquiermomento en que se sospechen errores.

Las pipetas automticas usadas para lasmediciones (concentracin espermtica, bioqumi-ca) han de calibrarse al menos dos veces al ao. Losprotocolos para estas mediciones y sus resultadosdeben conservarse en un registro especial.

Las balanzas para pesar semen y reactivosdeben calibrarse al menos cada ao por un tcnicoo ingeniero certificado por el fabricante de la balan-za. Los resultados deben guardarse en un registroespecial.

ProcedimientoAspectos generalesEn la tabla I se describen los pasos a seguir en elanlisis bsico de semen ordenados apropiadamen-te para asegurar eficiencia y calidad en el trabajodel laboratorio. Los detalles de cada paso en parti-cular se mencionarn a continuacin en este texto.Para el cultivo microbiolgico deben usarse reci-pientes para muestras estriles y pipetas estrilesdesechables. Algunos pasos no son obligatorios, yasea por limitaciones acordadas o porque dichospasos son opcionales segn el manual de la OMS(cada laboratorio puede decidir si realizarlos o no).

Detalles del procedimientoRegistrar, pesar y etiquetar el recipiente de muestrasInicialmente, la muestra ha de registrarse. El reci-piente debe etiquetarse inequvocamente de acuer-do con el formulario de solicitud, la hoja de regis-tro de la muestra y un cuestionario opcional. El eti-quetado debera, en general, comprender dos iden-tificadores nicos, p.ej. nombre y un nmero nicopara cada muestra.

Si la muestra se obtiene en el laboratorio, elrecipiente ha de ser pesado y marcado antes de laobtencin de la muestra. Cuando las muestras no serecogen en el laboratorio, el peso de los recipientesvacos debe marcarse en los mismos antes de su dis-tribucin a los mdicos/clnicos solicitantes, o a lospropios pacientes. Al recoger la muestra, debe ano-tarse la hora de la eyaculacin de forma clara en elrecipiente, as como en el protocolo. El peso neto dela muestra (peso total de la muestra y contenedormenos peso del contenedor vaco) debe anotarse enel protocolo como volumen seminal (unidad mL; 1decimal).

Colocar la muestra en un agitador orbital dentrodel incubador (37C)

Se debe colocar la muestra enseguida sobre la ban-deja mvil de un agitador orbital (37C). Es impor-tante comprobar que el recipiente usado permiteuna mezcla completa de la muestra con el agitadorusado. La hora de colocacin en el incubador debeescribirse en la hoja de trabajo. La muestra ha demantenerse en el incubador hasta unos 25-30 minu-tos despus de la eyaculacin, de forma que el exa-men pueda empezar 30 minutos despus de la eya-culacin. Sacar el contenedor del incubador y com-probar si la muestra est bien mezclada voltendo-la en el fondo del recipiente durante unos 20 segun-dos. Si la muestra fue producida fuera del laborato-rio, ha de atemperarse en el incubador unos 5-10minutos antes del examen.

Evaluacin de la licuefaccin, apariencia visual yviscosidad del semen

Inspeccionar la apariencia visual de la muestra enrelacin al color (sin comentarios o rojizo-marrn),opalescente o claro, presencia de partculas de gel ofilamentos mucosos. Un color amarillento del eya-culado habitualmente es debido a un contenidoaumentado de flavoprotenas que se originan en lasvesculas seminales, indicando un largo perodo deabstinencia sexual, o procedente de vitaminas B. Laictericia tambin puede ocasionar color amarillo.Una coloracin rojiza o marrn generalmente esdebida a presencia de eritrocitos (hemoglobina).

Comprobar si la licuefaccin es completa.Si no es as (partculas de gel o filamentos muco-sos), poner el espcimen de nuevo en el incubadordurante algunos minutos (el examen debe empezaren cualquier caso en el intervalo de 60 minutos

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despus de la eyaculacin; ver Tratamiento de lasmuestras viscosas, ms adelante). Las desviacio-nes de los hallazgos normales se anotan en la hojade trabajo. Si el olor de la muestra difiere clara-mente de la mayora de las muestras, tambin seanotar en la hoja de trabajo.

La viscosidad de la muestra se evala esti-mando la rapidez con que sale de la pipeta. Llenaruna pipeta con semen (p.ej. una pipeta de 5 mL. Siel volumen no se mide por peso, la pipeta usadapara medir el volumen puede servir) y dejar que elsemen se vace de nuevo en el contenedor. Si lasgotas forman filamentos cuya longitud es >2cm, anotar viscosidad aumentada en la hoja detrabajo.

Tratamiento de las muestras viscosas

Para las muestras con viscosidad moderada a muyaumentada, es suficiente comentar este hallazgoen la hoja de trabajo como texto libre. La viscosi-dad aumentada interfiere con la determinacin dela movilidad espermtica, la concentracin y losanticuerpos que recubren los espermatozoides. Enlas muestras en las que la elevada viscosidad difi-culta el anlisis, la adicin de un volumen conoci-do de suero salino, solucin salina tamponada(PBS) o medio de cultivo, seguida de un mezcladocuidadoso con una pipeta de calibre ancho, debe-ra dar una dilucin homognea para el anlisis. Sedebe tener en cuenta el volumen original para cal-cular la concentracin espermtica original en lamuestra no diluida. Si los espermatozoides van aser utilizados para fecundacin asistida, debe evi-tarse contaminacin de la muestra, y ha de usarsepara la dilucin el medio habitual para preparar elsemen con vistas a la fecundacin asistida. N.B.Cuando las muestras se diluyen, las caractersticasde la movilidad espermtica se vern afectadas.

Preparacin en fresco

Examen de la preparacin en fresco: Colocar 6 Lde semen bien mezclado sobre un portaobjetos lim-pio y poner un cubreobjetos encima (18x18 mm,#1.5; si se usa un cubreobjetos de 22x22, el volu-men del semen en el portaobjetos ser de 10 L).Esto confiere a la preparacin una profundidad de~20 m. El examen de esta preparacin en frescoha de empezar tan pronto como cesa el flujo en lapreparacin. Si el desplazamiento no se ha detenido

despus de 60 s, hay que descartar la preparacin yrealizar una nueva. Es necesaria una ptica concontraste de fases. Si se encuentra una media de

nes estn producidas por anticuerpos antiesperm-ticos y a menudo contienen una cierta proporcinde espermatozoides mviles, mientras que los agre-gados habitualmente contienen slo espermatozoi-des muertos. Los pequeos agregados de esperma-tozoides muertos y otros materiales se encuentrancon frecuencia en semen de hombres normales,mientras son anormales los grandes agregados, amenudo conteniendo centenares de espermatozoi-des. Cuando la presencia de agregados o aglutina-ciones espermticas est claramente aumentada,debe anotarse en forma de comentario libre en elinforme.

Otras clulas y detritus: Otras clulas y detritusque pueden encontrarse en el semen se evalan envarios campos y los hallazgos inusuales se expre-san como comentarios libres en el informe median-te diversas expresiones estandarizadas: Ausencia de detritus es una situacin muy rara,

algn grado de detritus es tpico, pero una con-taminacin moderada con detritus no es necesa-riamente anormal. Mayores cantidades de detri-tus son, sin embargo, anormales. Tener cuidadode diferenciar entre partculas acelulares y bac-terias.

Los glbulos rojos (eritrocitos) no debenencontrarse en el semen, aunque pueden encon-trase unos pocos sin que ello indique patologa.

Las clulas epiteliales (escamosas, cbicas ytransicionales) son habituales en pequeonmero en el semen. Su aumento no est rela-cionado con ninguna alteracin funcional espe-cfica o presencia de infeccin.

Las clulas redondas se observan a menudoen el semen y es importante diferenciar los leu-cocitos de los gametos inmaduros o grandesfragmentos celulares (habitualmente sinncleo) con citoplasma exfoliado del tbuloseminfero del testculo. Tambin, las clulas deorigen prosttico tienen un aspecto redondeadoen el eyaculado. Si hay >1x106 clulas redon-das/mL, contadas en la cmara de Neubauer (almismo tiempo que se realiza la concentracinespermtica), debe realizarse la deteccin deleucocitos mediante un mtodo especfico paraidentificar la presencia de clulas inflamato-rias.

Las bacterias y protozoos no se encuentranhabitualmente en el semen, pero si hay signosde microorganismos, debe anotarse en el informe.

Extensiones para tincin de eosina-nigrosina

Segn el manual de la OMS, si la proporcin deespermatozoides mviles es

Dilucin para determinar la concentracin esperm-tica

Para una buena exactitud de la concentracin esper-mtica es esencial que la muestra de semen sea mez-clada cuidadosa pero meticulosamente antes de reti-rar un volumen exacto con una pipeta de desplaza-miento positivo. Ver la Seccin 2 en este manual parael mtodo detallado de medicin de la concentracinespermtica.

Separar100 L para evaluacin de clulas inflama-torias

Para evaluar si una concentracin elevada de clulasredondas en semen (>1x106 clulas redondas/mL) esdebida a clulas inflamatorias, debe usarse un mto-do especfico (citolgico o inmunocitoqumico) paradeteccin de leucocitos.

Preparar extensiones para tincin morfolgica

Se preparan dos extensiones de cada muestra desemen en portaobjetos limpios para evaluacin cito-morfolgica. Una alcuota de semen bien mezclado(volumen 8-10-15 L segn la concentracin esper-mtica, para evitar un exceso de espermatozoides) secoloca sobre el porta y la gota se extiende con elborde de un cubreobjetos. Un mtodo alternativo esusar dos portaobjetos superpuestos para dispersar lagota de semen entre ambos y entonces separar losportaobjetos por deslizamiento. Independientementedel mtodo usado, las extensiones han de ser unifor-mes y finas para permitir una buena tincin y un exa-men fcil.

Las extensiones se dejan secar al aire, se fijaninmediatamente y se guardan para teirlas posterior-mente y realizar la evaluacin de la morfologa esper-mtica. (ver Seccin 5 en este manual). Las extensio-nes de muestras con sospecha de azoospermia debenfijarse en recipientes separados, con soluciones nue-vas con el fin de evitar el riesgo de contaminacin conespermatozoides de otras extensiones.

Separar y centrifugar semen para anlisis bioqumi-cos posteriores

El volumen seminal restante se centrifuga (3000 g, 15min) y el sobrenadante (plasma seminal) se coloca enun tubo marcado para anlisis bioqumicos posterio-res. El tubo se cierra y pone por orden de muestra enuna gradilla en el congelador (-20C). Los mtodos deanlisis bioqumicos no se incluyen en este manual.

Recuento en el hemocitmetro mejorado deNeubauer

Ver Seccin 2 en este manual.

Tincin de las extensiones para evaluacin morfol-gica Ver seccin 5 en este manual

Equipo y materialesEl equipo y materiales que se listan aqu son para larecogida del semen y el examen de la preparacin enfresco en general. En los siguientes captulos, elequipo y los materiales para los mtodos especficosdescritos se mencionan por separado. Recipiente para recogida de muestras (p.ej.

Sarstedt 100 mL; #75.563; tapa #76.564). Preservativo especial para recoleccin de semen

(Miles products Inc. Chicago, Illinois 60631,EEUU; Male Factor Pack, Hygiene, FertiproN.V., Blgica).

Microscopio de contraste de fases (objetivo defases 40x).

Portaobjetos de microscopio (tamao estndar);cubreobjetos (18x18 mm, #11/2 (grosor); 22x22mm; #11/2).

Pipetas para realizar la preparacin en fresco tipodesplazamiento de aire (no es necesario despla-zamiento positivo): 6 L. Para extensiones mor-fologa: desplazamiento de aire (no es necesariodesplazamiento positivo): 8-15 L. Para exten-siones de vitalidad: desplazamiento de aire (no esnecesario desplazamiento positivo): 15-50 L.

Puntas de pipeta: plstico, para pipetas de des-plazamiento de aire, volumen 5-50 L.

Centrfuga (1000-3000 g). Nota. La fuerza cen-trfuga relativa (FCR; g) se calcula a partir de lafrmula g = 1118 10-8 R N2, donde R = dis-tancia en centmetros desde el centro del rotor alpunto en el que se requiere la FCR (p.ej. el fondodel tubo) y N = revoluciones por minuto.

Balanza de laboratorio de carga superior 150 o300 g de capacidad; resolucin 0,01 g.

Tubos de ensayo para determinacin de clulasinflamatorias, p.ej. tubos de estireno de 55 mmde longitud, 11 mm dimetro externo.

Tubos de ensayo con tapn para congelar (bio-qumica), p.ej. tubos de estireno de 55 mm delongitud, 11 mm dimetro externo.

Incubador o cmara termostatizada (37C) Guantes de plstico para laboratorio.

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Anlisis del semen: visin general

Tabla I. Los pasos del anlisis bsico de semen

Tiempo desde la eyaculacin Tarea

0-5 min Registrar, pesara y etiquetar el recipiente con la muestra; etiquetar los documentos de laboratoriob.Poner la muestra en un agitador orbital dentro de un incubador a 37C.

20-25 min Comprobar licuefaccin, apariencia visual y olor.30 min Evaluar la viscosidad seminalc.

Examinar la preparacin en fresco para: movilidad espermtica y agregacin/aglutinacin, otras clulas y detritus.Realizar pruebas de anticuerpos.Preparar extensiones para tincin de eosina-nigrosina si hay 1x106 clulas redondas/mL en semen: determinar clulas inflamatoriasd.Realizar anlisis bioqumicos relacionados con la contribucin secretora de la prstata (p.ej. zinc), vesculas seminales (p.ej. fructosa) y epiddimo (p.ej. -glucosidasa)e.Teir la extensin para morfologa.Evaluar la morfologa (recuento diferencial).

aEl volumen seminal tambin puede ser determinado con una pipeta graduada con una precisin de 0,1 mL; en este caso no es necesario pesar.

bLas etiquetas deben contener en general dos identificadores nicos, p.ej. nombre y un nmero exclusivo.cLa pipeta usada para la determinacin del volumen seminal puede ser usada para evaluar la viscosidad cuando se deja caer el semen de la pipeta.

dLimitaciones acordadas por el grupo de trabajo.eEstos pasos son opcionales.

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Anlisis del semen: visin general

Principios bsicosContar espermatozoides diluidos e inmviles esfcil usando el microscopio. El problema es ase-gurar que esos espermatozoides son representati-vos del total de la muestra y que la alcuota exa-minada es la adecuada. Por tanto, se debe evitarla prdida de espermatozoides por sedimentacin,agregacin o por adhesin a las paredes del con-tenedor de la muestra, a las puntas de las pipetaso a los tubos, y estar seguros de no cometer erro-res de dilucin. Por esto, se debe mezclar cuida-dosamente la muestra antes de tomar el semenpara preparar la dilucin, y antes de tomar unaalcuota de la dilucin de espermatozoides pararellenar la cmara de recuento.

Adems, la dilucin debe ser exacta. Laspipetas de desplazamiento positivo son esencialespara minimizar errores cuando tomamos un volu-men determinado de semen bien mezclado para ladilucin. La razn de utilizar una pipeta de despla-zamiento positivo es que dicha pipeta toma un volu-men exacto. Las pipetas rutinarias, las cuales des-plazan un volumen de aire, son calibradas paratomar un volumen exacto de agua. Dado que la vis-cosidad del semen es ms alta que la del agua yvara de una muestra a otra, el aire de las pipetastomar volmenes de muestra diferentes segn elsemen.

Finalmente, para conseguir un volumencorrecto en la cmara de recuento, el cubreobjetosdebe montarse adecuadamente, y las cmaras debenrellenarse correctamente.

La concentracin de espermatozoides(106/mL semen) se calcula dividiendo el nmero deespermatozoides contados en la cmara de recuento

por un factor que depende de la dilucin y delnmero de cuadros contados. El nmero total deespermatozoides (106/eyaculado) es el producto delvolumen de eyaculado y de la concentracin esper-mtica.

Determinacin de la dilucin adecuadaEn una preparacin en fresco se estima la concen-tracin y se selecciona la dilucin ms apropiada.Con el mtodo recomendado para realizar la prepa-racin en fresco (6 L semen, cubre 18x18 mm,grosor # 1.5), la profundidad del volumen demuestra, observada en un campo de visin, es apro-ximadamente de 20 m. Teniendo en cuenta que eldimetro estimado del campo de visin es de 500m, el nmero estimado de espermatozoides obser-vados por campo de visin, se puede utilizar paraelegir la dilucin ms apropiada de la muestra, talcomo se indica en la Tabla I (4 espermatozoides porcampo corresponden a la concentracin de ~ 1x106

espermatozoides/mL). El rea exacta del campomicroscpico se puede calcular con un micrmetro,usando para ello un portaobjetos de microscopiocon una escala graduada, normalmente con indica-

7 European Society Human Reproduction and Embryology 2002

2. Concentracin espermtica

Tabla I: Dilucin del eyaculado

Esperm. porcampo de visin,objetivo de 40x Dilucin Semen (L) Diluyente (L)

Swim-up 1 + 1 (1:2) 100 100< 15 1 + 4 (1:5) 100 40015-40 1 + 9 (1:10) 50 45040-200 1 + 19 (1:20) 50 950> 200 1+ 49 (1:50) 50 2450

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dores de 0.1 y 0.01 mm. Medir el dimetro delcampo y calcular el rea del campo con la frmula:rea = x r2, donde r = dimetro/2.

En los microscopios ms antiguos, el di-metro del campo puede ser bastante ms pequeo ypor ello, se observan menos espermatozoides porcampo de visin (por ejemplo, si el dimetro es 250m, un espermatozoide por campo de visin corres-ponde a 1x106 espermatozoides/mL, as el esper-matozoide por campo de visin observado en elmicroscopio debe multiplicarse por cuatro antes deacudir a la Tabla I).

Las diluciones estndar son 1 + 19 y 1 + 9;para preparaciones de swim up con 10 anillos de Newton/bordes o lneasiridiscentes) deberan verse entre las superficiesde cristal de los dos lados donde el cristal delcubreobjetos se sujeta a la superficie de lacmara de Neubauer. Si se observan pocas lne-as, la distancia entre el cristal del cubreobjetosy la superficie de la cmara Neubauer est

aumentada, por lo que el volumen de la cmaraes mayor y el resultado de la evaluacin serincorrecto.

3. Los tubos que contienen la muestra diluidadebern mezclarse, al menos 10 segundos (enun agitador vortex), inmediatamente antes derellenar cada cmara del hemocitmetro.Despus de mezclar, se toma una alcuota de ~6-10 L con una pipeta y se rellena una cmaradel hemocitmetro de Neubauer mejorado. Elvolumen exacto depende del volumen necesa-rio para cubrir adecuadamente el rea bajo el

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Figura I: Una cmara del hemocitmetro de Neubauer mejo-

rado consta de 25 cuadros grandes descritos en la Figura.

Cada cuadro grande est rodeado de lneas triples y contie-

ne 16 cuadros pequeos. Estos cuadros pequeos pueden

usarse cuando hay demasiados espermatozoides para contar-

los en un cuadro grande. Con un objetivo de 40x, nicamen-

te se puede observar un cuadro grande en el mismo campo de

visin. Cada cmara de recuento (25 cuadros grandes) mide

1 x 1 mm y tiene una profundidad de 0,1 mm (100 m). As

el volumen total en una cmara es 0,1 mm3 = 0,1 L = 100

nL. (Una cmara de Makler tambin mide 1 x 1 mm, pero

tiene una profundidad de nicamente 0,01 mm. As el volu-

men total en una cmara de Makler es un dcimo de la

Neubauer = 0,01 L = 10 nL).

Concentracin espermtica

cubreobjetos. Despus, se toma una segundaalcuota para la otra cmara del hemocitmetro.Cada cmara deber rellenarse completamente.Sin embargo, si se llena en exceso se debe des-cartar y rellenar una nueva. No se debe eliminarel volumen sobrante de la cmara, ya que sepuede alterar la concentracin de espermatozoi-des en ella. Posteriormente se comparan losrecuentos de las dos alcuotas.

4. Dejar el hemocitmetro reposar durante 10-15minutos en una cmara hmeda, para permitira los espermatozoides sedimentar en la cuadr-cula.

5. Contar los espermatozoides con un objetivo de20-40x (contraste de fase) segn el siguientecriterio: un cuadro grande en una cmara deNeubauer est limitado, en todos los lados, porlneas triples (ver Figura 1: apariencia visualde la cuadrcula central de una cmara delhemocitmetro de Neubauer mejorado). Paradefinir cada cuadro grande, deben usarse comolmite las lneas situadas ms arriba y ms a laizquierda. Hay que tener en cuenta que senecesita un objetivo de 40x con una distanciade trabajo grande cuando usamos una cmarade Neubauer. Determinar el nmero de cuadros que se

deben contar. Primero, contar el nmerode espermatozoides en el cuadro superiorde la esquina izquierda. Si hay < 10 esper-matozoides, contar toda la cuadrcula (25cuadros en cada cmara). Para 10-40espermatozoides, contar 10 cuadros en

cada cmara. Para > 40 espermatozoides,contar 5 cuadros en cada cmara (porejemplo las cuatro esquinas y el centro). Elobjetivo es contar 200 espermatozoides encada cmara y que ste nmero sea sufi-ciente para comparar los dos recuentos.

Si se observa con claridad una cabeza deespermatozoide, se recomienda que seaincluida en el recuento de espermatozoi-des. Las cabezas de alfiler debern con-tarse aparte y ser comentadas en el infor-me. No deben contarse clulas germinalesinmaduras (sern valoradas en el recuentodiferencial de la morfologa), no obstantelas clulas redondas y las clulas inflama-torias deberan contarse independiente-mente en el hemocitmetro.

Clulas en el borde de lnea: nicamentelos espermatozoides cuya cabeza estlocalizada sobre las lneas limitantes mssuperiores o izquierdas (marcadas OKen la Figura 1) debern contarse comopertenecientes al cuadro. De ste modo,no se contarn los espermatozoides locali-zados en las lneas limitantes ms inferio-res o derechas (marcadas out en laFigura 1).

ClculosLos recuentos de las dos alcuotas se comparancomo se describe en el Apndice I. Se calcula elnmero total de espermatozoides contados (suma)y la diferencia entre los dos recuentos. Se acepta lavaloracin si la diferencia entre los dos recuentoses menor o igual que el valor obtenido en elApndice I. En caso contrario, hay que descartarlos recuentos, mezclar bien la dilucin de semen,rellenar dos nuevas cmaras del hemocitmetro yrealizar nuevas medidas.

La suma de los dos recuentos (nmero totalde espermatozoides en ambas cmaras) se dividepor el factor apropiado (Tabla II) para calcular laconcentracin de espermatozoides en la muestrade semen (expresado en 106 espermatozoides/mL)

Nota. En ste manual, el nmero total deespermatozoides contados se divide por los facto-res dados en la Tabla II. En el manual de la OMS,el nmero total de espermatozoides contados sedivide primero por 2, para obtener una media, y

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Tabla II:

Factor para dividir el nmero

total de espermatozoides contados

N de cuadros contados

Dilucin 25 10 5

1+1 100 40 201+4 40 16 81+9 20 8 41+19 10 4 21+49 4 1,6 0,8

Concentracin espermtica

luego sta media es dividida por otro factor. Por lotanto, los factores que se dan en el manual de laOMS son la mitad de los valores aportados aqu ycon este procedimiento se elimina un paso de divi-sin y por ello reduce posibles errores aritmticos. [Si los dos recuentos son aceptados, hay tres cl-culos para obtener la concentracin de esperma-tozoides en 106/mL de semen. Esos pasos puedenser realizados uno a uno, pero es preferible unifi-carlos en un clculo simple.1. En primer lugar, se calcula el nmero medio de

espermatozoides contados, dividiendo la sumade espermatozoides contados por 2 (x1/2).

2. En segundo lugar, se calcula la concentracinde espermatozoides en el hemocitmetro (porejemplo en la muestra diluida). Para ello sedebe conocer el volumen que se ha examinado.El volumen de un cuadro grande en el hemoci-tmetro de Neubauer mejorado es de 4 nL [200x 200 x 100 m (profundidad)]. As, 5, 10, y 25cuadros corresponden a volmenes de 20, 40, y100 nL respectivamente.El nmero medio de espermatozoides contadosse divide por el volumen en el cual han sidocontados (x 1/20; 1/40; 1/100). La concentracin de espermatozoides obtenidaes el nmero de espermatozoides por nL, loque equivale a 106 espermatozoides/mL(espermatozoides/10-9L = espermatozoides x106 / 10-3L).

3. En tercer lugar, como se ha diluido la muestrade semen original, para obtener la concentra-cin de espermatozoides en el semen, se multi-plica por el factor de dilucin: (x 2; 5; 10; 20;50). Por esto, diluciones de 1 + 1, 1+ 4, 1 + 9,1 + 19 y 1 + 49 corresponden a factores de x 2,5, 10, 20 y 50 respectivamente.Estos 3 pasos pueden realizarse con una simpledivisin, donde el nmero total de espermato-zoides en las dos cmaras se dividide por unfactor combinado simple que es dado en laTabla II].

ResultadosLa concentracin de espermatozoides se anota enel informe de la muestra, y se calcula el nmerototal de espermatozoides en el eyaculado (multi-plicando la concentracin por el volumen de eya-culado). Adems de la recogida de la muestra

incompleta y la variacin en los das de abstinencia,hay otros muchos factores externos que influyen enel nmero total de espermatozoides en el eyacula-do, por ejemplo haber tenido fiebre, consumir algntipo de droga y ciertas situaciones profesionales deestrs. Para evaluar correctamente los aspectoscuantitativos de la produccin de espermatozoides,los resultados del laboratorio deben contener datossobre la concentracin de espermatozoides, el volu-men de eyaculado (o el nmero total de espermato-zoides), los das de abstinencia, y si la recogida dela muestra fue completa.

Cuando no se encuentra ningn espermato-zoide en la valoracin, es preferible que el resulta-do no se exprese como 0,0 x 106 espermatozoi-des/mL, sino que se escriba un asterisco (*) en ellugar de la concentracin y del nmero total deespermatozoides. Como comentario adicional,debe indicarse en el informe si no se ha encontradoningn espermatozoide, o si se ha encontrado algnespermatozoide inmvil o de movilidad baja en eleyaculado o en el sedimento obtenido tras la centri-fugacin. Si no se ha encontrado ningn esperma-tozoide en 100 L de sedimento, debe hacerseconstar el nmero mximo de espermatozoides quepodran estar presentes en el eyaculado (los detallessobre los clculos vienen recogidos en las ltimassecciones de ste captulo), por ejemplo, si no se haobservado ningn espermatozoide; podemos decirque lo ms probable es que haya < 188 espermato-zoides en la muestra completa.

Control de calidadSe deber realizar los recuentos duplicados paradetectar errores al azar en la toma de la alcuota oen el recuento en el hemocitmetro.

Se deben calibrar regularmente las pipetasde desplazamiento positivo (a veces llamadas pipe-tas PCR) y las pipetas empleadas rutinariamentepara realizar las medidas de los diluyentes. Laspipetas que muestren resultados errneos se debenrecalibrar, segn las instrucciones del fabricante, oser enviadas a reparar y ajustar. Se deben anotar, enuna lista separada para cada pipeta, los resultadosde los controles de calibracin, as como de lasreparaciones y de los ajustes.

Se debe ser muy cuidadoso al mezclar y aldiluir el semen, al mezclar la muestra diluida y alpreparar y ajustar el hemocitmetro. Los hemocit-

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Concentracin espermtica

metros deben chequearse habitualmente cuando seestrenan y tras un periodo de uso (por riesgo de des-gaste y cambios en la profundidad de la cmara).

ReactivosDiluyente: 50 g NaHCO3; 10 mL de solucin deformaldehdo al 36-40% (una solucin de formal-dehdo saturada). Disolver los constituyentes en agua destilada (>

10 M/cm) y diluir hasta 1000 mL. Filtrar (para eliminar cristales) en un bote lim-

pio. Conservar a 4C (puede ser almacenado, al

menos, 12 meses). No debe contener partculas slidas.

Equipo y materiales Agitador (vortex) Microscopio de contraste de fases (objetivos

20x 40x, y 10x para enfocar fcilmente). Cmara hmeda: cualquier caja con una tapa y

una gasa o papel que se mantenga hmedo,

algn tipo de soporte para colocar la cmara derecuento por encima del material ligeramentehumedecido. Nota: la cmara de recuento debecolocarse horizontalmente.

Calculadora, contador de clulas de laborato-rio, centrfuga, una hoja de trabajo/ hoja de cl-culos.

Cmara de recuento: Hemocitmetro deNeubauer mejorado con cubreobjetos adecua-do.

Pipeta de desplazamiento positivo: por ejem-plo: Finnpipette PCR 20-200 L; puntas: porejemplo Labsystems 9403 080.

Pipeta ajustada, calibrada: por ejemploFinnpipette Digital 200-1000 L; puntas: porejemplo blue Treff o Finntip.

Tubos test Trombo-test-tube o Stockholmtube (KEBO 104.112-250).

Tapones para Trombo-test-tube o Stockholmtube (KEBO 103.811-12) Tubo de anlisis contapn para centrifugar muestras de semen.

Tabla IV: Cuando una muestra contiene espermatozoides siempre exis-

te un riesgo de no observarlos. En sta tabla se representa el

nmero crtico de espermatozoides, en relacin al nmero de

campos examinados, por encima del cual, el riesgo de no

observar espermatozoides es < 5%. As, al examinar 400 cam-

pos, el riesgo de no encontrar espermatozoides es < 5% si la

muestra contiene 188 espermatozoides. Si la muestra contiene

muy pocos espermatozoides, por ejemplo 100, el riesgo de no

encontrar ninguno es > 5% (20%). Dimetro de campo de 500

m, profundidad de preparacin de 20 m.

Campos de visin contados

4 40 400

Nmero crtico de espermatozoides 18.750 1.875 188

11

Concentracin espermtica

Tabla III:

Riesgo de no observar espermatozoides en varias concentra-

ciones de espermatozoides valoradas en cmaras de 100 y 10

nL y en una preparacin en fresco (~ 40 nL). El riesgo de no

encontrar espermatozoides es < 5% en concentraciones de

espermatozoides 300.000/mL para las cmaras de 10 nL,

75.000/mL para la preparacin en fresco y 30.000 para las

cmaras de 100 nL.

Riesgo de no encontrar ningn espermatozoide

1000 0,99 0,96 0,9010.000 0,90 0,67 0,3730.000 0,74 0,30 < 0,0570.000 0,50 0,06

75.000 0,47 < 0,05

100.000 0,37

200.000 0,14

300.000 < 0,05

Concentracinespermtica real(espermatozoi-des/mL) de lamuestra anali-zada

1 MaklerSin dilucin(10 nL de mues-tra analizada)

Preparacin enfresco (10 cam-pos 40 nL)

Neubauer(2 cmaras)Dilucin 1 + 1(100 nL)

Confianza del recuento de espermatozoidesQu significa no encontrar ningn espermato-zoide?Tericamente, cuando se examina una muestra desemen completa y no se encuentra ningn esper-matozoide, el resultado es cero espermatozoides.Sin embargo, cuando se examina una preparacinen fresco o en un hemocitmetro, slo se analizauna pequea parte de dicha muestra. Por ello, noencontrar ningn espermatozoide significa que lamuestra, con una cierta probabilidad, contienemenos de una determinada concentracin de esper-matozoides. La precisin de una valoracin depen-de de la concentracin real de espermatozoides y dela proporcin de la muestra original que fue exami-nada bajo el microscopio. A mayor proporcin,mayor ser la precisin. Por ejemplo: si se examinauna muestra de semen diluida 1+1, utilizando elhemocitmetro de Neubauer mejorado (dos cma-ras), se ha examinado 100 nL de la muestra origi-nal. Si la misma muestra se examina sin diluir enuna cmara Makler, se examinan 10 nL. En la pre-paracin en fresco se pueden examinar unos 10campos, los cuales corresponden a un volumen de40 nL. La Tabla III muestra el riesgo de no encon-trar espermatozoides en varias concentraciones deespermatozoides reales. El riesgo de no encontrarespermatozoides es < 5% en concentraciones deespermatozoides 300.000/mL para las cmaras de10 nL, 75.000/mL para las preparaciones en fres-co (40 nL), y 30.000/mL para las cmaras de 100nL.

Estos nmeros tambin reflejan que cuandono se encuentra ningn espermatozoide en unacmara de 10 nL, hay un riesgo del 5% de ignoraruna concentracin de espermatozoides de290.000/mL y del 50% de ignorar 70.000/mL. Estoresalta la necesidad de examinar el sedimento de losespermatozoides tras centrifugar, cuando no hemosencontrado ningn espermatozoide en la prepara-cin en fresco.

Confianza en la valoracin de una gota de 10 Ldel sedimento de espermatozoides obtenido tras lacentrifugacin.Bajo el objetivo de 40x, un campo microscpicocorresponde a 4 nL. Si la abertura tiene un dime-tro de 500 m se corresponde con un rea de196.427 m2 y con una gota de 10 L bajo un

cubreobjetos de 22x22, la profundidad es de 20,7m, lo que se corresponde con la observacin de unvolumen de 4.058.442 m3 4 nL.

Cada vez que se analiza al microscopio uncubreobjetos de arriba a abajo, se observan aproxi-madamente unos 40 campos. Realizando esta ope-racin 10 veces, se analizan 400 campos. Cuando seexaminan 400 campos, se valora un volumen totalde unos 1.600 nL (4 x 400), por ejemplo 1/62 delvolumen total del sedimento de 100 L (100.000nL). Si hay >188 espermatozoides en el sedimentoobtenido tras la centrifugacin, el riesgo de noencontrar espermatozoides es 5%. Por esto, sino encontramos ningn espermatozoide despus deexaminar un volumen total de 1.600 nL, podemosafirmar que los 100 L de sedimento, y por tanto lamuestra completa, contienen < 188 espermatozoi-des (Tabla IV).

Recuento de espermatozoides seleccionados parareproduccin asistida.Los espermatozoides seleccionados por centrifu-gacin en gradientes o swim up son valoradostras preparar una dilucin 1+1 (para inmovilizarlos espermatozoides) en el hemocitmetro deNeubauer mejorado. A continuacin se cuentanambas cmaras. Los espermatozoides seleccionados por swim up opor centrifugacin en gradientes se emplean parareproduccin asistida y para diversos estudiosexperimentales. Cuando los resultados se relacio-nan o se evalan en funcin del nmero de esper-matozoides (por ejemplo en publicaciones), esnecesario aplicar buenas prcticas de laboratorio(BPL) para garantizar una certeza de 10% en lavaloracin de la concentracin espermtica. Unaconcentracin de 4,0 x 106/mL debe ser expresadacomo 4,0 x 106/mL 10%, es decir, 3,6-4,4 x106/mL con una confianza del 95%. sta certeza esfcil de obtener; es simplemente cuestin de contaral menos 400 espermatozoides. Un hemocitmetrode Neubauer mejorado (ambas cmaras) toma2x100 nL de una suspensin de espermatozoidesdiluida al 1+1 (para inmovilizar los espermatozoi-des). La cmara de Makler toma 10 nL de muestrasno diluidas. Por ello, en el hemocitmetro deNeubauer se encuentran 10 veces ms espermato-

12

Concentracin espermtica

zoides para contar que en la cmara de 10 nL. Estotiene una especial importancia cuando obtenemosconcentraciones de espermatozoides bajas despusde la seleccin espermtica. Con las recomendacio-nes de rutina para valorar la concentracin esper-mtica, contando todos los espermatozoides enambos lados de un hemocitmetro de Neubauermejorado, se obtienen unos resultados precisosdesde 4 x 106/mL. Por el contrario, si contamostodos los espermatozoides que hay en una cmarade 10 nL, obtenemos unos resultados precisos den-tro del 10%, nicamente cuando la concentracinespermtica es 40 x 106/mL. Para obtener unresultado dentro del 10% en las muestras que seencuentren en el rango de concentracin de 4 x106/mL, se necesitan evaluar 10 cmaras de 10 nL.

La Tabla V proporciona el intervalo de con-fianza al 95% para aquellas concentraciones deespermatozoides que han sido obtenidas despus decontar todos los espermatozoides presentes en unhemocitmetro de Neubauer mejorado y en unacmara de 10 nL. Cuando la variacin excede de 10%, se recoger el rango de incertidumbre en el

informe. Por ejemplo, si se obtiene 2 x 106/mL enuna valoracin en un hemocitmetro de Neubauermejorado se expresa como 2 x 106/mL (rango 1,7-2,3) o 14%. Si aplicamos buenas prcticas delaboratorio, y buscamos, por ejemplo, una incerti-dumbre menor del 10%, se necesitan realizarvaloraciones de dos hemocitmetros de Neubauer.Si el mismo resultado se obtiene tras su valoracinen una cmara de 10 nL, el resultado debera serexpresado como 2 x 106/mL (rango 1,1-2,9) o 44%. Para conseguir el resultado de 2 x 106/mL 10% con la cmara de 10 nL, se necesitan realizar20 valoraciones. Si en un protocolo de FIV, el obje-tivo es inseminar, por ejemplo, con 50.000 esper-matozoides todos los ovocitos y en la valoracinobtenida en una cmara de 10 nL propociona elresultado de 1 x 106/mL (rango 0,4-1,6) 62%,contamos realmente con 20.000-80.000 espermato-zoides en una gota de 50 L. nicamente en el 24%de las veces, se adicionan 50.000 10%, es decir,45.000-55.000 espermatozoides. Por tanto, en lamayora de los casos (76%), se adicionan >55.000o

Tabla V: Expresin de los resultados de concentracin espermtica en el intervalo de confianza del 95% segn el nmero deespermatozoides evaluados en una cmara de 10 nL (cmara de Makler por ejemplo) y en un hemocitmetro deNeubauer (2 cmaras).

Bajo Alto % Bajo Alto %1 0,1 0,0 0,3 148 10 0,1 0,0 0,2 622 0,2 0,0 0,5 119 20 0,2 0,1 0,3 443 0,3 0,0 0,6 107 30 0,3 0,2 0,4 364 0,4 0,0 0,8 98 40 0,4 0,3 0,5 315 0,5 0,1 0,9 88 50 0,5 0,4 0,6 286 0,6 0,1 1,1 80 60 0,6 0,4 0,8 257 0,7 0,2 1,2 74 70 0,7 0,5 0,9 238 0,8 0,2 1,4 69 80 0,8 0,6 1,0 229 0,9 0,3 1,5 65 90 0,9 0,7 1,1 2110 1,0 0,4 1,6 62 100 1,0 0,8 1,2 2011 1,1 0,4 1,8 59 110 1,1 0,9 1,3 1912 1,2 0,5 1,9 57 120 1,2 1,0 1,4 1813 1,3 0,6 2,0 54 130 1,3 1,1 1,5 1714 1,4 0,7 2,1 52 140 1,4 1,2 1,6 1715 1,5 0,7 2,3 51 150 1,5 1,3 1,7 1616 1,6 0,8 2,4 49 160 1,6 1,4 1,8 1617 1,7 0,9 2,5 48 170 1,7 1,4 2,0 1518 1,8 1,0 2,6 46 180 1,8 1,5 2,1 1519 1,9 1,0 2,8 45 190 1,9 1,6 2,2 1420 2,0 1,1 2,9 44 200 2,0 1,7 2,3 1425 2,5 1,5 3,5 39 250 2,5 2,2 2,8 1230 3,0 1,9 4,1 36 300 3,0 2,7 3,3 1135 3,5 2,3 4,7 33 350 3,5 3,1 3,9 1140 4,0 2,8 5,2 31 400 4,0 3,6 4,4 1045 4,5 3,2 5,8 29 >400 400

Principios bsicosIdealmente, y con objeto de minimizar las diferen-cias en la observacin, tanto en los videos del con-trol de calidad como en las preparaciones de lasmuestras de rutina con semen fresco, todas las valo-raciones de la movilidad espermtica, se realizarnen un monitor de vdeo (ver procedimiento a conti-nuacin). Si no disponemos de equipo de vdeo,dicha observacin se realizar con el microscopio,utilizndose el objetivo de contraste de fase de 40x.

La valoracin se debe empezar lo antesposible, para evitar artefactos causados por un des-censo de la temperatura o por deshidratacin de lapreparacin.

La movilidad espermtica se determinarcontando todos los espermatozoides mviles einmviles en varios campos, elegidos de forma ale-atoria, evitando los campos cercanos a los extremosdel cubreobjetos, utilizando un objetivo de 40x. Sims del 25% de los espermatozoides se encuentranagregados, la valoracin de la movilidad se reali-zar slo con espermatozoides libres, haciendoconstar en el informe este inconveniente. Las cabe-zas sueltas, sin flagelo no deben contarse.

Procedimiento

Preparacin en frescoDisponer 6 L de semen mezclado sin diluir a 37Cen un portaobjetos limpio y atemperado, (37C), ycubrir con un cubreobjetos de 18x18 mm y # 1,5 degrosor. Esto proporciona una profundidad a la pre-paracin de 20 m. El examen de esta prepara-cin en fresco debe realizarse tan pronto como

haya cesado el desplazamiento de los espermato-zoides. Si ste permanece tras 60 s debe preparar-se y examinarse una nueva alcuota.Si el cubreobjetos es de 22x22 mm, el volumendebe ser de 10L para obtener una profundidad de20 m.

Recuento Se clasificarn al menos 200 espermatozoides porduplicado, es decir al menos 400 espermatozoidesen total (criterios y mtodo detallado de la valora-cin de la movilidad: ver apartado de valoracin dela movilidad espermtica). Se han de contar en almenos cinco campos para cada valoracin.

En cada campo se deben contar todos losespermatozoides progresivos rpidos, (clase a de laOMS) y los espermatozoides progresivos lentos,(clase b de la OMS). Se debe ser cuidadoso en con-tar todas, y solamente, las clulas que estn pre-sentes en el mismo campo al mismo tiempo. Nota:Si el nmero de espermatozoides mviles progresi-vos en el campo es muy elevado, debe utilizarseuna parte ms pequea del mismo; es de gran ayudauna retcula en el ocular.

Cuando se han contado todos los esperma-tozoides progresivos, contar en el mismo campo losespermatozoides no progresivos, (clase c de laOMS) y los espermatozoides inmviles, (clase d dela OMS).

Las cuatro categoras se expresan como por-centajes (rpido, lento, no progresivo e inmviles).

Es importante el recuento por duplicadopara detectar y minimizar los errores aleatoriosdebidos a la variacin obtenida al realizar alcuotasde la muestra de semen y a la valoracin de la

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ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.10-11, 2002

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

3. Movilidad espermtica

movilidad en la preparacin en fresco. Por tanto, laobservacin de la movilidad espermtica debe repe-tirse en una segunda alcuota preparada de la mismaforma. Deben calcularse las medias de los dosrecuentos y dar sta como resultado. Si las diferen-cias entre los dos recuentos de movilidad son dema-siado elevadas, se ha detectado un error al azar y sedeben realizar dos nuevas valoraciones (para deta-lles ver mtodo y comparacin de recuentos dupli-cados).

Movilidad espermtica en monitor de vdeo En la pantalla del monitor debe sobreponerse o bienun recuadro negro con una apertura circular o unatransparencia de acetato con un campo circulardibujado. En el campo circular as definido, unacuadrcula con recuadros de 25x25 m facilitar lavaloracin de la movilidad.

Utilizar el objetivo de 10x de contraste defase y el anillo de fase correspondiente del conden-sador. Comprobar en los oculares que la muestraest enfocada correctamente. Ajustar el foco mien-tras se examinan las imgenes en la pantalla.

Valoracin de la movilidad espermtica La movilidad espermtica se valora por categoriza-cin en cuatro grupos de movilidad a 37C, como seindica en la Tabla I.1. Elegir un campo de visin aleatorio (si la con-

centracin espermtica es muy elevada, sola-mente contar aquellos espermatozoides situadosen un campo ms pequeo, p. ej. en los cuatrocuadros centrales). En primer lugar, contar todoslos espermatozoides progresivos rpidos y len-tos. Despus contar en el mismo campo losespermatozoides no progresivos e inmviles.

2. Contar al menos cinco campos diferentes. Encada preparacin deben contarse al menos 200espermatozoides.

3. Repetir la valoracin de la movilidad espermti-ca, como mnimo en 200 espermatozoides enuna nueva preparacin de la misma muestra desemen.

Tabla I. Categoras de movilidad espermtica

Categora OMS Denominacin Velocidad correspondiente

Rpida progresiva a 25m/s ( 1 cuadro del monitor,o cinco veces la longitud de la cabeza)

Progresiva lenta b 5-24m/sNo progresiva c

(opcionalmente) los porcentajes de espermatozoi-des progresivos (a+b).

Control de calidadSe utilizan recuentos duplicados para disminuir elriesgo de errores aleatorios.

En las muestras de semen grabadas en vde-os, la velocidad de cada espermatozoide individualpuede medirse fotograma a fotograma para clasifi-car los espermatozoides en los diferentes grupos (a-d) de movilidad ms objetivamente.

Algunos aspectos del control de calidadinterno pueden efectuarse mediante exmenes repe-tidos de vdeos con valores conocidos de movilidadpor todos los tcnicos de cada laboratorio.

La base del control de calidad externo, es lavaloracin de los vdeos enviados a los laboratoriosparticipantes por uno de los tcnicos de cada labo-ratorio.

Equipo Microscopio de contraste de fases (objetivo de

10x) con platina termostatizada a 37C. Tubotriocular (oculares y tubo para cmara con mag-nificacin adicional 10x).

Cmara de vdeo blanco y negro (o color), p.ej.Panasonic: ( 1/2 pulgada; WV-BL200); conec-tada a un generador de texto).

Monitor de 13 cm [en blanco y negro, p.ej.Panasonic WV5340 o WV5370 (tamao nor-mal)]. Un recuadro negro con una apertura cir-cular, (~13 cm de dimetro). Conexiones: In:conexin a un grabador de vdeo; interup-tor:75

Magnificacin total sobre el monitor: 100m=75-88 mm (frecuentemente es necesariauna magnificacin adicional, superior a lamagnificacin 10x en el objetivo; lo ms usuales otra 10x en el foto tubo).

Comprobar la magnificacin total en pantallacon una escala micromtrica.

Escala micromtrica montada en un portaobje-tos de microscopio (para calibracin).

Portaobjetos para microscopio; cubreobjetos18x18 mm.# 1.5.

Contador de clulas con cuatro teclas.

Grabador de vdeoEs necesario equipo extra para grabar vdeo:

Generador de texto conectado al grabador devdeo, p.ej. Hama Video Script 550) Entrada:cmara de vdeo. Salida: al grabador de vdeo.Conexin In: conector tipo SCART multipin.

Grabador de cinta de vdeo (VHS) con posibili-dad de movimiento fotograma a fotograma(1/25 s). Vdeo domstico con 2 conectores tipoSCART multipin para In y Out. Entradadesde el generador de texto. Salida al monitor.

Cintas de vdeo (30-60 min de duracin; altacalidad).

Procedimiento 1. Encender la cmara, monitor, grabador de vdeo

y generador de texto. Este ltimo se enciendepara realizar una demostracin - apagar presio-nando tres veces MODE.

2. Colocar la cinta en el grabador de vdeo.Rebobinarla desde el principio hasta el finalantes de empezar.

3. Colocar el contador de tiempo a cero.Comprobar que el grabador de vdeo indica eltiempo usado en el panel.

4. En primer lugar, grabar la imagen de una esca-la micromtrica que permita la calibracin.Grabar ~10 s, despus pulsar pausa.

5. Colocar el mando controlador del haz de luz deforma que sta no llegue a la cmara, es decircon el fondo del campo oscuro. Ir al generadorde texto e identificar la muestra (p.ej laborato-rio de androloga, hospital XXXXX, control decalidad). Cuando el texto est visible en elmonitor pulsar grabar durante ~10 s. Grabar 5 sms sin el texto pero con el fondo del campooscuro.

6. Colocar una alcuota de la muestra en el por-taobjetos (atemperado a 37C) y enfocar elmicroscopio. Colocar el mando controlador delhaz de luz de forma que sta llegue a la cmaray ajustar el foco. Desactivar la entrada de luz ala cmara.

7. Anotar el tiempo de inicio y el nmero de lamuestra que se va a grabar (p.ej. Muestra 1).

8. Con la muestra identificada por el texto en pan-talla, grabar durante 5 s.

9. Apagar el texto de identificacin de la muestray reiniciar la entrada de luz a la cmara.

10. Comprobar el enfoque. Grabar durante 10-15 s.Valorar el nmero de espermatozoides que pue-

17

Movilidad espermtica

den contarse por cada campo. Repetir los pasos10-12 hasta que se cuenten >200 espermatozoides.

11. Cambiar el campo de observacin del microsco-pio y colocar el controlador del haz de luz deforma que le entre luz a la cmara.

12. Grabar 5 s con el campo oscuro despus de habergrabado cada campo de observacin.

13. Despus de haber completado la grabacin de una

muestra, grabar un periodo de tiempo ms largo,10 s, de campo oscuro.

14. Repetir desde el paso 7 hasta que la cinta se ter-mine (en una cinta de 60 min podran grabarse~10-12 muestras, en el caso que stas tengan unaconcentracin de espermatozoides razonable).

15. Despus de la ltima muestra grabar el mensa-je fin.

18

Movilidad espermtica

Principios bsicosUna clula con la membrana celular intacta no setie con eosina Y, mientras que una clula muerta,p.ej. con la membrana celular daada, absorbe elcolorante rojo. La nigrosina se utiliza como tincinde fondo para contrastar las clulas vivas sin teir,blancas.

Procedimiento1. Mezclar una gota, 50 L, de semen licuado,

bien mezclado y sin diluir con una gota, 50 L,de eosina-nigrosina, p.ej. en un platillo de por-celana, e incubar durante 30 segundos.

2. Poner 12-15 L de la solucin en un portaobje-tos limpio y hacer la extensin. La gota seextiende deslizando un cubreobjetos delante dela gota. Pueden prepararse dos extensionessimultneamente colocando 20-30 L entre dosportaobjetos y separndolos a continuacin. Nodeben realizarse las extensiones demasiadogruesas porque el color de fondo podra serdemasiado oscuro y cubrir los espermatozoides.

3. Dejar secar al aire y examinar directamente, omontar el mismo da y examinar cuando la pre-paracin montada se haya secado, p.ej. dejn-dola durante la noche. Los portaobjetos monta-dos se conservan a temperatura ambiente.

4. Valorar al menos 200 espermatozoides a unamagnificacin de 1000x, o 1250x, usando unobjetivo de alta calidad 100x sin contraste defases en aceite de inmersin y con un correctoajuste de campo claro, iluminacin Khler.Dado que este mtodo diluye a la mitad lamuestra de semen, es necesario tener paciencia

para encontrar 200 espermatozoides en mues-tras con baja concentracin. Los espermatozoi-des blancos, sin teir, se clasifican comovivos, y los que poseen alguna coloracinrosa o roja se clasifican como muertos.

5. La OMS no especifica recuento duplicado parala valoracin de la vitalidad, pero si se hace, lacomparacin se deber realizar igual que en lamovilidad o la morfologa (comparacin deproporciones; Apndice II).

Clculos y resultadosEl resultado es la proporcin de espermatozoidesvitales, vivos, expresado como porcentaje sindecimales.La proporcin de espermatozoides vivos suele seralgo mayor que la proporcin de espermatozoidesmviles en la misma muestra.

ReactivosReactivos: 0,67 g de eosina Y (C.I. 45380, EuropaM 15935), 10 g nigrosina (C.I. 50420, Europa M15924), y 0,9 g de cloruro sdico en 100 mL deagua destilada.

1. Disolver 0,67 g de eosina Y y 0,9 g de colurosdico en 100 mL de agua destilada calentandosuavemente, y aadir 10 g de nigrosina.

2. Llevar la solucin a ebullicin y dejar que seenfre a temperatura ambiente.

3. Filtrar la solucin con papel de filtro, p.ej.Munktell clase II.

4. Almacenar en botella de cristal cerrada herm-ticamente.

19 European Society Human Reproduction and Embryology 2002

4.Vitalidad espermtica

ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.12, 2002

La tintura debe estar a temperatura ambiente cuan-do se utilice.Montaje: usar medio de Merck Entellan u otromedio equivalente para montaje rpido y perma-nente.

Equipo y material Microscopio con objetivo de 100x para inmer-

sin en aceite. Portaobjetos de tamao estndar, y cubreobje-

tos, p.ej 24x60 mm.

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Vitalidad espermtica

Principios bsicosLa morfologa vista con el microscopio no es la ver-dadera morfologa del espermatozoide vivo, sinouna imagen creada por nosotros. Esta imagen abar-ca una serie de factores: espermiognesis, transpor-te espermtico, maduracin y envejecimiento, tiem-po en el plasma seminal, tcnica de extensin, fija-cin, tincin, montaje y la ptica e iluminacin usa-das (calidad del microscopio). Los criterios de cla-sificacin son solo el paso final por el cual descri-bimos la imagen creada durante la preparacin.Usando mtodos estandarizados y controlados,podemos minimizar las fuentes de error dependien-tes de la tcnica y centrar nuestros esfuerzos en laclasificacin de las variaciones de la morfologaespermtica.

Es de gran importancia que las preparacio-nes (extensin y tincin) sean de alta calidad yaque, incluso pequeos artefactos dependientes de latcnica influyen en el aspecto del espermatozoide.

Aunque el espermatozoide humano muestragrandes variaciones en su morfologa, las observa-ciones de espermatozoides obtenidos de moco cer-vical post coital han ayudado a definir la morfolo-ga del espermatozoide ideal. Presumiblemente, elespermatozoide que fecundar es seleccionadoentre estos espermatozoides ideales.

La tincin de Papanicolau (hematoxilina,naranja G6 (OG6 ) y EA50) proporciona una claradiferencia entre constituyentes celulares basfilos yacidfilos, permitiendo as, un examen detallado delpatrn de cromatina lo cual es de utilidad para el estu-dio de la presencia de formas inmaduras. La tincindel citoplasma puede variar entre rojo y verde depen-diendo de la fuerza inica, el pH y la composicin delespacio celular y del colorante (OG6 y EA50).

Tincin nuclearHay muchas hematoxilinas dependiendo del gradode oxidacin de la hematoxilina y del tipo de mor-diente utilizado (el reactivo que facilita la unin delcolorante a las estructuras celulares). La hematoxi-lina por s sola es incolora. Es la forma oxidada,hematina, la que da el color. El color de la hemati-na depende del pH. En medio cido es roja mientrasque en medio alcalino es azul. Consecuentemente,el pH durante la tincin afecta al resultado final. Laoxidacin espontnea de la hematoxilina a hemati-na tarda semanas en producirse. Por ello la hemato-xilina es oxidada artificialmente aadiendo unagente oxidante; normalmente yodato sdico uxido mercrico. La mayora de las hematoxilinascomercialmente disponibles estn oxidadas artifi-cialmente y contienen una mezcla de hematoxilinay hematina. Puede producirse una sobreoxidacintransformandose la hematina en oxihematina inco-lora. Esto explica la atenuacin espontnea delcolor que se observa en tinciones almacenadasdurante largos perodos de tiempo (aos).

La hematoxilina y la hematina tienen unacarga positiva dbil por lo que es necesario el usode mordientes que se comportan como reactivos deunin, ligando la hematoxilina a la clula. El tipo demordiente tiene tambin efecto sobre el color de laclula teida. Los mordientes son compuestosmetlicos que se unen simultneamente a la hema-toxilina y a los componentes tisulares cargadosnegativamente, normalmente residuos de cido fos-frico del DNA, aunque tambin a grupos carboxi-lo. El sulfato de amonio-aluminio es el ms usado yes un componente de las hematoxilinas de Harris yde Mayer.

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ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.13-17, 2002

European Society Human Reproduction and Embryology 2002

5. Morfologa espermtica

Las extensiones teidas con la hematoxilinade Harris (la habitual en la tincin de Papanicolau)se conservan durante aos si se guardan en oscuri-dad. Sin embargo la intensidad del color va dismi-nuyendo despus de un almacenamiento prolonga-do, tal como se ha explicado previamente.

Tincin citoplasmticaSe realiza con el naranja G6 (OG6), que es unasolucin cida que permite la unin del OG6 a lasproteinas citoplasmticas cargadas negativamente.

Tincin citoplasmtica y nucleolarEl EA 50 es una mezcla policromtica de coloran-tes: verde claro (SF amarillento), eosina Y y marrnBismarck Y. El verde claro y la eosina son coloran-tes cidos: el verde claro se une a las cadenas late-rales de la protenas bsicas. La eosina es una xan-tina cargada negativamente en soluciones acuosas yque tie los componentes citoplasmticos, losnucleolos (ausentes en el espermatozoide) y loscilios. Su absorcin mxima es a 515-520 nm.

Consideraciones para la evaluacin de la morfo-loga espermticaCada espermatozoide sin defectos morfolgicoses definido como ideal. Todas las desviaciones de lamorfologa ideal son clasificadas como defectos. Lapresencia de defectos en cada regin del esperma-tozoide se expresa como defectos por 100 esper-matozoides para esa regin. Un espermatozoidecon un defecto en la cabeza, en la pieza intermediay en la cola es registrado como un espermatozoidecon tres defectos pero sigue siendo un nico esper-matozoide defectuoso. Segn esto, el nmero totalde defectos ser mayor al nmero de clulas defec-tuosas.

Slo se cuentan los espermatozoides com-pletos, con cabeza y cola. Las cabezas solas secuentan de forma separada. Si hay muchas formascabeza de alfiler o colas sueltas (>20% de todoslos espermatozoides) deber ser anotado aparte. Lasclulas germinales inmaduras deben ser contadasseparadamente, y no como espermatozoides.

Qu es un espermatozoide ideal?Un espermatozoide maduro ideal, tal como fueadoptado por la OMS en 1999, tiene una cabeza conforma oval y contorno regular (4,0-5,0 m de largo

y 2,5-3,5 m de ancho) con una parte plida ante-rior (acrosoma: 40-70% del rea de la cabeza) y unaregin ms oscura posterior. La relacinlargo/ancho de la cabeza debe ser entre 1,5-1,75. Lacola debe estar simtricamente unida a la base de lacabeza. La base de la cabeza debe ser ancha y nosimilar a una flecha. Solo debe haber una colaunida, de aproximadamente 45 m de largo, noenrollada, rota ni doblada sobre s misma.Inmediatamente tras la cabeza, la primera parte dela cola, la pieza intermedia deber ser algo msancha (1 m aprox.) y de 7-8 m de largo. Una gotacitoplasmtica normal tiene un contorno liso (noirregular), aparece en la base de la cabeza y sutamao es inferior a un tercio de una cabeza nor-mal.

Todas las formas lmite o dudosas debenclasificarse como defectuosas. Estos criterios seajustan a los criterios estrictos para formas mor-folgicamente normales (Menkveld et al, 1990).

En la pgina 19 del manual de la OMS(1999) el tamao de una gota citoplasmtica normaldebe ser inferior a un medio del rea de una cabezanormal. En la pgina 21 el lmite es un tercio. Larecomendacin del presente manual es la de un ter-cio del rea de una cabeza normal.

En el manual de la OMS las leyendas de lasfiguras 2.9-2.10 no son congruentes con el texto delas pginas 19-21. Este manual recomienda que seapliquen los criterios dados en el presente texto.

Recuento de formas defectuosasEsta valoracin est relacionada con las partes prin-cipales del espermatozoide (cabeza, pieza interme-dia y cola). No se realiza diferenciacin entre lasdiferentes anormalidades. Si predomina una anor-malidad concreta, deber comentarse en el informe.Se valoran las siguientes cuatro categoras principa-les.

Defectos de cabezaIncluyen formas grandes, pequeas, alargadas(cociente largo/ancho>2), con forma de pera (piri-formes), redondas, amorfas, vacuoladas (>20% delrea de la cabeza ocupada por vacuolas no teidas),acrosomas pequeos (

Defectos de cuello y de pieza intermediaIncluyen cola doblada (cuando la pieza intermediay la cola forman un ngulo >90 con el eje longitu-dinal de la cabeza espermtica = originada a partirde un centrolo anormal), con insercin asimtrica,pieza intermedia ancha, irregular o estrecha (ausen-cia o desplazamiento de la vaina mitocondrial) o lacombinacin de estas anormalidades.

Defectos de colaIncluyen cola corta, doble, horquilla (hairpin),rota, doblada (ngulo >90), irregular o enrollada, olas combinaciones de estas anomalas. Las colassueltas no se cuentan. Una frecuencia alta de colasenrolladas puede indicar que el espermatozoide haestado sometido a estrs hipoosmtico. La colaenrollada est tambin relacionada con el envejeci-miento del espermatozoide. Una frecuencia >20%de formas enrolladas deber comentarse en el infor-me.

Gotas citoplasmticasPueden permanecer restos citoplasmticos sobresa-liendo de la base de la cabeza en el cuello-piezaintermedia. Las gotas con contorno liso, y un tama-o no superior a la tercera parte de la cabeza delespermatozoide son clasificadas como normales. Siel tamao de la gota es mayor o el contorno es irre-gular (teida verde o roja), se trata de un residuocitoplasmtico anormal y se clasifica como gotacitoplasmtica. Algunos espermatozoides inmadu-ros pueden tener gotas citoplasmticas en otrasposiciones a lo largo de la cola.

Defectos especficosEntre los animales domsticos se han descrito dife-rentes defectos esterilizantes en los que prctica-mente todos los espermatozoides producidos por undeterminado animal tienen un defecto estructuralespecfico que perjudica la funcin espermtica. Enlos hombres se han descrito pocos casos equivalen-tes; el ms conocido es probablemente el denomi-nado defecto de cabeza redonda o globozoos-permia. Este defecto se ha visto en algunos hom-bres y afecta a todos los espermatozoides en suseyaculados.

Preparacin de las extensinesLos portaobjetos para las extensiones de morfolo-

ga deben estar totalmente libres de grasa para ase-gurar que la extensin se adhiere al cristal. Si laextensin se desprende dur