LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 1 `6/26/2012

Manual for Leica SP2 Confocal Microscope  

Enter you name, the date, the time, and the account number in the user log book. 

 Things to check before start‐up.   Make sure that your sample slides are clean and sealed.  Use Windex and cotton balls or Kimwipes to clean 

coverslips.  Fixed samples need to be sealed with nail polish.  

Check the objectives. The 10x and 20x objectives are DRY objectives, and should NEVER have oil on them!  There are 40x and 63x OIL immersion objectives, and a 63x WATER immersion objective also on this microscope.  If oil immersion objectives have oil on them, wipe the lens gently only with lens paper.   

 

System Start‐up. 1. Turn on the microscope controllerb and the 

Scanner Laser HeNec and PC/Standd switches.   

2. Turn on the computere and log on to the desktop.  

3. Turn on the Mercury Arc Lamp power supplier, if you look at fluorescently labeled samples.    

4. Start the LCS program by double‐clicking the LCS icon on the desktop.  On the pop‐up starting window panel, select the Personal that contains your setting for acquisition parameters you have created or Company for a default setting.

      

     

b f

ed c

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 2 `6/26/2012 Oveview of Leica Confocal Software (LCS) Upon LCS program start, the basic image acquisition menu will appear.  The Acquire button 

 should appear pressed.   

Click the Beam button  to display the Beam Path Setting as appeared. 

Click the Z‐Scan button     and select z‐Wide (this is required to focus to sample on the regular slide holder by the Remote Control Knobs; see below). 

With the Obj button  , you can select the objective you want to use. (A message window may pop up, and click OK)  

With MicCtrl button  , you can switch between Scan mode (for laser scanning) and Visual mode (for viewing through the eyepiece).   

 

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 3 `6/26/2012 Basic Operation of Leica DM IRE2 Microsocpe. 

Bright‐field viewing: 1. Place your sample slide with coverslip 

(preferably #1.5 thickness) facing down to the objective on the stage.   

2. For bright‐field viewing, turn on the microscope 

halogen lamp light by turning the wheel b toward you and turn the VIS‐SCAN switch c to VIS position (Note: switch back to Scan position for confocal scanning, see below)   

3. Start with low magnification objectives (10X or 20X) first to focus onto your specimen.  You can place the desired objective in position by turning the 

lens turret d by hand or by clicking Obj button  and selecting an objective you want to use (recommended; see below).  The information of the selected objective and their z‐position can be read on the readout 

panel e at the front of the scope.    

4. Focus on to the sample by moving the objective turret with the Coarse 

Focus Buttons f (upper and lower) and the Fine Focus Knob g. Push the upper Coarse Button to bring the objective to the upper limit (“0 µm”) position – where the microscope has been calibrated for your sample to be near in focus.   

5. Use the Fine focus knob to fine tune focusing. The extent of the fine movement can be set from S0 (very fine) to S3 (coarse) by pressing the 

STEP button h (S2 is recommended for most cases).  

Please DO NOT press the LEARN, CHANGE, or  buttons.  

6. With most cells or tissue samples stained with fluorescent dye, you could easily focus to your sample with a fluorescence mode (see below) or Phase Contrast mode.  For Phase Contrast mode with 10x or 

20x objectives, turn the Condenser Ring i to select PH1 (for 10x) or PH2 (for 20x).    

7. For using oil or water immersion lens, lower the objective turret slightly, expose the lens by turning the turret half way by hand, and place a drop of oil or water on the objective (be careful not to touch the lens directly with application tools!).  Place the slide over the objective and raise the objective until the oil just spreads out as it contacts the slide.  Use find focus knob to gradually bring your sample into focus.  Check your slide occasionally to make sure that you are not pushing up the slide with the objective. This can damage the objective lens and your sample! 

 

e

c

b

d

e

gf

h

i

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 4 `6/26/2012 Fluorescent viewing: You can check your sample to see if your fluorescence labeling works by using the mercury lamp illumination and the appropriate filter sets.  The microscope has filter sets for viewing DAPI (A), green fluorescence (I3) and red fluorescence (N2.1).   1. Press either the left or right horizontal arrow button j on the front 

of the scope to choose the filter (FLUO) set.  “Scan” position has no filter set in place and is used for laser confocal scanning.  The fluorescent light can be blocked (closed) or emitted by pressing the 

Shutter 1) button (The “closed” light should be off for fluorescent viewing.).

2. Turn the VIS‐SCAN switch 1! to Scan position to block the transmitted bright‐field light, if necessary.

3. Examine the sample through the eyepieces. (Make sure that PORTS is in VIS and 

MAG is at 1x. If not, change it selecting Visual from MicCtrl button  in LCS program window.)

4. When you are ready to scan your sample with laser, close the SHUTTER1)  to prevent any unnecessary bleaching of the sample with mercury arc lamp light.

 Setting up for Confocal Laser Scanning.  To turn on the laser(s);  

(1) Turn on only the lasers you will use. They do not need more than a minute or so to warm up and stabilize, so it is not necessary to turn them on until you know you need them.  

(2) Argon laser (for 458, 476, 488, and 514 nm excitation line): Turn on the red Laser Ar/ArKr switch b and turn the Level Ar/ArKr level knob c to MIN. Then, turn the left Ar/ArKr key d to “ON”, and then turn further to “START” position and release the key.  Adjust the laser power with LEVEL 

knob c (usually 9 o’clock position is sufficient).  (3) Melles Griot yellow DPSS (561 nm) laser:  push the

green button e for a few seconds and release.

(4) He/Ne (633 nm) laser: turn the He/Ne 633 keyf to ON.

(5) Diode UV laser 405 nm: Turn on the red power 

button g and turn the key h to I position.

1$ 1%

b

g

j 1)

1!

c

d

e

f

h

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 5 `6/26/2012 LCS Imaging program setting 

1. First, select the appropriate laser lines and set up detectors for the 

fluorescent labels you used on your sample from the drop‐down L listi (Leica Factory setting). This will automatically set up the emission detector 

band‐widthj, activate the proper detector (PMTs)1), dichroic 

beamsplitter1!, and excitation laser wavelength and power1@.  You can adjust the range and position of detector bandwidth and the laser power level as necessary.   

2. You can also change the color scheme of individual images into any color or 

grey scale by clicking the pseudo‐color selector 1# associated with each PMT on the window screen (Note: the color information will be saved with image files when saved).   

3. Press Mode button  to select Scan Mode (default is XYZ).  

i

1@

j

1)

1!

1#

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 6 `6/26/2012

4. Press Format , and Speed   buttons to select these parameters (defaults are 512x512 format and 400Hz scan speed). 

5. Press Z‐scan button  and select z‐Wide in order to use Z POS knob 1$ to move the objective for focusing (Default is z‐Galvo, which is used with Galvo stage adaptor).  

6. Click MicCtrl button  to select Scan mode for laser scanning (it will automatically shut off visual output through the eyepieces).    

7. Press Continuous button   to start scanning (it will become Stop button).  An image or images, depending on the number of active detectors, will appear on the right monitor. 

Remote Control Knobs  8. Optimize the images by adjusting parameters including;  

1. The z‐position (focusing) within the specimen (Z‐POS knob1$). 2. Zoom factor (ZOOM knob 1%): Default is 1; increasing zoom will magnify the image and improve the 

resolution, but also will bleach the sample faster! 

3. PMT1, 2, 3, Trans and Smart Offset knobs 1^: Turn PMT knobs to increase the detector sensitivity so to increase the signal intensity of each fluorescent and transmission image channel (Note: Keep the PMT level under 600 V).  To decrease background signal, click the mouse over a channel to select it and turn Offset 

knob counterclockwise.  With Q LUT button   in the Experiment live view window, a full dynamic range of the PMT for optimal image quality can be obtained.  Every clicking this button changes the view window in three different LUT modes; pseudocolor, Hi‐Lo, and monochrome. In the Hi‐Lo mode, pixels saturating the PMT will appear blue and pixels which are black (0 value) appear green.  Adjust the PMT gain and PMT offset such that the brightest pixels are just under the saturation (a few blue pixels) and the darkest pixels are just above the zero value (a some green pixels). (Adjust Laser power by dragging the laser power bar on the menu window if necessary).  

 Pseudocolor                 Hi‐Lo           monochrome 

1$ 1%

1^

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 7 `6/26/2012

Click the Stop button again to stop scanning. (You can save the current parameter setting with 

Save button and put a specific name for later use).  Viewing Images.  

Single button– puts up full screen of selected fluorescent channel.  

Ch 1, 2, 3, 4 buttons– activate the channel on the screen.  

Tiled button– views up to 3 channels simultaneously. 

Ovl button – overlays (merge) multiple channels into one.  

Display button‐ change the magnification of the  screen  image. 

Lut button‐ open color look‐up table.  

Acquiring Single Optical Section Image. 

Make sure to switch MicCtrl to Scan mode.   

Press Single Scan button to acquire an image by a single laser scanning at a scanning speed (normally 400Hz).  The resulting image may display background noise.  Image averaging is a process to decrease this noise and improve the signal‐to‐noise ratio. 

To use averaging, click either Li.A  (line averaging, recommended) or Aver  (frame averaging) button and select the number of lines (or frames) to be averaged (4 line or frame averaging is a good starting point).  Then, click the Single Scan button. 

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 8 `6/26/2012 After scanning, the image will be saved in the directory (temporarily in the RAM).  Save the data to the 

hard drive with the Save button on the top menu icon panel , and type the file name. (Note: All the images (as *.tiff) will be saved under the saved Leica file (as *.lei)). Computer crash or power outage will result in loss of unsaved data! SAVE FREQUENTLY!!

If you want to create a new folder for a new set of images, click New icon on the menu panel. 

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 9 `6/26/2012 Sequential Scanning Mode This confocal microscopy can detect up to four channels (3 fluorescence and 1 transmission) simultaneously as long as all the excitation and emission spectra of fluorophores are well separated.  Imaging of samples stained with different dyes thus simply requires manipulation of laser power and adjustment of the detector bandwidth.  However, often excitation of one fluorophore may cause the emission to appear into the range of another (bleed‐through) or can be induced by neighboring laser lines (cross‐talk), both of which produce false signals. To avoid these, the sample should be scanned sequentially by collecting one fluorophore signal at any given time.  There are two ways to set up sequential scan mode depending on fluorescence of your sample. To scan sequentially the sample without need to use 405 nm UV laser (no DAPI staining) : 1. Choose the beam setting parameter 

for your fluorophores (for example, GFP and DsRED) by selecting the Leica FITC‐TRITC from the preset list). It will set laser lines, dichroic mirror, and PMTs for simultaneous imaging of the two colors. 

 2. Set up a condition for one 

fluorophore (i.e. FITC) by only activating and adjusting the laser level and the PMT (i.e. decrease the 561 nm laser power to 0% and uncheck the PMT2 Active box).   

 

3. Click Save buttonb on the Beam Path Setting panel and type a name for this set up as your own setting (i.e. “GFP‐seq”).  Click OK and the setting will be in the User set list (U in front of the setting name).  

4. Repeat the same process for the other fluorophore (i.e. TRITC) and save the condition as another setting (i.e. “DsRED‐seq”).  Make sure to uncheck the PMT1 Active check box and lower 488 laser level to 0%.  

 

b

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 10 `6/26/2012

5. Click the Seq button  in the Beam Path Setting window.  The 

Sequential scan settings windowc will appear. Add the fluorophore acquisition setting one at a time by selecting it from the preset list menu and then click Add button in the Sequential scan settings window.  

 

6. Keep the scan moded at “between lines”.  Do not close the Sequential scan settings window.  You can save this sequential acquisition settings by Save button 

e in the Sequential scan settings window. 

 7. Start the acquisition by clicking 

Single Scan or Series button depending on your imaging condition. 

                         

c

d

e

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 11 `6/26/2012 To scan sequentially the sample with need to use 405 nm UV laser (DAPI staining): Due to the hardware for UV laser, sequential scanning of a specimen containing UV dye (i.e. DAPI or Hoechst) needs a different configuration.  Here is an example of specimen stained with DAPI and FITC.  1. For setting up DAPI, double click L‐

405 only from the preset list.  It will make UV laser and PMT1 active. Start scanning by clicking Continous button.

2. While scanning, adjust the image with PMT1 knob and Offset knob (and laser power if necessary). 

3. Stop scanning and select the number of line averaging with the Li.A button.  Save the setting as described above (for example “training blue”). 

4. Next, double click on L‐488DD from the preset list and it will make 488 nm laser and PMT2 active and turn off UV laser and PMT1.  Start scanning and adjust the image quality with PMT2 knob and Offset knob (and 488 nm laser power if necessary).   

5. Stop scanning and select the number of line averaging with Li.A. button as above.  Save the setting as “training green”.  

6. Click Seq button  and add “training blue” and “training green” 

setting from the User (U) list.  7. Select between  frames  from  the 

Mode  drop‐down  list  and  check the  Line‐Average  box  from  the Parameter list. 

8. Click Single Scan or Series button to  acquire  sequential  image capturing. 

9. To  find  a  new  region  for  a  new image, close the Sequential Scan Settings window. Double‐click on one of the setting you created. Click Continuous button and find a new region of interest. 

10. Once  you  find  a  region,  stop  scanning. Click  Seq button  to bring up  the  sequential  setting  and  acquire sequential imaging with Single Scan or Series button. 

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 12 `6/26/2012 Acquiring Z‐series images.  Z‐series allows acquisition of optical sections through the certain volume of your sample that can be used for making 3D images.  1. To set the z range, press Continuous button, turn Z‐POS knob in counterclockwise to focus onto a specific z 

position of your sample and click End button (it will appear pressed).  

2. Turn Z‐POS in opposite direction (clockwise) to focus on a deeper region of the specimen and click Begin button (pressed).  

3. Click Stop button to stop scanning. 4. (optional) Click Series button to check the thickness of the z‐series and determine the 

number of optical sections.  5. Click Sect button to select the predetermined number of optical section, or to select Others… 6. Selecting Others brings up a z‐configuration window to determine the number of sections 

and spacing (step size) between sections. Enter a desired step size (~1 µm for 63x objective) and click Calculate button next to the # Section. It will automatically calculate the # of sections according the Step size.  Press OK. 

7. Choose the number of averaging 

using Li. A. button  and click 

“Series” button  to begin Z‐series stack imaging. 

8. With series buttons in the viewer window, you can view the individual sections or project all the sections into one 2D image. Choose Max. (maximum pixel projection) or Avg. (average pixel projection). With Sect. Button, you can visualize cross‐section of the specimen.  

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 13 `6/26/2012 Acquiring Time Series images. Time series allows time‐lapse imaging of live samples to study the changes and dynamics of your object of interest. The time‐lapse images can be saved as multiple Tiff files and AVI files for playing in movie programs.   1. To set obtain time‐

series images, select scan Mode as xyt. It will activate Time buttons

.  2. Click Time button

 to open the time‐lapse setting window and set the parameters such as the time interval between frames and the number of frames.  

3. Check one of three parameters and enter the desired numbers into the other two parameters Hit Enter key on keyboard, which will calculate the value for the checked parameter. (for example shown in right, check “Complete Time” and 

enter 5 sec for T and 100 for Frames. Enter key will calculate the Complete Time as total time of 8min 15s.) 

4. Click Apply button.  5. Click Series button to start the time‐lapse series acquisition.  (Option) Click on Aver or Li.A. button to set the number of averaging per frame. Note: If your object of interest changes or move faster than scanning speed, averaging will generate distorted or ghost images.        

To increase the signal, use slower scan speed by clicking Speed   button. 

Set time interval

Set the number of frames

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 14 `6/26/2012 Processing and exporting images:  The original images are saved as single tiff files; for example a two‐color channel image is saved in two tiff files ‐‐ one for each channel.  You can save a current screen image after image processing such as brightness‐contrast enhancement and merging channels (useful for powerpoint presentation).  

   1. Adjust images and put annotations you want, such as scale bar. 

2. Click the Display button  and select 1:1 to display image in exact pixel dimension.  3. Click on the image you want to export and right‐click on the mouse to bring the context menu; Send 

To>Experiment>Selection (raw)/Selection (snapshot)/All (snaphot).  Select one of these options and it will export to a new image file. 

Selection (raw): export the current selected image only (no annotations included). 

Selection (snapshot): export the current selected screen image with all annotations. 

All (snapshot): export all the screen images with annotations.  

4. For time series, you can go through or play the time lapse movie with sequence buttons (First, Next, Play, Prev, Last).  For Z‐series, Max or Avg buttons projects the different sections into a projected 2D image. You can also visualize the cross‐section of the specimen with Sect. button. 

5. Save the *.lei folder file whenever you add new images. 

LMW Microscopy Lab : Leica SP2 Page 15 `6/26/2012 Saving Images.  This is a very important for your effort and data.  Computer crash or power outage will result in loss of unsaved data! SAVE FREQUENTLY!!  To save the imaging data files, click “Save” button at the top of the window. Select D drive and users folder. Create your folder, rename the Experiment# and save.   Since the storage memory in the computer will be filled up quickly and this lack of hard drive space prevents image acquisition, all user files will be deleted after two weeks. Be sure to copy your files to a flash memory or CD/DVD disks.   Shut‐down Procedure Please enter your time of use in the log book and note any problems and suggestions during your time. 

1. Clean the oil from the objectives only with lens paper (not Kimwipe). Clean the microscope and stage. 2. Close the LCS program.  3. Copy your data files to a flash drive or CD. Users are responsible for their own files, as there is no 

automatic backup at present.  4. Log off the computer (not turning off the computer) and turn off the microscope control box.  5. If there is someone who wants to use, leave the instrument ON. 6. If you are the last user of the day:  

1)  Turn off the mercury lampb.   

2)  Minimize the power of the Ar/ArKr level c for >3min before turning it off.   3)  Around 3 min after minimizing the Ar/ArKr 

level, turn the key d to “off” and wait for 10 min to cool down the laser.  It is ready to turn 

off the red button e switch.  4) For the He/Ne 633 laser, turn the 

key f to off position.  5)  Turn the Melles Griot DPSS laser off by pushing the OFF 

(red) g button.  6)  For 405 nm laser, 

turn the key h to off position and then turn off the 

red button i.   

7)  Exit windows and shut down the power for PC stand j, the Scanner/Laser HeNe 1), and the Laser 

Ar/Kr e with the red buttons. Finally, turn off the microscope controller 1!. 

b

c

d

e

f

g

hi

j1)

1!