Manual de Uso Del Confocal Revisado 2010 1

8/17/2019 Manual de Uso Del Confocal Revisado 2010 1

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GUÍA BÁSICA DE USO DEL

MICROSCOPIO CONFOCALLSM 5 DE ZEISS

Dra. Angélica Zepeda R.Responsable Académico de la Unidad de Microscopía

Instituto de Investigaciones BiomédicasUniversidad Nacional Autónoma de México

Fecha de elaboración: Enero del 2009

1ª revisión: Abril del 2010


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Esta guía describe la operación básica del microscopio confocal LSM 5 paraobservación de tejido o células montadas en vidrio e inmunohistoquímicamente

procesadas (marcaje fluorescente de uno, dos y tres fluoróforos).Este manual pretende cubrir todos los aspectos básicos de adquisición de imágenes. Sinembargo, si se requiere información mas precisa que no se incluya en la guía, se podrásolicitar asistencia tanto a la Técnica, como al Investigador Académico responsable dela Unidad para recibir asesoría individual.

Contactos: Técnico Responsable LIIB. Miguel TapiaCubículo C003, Planta Baja, Torre C. Sede Circuito Exterior.

Tel. 5622-9185

Investigador Responsable Dra. Angélica Zepeda R.Cubículo C211, 2º piso, Torre C. Sede Circuito Exterior.Tel. 5622-8222 ext. 46811


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SOFTWARE

El software LSM 5 PASCAL, Versión 2.8 controla el microscopio, los láseres, elmódulo de escaneo, el proceso de adquisición, las herramientas de adquisición y eldespliegue de las imágenes.El software del microscopio confocal cuenta con tres láseres de un fotón (Ar, HeNe543 y HeNe 633) que permiten al usuario seleccionar entre longitudes de excitación de458, 488, 514, 543 y 633nm, y el software LSM (propio de Zeiss) provee diversasfunciones para la adquisición de imágenes, que incluye la adquisición con diferentesresoluciones de imágenes en 2D y 3D (x, y, z).El software se puede operar empleando el mouse y el teclado de la computadora y se

usan de la misma manera en la que opera WINDOWS.

MICROSCOPIO

El microscopio cuenta con los siguientes juegos de filtros para observar las muestrasempleando la lámpara de mercurio:

1) Filtro FITC Pase de banda de excitación: 450-490nmEspejo Dicróico: FT 510Emisión: LP 515

2) Filtro DAPI (Las muestras marcadas con DAPI solo se podrán observar almicroscopio, no con el sistema confocal)Pase de banda de excitación: 365nmEspejo Dicróico: FT 395Emisión: LP 397

3) Filtro Rodamina Pase de banda de excitación: 546nm

Espejo Dicróico: FT 580Emisión: LP 590


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ENCENDIDO DEL EQUIPO

1. Prender el equipo (conformado por el CPU, monitor, láseres, microscopio y,multi-punto) por medio de los 2 interruptores que se encuentran detrás de la

puerta de entrada del cuarto del microscopio (a la izquierda del microscopio).Ambos interruptores deberán estar en posición I/ON.

2. En caso de que el microscopio se este en posición de apagado, prenderlo pormedio del botón verde que se encuentra al lado derecho del estativo.

3. En caso de que la computadora esté apagada, prender el CPU.4. Una vez encendida la computadora, esperar a que inicie el sistema operativo

Windows.a. Aparecerá la ventana “Begin logon”. Presionar simultáneamente la

combinación de teclas Ctrl+Alt+Del b. Aparecerá la ventana “Service Control Manager”. Esta ventana no se

puede desplazar, solo presione ENTERc. Aparecerá la ventana “Logon information”. Presionar la tecla “OK”

cuando se le solicite el usename / password (no teclear nada en loscampos). El “username” predeterminado es: administrador

d. Aparecerán dos ventanas simultaneas:i. en “Enter network password”, ingresar la palabra confocal.123

seguido de la tecla Enter. Esta ventana reaparece, volver aingresar la palabra confocal.123 seguido de la tecla Enter.

ii. la segunda ventana desaparecerá al ingresar el password anterior.Con esto se actualizará la red interna del Instituto y podrá guardar los datos

adquiridos en unidad de red correspondiente (X para la Sede de Circuito Escolar; W para la Sede de Circuito Exterior) al término de la sesión.

5. Haga doble click en el ícono PASCAL para iniciar el software que opera elconfocal y aparecerá el panel de operación “LSM 5 Pascal Switchboard”.Presione el ícono “Online mode” (en caso de que no esté presionado) y despuésel botón “Start”. Si presiona “Offline mode” o trabaja en esta modalidad, lasfunciones del sistema operativo no estarán disponibles y no podrá haceradquisición de imágenes.


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6. Se abrirá la ventana “Hardware initialization”. Espere a que el programareconozca todos los componentes del sistema.

OBSERVACION DE LA MUESTRA AL MICROSCOPIO

Asegúrese de que el deslizante plateado que se encuentra al lado derecho delmicroscopio esté en posición “VIS” (metido hasta el fondo). Para ubicar el campode interés a analizar en su muestra, emplee el campo claro. Para ello, se deberá

presionar el botón HAL ubicado al lado derecho del estativo del microscopio (elfoco correspondiente se enciende en color verde). Se puede regular la cantidad deluz por medio de la perilla que se encuentra al lado del botón de encendido.

Nota: Antes de analizar una muestra en el confocal, se pide que los usuarios hayan

revisado que sus muestras efectivamente presentan el marcaje de fluorescencia

esperado, ya que el uso de la lámpara de fluorescencia asociada al microscopio

confocal estará restringido. En caso de no contar con un microscopio de


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fluorescencia, los usuarios podrán emplear los microscopios de fluorescencia que

sen encuentran a su disposición en la Unidad de Microscopía.

1. Selección del objetivo: El revolver de los objetivos NO se mueve manualmente.Para evaluar su muestra: Coloque la laminilla en la platina con el cubreobjetos

hacia arriba; seleccione el objetivo 10x presionado alguno de los 2 botones enarreglo horizontal marcados con puntas de flecha negras que se encuentran dellado derecho en la base del estativo debajo del tornillo micrométrico; enfoque la

preparación y siga los siguientes pasos para obtener una iluminación de campoclaro uniforme (Iluminación Köhler).

a. Revise que el disco horizontal localizado debajo de la platina, que indicael tipo de iluminación a emplear, esté en la posición I/H. De no ser así,gire el disco manualmente hasta dejarlo en esa posición.

b. Suba el condensador hasta el tope superior girando el tornillo negromediano que se encuentra debajo de la platina

c. Gire el disco pequeño vertical que se encuentra en el lado derecho de la

base del estativo (diafragma de campo) y cierre el campo visual hastaque solo se vea la parte central de la muestra (que quede iluminadaaproximadamente 1/3 de la muestra)

d. Enfoque los bordes del diafragma ajustando la altura del condensadorhasta que los bordes del octágono aparezcan nítidos.

e. Abra el diafragma de campo hasta que los bordes desparezcan delcampo visual

ADQUISICIÓN DE IMÁGENES

1. Prender los láseres que se vayan a emplear por medio de los interruptorescorrespondientes:

f. Encender el o los láseres He/Ne que se vayan a emplear girando hacia laderecha la llave correspondiente. La fuente de alimentación del lásermarcada con el No. inventario UNAM 1050375 genera luz verde de543 nm (se usa para detectar fluoróforos como ioduro de propidio,Rodamina, Texas Red, CY3, Alexa Fluor 546, etc) mientras que lafuente de alimentación del láser marcada el No. inventario UNAM1050376 , genera luz roja de 633 nm (se usa para detectar fluoróforoscomo Alexa Fluor 633, BODIPY, CY5, etc) . El foco rojo en cada cajasignifica que el láser está prendido.

g.

Encender el láser Ar que genera luz azul-verde de longitudes de ondade 458, 488 y 514 nm. Colocar el interruptor (botón con la leyenda“power enable”) en la posición “I” y posteriormente girar la llave a la

posición “I”. Cuando este láser se enciende, se observa una luznaranja debajo del ventilador y solo cuando la luz se torna morada,el láser estará listo para usarse (Aprox. 5 min. después de haber sidoencendido).

2. Mueva el deslizante plateado ubicado al lado derecho del estativo delmicroscopio a la posición “LSM” y asegúrese de que el obturador (shutter)ubicado del lado derecho en la parte superior del estativo (entre los dos

deslizantes ubicados con las letras F A) esté completamente metido


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3. Presione el botón “Micro” que aparece en el submenú de la ventana “LSM 5

Pascal”. La ventana “Axioplan control” aparecerá en la pantalla.

4. Seleccione el objetivo 40X presionando en la zona blanca de la ventana queindica “Objective”

5. Cierre la ventana “Axioplan control”

6. Presione con un solo click el botón “Acquire” en la barra del menú principalque aparece en la pantalla de la computadora

7. Presione el botón “Config”. Aparecerá la ventana “Configuration Control”. 8. Presione el botón “Single Track” si desea evaluar un solo fluorocromo o

“Multi Track” si desea evaluar dos o más flurocromos.9. Si usa “Multi Track” se recomienda que por cada canal pase una sola línea de

laser para evitar “sangrado (bleeding)” de los canales (ver pasos siguientes).


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10. Presione el botón “Store/Apply” en el panel “Track”. Se abrirá la ventana

“Track Configurations”.

11.

Al presionar la flecha, usted encontrará configuraciones predeterminadas para ladetección diferentes fluoróforos.

12. Escoja la combinación de fluoróforos de su muestra y presione el botón“Apply”.

Nota importante: El botón “Store” solo se usa para guardar configuraciones con

parámetros que el usuario ha establecido para sus propios experimentos. Si lo presiona porerror, la configuración predeterminada se guardará con nuevos parámetros y podría dejarde funcionar óptimamente para el resto de los usuarios.

Debido a que las configuraciones que aparecen en este menú han sidoestructuradas por cada usuario, la configuración puede no representar lo que


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usted desea evaluar. Así lo más recomendable es que usted defina lospárametros para la configuración de sus fluorocromos basándose en la “Tabla

de Configuraciones” que se encuentra anexo al final de este manual.Cada parámetro se puede cambiar dando 1 click en la figura de los espejos,

los filtros y el círculo de color que representa el color de su fluoróforo.

Para evaluar más de 1 fluoróforo, configúrelos en la opción “Multi track” perocada fluoróforo por separado como se indica en la sección “Un solofotomultiplicador” de la tabla de configuraciones anexa al final de este manual.Para añadir “tracks” al evaluar fluoróforos múltiples, presione botón “Addtrack” en la ventana configuration control y configúrelo con respecto a losdatos proporcionados en la tabla de configuraciones anexa al manual. Paranombrar el “track”, de 1 click, espere 2 segundos y de otro click, la ventana se

activará para que usted escriba.


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13. Presione el botón “Scan” que aparece en el submenú en la ventana “LSM 5Pascal”.

14. Aparecerá la ventana “Scan Control”.

15. Presione el botón “Mode”


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Para iniciar su sesión, se recomienda que,a. En el panel “Objective lens and Image Size” escoja:

Frame Size: x: 512 y: 512 (A medida que este número aumenta,también aumenta la resolución espacial)

b. En el panel “Speed” escoja “Scan Speed”: 8 (velocidad máxima, mientras mayor sea la velocidad de escaneo menor será la resolución

del barrido de la muestra.) c. En el panel “Pixel Depth...” escoja los siguientes parámetros:

i. Data Depth: 8 bit ii. Scan direction: Flecha unidireccional

iii. Mode: Frame

iv.

Method: Mean v. Number: 1 (A medida que este número incrementa, también

aumenta la proporción señal/ruido y se obtiene mayor resolución.Sin embargo, la adquisición de la imagen se lentifica y la muestrase blanquea mas rápidamente)

d. En el panel “Zoom, Rotation & Offset” escoja: zoom 1 y rotación 0. (Siaumenta el valor en la opción “Zoom” puede hacer un acercamientoóptico de la imagen que está adquiriendo).La opción “Offset” le permite mover su muestra en el plano XY, sinnecesidad de emplear los tornillos del microscopio

NOTA: Estos son los valores que se recomiendan para iniciar la sesión. Sinembargo, una vez que inicie la adquisición de la imagen, el usuario podrá irdeterminando los parámetros óptimos para disminuir el ruido de fondo y aumentarla ganancia en su muestra a medida que vaya explorando diferentes planos focalesempleando para ello el tornillo micrométrico (ver inciso 21a). Asimismo, podrácambiar de objetivo dependiendo de sus necesidades como se describe en el paso 1de la sección “Adquisición de imágenes”; los objetivos 40x y 100x son de inmersiónen aceite (el aceite se los proporcionará el Técnico académico de la Unidad).

El aceite se deberá poner sobre la muestra mientras no haya objetivos

posicionados sobre la muestra. Para poner el revolver de los objetivos en posición“sin objetivo”, presione alguno de los 2 botones marcados con puntas de flecha


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negras que se encuentran en la base del estativo debajo del tornillo micrométrico.Una vez que colocó la gota de aceite, regrese al objetivo a emplear asegurándose de

pasar por los objetivos de aire, NO por el resto de los objetivos de aceite.

Se recomienda dejar abierta la ventana “Scan control” con el objeto de

modificar los parámetros que se requieran a lo largo del experimento.

16. Presione el botón “Channels” de la ventana “Scan control” y se desplegará un panel que permitirá establecer los parámetros de los canales a usar (Channelsettings) así como determinar las líneas de excitación del/los láseres a usar(Excitation of Track).

17. En el panel “Channel Settings”, aparecen los parámetros del Pinhole (aperturaconfocal). Presione el botón marcado con el número “1”. Esta es la aperturaóptima que el sistema genera automáticamente para el objetivo que se estáempelando.

18. En el panel “Excitation of Track” la configuración predeterminada debemostrar marcadas con palomita las líneas de láser propias de la configuraciónque usted eligió en los pasos 11-12 de la sección “Adquisición de Imágenes”.De no ser así, márquelas manualmente presionando sobre la ventana cuadradaque aparece a la izquierda de cada láser y palomee únicamente las líneas de láserque utilizará.

Nota importante: Si usted está usando la configuración “Multi track”

asegúrese de que estén palomeadas las líneas del laser correspondiente a cadacanal por separado.

EJEMPLO PARA SINGLE TRACK


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EJEMPLO PARA MULTI TRACK

19. Posicione el botón marcado “Detector Gain” a la mitad de la barra de cadalínea(s) seleccionada(s) (esta es solo una posición inicial para empezar laadquisición y se podrá modificar hasta que el investigador considere que está enel nivel óptimo para sus condiciones experimentales).

20. Posicione el botón indicador del % de transmisión a un tercio de la barra (en elcaso de las líneas 458, 488 y 514) y a la mitad o ¾ de la barra (en el caso de laslíneas 543 y 633). Esta es solo una posición inicial para empezar la adquisicióny se podrá modificar hasta que el investigador considere que está en el nivelóptimo para sus condiciones experimentales).


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21.

Presione el botón “Fast XY” (adquisición rápida de baja resolución) que seencuentra en la columna de íconos en el extremo derecho de la ventana “Scancontrol”. La adquisición continua de la imagen iniciará y se puede parar encualquier momento presionando el botón Stop. Si logra ver la imagen esperada,

pero con poca resolución, asegúrese de usar el objetivo de 40x de inmersión enaceite. Si no logra ver la imagen esperada, puede intentar las siguientesopciones:

a. mueva el micrométrico hasta que encuentre señal en el plano focaldeseado mientras el sistema esté adquiriendo continuamente la imagen ycuando logre ver la imagen esperada, continúe la configuración de sus

parámetros b. presione el botón “Find” que se encuentra en la ventana “Scan control”.Esta función encontrará automáticamente los parámetros de contraste y

brillantez óptimos para su muestra.c. asegúrese de que no haya burbujas en la gota de aceited. continúe afinando la configuración de parámetros como se describe en

los puntos siguientes


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22. En el menú que aparece del lado derecho de la ventana en la que se estádesplegando la imagen adquirida, puede seleccionar la ventana “Split xy” paraevaluar cada canal por separado, así como la mezcla de ambas imágenes.


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23. Inicie la configuración de los parámetros para la adquisición de las imágenesmientras el sistema está en el modo de adquisición rápida continua (Fast XY).En el panel superior “Channel Settings” aparecerán 2 recuadros de color es, con las siglas “Ch1” y “Ch2” que corresponden al color de la línea de láser quese esté empleando (los colores de los recuadros, generalmente, coinciden con el

color de la emisión de los fluoróforos que usted evaluará empleando las líneasde láser que seleccionó). Presione el botón Ch1 y mueva el botón de la barra“Detector Gain” a la mitad de la barra. Esta es la función que le permitirámodificar contraste y brillantez de la imagen a adquirir (hacia la derechaaumenta la brillantez, hacia la izquierda la disminuye), mientras que la barra“Ampl Offset” modula el ruido de fondo (hacia la derecha lo aumenta y hacia laizquierda lo disminuye) y la barra “Ampl Gain” modula el factor deamplificación de la señal. Presione el botón Ch2 y siga el mismo procedimiento.Si no logra ver la imagen esperada, mueva el micrométrico hasta que encuentreseñal en el plano focal deseado mientras el sistema esté adquiriendocontinuamente la imagen y cuando logre ver la imagen esperada, continúe la

configuración de sus parámetros. En caso de no encontrar el campo ideal paraadquirir, puede volver a ver su muestra en capo claro presionando en botón HALdel microscopio y metiendo la barra plateada hasta la posición “Vis”. Una vez

determinado el nuevo campo, inicie el proceso desde el paso 20

24. Cuando haya optimizado los parámetros de adquisición, presione el botón“Single” de la ventana “Scan control” para obtener una imagen de mayorresolución. Generalmente, esta imagen aparecerá mucho menos brillante que la


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adquirida con “Fast XY”. Si este es el caso, presione el botón “Cont” (adquisición continua de mediana resolución) que se encuentra en el menú a laderecha dentro de la ventana “Scan control” y continúe modificando los

parámetros de adquisición hasta que la imagen le parezca satisfactoria.

25. Si esta imagen le es satisfactoria, podrá almacenarla (ver “Almacenamiento deimágenes”). De lo contrario, continúe modificando los parámetros hasta que

obtenga la imagen óptima. 26. Algunas formas de mejorar la señal:

a. Aumentar la resolución de la imagen presionando el botón 1024 o 2048en la opción “Frame Size” del submenú “Mode” en la ventana “Scan

control” b. Disminuir la velocidad de barrido en la opción “Scan Speed” del

submenú “Mode” en la ventana “Scan control” c. Aumentar el número de promedio de barridos de la muestra en la

opción “Number” del submenú “Mode” en la ventana “Scan control”


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Para revisar si la señal de su muestra está saturada, presione el ícono “Palette” que seencuentra en el menú de la ventana en la que está desplegada la imagen adquiridamientras esté trabajando en el modo de ADQUISICIÓN CONTINUA. Se recomiendahacer este procedimiento empleando la resolución final que se vaya a emplear (512,1024, 2048 pixeles).

a. Aparecerá la ventana “Color Palette”. Elegir la opción “Range indicator”.Para evaluar la intensidad en imágenes con múltiples colores, seleccione el

botón “Split xy” que se encuentra en el menú derecho de la ventana dondese despliega la imagen.

b. Presionar el botón “Cont” de la ventana “Scan Control”. Los pixeles rojos

indican saturación de color en su muestra, mientras que los azules indican baja señal.


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c. La brillantez adecuada para cada canal en la imagen la podrá ajustar presionando el botón “Ch1” y “Ch2” del panel “Channel Settings” en laventana “Scan control” y modificando los valores de las opciones“Detector Gain” y “Ampl Offset” de la ventana “Scan Control” de cadacanal mientras el sistema está adquiriendo.

d.

Se recomienda que ajuste la ganancia de forma que haya entre un 15 y 20%de pixeles rojos en la imagen y que ajuste el valor “Offset” hasta que todo oque usted considera ruido de fondo esté marcado en azul.

Al finalizar el procedimiento de ajuste, presione el ícono “Palette” y seleccionela opción “No Palette” para desplegar los colores de sus fluoróforos. Cierre la

ventana “Color Palette”.

Reconstrucción de imágenes en el plano zEste procedimiento permite producir un apilado de imágenes en el plano XY endiferentes planos focales (secciones ópticas).

Para producir un apilado de imágenes en el plano z:


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1. Presione el botón “Mode” ubicado dentro de la ventana “Scan Control” e ingrese: Scan Speed: 8 y Number: 1. Con ello evitará que su muestra sefotoblanquee rápidamente.

2. Presione el botón “Z stack” que se encuentra en el menú de la ventana “Scancontrol”. Automáticamente se desplegará el panel “Z Settings”.

3.

Presione sobre la pestaña “Mark First/Last” del panel “Z Settings” 4. Se recomienda determinar el tamaño óptimo del apilado mientras se estéhaciendo un barrido continuo de la muestra. Para ello, presione el botón “XYCont” de la ventana “Scan Control”.

5. Gire el tornillo micrométrico para enfocar uno de los límites del apilado.6. Presione el botón “Mark First” 7. Continúe girando el tornillo micrométrico en la misma dirección o en dirección

contraria (según sea su caso) para enfocar el otro límite del apilado8. Presione el botón “Mark Last” 9. Presione el botón “Stop” 10. Determine la resolución con la que obtendrá el apilado (512, 1024, 2048) del

menú “Mode” que se encuentra en la ventana “Scan control”. Usted podráobtener una imagen más limpia de ruido a medida que aumente el número deescaneos que se encuentra en la ventana “Number” en el submenú “Pixel depth,Scan direction and Scan average”

11. Presione el botón “Start” para iniciar el barrido de las secciones que componensu apilado. Usted podrá ver el avance del apilado por medio de la barra negraque se encuentra en la parte inferior de la imagen.

Nota: La barra “Num Slices” le permite determinar el número de secciones

ópticas que desea que contenga el apilado; los límites del apilado se mantendrán

constantes. Si usted desea obtener un mayor o menor número de secciones de las

que detectó el sistema, ingrese el número deseado en la casilla “Num slices”

seguido de la tecla Enter.

12. Si desea guardar el apilado con mejor resolución, modifique los parámetros

“Scan Speed” y “Number” del submenú “Mode” en la ventana “ScanControl”.


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13. Para ver la galería de secciones que componen el apilado, presione el ícono“Gallery” que aparece en el menú de la derecha de su imagen

14. Para ver el apilado presione el botón “3D view” de la ventana LSM 5 Pascalmenú principal, ventana “LSM 5 Pascal”. Aparecerá un submenú, presione“Projection”. Se abrirá la ventana “Projection”. Elija el plano en el que desea

ver la reconstrucción presionando en la ventana circular “x” “y” o “z” según seael caso y presione “Apply”.

15. Aparecerá una nueva ventana con la imagen reconstruida del apilado. Si deseacada uno de los pasos de la rotación de su imágen, presione la ventana

“Gallery” que aparece a la derecha de la ventana de la imagen adquirida.16. Para volver a la función de escaneo en un solo plano focal, presione el botón “zstack”

Almacenamiento de imágenes y reconstrucciones

Las imágenes se almacenan en bases de datos creadas por los usuarios.Para guardar una imagen, primero deberá generar una base de datos:

1. De doble clic en el ícono “My Computer” que se encuentra en el escritorio de la

computadora2. De doble clic en la unidad D:3. Presione File, aparecerá un submenú, presione New, aparecerá un submenu a la

derecha, presione Folder 4. Grupo Escriba el nombre del Jefe de grupo en la ventanilla que indica el nombre

del Fólder5. Ubique el cursor sobre la ventana de la imagen a guardar6. Presione el botón “Save As” que se encuentra en el menú de la derecha de la

imagen a guardar7. Aparecerá la ventana “Save Image and Parameter As” 8. Presione el botón “New MDB” que se encuentra a la derecha de esta ventana

9.

Aparecerá la ventana “Create New Database”


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10. Ubique el cursor sobre la ventana que indica “Create in” y de un clic. Sedesplegará la lista de unidades que contiene la computadora

11. Ubique el cursor sobre la flecha que marca hacia arriba de la ventana hasta quevea la unidad D: y de doble clic sobre el icono de esta unidad

12. Aparecerá una lista de folders. Localice su fólder y de de doble clic en él

13.

Aparecerá la ventana “Create New Database” 14. Escriba un nombre para su base de datos en el espacio “File name” y presioneel botón “Create”

15. Aparecerá la ventana “Save Image and Parameter As”. En la parte inferioraparece la subventana “Database (MDB)”. Asegúrese de que el nombre delfólder donde guardará su imagen este resaltado en azul. Si no es así, de dobleclic sobre el nombre de su fólder

16. En la parte superior de la venta aparece la opción “Name”. Borre el contenidode esa ventana e introduzca el nombre de su imagen. Presione Ok.

17. Su imagen habrá quedado guardada y lo podrá rectificar por que el nombre de laimagen aparecerá en la barra superior azul que enmarca a su imagen.

18.

Las imágenes almacenadas las deberá copiar a las carpetas de red X: o W: siesta en la Sede de Circuito Escolar o Exterior respectivamente. Asegúrese decopiar todo el contenido de su base de datos (archivos “.mdb” “.ldb” y “.lsm”)

a su fólder en red. Los datos almacenados en estas unidades se borraránautomáticamente los días martes y viernes a las 6:00 AM. Por favor tómeloen cuenta para evitar la pérdida de sus datos.

19. Las imágenes almacenadas en este formato se pueden desplegar para su posterior procesamiento empleando programas de análisis de imágenes como lossiguientes: LSM VisArt, Image J, Image Pro e Imaris entre otros. Ustedencontrará software de uso libre en la página electrónica de la Unidad, bajo elícono de análisis de imágenes:

http://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/unidad_microscopia.html

Para finalizar el programa, cierre todas las ventanas excepto la “LSM pascal”. Oprimael botón “File” y después el botón “Exit” aparecerá la ventana switch off light manager, presione “No”.

SOLUCION DE PROBLEMAS COMUNES1) No logro observar la muestra en el microscopio

Posibles soluciones: Mueva el deslizante plateado ubicado al lado derecho del estativo delmicroscopio a la posición “LSM” y asegúrese de que el obturador(shutter) ubicado del lado derecho en la parte superior del estativo(entre los dos deslizantes ubicados con las letras F A) estécompletamente metido

Posicione los pasos de luz marcados con F A en la posición massuperior

Mueva el plano focal girando lentamente el tornillo micrométricomientras continúa la adquisición

Asegúrese de que los láseres estén encendidos

Asegúrese de que la configuración que escogió tenga marcadas (con palomita) las líneas de láser de interés


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Asegúrese de que el botón indicador de ganancia “Detector Gain”esté posicionado como mínimo a la mitad de la barra

2) Veo mi muestra con el objetivo de 20X al microscopio, pero no veo nada enempelando el sistema confocal

Posible solución: Cambie al objetivo de 40X

3) La imagen adquirida se ve muy “pixelada” Posibles soluciones:

Aumente la resolución espacial del “Frame Size” a 1024 y si usa unobjetivo de 100X, use 2048 del submenú “Mode” en la ventana“Scan control”

Aumente el número de escaneos en la opción “Number” del menúantes mencionado

Asegúrese de estar adquiriendo con el modo “Single” o “Cont”, no con “Fast XY”

4) Muy baja señal aun con los valores de ganancia de detección y deamplificación altos

Posible solución: Aumentar el tamaño del pinhole, aunque con ello perderá

confocalidad


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ANEXO: TABLA DE CONFIGURACIONES

Láser Emisión (nm) HFT NFT Ch1 Ch2

Un solo fotomultiplicador

FITC (CY2, Alexa 488) Argón 488 488 None LP505

Enhaced GFP (EGFP) Argón 488 488 None LP505

Enhaced Cyan FP (ECFP) Argón 458 458 None LP475

Enhanced Yellow FP (EYFP) Argón 514 514 None LP 530

Lucifer Yellow Argón 458 458 None LP 475

Cy3 (Rhodamine, Texas Red) He-Neón Verde 543 543 None LP560

DS Red He-Neón Verde 543 543 None LP560

Alexa 633, Cy5 He-Neón Rojo 633

488 / 543 /

633 None LP650

Dos fotomultiplicadores

FITC / Cy3

Argón+He-Ne

Verde 488 / 543

488 / 543 /

633 545 LP560 BP 505-530

FITC / Cy5

Argón+He-Ne

Rojo 488 / 633

488 / 543 /

633 545 LP650 BP 505-530

CY3 / Cy5

He-Ne Verde +

Rojo 543 / 633

488 / 543 /

633 635 LP650 BP 560-615

Enhaced GFP (EGFP) Argón 488 488 plate LP505

Enhaced Cyan FP (ECFP) Argón 458 458 plate LP475

Enhanced Yellow FP (EYFP) Argón 514 514 plate LP 530

Lucifer Yellow Argón 458 458 plate LP 475

DS Red He-Neón Verde 543 543 plate LP560

Documents

Manual de Uso Del Confocal Revisado 2010 1