Manual de Estudiantes Biologia Para Ingenieros_2014ii

Laboratorio de Biología para Ingenieros UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química

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GUÍA DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA PARA INGENIEROS

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

BIOLOGÍA PARA INGENIEROS MEDELLÍN

2014



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ÍNDICE

1. Normas generales y de bioseguridad en el laboratorio. 2. Identificación de matrices con presencia de macromoléculas. 3. Determinación de aminoácidos y proteínas. 4. Determinación de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidón. 5. Transesterificación para producción de biodiesel. 6. Preparación de medios de cultivo específicos y aislamiento de microorganismos del medio ambiente. 7. Caracterización macroscópica, microscópica y aislamiento de microorganismos ambientales. 8. Determinación de la capacidad metabólica de microorganismos ambientales. 9. Manejo de materiales y equipos de laboratorio. 10. Cinética de crecimiento microbiano: Fermentación alcohólica. 11. Degradación de colorantes utilizando hongos de pudrición blanca de la madera. 12. Extracción de enzimas de origen vegetal, efecto de inhibidores sobre la actividad enzimática. 13. Actividad catalítica de la α-amilasa y variables que la afectan.



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1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO E IDENTIFICACIÓN DE MATRICES CON PRESENCIA DE MACROMOLÉCULAS.

NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO a. Llegar puntualmente. Todas las prácticas están programadas para ser realizadas en el tiempo previsto. b. Llevar las guía de la práctica a realizar, esta debe ser leída con anticipación. c. Tenga en cuenta las instrucciones dadas en cada sesión. El profesor puede preguntar cualquier información que esté contenida en ellas. d. No es permitido el uso de radios, walkman, celulares o equipos puedan interrumpir el desarrollo de la práctica. e. Es prudente usar pantalón largo y evitar las faldas y pantalonetas. f. Usar zapatos cerrados adelante, evitar sandalias o calzado similar. g. No es permitido el ingreso al laboratorio de personas diferentes a los matriculados en el curso. h. Desarrollar las actividades con calma, tome el tiempo necesario para hacer los distintos procedimientos para que los resultados sean buenos. i. Analícelos resultados obtenidos durante la práctica. Confíe en sus propias observaciones. j. Está prohibido fumar dentro del laboratorio. k. Utilícelos reactivos adecuados en cantidades y concentraciones indicadas. No desperdicie el material. l. El material de trabajo es propiedad dela universidad y debe ser devuelto en buenas condiciones y limpios. Usted es responsable y debe reponer y pagar todo el material que sea dañado o extraviado. m. La limpieza, el cuidado al trabajar, el empleo correcto de las técnicas enseñadas y el interés son factores que contribuyen al éxito de la práctica. n. No emplee material sucio o contaminado para extraer reactivos de los recipientes. o. No se retire del laboratorio sin justificación.



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p. Dejar los puestos de trabajo limpios después de terminar la práctica.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD La bioseguridad, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo en el laboratorio procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de estudiantes, docentes, monitores y el medio ambiente (Forero de Saade, 1997). a. Evitar contacto de piel o mucosas con líquidos. b. Lavado de manos al inicio de la sesión y al finalizar la misma para remover todo tipo de contaminante químico y/o biológico. c. Usar guantes si es necesario o se sugiere por el instructor d. Usar la mascarilla si se recomienda. e. Usar la bata cerrada durante toda la práctica para evitar contacto de la ropa con los reactivos y microorganismos usados durante la sesión. f. No es permitido el consumo de alimentos (chicles, bebidas, frutas, entre otros) durante el desarrollo de la práctica. g. El cabello debe estar recogido. h. No usar gorros que no sean apropiados para la práctica. i. Si hay derrame de alguna sustancia química, el sitio debe ser limpiado inmediatamente, para evitar que de forma accidental otra persona pueda tocarla. j. Si alguna sustancia química entra en contacto con la piel, ojos, lavar Con agua durante unos minutos. Nota: En caso de accidentes consulte con el instructor o docente encargado. k. Tenga un uso adecuado de los residuos generados durante la práctica. Si tiene dudas pregunte al docente o al monitor encargado.



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2. IDENTIFICACIÓN DE MATRICES CON PRESENCIA DE MACROMOLÉCULAS

OBJETIVO Identificar cual(es) macromolécula(s) se encuentran en cada una de las matrices mostradas. PREGUNTAS

I.¿Qué es una macromolécula? II.¿Cuáles son los tipos de macromoléculas?

III.¿Dónde se pueden encontrar las macromoléculas?



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3. DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

OBJETIVO Reconocer la presencia de algunos aminoácidos en las proteínas, a través de reacciones específicas que permiten su identificación. MARCO TEÓRICO Proteínas Las proteínas son los materiales que desempeñan un mayor número de funciones en las células de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura básica de los tejidos (músculos, tendones, piel, uñas, etc.) y, por otro, desempeñan funciones metabólicas y reguladoras (asimilación de nutrientes, transporte de oxígeno y de grasas en la sangre, inactivación de materiales tóxicos o peligrosos, etc.). También son los elementos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del código genético (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema inmunitario. Aminoácidos Son macromoléculas orgánicas, constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), entre otros.



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Se clasifican, de forma general, en holoproteínas y heteroproteínas según estén formadas respectivamente sólo por aminoácidos o bien por aminoácidos más otras moléculas o elementos adicionales no aminoacídicos (Proteínas). Reacciones características de los aminoácidos y proteínas. • Prueba Biuret: Es una prueba general para proteínas, no especifica. Cuando una proteína reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva un complejo color violeta. La prueba Biuret trabaja para cualquier tipo de compuesto que posea uno o más de los grupos siguientes:

• Prueba de Ninhidrina: Es positiva para aminoácidos y proteínas que tengan un grupo -NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo azul-violeta. • Prueba Xantoprotéica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto amarillo. La producción de un producto coloreado amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de la reacción Xantoprotéica. • Prueba para metales pesados: Los metales pesados tienen el efecto de precipitar proteínas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino libres y los grupos carboxilo libres. Los iones más comúnmente usados para detector la presencia de proteínas incluyen Zn 2+, Fe 3+ , Cu 2+ , Sb 3+ , Ag 1+ , Cd 2+ y Pb 2+

Entre los metales, Hg 2+, Cd 2+, y Pb 2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar serios daños a las proteínas (especialmente enzimas) desnaturalizándolas. Victimas que han ingerido iones de mercurio o plomo se tratan con un antídoto de algún alimento rico en proteínas. La proteína se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la absorción de tales iones. Los alimentos más usados son leche y clara cruda de huevo. La proteína que se precipita es removida inmediatamente del estómago mediante un lavado estomacal (Alices. 2009).



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• Prueba Hopkins Cole: Es específica del grupo indol característico del Triptófano. El anillo del indol se hace reaccionar con ácido Glioxálico en presencia de ácido Sulfúrico concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la solución de proteína y el ácido sulfúrico. La reacción de Hopkins Cole es positiva sólo para las proteínas que contienen Triptófano. Se supone que el ácido concentrado hidroliza las proteínas en la interfase liberando el Triptófano para dar el producto violeta. Sin embargo, el Triptófano puro en solución no da positiva la reacción, a menos que se agreguen agentes oxidantes, por lo que es de suponer que el Triptófano de las proteínas no se libera como tal, por lo cual la reacción presentada es sólo parcialmente correcta. • Prueba para aminoácidos azufrados: Esta reacción detecta la cisteína y metionina y proteínas que la contengan. En medio fuertemente alcalino el radical mercapto de la cisteína metionina se desprenden como ácido sulfhídrico que se pone en evidencia añadiendo sales de plomo para que se forme de un precipitado negro de sulfuro de plomo (Ordorica & Velázquez. 2012). • Desnaturalización: Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija. La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína: Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión. Una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie. Pérdida de las propiedades biológicas (Desnaturalización).

MATERIALES • Leche • Harina de trigo • Huevo • Gelatina sin sabor • Tubos de ensayo

• Baño termostático. • Ácido nítrico concentrado • Hidróxido de sodio al 25% • Hidróxido de sodio al 50% • Sulfato de cobre al 1%



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• Acetato de plomo al 2% • Ácido clorhídrico concentrado

• Etanol

PROCEDIMIENTO Preparar las siguientes soluciones: • Solución de albúmina 30% v/v. • Solución de harina de trigo 1% v/v. • Solución de gelatina sin sabor 3%p/v. Reacción Xantoprotéica

Tubo Solución Cantidad (mL) 1 Albúmina 2 2 Leche 2 3 Harina de trigo 2 4 Gelatina sin sabor 2

• A cada uno de los tubos adicione 5 gotas de ácido nítrico concentrado. • Caliéntelos al baño maría hasta cambio de coloración. • Alcalinice la mezcla adicionando gota a gota de hidróxido de sodio al 25%. • Observe y anote los resultados. Prueba de los aminoácidos azufrados


• A cada tubo adicione 3 gotas de hidróxido de sodio al 25%. • Agregue 5 gotas de acetato de plomo al 2%. • Caliéntelos al baño maría por 10 min. • Observe y anote los resultados.



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Prueba de Biuret


• A cada tubo adicione 5 gotas de hidróxido de sodio al 25% • Adicione 5 gotas de sulfato cúprico al 1%. • Observe y anote los resultados. Desnaturalización

Tubo Solución Cantidad Procedimiento

1 Albúmina 10 gotas Calentar gradualmente y observe

temperatura de coagulación 2 Albúmina 10 gotas 20 gotas de etanol 3 Albúmina 10 gotas 5 gotas de HCl concentrado 4 Albúmina 10 gotas 5 gotas de hidróxido de sodio al 50%

Agite los tubos y observe si se produce coagulación. Para todas las reacciones anteriores, reporte los datos y observaciones en la siguiente tabla:

Reacción Leche Albúmina Harina

Xantoprotéica

Aminoácido azufrados

Biuret



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Desnaturalización

Conclusiones

PREGUNTAS

I.¿Qué es un péptido? II.¿Qué es un enlace peptídico?

III.¿Cuál es la estructura de una proteína? IV.¿Cuáles son las reacciones de cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio? V.¿Existen otras pruebas cualitativas y/o cuantitativas diferentes para la identificación de

aminoácidos en proteínas? ¿Cuáles?



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4. DETERMINACIÓN DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDÓN Y POSIBLES APLICACIONES INDUSTRIALES

OBJETIVOS • Determinar propiedades del almidón tales como el punto de gelatinización e índice de hinchamiento. • Evaluar la aplicabilidad del almidón en la elaboración de pegantes y adhesivos.

MARCO TEÓRICO Los gránulos de almidón, que se producen en las plantas a partir de la fotosíntesis de dióxido de carbono, están formados por polímeros de glucosa y sirven como reservas de energía. Hacia el final de la temporada de cultivo, el almidón se acumula en las ramas de los árboles, cerca de las yemas. También se encuentra en frutas, semillas, rizomas y tubérculos. Los gránulos de almidón son muy adecuados para el almacenamiento a largo plazo, debido a que es un material compacto, la sequedad relativa y alta estabilidad. La transformación del almidón crudo en agua caliente se llama gelatinización: los gránulos se hinchan y estallan, formando una pasta. Durante el almacenamiento prolongado o refrigeración, la pasta de almidón a menudo se espesa debido a un fenómeno llamado retrogradación. Gelatinización y retrogradación, que corresponden a modificaciones estructurales en los gránulos, afectan el comportamiento del almidón que contienen los sistemas. En consecuencia, el almidón es excelente para modificar la textura de muchos procesados y los alimentos cocinados en casa (por ejemplo, como harina de maíz o harina para espesar las salsas) y también ha sido utilizado durante siglos para otros fines, incluida la fabricación de papel, colas o refuerzos de la tela. Hoy en día, las nuevas aplicaciones del almidón son emergentes, incluyendo las fibras de las dietas bajas en calorías, los materiales biodegradables, envases, películas delgadas y materiales termoplásticos.



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Los gránulos de almidón nativos varían enormemente de forma y de tamaño (desde 0,1 a 200 nm), pero todos tienen una característica común: bajo el microscopio e iluminados con luz polarizada, granos de almidón teñidos con yodo presentan una "cruz de Malta" distintiva lo que indica la existencia de algún orden interno común. Cuando los gránulos se calientan en exceso de agua, la “cruz” comienza a desaparecer, lo que demuestra que este orden molecular se está interrumpido (Almidón: un misterio estructural). MATERIALES • Almidón • Agua. • Lugol

PROCEDIMIENTO Preparar 100 ml de una solución de almidón al 10% p/v, con la cual se realizaran cada uno de los siguientes procedimientos: a) Capacidad de retención del agua. Pesar un tubo de ensayo vacío Tomar 10 mL de la solución preparada y agregarlos al tubo. Pesar nuevamente. Centrifugar a 3500 rpm por 30 minutos. Pesar otro tubo limpio y seco. Pasar el sobrenadante al tubo anterior. Pesar sistema con el sobrenadante. Pesar el precipitado. Calcular la capacidad de retención del agua mediante:

b) Determinación y microscopia del punto de gelatinización Llevar 90 mL de la solución a un beaker. Calentar con agitación constante midiendo la temperatura periódicamente. Tomar muestras de la suspensión a las temperaturas de 30, 60, 70 ºC en porta objetos. Teñir con lugol las muestras tomadas



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Observar cambios en microscopio para cada una de las muestras utilizando un objetivo de 40x. Determinar la temperatura de gelatinización. c) Aplicación: Evaluación de pegantes.

Con el gel formado, realizar los siguientes procedimientos: Rotulado de botellas. Agregar gel sobre el papel kraft. Dejar secar por 1 minuto. Adherir el papel a una botella. Dejar secar por 5 minutos (Hacer uso del secador). Retirar papel. Sellos de papel. Esparcir gel sobre una tira de papel kraft. Dejar secar por 10 minutos (utilizar secador). Humedecer el papel. Colocar la tira de papel sobre otro papel seco. Dejar secar. Retirar el papel. d) Índice de hinchamiento. • Añadir 3 g de almidón en una probeta de 10 mL. • Medir el volumen ocupado por el almidón. • Agregar agua destilada hasta completar un volumen de 10 mL. • NO AGITAR. • Dejar reposar. • Medir el volumen de almidón cada 10 o 15 minutos hasta observar que no haya variación.



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5. TRANSESTERIFICACIÓN PARA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

OBJETIVO • Producir biodiesel a partir de aceite de palma, mediante una reacción de transesterificación con metanol. • Determinar el índice de acidez de algunos aceites mediante la norma NTC por el método con etanol caliente usando indicador.

MARCO TEÓRICO La transesterificación es un término general que se utiliza para designar a las reacciones orgánicas en las cuales se produce un intercambio o sustitución del grupo acilo o alquilo de un éster. Desde una perspectiva más contextualizada, podríamos definir la transesterificación como la reacción mediante la cual, los triglicéridos (TG) presentes en los aceites vegetales y grasas animales se combinan con un alcohol de bajo peso molecular usualmente metanol o etanol en presencia de un catalizador adecuado, para formar glicerina y ésteres metílicos o etílicos. Los alquil ésteres grasos obtenidos a partir de la reacción anterior, poseen propiedades y tamaño similares a los constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como biodiesel. Los catalizadores que se suelen utilizar a escala comercial son los catalizadores homogéneos básicos. Se ha reportado que la síntesis de biodiesel catalizada por bases es 4000 veces más rápida que al usar ácidos, pero tiene la desventaja que necesita materias primas refinadas con un contenido de agua menor al 0,5 % p/p y de ácidos grasos menor al 1,0% p/p. Entre las ventajas de utilizar un catalizador heterogéneo frente al homogéneo y enzimas, se puede mencionar: reutilización del catalizador, facilidad de procesos continuos, uso de materias primas de diversa fuentes, no se forman jabones, purificación más sencilla, no se necesita neutralizar, tiempo de reacción menores. Entre los posibles inconvenientes,



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podrían presentarse: resistencia a la transferencia de masa, mayor temperatura de reacción y lixiviación de las especies activas. En la síntesis de biodiesel, el uso de catalizadores estructurados permitirá eliminar algunos pasos del proceso, como neutralización y lavado en el caso de los catalizadores homogéneos, filtrados para los heterogéneos. Este ahorro de etapas podría compensar el mayor costo del catalizador si se superan los problemas operativos que imponen entre otros aspectos la posibilidad de regeneración y reuso del catalizador. El depósito de catalizador en polvo sobre el monolito debe cumplir tres requisitos fundamentales: asegurar una cantidad suficiente de catalizador, formar una capa homogénea y tener una adherencia suficiente para su manipulación y uso (Damiani, Reinoso & Tonetto. 2011) Los ésteres grasos obtenidos a partir de la reacción dada, poseen propiedades y tamaños similares a los constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como Biodiesel (Torossi. 2006)

Figura 1. Reaccion para producción del biodiesel

Principales variables que afectan la reacción de transesterificación

Figura 2. Principales variables que afectan la reacción de transesterificación.

• Tanto la acidez del aceite como su contenido acuoso, son parámetros importantes para tener en cuenta, por lo que una valoración previa de la acidez del aceite, es importante para determinar la cantidad de catalizador capaz de neutralizarla sin disminuir su acción catalítica. Para el aceite de palma a usar, se supondrá un índice de acidez de 1.5 mg NaOH/g aceite (Torossi. 2006)



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• La relación molar entre el alcohol y el aceite es una de las variables más influyentes en el rendimiento de la reacción y en la viscosidad final del biodiesel. El alcohol más utilizado es el metanol debido a su polaridad y a su estructura de cadena corta. Si bien la estequiometria para la reacción requiere tres moles de alcohol por mol de aceite, en la práctica, se incrementará (9:1) para desplazar el equilibrio hacia una mayor formación de ésteres metílicos (Torossi. 2006). • Los catalizadores a utilizar, son catalizadores básicos, como el hidróxido de sodio o de potasio. Es de suma importancia utilizar reactivos concentrados, para minimizar la presencia de agua. La cantidad de catalizador a usar el 1% p/p con respecto a la cantidad de aceite más la cantidad de catalizador necesario para neutralizar el ácido presente en el aceite (índice de acidez) (Torossi. 2006). Cálculos previos a la práctica • Realizar los cálculos correspondientes para procesar 50 gramos de aceite de palma (100% de pureza, densidad 856 g/mol) con la relación anteriormente indicada. • Calcular el peso de catalizador necesario en la reacción y para neutralizar la acidez del aceite

PROCEDIMIENTO Transesterificación 1. Pesar el catalizador y disolverlo en el metanol. 2. Pesar 50 gramos de aceite y calentarlo para climatizar (60 grados centígrados). 3. Agregar la solución de catalizador-Metanol al aceite de palma. 4. Pasar mezcla a un balón volumétrico con un magneto y poner en el montaje esquematizado en la figura 3.



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Figura 3. Montaje transesterificación

5. Asegúrese de que la mezcla se mantenga aproximadamente a 60 grados centígrados mediante un calentamiento en baño María con agua caliente. 6. Encender el sistema de agitación y de reflujo. 7. Dejar reaccionar por 45 minutos. 8. Desmontar y pasar la mezcla a un embudo de decantación para separar las fases. 9. Recuperar el biodiesel (fracción liviana). 10. Purificar el biodiesel mediante lavado con agua a 100 grados centígrados.

Determinación del índice de acidez por Método con etanol caliente usando indicador. Materiales • Etanol 95% v/v neutralizado según la norma NTC. • 2,5g de aceite. • Solución de NaOH al 0,25M normalizada. • Bureta.

Procedimiento 1. Pesar 2,5g de aceite en un Erlenmeyer de 100 ml. 2. Agregar 50 ml de etanol neutralizado (según la norma NTC.) a 75ºC 3. Mezclar y llevar a ebullición. 4. Titular con NaOH a 0,25 M, agitando vigorosamente. 5. Determine el índice de acidez (ecuación 1). 6. Calcular la acidez (ecuación 2).



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Donde V: volumen usado de NaOH 0,25M en la titulación. c: concentración exacta de NaOH : 0,2483M. m: masa de aceite. M: masa molar del aceite (Tabla 1). Tabla 1. Masa molar de aceites

Tipo de grasa Expresada como Masa molar (g/mol)

Aceite de coco, de palmiste y similares Ácido láurico 200

Aceite de palma Ácido palmítico 256 Aceites de algunas crucíferas Ácido erúcico 338

Todas las otras grasas Ácido oleico 282

En el caso de semillas de colza con un contenido máximo de ácido Eurico de 5%(m/m), la acidez se debe expresar como ácido oleico PREGUNTAS

I.¿Que son las normas NTC y que utilidad tienen? II.¿Cómo se neutraliza el etanol según la norma NTC 218 (Numeral 4.7.2)?

III.¿Cómo determinaría si los productos de la transesterificación si son los productos esperados?

IV.¿Qué se esperaría si se le mide el índice de acidez y la acidez a la glicerina obtenida en la transesterificación? ¿Tiene algún sentido medirlas?



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6. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ESPECÍFICOS Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE

OBJETIVOS • Preparar medios de cultivo sólidos, utilizando diferentes tipos de sustratos (almidón y caseína). • Reconocer algunos ambientes que permiten evidenciar la existencia de microorganismos.

MARCO TEÓRICO Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolución de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación y el punto de ebullición del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes. Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las características del ambiente determinan cuáles especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: mohos, levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus. El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto ingobernable de microorganismos compiten entre sí para obtener lo que todos ellos necesitan: nutrientes y energía. Al mismo tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composición química del suelo donde habitan. Más aún, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presión del ambiente. Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscópicas o protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelícula



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de microorganismos contenidos en una matriz de polisacáridos, cuyo espesor puede oscilar entre algunos micrómetros y pocos milímetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las biopelículas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de mar, o bien sobre soportes constantemente húmedos tales como paredes de la cañería de agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies (Carrillo, 2003). Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Los medios de cultivo se pueden clasificar según la origen, consistencia y composición (López & Torres. 2006). MATERIALES • • Cajas Petri con agar nutritivo • Escobillón de algodón • Incubadora. • Mechero

• Cámara de flujo laminar • Caseína • Almidón soluble. • Agar bacteriológico

PROCEDIMIENTO • Preparar los medios de cultivo (caseína y almidón) de acuerdo a las composiciones de la siguiente tabla y seguir las indicaciones que se den para su preparación.

Tabla. Composiciones de medios específicos Agar caseína Agar almidón

Caseína 8% p/v Almidón soluble 1% p/v Agar 15 g/L Agar 15 g/L pH 7.2 pH 7.2



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• Las cajas Petri, están preparadas con anterioridad, a condiciones de pH 7.2, medio de agar nutritivo (15 g/L) y esterilizadas para garantizar su ubicuidad. • En la caja Petri con medio sólido, correspondiente a cada estudiante, inocule las cajas con microorganismos obtenidos de las siguientes fuentes: Del aire. Superficie de la mesa de trabajo. Mucosas y piel. Manos lavadas con jabón y/o antibacterial. Manos sin lavar. Piel de animales. • Luego incube dejando la caja invertida a 37°C de 24 a 48 horas.



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ANEXO Algunos Medios de Cultivo Específicos Agar Nutritivo Composición: Agua destilada………………………………………………………….……..............1 L Agar Nutritivo..………………………………………….........................................15 g Ajustar pH del medio a 7.2 Agar-Caseína (Harrigan y McCance, 1979) Composición: Caseína …………………………………….…………...................................... 8% m/v Agar Nutritivo……………………………………………......................................100 ml Ajustar pH del medio a 7.2 Agar Almidón (Harrigan y McCance, 1979) Composición: Almidón soluble……………….…………………………………………….........1% m/v Agar Nutritivo……………………………………………......................................100 ml Ajustar pH del medio a 7.2 Agar MA (Abhaykumar&Dube, 1992) Composición: Carboximetilcelulosa……………...…….………………………………………………1 g Fosfato de hierro III.........................................................................................0.001 g Agar Nutritivo……………………………….………………..................................100 ml



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7. CARACTERIZACIÓN MACRO Y MICROSCÓPICA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AMBIENTALES.

En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para el manejo de microorganismos. Todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si fuera potencialmente perjudicial para la salud. OBJETIVOS • Observar y describir las características morfológicas de las colonias. • Utilizar el método de coloración de Gram para caracterizar una colonia bacteriana. • Clasificar microorganismos de acuerdo con las características morfológicas.

MARCO TEÓRICO Nota: En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para el manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la práctica cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener especial cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminación. Caracterización de microorganismos La observación de los microorganismos se valora en dos aspectos: • El aspecto macroscópico, en el que se evalúa color, forma y tamaño de las colonias. • El aspecto microscópico en el que se evalúa la forma, el tamaño y propiedades de la pared del microorganismo como tal.

Estas apreciaciones le permitirán al microbiólogo determinar aspectos como:



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• Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo • La morfología microscópica debe presentar uniformidad en el tamaño, absorción de la coloración y forma de los microorganismos evaluados. • Composición de la pared, ya que la coloración de Gram utilizada para la observación microscópica, da cuenta de los componentes presentes en la pared celular; puesto que al ser negativa el microorganismo en esta tendría mayor porcentaje de lipopolisacáridos, mientras que al ser positiva, indicaría que el microorganismo en esta estructura presenta mayor porcentaje de péptidoglicanos. • Viabilidad, dado que la observación en fresco, permite ver el movimiento microbiano.

Preparaciones Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan los microorganismos vivos, lo que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad de los mismos. Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el mismo índice de refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlos visualizar. Los métodos para observar los microorganismos proporcionan las siguientes ventajas: Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar los tipos morfológicos microbianos. Una visualización de las estructuras internas y externas tales como. Espora, equivalente nuclear, gránulos citoplasmáticos, pared celular, cápsula y flagelo.

Una de las coloraciones más utilizadas en el laboratorio, para la identificación de microorganismos es la coloración de Gram, por tal razón se verá en detalle. Coloración de Gram La coloración de Gram es un método que ha permitido la división de las bacterias en dos grupos: El de Gram positivas y el de las Gram negativas. La técnica esta basada en la capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta durante la decoloración con el alcohol acetona. Las bacterias Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color púrpura propio del cristal violeta (Figura 1).



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Figura 4. Gram Negativas

Las bacterias Gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Después de la decoloración, se utiliza la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho colorante da un color rosado a las células decoloradas (Figura 2).

Figura 5. Gram Positivas

Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de péptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las Gram negativas, encima de ésta, presentan una delgada capa de péptidoglicano, a la que se superpone una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína, denominada membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemática bacteriana: las que no lo poseen, Gram (+) y las que sí, Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de enorme importancia taxonómica. En el comportamiento como patógenos y en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ahí que la realización rápida de una coloración de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnológicos y en la bacteriología clínica (Facultad de química farmacéutica).



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MATERIALES • Cajas Petri con agar nutritivo con colonias. • Colorantes Gram. • Mecheros. • Microscopio.

• Estereoscopio. • Porta objetos. • Cubre objetos. • Aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO Observe la morfología de las colonias a nivel microscópico y descríbalas según tamaño, color y forma. 1. Observación en fresco. Se realiza un frotis, el cual consiste en tomar con un asa una muestra de la colonia y esparcirla en el porta objetos, previamente humedecido con una gota de agua, realizando movimientos horizontales. Se adiciona una muestra de colorante (azul de metilo) a la muestra fresca. La observación en fresco se utiliza para hongos y levaduras (cristal violeta o azul de metilo), micro algas (lugol), células vegetales o bacterias coloreadas. 2. Coloración en seco. Es necesario fijar la muestra después de haber realizado el frotis, para fijar se flamea el portaobjetos, teniendo precaución de no quemar la muestra, hasta que se evapore todo el agua, posteriormente se adicionan los colorantes, según el método de tinción a utilizar. o Coloración de Gram: Tome colonias separadas de acuerdo a su morfología y realice coloración de Gram: a. Teñir con cristal violeta durante 30 segundos. b. Retirar el colorante con agua. c. Cubrir con lugol durante 1 minuto. d. Lavar con agua. e. Decolorar con alcohol cetona. f. Contrastar con safranina durante 20 segundos. g. Lavar con agua. h. Secar el exceso de agua.

Describa su forma (cocos, bacilos, espiral) tipo de agrupación y clasifíquelas según la absorción de la coloración en Gram (+ o -).



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Morfología típica de los microorganismos

Aislamiento de microorganismos • Realice un repique de un microorganismo ambiental en cada uno de los medio de cultivo específicos, preparados con anterioridad. • Incube dejando la caja Petri a 37ºC

PREGUNTAS

I.¿Cómo actúan cada uno de los reactivos utilizados en la tinción de Gram? II.¿Qué relación existe entre la morfología macroscópica y la microscópica?

III.¿Cuáles son los tipos de tinción y para que se utilizan? IV.¿Por qué es importante la observación microscópica en un proceso biotecnológico?



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8. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD METABÓLICA DE MICROORGANISMOS AMBIENTALES

OBJETIVOS • Caracterizar microorganismos con actividad amilolítica y proteolítica. • Determinar cualitativamente la capacidad de un microorganismo para hidrolizar sustrato específico.

MARCO TEÓRICO. Pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varia entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar. No obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de forma rápida tras incubación de unas 2-6h; en general, se trata de reacciones enzimáticas cromogénicas o pruebas convencionales modificadas (hay discos o tabletas comercializados con substratos cromogénicos para uso individualizado)(Fernández, García, Sáez & Valdezate. 2010). Hidrólisis del almidón En la naturaleza abundan las enzimas capaces de hidrolizar los almidones. La movilización del almidón exige eventual conversión en glucosa. En el hombre, las enzimas que realizan este proceso son las amilasas salivares y las amilasas del tracto digestivo.



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Las dextrinas son los fragmentos de polisacárido resultantes en la hidrolisis enzimática de las cadenas laterales del almidón. El termino dextrinas se aplica también a las sustancias obtenidas por calentamientos del almidón seco o por hidrolisis parcial del almidón con ácidos diluidos (Geissman, 1974). Esta prueba se realiza en agar almidón, una vez se tiene crecimiento microbiano, se inunda el agar con lugol, se forma un complejo coloreado con el almidón, de manera que en las zonas donde se da la hidrólisis como consecuencia de la producción de amilasas, aparecen zonas claras (Hidrólisis del almidón). Hidrólisis de la caseína. La caseína es una proteína encontrada en la leche. Como todas las proteínas, esta compuesta de aminoácidos que son utilizados por los microorganismos como fuentes de energía y de carbono. Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se vuelve turbio debido a que la caseína reacciona con los iones de calcio y forma complejos coloidales insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la hidrólisis de la caseína, los aminoácidos resultantes se disuelven en el medio acuoso y el medio se torna de nuevo transparente alrededor de la colonia de los microorganismos. La prueba se realiza inundando el agar caseína con ácido clorhídrico al 1%. El ácido provoca la precipitación de las proteínas y la aparición de zonas menos opacas en el medio, que pueden identificarse como zonas en las que se ha hidrolizado la caseína (Alarcón & Olivas, 2004). MATERIALES • Cajas Petri con medios de cultivo específicos incubadas. • Lugol. • Ácido clorhídrico al 1%

PROCEDIMIENTO Luego de una semana de cultivo, observar variaciones en el medio de cultivo específico y crecimiento del microorganismo y de acuerdo con el sustrato empleado, aplicar las pruebas cualitativas para evidenciar el consumo o no del sustrato. PREGUNTAS

I.Defina sustrato, enzima, producto y revelador en el contexto de pruebas bioquímicas.



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9. MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

OBJETIVOS • Conocer y/o familiarizarse con los diferentes equipos de laboratorio, a través del desarrollo de actividades que involucren manejo de material de vidriería (probetas, erlenmeyers, pipetas, etc.) y equipos de laboratorio (balanzas analíticas, pH metro, espectrofotómetro, micropipetas, filtros). • Realizar la medición de biomasa por medio de las técnicas de peso seco y turbidimetría (absorbancia). • Realizar la determinación de azúcares reductores por el método espectrofotométrico del DNS.

MARCO TEÓRICO Para lograr resultados confiables en el laboratorio, es indispensable conocer tanto el funcionamiento de los instrumentos y los equipos de laboratorio, como los principios teóricos que los rigen. Durante el desarrollo de esta práctica se construirán dos curvas de calibración para las cuales se utilizarán micro pipetas, balones volumétricos, balanzas analíticas, espectrofotómetro, baño maría, entre otros. A continuación se describen algunos aspectos generales relacionados con la práctica:



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Micropipeta: Es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volúmenes pequeños (por ejemplo, 10 μl), y las azules para pipetear volúmenes grandes (por ejemplo, 800 μl). Tipos: Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. Operación del Equipo a. Se presiona el botón superior suavemente hasta el primer tope. b. Se sumerge la punta, en la solución que se necesita pipetear estando seguros que la punta este bien colocada y que no haya ningún tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta. c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solución, soltando el botón suavemente. d. Para descartar la solución de la punta presione el botón hasta el segundo tope. e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas, ver figura 3 (Micropipetas).

Figura 6. Micropipeta uso y partes

Espectrofotometría: La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las



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radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la absorbancia se puede usarla ley de Lambert- Beer, esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción, que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción específico (εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas. La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan de: 1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos. Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando,



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de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta. (Ver figura 4) (Abril, Bárcena, Fernández, Galván, Jorrín, Peinado, Meléndez &Túnez).

Figura 7. Funcionamiento de espectrofotómetro

Turbidimetría: La turbidimetría es un campo analítico relacionado con la colorimetría, tanto en el aspecto teórico como experimental. La turbidimetría determina la cantidad de luz no dispersada, el fundamento de esta técnica es la dispersión de la luz por partículas no transparentes suspendidas en un líquido, como por ejemplo, precipitado y suspensiones coloidales. Cuando se utiliza esta técnica con fines cualitativos se suelen construir curvas de calibrado con muestras de concentraciones conocida. Estas muestras (precipitados o suspensiones) deben prepararse bajo condiciones rigurosamente controladas ya que la cantidad de luz dispersada depende no solo de la concentración sino también del tamaño y número de partículas implicadas. Para que la luz dispersada pueda utilizarse comparativamente es necesario que tanto el número de partículas como su tamaño sean del mismo orden. Además, la longitud de onda de luz que es dispersada más eficazmente depende también del tamaño de las partículas. Bajo condiciones controladas, se puede lograr que el tamaño de partícula en la suspensión sea reproducible y en consecuencia que esta técnica sea de aplicación analítica. Las aplicaciones de la turbidimetría son muy variadas, algunos sistemas son turbios al llegar al laboratorio analítico, como en el análisis de los materiales



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de suspensión en las aguas. En la industria se utiliza en la medición de la transparencia de bebidas y productos farmacéuticos. (Merino, 1996) MATERIALES • Micropipeta de 1000µL • Micropipeta de 200µL • Micropipeta de 100µL • Baño termostático • Vórtex. • Espectrofotómetro • Baño de hielo

• Tubos tapa rosca • Gradillas • Balones volumétricos de 100 ml • Glucosa • DNS • Solución madre de levadura

PROCEDIMIENTO Elaboración de la curva estándar de glucosa • Preparar una solución madre de glucosa a 1g/L en un balón de 100 ml. • Hacer las siguientes diluciones en tubos de ensayo usando las micropipetas

Solución Concentración

(g/L)

Volumen de solución madre

(µL)

Volumen de agua destilada (µL)

Blanco 0 0 1000 1 0,125 125 875 2 0,25 250 750 3 0,5 500 500 4 0,75 750 250 5 1 1000 0

• Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 1000 µL de DNS, incluyendo al blanco. • Tapar cada tubo para evitar pérdidas de muestra por evaporación. • En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones, guardar todos los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar. • Llevar todas las soluciones al baño termostático a una temperatura de 80-90°C durante 5 minutos.



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• Pasados los 5 minutos exactos, llevar las soluciones a un baño de hielo durante 5 minutos o hasta el momento que se vaya a realizar las lecturas de las absorbancias. • Leer las absorbancias de las soluciones a 540 nm. • Realizar una curva de calibración de concentración de glucosa en g/L versus absorbancia. • Hacer un ajuste lineal de los datos

Cuantificación de biomasa por el método del peso seco • A partir de la solución madre de levadura, adicionar los siguientes volúmenes en balones volumétricos aforados de 25 ml

Solución Volumen de solución madre (mL) 1 20 2 16 3 12 4 8 5 4

• Secar los filtros en estufa por 10 minutos a 90-100 °C. • Dejar enfriar. • Pesar en balanza analítica (usar siempre la misma). • Filtrar 15 ml de la solución preparada. • Llevar a estufa el filtro durante 30 minutos. • Enfriaren desecador. • Pesar nuevamente el filtro. • Determinar la concentración en g/L. • Tomar una muestra de 1 ml de solución y depositarla en una celda. • Leer absorbancia en el espectrofotómetro a 600 nm. • Hacer una curva de calibración de absorbancia versus concentración de levadura (g/L).

Nota: • Recuerde que las soluciones deben estar homogéneas en los momentos de hacer diluciones y hacer las lecturas de absorbancias. • Los filtros nunca deben ser tocados directamente, use siempre pinzas dispuestas en el laboratorio.



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10. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

OBJETIVOS • Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentación batch realizada por levadura Sacharomyces cerevisiae. • Estudiar la cinética de crecimiento de un cultivo batch con células libres. • Determinar los parámetros cinéticos del modelo de Monod (Ks y µmáx.).

MARCO TEÓRICO La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular (Medios de fermentación). La variedad de materias primas usadas en la manufactura de etanol vía fermentación son clasificadas en tres tipos: azúcares, almidones y materiales celulósicos. Los azúcares (de caña de azúcar, remolacha de azúcar, melazas y frutas) pueden ser convertidos a etanol directamente. La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la celda. La glucosa se degrada en un ácido pyruvic. Este ácido pyruvic se convierte luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan,



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cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es: la levadura común o la Sacharomyces cerevisiae (Fermentación alcohólica). En la actualidad, ha surgido un interés creciente en la inmovilización de células para la producción de alcohol, debido principalmente a las numerosas ventajas que ofrece. La inmovilización celular permite el aumento en la productividad, la factibilidad del proceso en continuo, la estabilidad celular y los bajos costos en recuperación y reciclo en los procesos de separación. Sin embargo, su implementación en los procesos industriales es aun limitada y su aplicación dependerá de los futuros desarrollos en los procedimientos de inmovilización que puedan ser fácilmente escalables (Franco & Muñoz). Existen factores tanto físicos como químicos que inciden positivo o negativamente en el transcurso de la fermentación alcohólica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la fermentación. Los más relevantes son los siguientes: La temperatura, a mayor temperatura la fermentación transcurre en menor tiempo, sin embargo es menos pura, se produce menos etanol y más cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30 °C tienen su temperatura óptima de desarrollo. Por encina de 35 °C la actividad disminuye rápidamente y mueren antes de los 45°C. Oxígeno, aunque la fermentación es un proceso anaerobio, las levaduras mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxígeno disuelto en el mosto. Nutrientes, Los azúcares son fuente de energía para las levaduras. PROCEDIMIENTO • Preparación de inoculo.

Activar la levadura en, incubándola en el siguiente medio de cultivo Reactivo Cantidad (g/L)

Glucosa 60 MgSO4.7H2O 1 KH2PO4 2 (NH4)2 SO4 3 Extracto de levadura 4 Peptona universal 3,6

A las siguientes condiciones: 30°C y 150 rpm durante 24 horas. • Medio de cultivo para realización de las fermentaciones

Para las fermentaciones se emplea la siguiente composición para el medio de cultivo



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Reactivo Cantidad (g/L)

Glucosa X MgSO4.7H2O 1 KH2PO4 2 (NH4)2 SO4 3 Extracto de levadura 4 Peptona universal 3,6

Donde X es la concentración de glucosa en el medio, la cual puede ser 90, 60 o 30 g/L, según corresponda. El pH del medio se ajusta a 5 y se esteriliza por 15 minutos a 15Psi y 121°C. • Montaje para seguimiento de biomasa y consumo de sustrato

Montaje en batch en erlenmeyers de 500ml, con un volumen de fermentación de 300 mL, se adicionan 270 mL de medio de cultivo y 30 mL levadura, libre de glucosa. Se hacen tres montajes cada uno con una concentración diferente. • Montaje para la determinación de etanol.

La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO2 liberado durante la fermentación, apoyados en la relación estequiométrica:

La determinación de etanol se realizara en erlenmeyers de 100 mL con un volumen de fermentación de 60 mL, se adiciona 54 mL de medio de cultivo y 6 mL de biomasa, libre de glucosa. Al igual que para la determinación de biomasa y consumo de sustrato se realizan tres montajes con diferentes concentraciones. La diferencia del montaje para la determinación con respecto al montaje para la determinación de biomasa y consumo de sustrato es que este montaje lleva un fermentómetro (ver figura 5 y 6)



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Figura 8. Fermentómetro

Figura 9. Montaje con fermentómetro

Mediante la relación estequiométrica de la reacción de fermentación se sabe que por cada mol de dióxido de carbono que se libera, se produce una mol de etanol; lo que permite determinar la cantidad de etanol equivalente (g/L), conociendo el volumen de líquido en el interior del reactor, así:

Donde Es la concentración de etanol equivalente en el reactor en g/L. Cantidad de dióxido de carbono liberado en gramos.

Volumen del líquido en el reactor en litros. • Toma de muestra de los montajes en batch

Se debe tomar muestra cada dos horas, en los cuales se realizará el siguiente procedimiento: 1. Tomar el cultivo del agitador y llevarlo a la cámara de flujo laminar. 2. Tomar dos muestras de 1 ml cada una con micro pipeta en epperndorf de 2mL. 3. Centrifugar 1 muestra (10000 rpm por 5 min)



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• Cuantificación de Biomasa:

1. Tome la muestra que no fue centrifugada. 2. Medir absorbancia a 600 nm para determinar concentración de biomasa. • Cuantificación de Glucosa:

1. Trasvase el sobrenadante de la muestra que fue centrifugada. 2. Cuantificar azucares reductores (ATR) por el método de DNS. • Cuantificación de Etanol indirecto:

1. Al montaje del fermentómetro se le registra el peso, con el fin de determinar la cantidad de CO2 producido.



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11. DEGRADACIÓN DE COLORANTES UTILIZANDO HONGOS DE LA PUDRICIÓN BLANCA DE LA MADERA.

OBJETIVO • Evaluar el porcentaje de degradación de los colorantes azul índigo y Orange II, colorantes patrón e industriales en medio sólido y líquido, empleando algunos hongos de pudrición blanca de la madera.

MARCO TEÓRICO La lignina es un biopolímero aromático complejo; es el segundo polímero en abundancia después de la celulosa, constituye cerca del 15% de la biomasa terrestre y su fuente natural es la madera, donde se encuentra en una proporción del 20 al 35%. Solamente un pequeño número de microorganismos son responsables de la biodegradación de la lignina, de los cuales los hongos de la podredumbre blanca constituyen el grupo más importante, gracias a que producen unas enzimas ligninolíticas extracelulares, lignino peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa (MnP), que tienen una potente capacidad oxidante. En la degradación enzimática de la lignina intervienen una serie de reacciones inespecíficas que originan la formación de radicales libres en el biopolímero y dan como resultado la desestabilización de los enlaces y finalmente la ruptura de la macromolécula. Los hongos de la podredumbre blanca de la madera, también llamados hongos ligninolíticos, así como sus enzimas ligninolíticas, tienen potencial aplicación en la industria del papel, principalmente en el proceso de deslignificación durante el blanqueo, y en biorremediación de suelos y aguas contaminadas, porque la baja especificidad de estas enzimas les permite oxidar, además de la lignina, una amplia variedad de compuestos orgánicos contaminantes como tintes, hidrocarburos poliaromáticos, pentaclorofenol, etc. Algunos de los factores más importantes que se deben tener en cuenta en las tecnologías de biorremediación de suelos contaminados con hongos ligninolíticos, son: alcanzar una abundante colonización del suelo, mantener su crecimiento por un periodo prolongado de tiempo y favorecer la producción de enzimas ligninolíticas. Además, que su desarrollo no sea impedido por la microflora antagonista predominante.



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En biorremediación de suelos, los hongos ligninolíticos normalmente son aplicados en forma de micelio crecido sobre viruta de madera, paja de trigo, carozo de maíz, o algún otro material lignocelulósico similar. Esta forma de inoculación permite obtener una abundante colonización del suelo, sostener su crecimiento por un periodo prolongado de tiempo dado su aporte de carbono y favorecer la producción de enzimas ligninolíticas, puesto que con estos materiales se tiende a simular su nicho ecológico natural (Feijoo, Lema & Quintero. 2006). Los hongos de la PB, secretan una o más de las tres enzimas extracelulares oxidativas esenciales en la mineralización de lignina: la lignina peroxidasa, que por síntesis endógena de H2O2, oxida veratril alcohol, a la vez oxida compuestos aromáticos no fenólicos, en la reacción se generan radicales arilo y alquilo que se anabolizan intracelularmente; la manganeso peroxidasa, que oxida componentes fenólicos de la lignina, mediante la reacción de oxidación del Mn2+ a Mn3+, la cual es dependiente del H2O2, y la Lacasa, una fenol oxidasa con cobre, que oxida anillos de la lignina (Pérez et al.,2002). El patrón de actividad de estas enzimas es específico del género y especie de hongo de la PB involucrado, algunos excretan la LiP, la MnP y no la Lacasa o la MnP, la Lacasa y no la LiP; existen otras enzimas que están indirectamente asociadas con la mineralización de lignina: como la glioxal oxidasa y la superóxido dismutasa que sintetiza H2O2 necesario, para la actividad de la LiP y la MnP; mientras otras enzimas fúngicas funcionan como enlace entre las rutas de mineralización de la lignocelulosa, como: la glucosa oxidasa, la aril alcohol oxidaba, la celobiosa quinona oxidorreductasa y la celobiosa deshidrogenasa (Pointing, 2001). La síntesis fúngica de la LiP y la MnP se realiza bajo una alta tensión de oxígeno, se reprime en agitación o cuando los hongos de la PB, se cultivan en medio líquido, sin embargo la Lacasa se sintetiza sólo en agitación, estas tres enzimas son inespecíficas y se inducen en condición limitante de nutrientes, como la fuente de nitrógeno, (Christian, Shrivastava, Shukla, Modi & Vyas. 2005.), este complejo enzimático inespecífico fúngico extracelular, tiene potencial en la eliminación de xenobióticos con estructura química similar a la lignina tales como: aromáticos, nitroaromáticos, aromáticos policíclicos, herbicidas, pesticidas, detergentes clorofenoles y colorantes (Pointing, 2001). Los hongos ligninolíticos sintetizan un sistema enzimático extracelular muy particular y no específico. El mecanismo de estos sistemas responsables de degradar la lignina está basado en la formación de radicales libres, lo cual hace que estas enzimas sean activas catalíticamente sobre una gran diversidad de sustratos orgánicos. Debido a esto, los hongos ligninolíticos poseen un uso potencial muy atractivo en la biorremediación de ambientes contaminados con mezclas complejas de contaminantes peligrosos. Estos hongos tienen la capacidad de mineralizar completamente a CO2 los contaminantes muy recalcitrantes, como los bifenilos policlorados, los explosivos aromáticos, los hidrocarburos policíclico



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aromáticos, los plaguicidas clorados y organofosforados. Asimismo, pueden decolorar efluentes contaminados con colorantes de origen industrial. Todo esto resalta la versatilidad de los sistemas enzimáticos de los hongos ligninolíticos, ya que son enzimas de poca especificidad que pueden reconocer sustratos con estructuras moleculares muy diversas. En la literatura pueden encontrarse muchos ejemplos de tratamientos de contaminantes por medio del uso de hongos degradadores de lignina o sus sistemas enzimáticos. Se ha demostrado la oxidación de efluentes derivados del blanqueo del papel con Phanerochaete chrysosporium, cuya manganeso peroxidasa es la enzima responsable. De la misma manera, las lacasas de Trametes versicolor se han identificado como enzimas muy eficientes en la decoloración de estos efluentes. Las peroxidasas dependientes de manganeso obtenidas de Bjerkandera adusta y de Pleurotus eryngii, así como las isoenzimas de lacasas de Coriolopsis gallica, han sido utilizadas en la degradación de colorantes sintéticos tipo azo, o de diversos colorantes industriales. Por otro lado, se ha observado la mineralización de 2,4-diclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, guayacoles policlorados, diversas vainillinas policloradas y pentaclorofenol por el hongo P. chrysoporium, pero también se ha observado que los fenoles policlorados son sustratos de las peroxidasas extracelulares de este hongo, como la lignino peroxidasa y la manganeso peroxidasa. La lignino peroxidasa y la manganeso peroxidasa de P. chrysoporium así como la cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago son enzimas capaces de catalizar la deshalogenación en la posición 4 del anillo aromático del pentaclorofenol. Debido a que esta deshalogenación da lugar a la quinona, este proceso se denomina deshalogenación oxidativa, obteniéndose la tetraclorobenzoquinona como producto final. La combinación de la acción de estas enzimas con el sistema intracelular reductor en P. chrysoporium ha permitido la deshalogenación completa del pentaclorofenol (Tinoco & Vásquez). La industria textil es una de las que genera mayor cantidad de aguas residuales en sus procesos; los valores típicos se encuentran alrededor de 80-200 m3 de efluentes líquidos residuales generados por tonelada de producto. Estos efluentes contienen altas concentraciones de sólidos disueltos, sodio, cloro, sulfatos y tintes recalcitrantes y cancerígenos, estos últimos pueden alcanzar valores de hasta 400 mg/L. Cerca del 15% de los colorantes empleados en la industria textil se pierden en el proceso de teñido, los cuales en la mayoría de los casos son vertidos en cuerpos de agua generando contaminación. Estas aguas residuales son difíciles de tratar debido a que los tintes contienen estructuras moleculares aromáticas complejas, que los hacen estables en el ambiente y difíciles de degradar. Se han empleado diferentes procesos físicos y químicos para eliminar o remover la carga colorante en los efluentes industriales, sin embargo se presentan inconvenientes entre ellos: i) altos costos de tratamiento, ii) los contaminantes químicos no son destruidos sino simplemente removidos de los efluentes y relocalizados en otro sitio donde el problema persiste, iii) en procesos donde se utiliza el cloro para la decoloración, se puede



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producir compuestos órganoclorados que son altamente tóxicos y recalcitrantes, iv) en ciertos tratamientos químicos se produce ruptura del anillo aromático del colorante generando sustancias aun más tóxicas. Actualmente los procesos biotecnológicos para la eliminación de contaminantes ambientales están en pleno proceso de investigación y son muy promisorios gracias a que se pueden alcanzar altas eficiencias de remoción de contaminantes, además poseen un costo competitivo respecto a tratamientos físico-químicos equivalentes y son amigables con el medio ambiente. Se ha realizado un importante número de investigaciones sobre la decoloración de colorantes sintéticos para uso no industrial y en menor proporción se observan trabajos con colorantes industriales. Los colorantes sintéticos no industriales se emplean principalmente como indicadores de cambios ambientales, por ejemplo: pH, redox, presencia de oxígeno, etc., y se han empleado como modelos para evaluar el potencial del sistema ligninolítico de los hongos de la pudrición blanca de la madera frente a otros colorantes con la misma estructura química. En estudios de degradación de colorantes industriales o hidrocarburos poliaromáticos entre otros, la degradación de este tipo de colorantes se realiza principalmente como control de la presencia o no de actividad ligninolítica (Cardona, Osorio & Quintero. 2009). MATERIALES • Cajas Petri con hongos de pudrición blanca colonizados en medio Kimura. • Erlenmeyers 250 mL. • Colorantes.

PROCEDIMIENTO Medio de mantenimiento

Reactivo Medio sólido (g/L) Medio líquido (g/L) Glucosa 20 20 Peptona universal 5 5 Extracto de levadura 2 2 KH2PO4 1 1 MgSO4.7H2O 0.5 0.5 Agar 15 No pH 5.5 5.5

Cepas de hongos de pudrición blanca • Bjerkandera sp. Anamorfo.



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• A. Discolor. • Peurutus Eryngii. • Lentinus Tigrinus

Colorantes Colorante Concentraciones (ppm)

Orange II 100 200

Azul índigo 100 200

Determinación de la capacidad de decoloración • Medio sólido Cada caja Petri contiene aproximadamente 20 ml de medio de cultivo Kimura estéril .más el colorante a la concentración correspondiente. Sembrar el hongo que corresponde, transfiriendo un trozo circular de agar colonizado. Incubar por 15 días a 30ºC en estático. Medir la velocidad de crecimiento y de decoloración, midiendo en cada caja Petri el crecimiento radial y el halo de decoloración • Medio líquido Los colorantes se adicionaran individualmente en cada erlenmeyer de 250 mL que contienen 100 mL de medio de cultivo estéril. Los experimentos se llevaran a cabo en un shaker a 175 rpm en un tiempo de 7 a 14 días a 33ºC. La concentración del colorante será medida tomando muestras de 1 ml y leyendo su absorbancia en tiempos periódicos. Antes de medir la absorbancia, se debe centrifugar durante 5 minutos la muestra a 8000 rpm, con el fin de obtener el sobrenadante libre de biomasa. Calcular el porcentaje de decoloración.

La lectura de la absorbancia se realizara a las siguientes longitudes de onda: Orange II a 485 nm. Azul índigo a 598 nm. Para la conversión de la absorbancia se requiere de las curvas de calibración de cada uno de los colorantes (Absorbancia versus concentración).



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12. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS DE ORIGEN VEGETAL. EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.

A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Las enzimas son un ejemplo de que no sólo es importante lo que comemos sino que además es indispensable tener una buena capacidad de absorber esos nutrientes. OBJETIVOS • Determinar experimentalmente la actividad de un extracto enzimático de origen vegetal que contiene polifeniloxidasa (PFO). • Evaluar el efecto que ejerce un inhibidor sobre la actividad enzimática. • Determinar los parámetros cinéticos para la reacción con y sin inhibidor. • Determinar qué tipo de inhibidor es el ácido cítrico. MARCO TEÓRICO Inhibidores El efecto de un inhibidor es disminuir o bloquear la velocidad de una reacción catalizada uniéndose al enzima. La mayor parte de los enzimas están afectados. Son específicos, cualquier sustancia no sirve para unir cualquier enzima. Se alteran grupos importantes para la función catalítica o se altera ligeramente la conformación (con lo que la proteína ya no es activa) sin llegar a desnaturalizarlo. Los inhibidores sirven para distinguir los grupos esenciales. En la inhibición acompetitiva, el inhibidor sólo se une al complejo enzima - sustrato, que ya no formará producto, por lo que la velocidad bajará. El inhibidor no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformación y el enzima ya no es tan efectivo. En la inhibición mixta, intermedia entre acompetitiva y competitiva. El inhibidor (que no tiene porqué parecerse al sustrato) no se une al centro activo aunque tiene efecto de



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competitivo. La unión de uno y otro no son excluyentes. El resultado final depende de cuál de los dos prevalezca. Inhibición no competitiva: En este caso da igual unirse al enzima que al complejo enzima - sustrato, aunque no se transformará igual de bien porque la velocidad es diferente. Cuanto más se parezca el inhibidor al estado de transición del sustrato más eficaz será el inhibidor. Son inhibidores muy potentes de la actividad catalítica del enzima (Inhibidores) Enzima polifenoloxidasa La polifenoloxidasa, es una de las enzimas más estudiadas en la industria de los alimentos ya que es la responsable de las reacciones de pardeamiento enzimático en frutas y verduras. Una de las razones por las cuales es importante su estudio es porque comercialmente es indeseable, ya que modifica las propiedades sensoriales, nutricionales y en general de calidad que perjudica la comercialización de un producto. El banano que pertenece al género Musa, con sus innumerables variedades, es una fruta tropical de importancia comercial que sufre cambios en su textura, color a través del proceso de maduración. Los cambios asociados a la maduración como bioquímicas, fisiológicos y de composición y el ablandamiento de los plátanos se han estudiado y reportado ampliamente durante las distintas fases de desarrollo en las cuales la polifenoloxidasa cumple un papel importante (Guerrero, 2009). Alfa metildopa La metildopa o alfa metildopa es un fármaco simpaticolítico (actúa inhibiendo el sistema simpático) que se emplea en el tratamiento de la hipertensión arterial (Metildopa). La metildopa es un aminoácido aromático inhibidor de la descarboxilasa en el hombre y en animales. Aunque el mecanismo de acción aún no ha sido demostrado concluyentemente, el efecto antihipertensivo de la metildopa probablemente se debe a su transformación en alfa-metilnorepinefrina, la cual disminuye la presión arterial por estimulación de receptores centrales alfa-adrenérgicos inhibitorios y/o por reducción de la renina plasmática. La metildopa ha demostrado causar una reducción neta en la concentración tisular de serotonina, dopamina, norepinefrina y epinefrina (Metildopa). MATERIALES • Solución buffer de fosfato con pH 6.2. • Un banano (criollo) o manzana.

• Pastillas de Alfa metildopa (sustrato).



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• Ácido Cítrico (inhibidor) 7.5% (p/v). • Baño de hielo.

• Falcón. • Centrífuga. • Espectrofotómetro.

PROCEDIMIENTO

1. Extracción de la enzima

Se pesan entre 10 y 15 gramos de la fruta (banano o manzana), se colocan en un mortero pre-enfriado y se agregan 15 ml de solución de buffer de fosfato a pH= 6.2. Se tritura el material en el mortero. Se filtra el extracto y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos. La solución sobrenadante se decanta, se conserva en un baño de hielo y se rotula como extracto enzimático.

2. Preparación del sustrato

Tomar una pastilla de alfa metildopa y diluirla en 100 mL de buffer fosfato pH: 6.2. Esto corresponde a la solución madre.

Diluciones de sustrato

Grupo Volumen de solución madre de sustrato (ml)

Volumen de Tampón (ml)

1 5 0 2 4.5 0.5 3 4 1 4 3.5 1.5 5 3 2

3. Medida de la actividad enzimática

Calibre el espectrofotómetro en absorbancia λ= 420 nm y prepare las siguientes soluciones en tubos de ensayo.

Blanco Muestra Muestra + Inhibidor

Buffer pH = 6.2 1.5 ml 1.4 ml 1.2 ml Alfa metildopa 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml



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Calibrar el cero Inhibidor ----------- ---------- 0.2 ml Extracto enzimático ----------- 0.1 ml 0.1 ml

Inmediatamente después de agregar el extracto enzimático, lea la absorbancia en el espectrofotómetro (dejar la tapa abierta) y empiece a contar el tiempo a partir de cero. Repita la lectura de absorbancia cada 30 segundos hasta completar 5 minutos.

Para la determinación de la actividad enzimática se aplica la siguiente relación:

PREGUNTAS

I.Grafique absorbancia vs. Tiempo para la reacción con inhibidor y sin inhibidor. II.Grafique concentración de sustrato vs velocidad de reacción

III.¿Qué efecto tiene el inhibidor sobre la velocidad de reacción? IV.Discuta sobre el beneficio o las aplicaciones de los inhibidores.



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13. ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LA Α-AMILASA Y VARIABLES QUE LA AFECTAN

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Las enzimas son un ejemplo de que no sólo es importante lo que comemos sino que además es indispensable una buena capacidad de absorber esos nutrientes. OBJETIVOS • Experimentar sobre diferentes aspectos de la actividad enzimática. • Comprender la forma como diversos factores influyen sobre la actividad catalítica de las enzimas. • Evaluar la dependencia que puede presentar una reacción enzimática con respecto a la acidez del medio y a la temperatura. MARCO TEÓRICO Constituye la forma más generalizada, aunque no la única, de reserva energética en vegetales. Se almacena en forma de gránulos, y puede llegar a constituir hasta el 70% del peso de granos (maíz y trigo) o de tubérculos (patata). El análisis minucioso de la estructura del almidón demuestra que es una mezcla de otros dos polisacáridos: la amilosa y la amilopectina. La proporción de ambos polisacáridos varía según la procedencia del almidón, pero por lo general, la amilopectina es la más abundante.



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Los almidones constituyen la principal fuente de nutrición glicídica para la humanidad. El almidón puede ser degradado por muchas enzimas. En los mamíferos, estas enzimas se llaman amilasas, y se producen sobre todo en las glándulas salivares y en el páncreas. La amilosa es un polímero lineal formado por unidades de α -D-glucopiranosa, unidas exclusivamente por enlaces (1α-4). El número de monómeros de la molécula depende de la procedencia del almidón: alrededor de 1000 en el caso de la papa y 4000 en el caso del trigo. La amilosa se disuelve fácilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hélice comprende 6 unidades de glucosa. La amilopectina tiene un peso molecular mucho mayor que la amilosa y puede contener cientos de miles o millones de monómeros de α -D-glucopiranosa. Es un polímero ramificado, en el que las cadenas principales están formadas por mosacáridos unidos mediante enlaces glucosídicos (1α -4) y donde cada rama se une a la cadena principal mediante enlaces glucosídicos (1α -6). Estas ramificaciones están regularmente espaciadas (cada 25-30 residuos de glucosa) y cada rama contiene únicamente uniones (1α -4) (Almidón). Termamyl 120L es un producto enzimático líquido que contiene α -amilasa sobresaliente termoestable expresada en y producida mediante una cepa genéticamente modificada de Bacilluslicheniformis. Se utiliza en las industrias de: • Almidón: Licuefacción continúa del almidón en cocedores a presión o en equipos que operan a similar temperatura. • Alcohol: Adelgazamiento del almidón en los macerados de la destilación. • Cervecería: Licuefacción del almidón. • Azúcar: Rompimiento del almidón presente en el jugo de caña. Por lo que el contenido de almidón en el azúcar crudo se reduce y la filtración en la refinería se facilita. La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4α-glucosídicas de la amilosa y amilopectina. Por lo que el almidón se rompe rápidamente en dextrinas solubles y oligosacáridos (Termamyl 120L). Los pasos para transformar el almidón en jarabe glucosado son dos: licuefacción, y sacarificación. Durante el proceso de licuefacción se obtienen malto dextrinas empleando la enzima alfa amilasa. Estas malto dextrinas contienen diferentes oligosacáridos y dextrinas y es ligeramente dulce. Luego se puede continuar la conversión a glucosa usando la enzima amiloglucosidasa conocida también como glucoamilasa. Esta última etapa se conoce como sacarificación, donde la amiloglucosidasa puede transformar las malto dextrinas casi completamente en glucosa; en la práctica se produce también un poco de maltosa (Cruz, 2012).



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MATERIALES Almidón soluble. DNS Lugol Soluciones Buffer 0.1 M Citrato con pH:3.5 Fosfato con pH:6.3 Fosfato con pH:9 PROCEDIMIENTO 1. Preparar las siguientes soluciones: 25 ml de Almidón al 0.5% m/v en buffer citrato pH 3.5 25 ml de Almidón al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 9 50 ml de Almidón al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 6.3 50 ml de enzima diluida 1:150 (Preparada por el monitor) 2. Evaluación del cambio del pH sobre la actividad de la enzima amilasa Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2,5 mL de la solución de almidón, de acuerdo a la siguiente tabla:

Número de tubo pH 1 3,5 2 6,3 3 9 4 3,5 5 6,3 6 9

Llevar los tubos de ensayo por 3 minutos a baño de 90oC para temperar. Agregar a los tubos a los tres primeros tubos 0.5 mL de la enzima diluida, agitar y dejar los 6 tubos en el baño de 90oC por 30 minutos. Agregar 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos, para parar la reacción. Tomar 0,5 mL de todos los tubos y agregar 30µL de lugol. Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio. Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.



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Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6. 3. Evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa. Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2.5ml de la solución de almidón de pH 6.3. Temperar cada uno de los tubos por 3 minutos así:

Número de tubo °C 1 25 2 60 3 90 4 25 5 60 6 90

Agregar 0.5ml de la enzima diluida a los tubos tres primeros tubos. Agitar y llevar los 6 tubos nuevamente a la temperatura correspondiente por 30 minutos. Parar la reacción agregando 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos. Tomar 0,5 mL de todos los tubos y agregar 30µL de lugol. Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio. Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores. Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.

Nota: La actividad enzimática será reportada como µmol de azucares formados por litro de solución por minuto por cantidad de enzima. Procedimiento para determinar el porcentaje de azúcares reductores utilizando DNS a. Tomar 1 ml de solución problema. b. Adicionar 1 ml de reactivo DNS. c. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en baño a ebullición por 5 minutos. d. Pasar los tubos a un baño de hielo, dejarlo por 5 minutos. e. Leer Absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.

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Manual de Estudiantes Biologia Para Ingenieros_2014ii