Manual Bioquimica II

Laboratorio de Bioqumica II

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

Instituto de Ciencias Biomdicas

Laboratorio

de

Bioqumica II


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N D I C E Toma de muestras....... 3

Preparacin antes del procedimiento. 4

Puncin arterial... 4

Carbohidratos... 6

Metabolismo. 9

Gluclisis.. 10

Fermentacin 10

Ciclo del cido Ctrico. 10

Cadena de transporte electrnico... 11

Cadena respiratoria. 12

Identificacin de Carbohidratos..... 12

Identificacin de Carbohidratos por Cromatografa en Capa Fina.......... 15

Produccin de Piruvato y Acetaldehdo durante la fermentacin de la

Glucosa.

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Pruebas para Sacarosa 21

Preparacin de Osazonas 23

Determinacin de Glucosa en sangre. 26

Curva de Tolerancia a la Glucosa.. 27

Induccin y represin Hormonal en el metabolismo de los

Carbohidratos..

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Lpidos.. 34

cidos Grasos.. 34

Propiedades de los cidos Grasos.. 35

Funcin de los cidos Grasos. 35

Extraccin de Lpidos 37

Determinacin de Colesterol srico 38

Metabolismo Protico.. 41

Determinacin de Urea y Creatinina..... 43

Determinacin de Protenas Sricas y Albmina.. 46

Determinacin de cido rico... 49

Anexos.. 52


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T O M A D E M U E S T R A S Forma en que se realiza el examen.

Se extrae la sangre de una vena (venopuncin), a menudo una vena de la parte interior del codo o la parte posterior de la mano. Se limpia el sitio de la puncin con un antisptico y se coloca un torniquete (una banda elstica) o un esfigmomanmetro alrededor del antebrazo para aplicar presin y limitar el flujo sanguneo a travs de la vena, lo cual hace que las venas debajo del torniquete se dilaten (se llenen de sangre). Luego se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermtico o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira el torniquete para restablecer la circulacin. Una vez que se ha recolectado la sangre, se retira la aguja y se cubre el punto de puncin para detener cualquier sangrado. Preparacin para el examen.

La preparacin puede estar sujeta a variaciones, dependiendo de la prueba especfica y muchas de ellas no requieren de una preparacin especfica. Es posible que se deba limitar la administracin de ciertos medicamentos un poco antes de la prueba o suspender el consumo de alimentos la noche (ltima ingesta a 8 pm) anterior para asegurar resultados exactos. Bebs y nios:

La preparacin tanto fsica como sicolgica que se puede ofrecer para cualquier prueba o procedimiento mdico depende de la edad del nio, sus intereses, la experiencia anterior, y el nivel de confianza. Para obtener mayor informacin, se recomienda leer las siguientes pautas:

Es la preparacin apropiada para un examen o procedimiento que puede reducir la ansiedad del nio, estimular su cooperacin y ayudarlo a desarrollar habilidades para hacer frente a la situacin.


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Las investigaciones han demostrado que las intervenciones de preparacin son efectivas para reducir algunos signos de angustia en los nios como llorar o resistirse al procedimiento; lo cual ha llevado a otros hallazgos que sugieren que cuando los nios estn preparados, presentan menos dolor y exhiben menos signos sicolgicos mostrando menos angustia. PREPARACIN ANTES DEL PROCEDIMIENTO

Dado el nivel de desarrollo del nio (de 0 a 1 ao), ser beneficioso hacer una pequea preparacin antes del examen, pero algunas consideraciones pueden aliviar la ansiedad de los padres.

Sin importar el tipo de examen o procedimiento, el beb probablemente llorar como respuesta normal al ambiente extrao, a las personas que no le son familiares, a la inmovilizacin y a la separacin de sus padres. El beb puede llorar ms por estas razones que por la misma incomodidad del examen o procedimiento. Saber esto desde el principio, al igual que tener informacin especfica sobre el examen, puede ayudar a disminuir la ansiedad que siente un padre en cuanto a lo que va a ocurrir. Por qu la inmolizacin?

Al beb se lo puede inmovilizar con las manos o con dispositivos fsicos. A los bebs les falta control fsico, coordinacin y capacidad para seguir instrucciones que los nios mayores y los adultos normalmente poseen. Se puede usar la inmovilizacin durante un procedimiento o en otras situaciones para garantizar la seguridad del beb.

Si se efecta una venopuncin para obtener una muestra de sangre o empezar un IV, la inmovilizacin es necesaria, ya que si el nio se mueve mientras le estn insertando la aguja, la lesin puede lastimar el sistema venoso, algn hueso, tejido o nervios.

La mayora de los exmenes y procedimientos requieren de una precisin extrema para obtener los resultados deseados, ya sea para colocar un IV correctamente, asegurarse de los resultados exactos de un examen o evitar lesiones al beb. PUNCIN ARTERIAL Forma en que se realiza el examen:

Generalmente, la sangre se extrae de la mueca, aunque tambin puede extraerse de la parte interior del codo, la ingle u otra arteria. Los latidos cardacos (pulso) se sienten ejerciendo presin en el rea sobre una arteria. Se limpia el rea con un antisptico y se puede inyectar o aplicar una pequea cantidad de anestsico antes de insertar la aguja. La sangre debe fluir fcilmente dentro de la jeringa especialmente preparada (heparinizada) y luego de obtener una muestra suficiente de sangre, se retira la aguja y se presiona el sitio de puncin durante un perodo de cinco a diez minutos para detener el sangrado. Finalmente, la persona se mantiene bajo observacin durante este tiempo para estar seguros de que el sangrado se detenga.


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La sangre est formada por diversos componentes:

Glbulos Rojos o Hemates- Son las clulas sanguneas ms numerosas y la hemoglobina que contienen es la responsable de su color rojo. Se forman en la mdula sea, que se halla dentro de los huesos del esqueleto, desde donde son liberados en el torrente sanguneo.

Su funcin es transportar el oxgeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del cuerpo para que las clulas respiren, y tambin eliminan los residuos producidos por la actividad celular (anhdrido carbnico).

Glbulos Blancos o Leucocitos- Son los encargados de proteger al organismo contra los diferentes tipos de microbios. Cuando hay una infeccin aumentan su nmero para mejorar las defensas. Unos se forman en la mdula sea y otros en el sistema linftico (bazo, ganglios, etc).

Plaquetas o trombocitos- Son las clulas sanguneas ms pequeas. Se producen tambin en la mdula sea y viven unos 6-7 das. Las plaquetas intervienen cuando se produce una rotura en alguna de las conducciones de la sangre. Se adhieren rpidamente al lugar de ruptura para que cese la hemorragia, dando tiempo a la formacin del cogulo definitivo.

El Plasma- Es un lquido compuesto de agua, protenas, sales minerales y otras sustancias necesarias para el funcionamiento normal del organismo y en donde se encuentran "nadando" las clulas sanguneas.

La Albmina- Es una protena que ayuda a mantener el agua del plasma en una proporcin equilibrada. Las Globulinas. Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las infecciones. Su disminucin acarrear una bajada de defensas. Factores de Coagulacin- Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La ausencia de algn factor de coagulacin puede ocasionar trastornos hemorrgicos ya que se dificulta la formacin del cogulo.

Otras protenas transportan sustancias necesarias para el normal funcionamiento de las clulas (grasas, azcares, minerales, etc).


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C A R B O H I D R A T O S

Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes de la biosfera y a su vez los ms diversos. Normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y tambin en los tejidos animales, como glucosa o glucgeno. Estos sirven como fuente de energa para todas las actividades celulares vitales.

Refirindonos a la Bioqumica elemental de los Hidratos de Carbono, podemos decir que son polihidroxicetonas o polihidroxialdehidos y sus derivados. Para los fines de estudio en nutricin solamente se tienen en cuenta aquellos con cuatro o ms tomos de carbono.

Estos compuestos son extremadamente polares y se unen entre s dando polmeros. Las funciones que cumple en el organismo son, energticas, de ahorro de protenas, regulan el metabolismo de las grasas y estructural.

Energticamente, los carbohidratos aportan 4 KCal (kilocaloras) por gramo de peso seco. Esto es, sin considerar el contenido de agua que pueda tener el alimento en el cual se encuentra el carbohidrato. Cubiertas las necesidades energticas, una pequea parte se almacena en el hgado y msculos como glucgeno (normalmente no ms de 0,5% del peso del individuo), el resto se transforma en grasas y se acumula en el organismo como tejido adiposo. Se recomienda que minimamente se efecte una ingesta diaria de 100 gramos de hidratos de carbono para mantener los procesos metablicos.

Ahorro de protenas: Si el aporte de carbohidratos es insuficiente, se

utilizarn las protenas para fines energticos, relegando su funcin plstica.

Regulacin del metabolismo de las grasas: En caso de ingestin deficiente de carbohidratos, las grasas se metabolizan anormalmente acumulndose en el organismo cuerpos cetnicos, que son productos intermedios de este metabolismo provocando as problemas.

Estructuralmente, los carbohidratos constituyen una porcin pequea del peso y

estructura del organismo, pero de cualquier manera, no debe excluirse esta funcin de la lista, por mnimo que sea su indispensable aporte. Los hidratos de carbono se clasifican en simples y complejos:

Los simples, son azcares de rpida absorcin y son energa rpida. Estos generan la inmediata secrecin de insulina. Se encuentran en los productos hechos o, con azcares refinados azcar, miel, mermeladas, jaleas, golosinas, leche, hortalizas y frutas etc. Algo para tener en cuenta es que los productos elaborados con azcares refinados aportan caloras y poco valor nutritivo, por lo que su consumo debe ser moderado.

Los complejos, son de absorcin ms lenta, y actan ms como energa de reserva por la anterior razn. Se encuentra en cereales, legumbres, harinas, pan, pastas. Segn el nmero de molculas que tengan los glcidos se los puede dividir en cuatro grandes grupos:


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Monosacridos que se subdividen Pentosas y Hexosas

Las pentosas:

Xilosa- Se encuentra como componente de la madera.

Ribosa- Constituyente de los cidos nucleicos.

Arabinosa- Forma parte de las gomas, muclagos y pectinas (de este grupo, estas son las

nicas que normalmente ingerimos dentro de mermeladas y dulces). Las hexosas: Son 24 pero, solamente tienen importancia biolgica cuatro: D-glucosa- aparece en los frutos maduros, sangre y tejidos animales. Esta constituye el

azcar del organismo, es muy soluble en agua, y es el carbohidrato que transporta la sangre y el que principalmente utilizan los tejidos. D-manosa- Siempre aparece combinado en la naturaleza. Nunca libre por tanto preferimos no enunciar ningn componente. D-galactosa- Aparece en lpidos complejos. El hgado puede convertirla en glucosa y despus en energa. D-fructosa- Se lo denomina azcar de frutas. Aparece libre en la miel y en los jugos de

frutas. Tiene un sabor muy dulce.

Representacin de una triosa, tetrosa, pentosa y una hexosa

Disacridos.- Los disacridos estn formados por la unin de dos monosacridos, que se

realiza de dos formas:

1.- Mediante enlace monocarbonlico, entre el C1 anomrico de un monosacrido y un C no anomrico de otro monosacrido, como se ve en las frmulas de la lactosa y maltosa .Estos disacridos conservan el carcter reductor.


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LACTOSA

MALTOSA

2.- Mediante enlace dicarbonlico, si se establece entre los dos carbonos anomricos de los dos monosacridos, con lo que el disacrido pierde su poder reductor, por ejemplo como ocurre en la sacarosa.

-Disacridos se subdividen en maltosa, lactosa y sacarosa

Maltosa- Aparece en la malta o cebada germinada y es muy soluble en agua.

Lactosa- Es el azcar de la leche y es poco soluble en agua.

Sacarosa- Es el azcar de mesa. Se obtiene de la caa de azcar y de la remolacha, y

como todos saben, es muy soluble en agua.

SACAROSA

Oligosacridos:

Trisacridos- La rafignosa se encuentra en legumbres.

Tetrasacridos- La esteaquiosa, el ms estudiado, se encuentra en las semillas de soja.


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Polisacridos:

Almidn- Este se encuentra en los vegetales en forma de granos, ya que son la reserva nutritiva de ellos. Aparecen en la papa, arroz, maz, y dems cereales.

Glucgeno- Se encuentra en los tejidos animales, donde desempea la funcin de

reserva nutritiva. Aparece en el hgado y en los msculos.

Celulosa- Cumple funciones estructurales en los vegetales.

Inulina- Aparece en los tubrculos de dalia, en alcauciles, ajos y cebollas.

Liquenina- Aparece en los musgos y lquenes.

Mucopolisacridos- Cumplen funcin de sostn, nutricin y comunicacin intercelular.

Inicialmente solamente se les dio un papel estructural y energtico, pero se han reconocido nuevas funciones celulares como decir que son combustibles o reservas energticas celulares

POLMEROS QUE FORMAN EL ALMIDN

AMILOSA

AMILOPECTINA

La celulosa est constituida por unidades de b-glucosa, y la peculiaridad del enlace b(beta) hace a la celulosa inatacable por las enzimas digestivas humanas, por ello, este polisacrido no tiene inters alimentario para el hombre.

METABOLISMO

El metabolismo de los compuestos de carbono proveen de los metabolitos bsicos para la biosntesis, la energa metablica necesaria y el poder reductor. Los carbohidratos


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que contienen glucosa son los ms utilizados como fuente de carbono y energa por los hongos, el metabolismo del carbono comienza por el catabolismo de la glucosa. Otras hexosas pueden convertirse en glucosa pero las pentosas necesitan una ruta glucoltica alternativa. Las fuentes de carbono como cidos grasos, aminocidos orgnicos y alcoholes entran a la va de la glucosa por diferentes puntos. Las fuentes de carbono que no son carbohidratos deben ser convertidos en glucosa por un proceso llamado gluconeognesis.

GLUCLISIS

Es la conversin de azcares a piruvato o a acetil-CoA. Existen 3 rutas para la gluclisis de las hexosas, la va de Embden-Meyerhof-Parnas (EM), la va de la hexosa monofosfato (HM) y la va de Entner-Doudoroff (ED). Todas contienen glucosa-6-fosfato. Hay dos vas para la gluclisis de las pentosas, la va del Xilitol (XP) que alimenta la va del HM y la va de la fosfocetolasa (PK).

Las vas EM, HM y XP son generales pero no universales para todos los hongos, la PK es ms eficiente en conversin de pentosas a unidades C2 para respiracin y fermentacin.

La interconversin de azcares por HM ocurre por una serie de reacciones enzimticas libremente reversibles.

FERMENTACIN

Es la regeneracin de NAD por transferencia de electrones de NADH a un aceptor orgnico de electrones. En los hongos este aceptor es piruvato. Es un proceso anaerbico y existen organismos fermentadores facultativos y obligados.

Son tres los principales tipos de fermentacin en los hongos, alcohlica, cido lctica y por una mezcla de fermentaciones. En Saccharomyces se han hecho la mayora de los estudios. La fermentacin de cido lctico, se lleva a cabo principalmente en Chytridiomycetes, Oomycetes y Zygomycetes. Rhizopus (Zygomycetes) realiza simultneamente fermentacin alcohlica y cido lctico.

La mezcla de fermentacin de cidos se presenta en un pequeo grupo de Chytridiomycetes, similar a la fermentacin de Enterobacteriaceae, con acetato, lactato, formato, etanol, metano, CO2 y H2 como productos finales.

CICLO DEL CIDO CTRICO

Ha sido demostrado un ciclo del cido ctrico en los hongos (junto con su actividad enzimtica). El ciclo funciona aceptando unidades acetil, derivados de piruvato, oxidacin de cidos grasos o de otras fuentes y las incorpora al cido ctrico para oxidarlas luego en


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un proceso gradual que da CO2 por resultado. En el proceso de oxidacin se reduce NAD, excepto en la transicin del succinato al fumarato. La coenzima A es el agente de transferencia que provee de las unidades acetil en el ciclo. El ciclo del glioxalato tiene un atajo en el ciclo del cido ctrico, ligando isocitrato, succinato y malato. Acetil-CoA es parte de este proceso. Las enzimas del ciclo del cido ctrico son parte de la mitocondria. Adems de oxidar sustratos, el ciclo provee de intermediarios importantes en la biosntesis (cido glutmico, cido asprtico), como resultado obtiene una deplecin de sus intermediarios (si estos no son repuestos, el ciclo se interrumpe). El ciclo del cido ctrico es uno de los ejes del catabolismo y anabolismo.

CADENA DE TRANSPORTE ELECTRNICO

Es el segundo proceso ms importante de la respiracin. En l, los tomos de hidrgeno son transferidos por una serie de pasos de oxidacin-reduccin hacia el oxigeno, con quien forman agua. Los electrones se toman en pares de los sustratos en el ciclo del cido ctrico y la gluclisis, y son transferidos como pares por la unidad ubiquinona. Los componentes de la cadena pueden ser aislados como subunidades estructurales.


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CADENA RESPIRATORIA

Es similar a la de los otros organismos aerobios, esta compuesta por 3 procesos independientes, el ciclo del cido ctrico, transporte de electrones y fosforilacin oxidativa. Estos procesos estn atados a la estructura de la mitocondria que es el centro de respiracin en eucariontes.

IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS

Introduccin.

Los glcidos o azcares son sustancias que en un principio se les denomin hidratos de carbono, debido a que su frmula mnima es CH2O, como si cada carbono estuviera "hidratado". Esta denominacin no es correcta.

Los glcidos estn ampliamente distribuidos tanto en tejidos animales como vegetales. En las plantas son producto de la fotosntesis, e incluyen la celulosa de la pared celular vegetal. En las clulas animales, los glcidos glucosa y glucgeno sirven como fuente de energa para las actividades vitales.

Por su funcin qumica son aldehdos polihidroxilados o cetonas polihidroxiladas, esto quiere decir que son cadenas de tomos de carbono en donde el primer carbono tiene una funcin aldehdo, o el segundo tiene una funcin cetona, y tienen un grupo oxhidrilo en cada uno de los carbonos restantes.

Clasificacin:

Se dividen en tres grandes grupos:

a) Monosacridos, osas o glcidos simples:

Son no hidrolizables y constituyen las unidades menores. Se clasifican de acuerdo con el nmero de tomos de C que poseen: triosas, tetrosas, pentosas,

hexosas y heptosas, siendo las ms importantes biolgicamente las que tienen 3, 5 y 6 tomos de C. Si poseen funcin aldehdo se llaman aldosas y si tienen funcin cetona, cetosas. Todos son reductores.

b) Oligosacridos:

Por hidrlisis dan de 2 a 6 molculas de osas. Se forman por la unin de "n" molculas de stas ltimas con prdida de "n -1" molculas de agua. Si por hidrlisis dan dos molculas de osas se denominan disacridos, etc. Algunos son reductores y otros no. Rafinosa


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e) Polisacridos u sidos: Por hidrlisis, dan un nmero variable de monosacridos. Si dan pentosas por

hidrlisis, se denominan pentosanos; si dan hexosas, hexosanos. Otros compuestos dentro del grupo son los Mucopolisacridos y los poliurnidos, que por hidrlisis dan monosacridos y ciertos cidos denominados cidos urnicos derivados de la glucosa y la galactosa. No son reductores. amilopectina

glucgeno

Las reacciones generales de reconocimiento general de glcidos se basan en sus propiedades reductoras (reaccin de Fehling), en evidenciar los derivados furfricos que se obtienen por deshidratacin de los glcidos (reaccin de Molish), y en identificar polisacridos (reaccin de Lugol).

Los monosacridos se diferencian de los disacridos por medio de la reaccin de Barfoed ya que slo los monosacridos dan positiva esta reaccin.

Las cetosas (glcidos con funcin cetona en carbono 2) se diferencian de las aldosas (glcidos con funcin aldehdo en carbono 1) por medio de la reaccin de Seliwanoff ya que slo las cetosas dan positiva esta reaccin.

La pentosas (glcidos de 5 carbonos) se diferencian de las hexosas (glcidos de 6 carbonos) por medio de la reaccin de Bial, ya que slo las pentosas dan positiva esta reaccin.

Reaccin de Molish Fundamento: Todos los glcidos por accin del cido sulfrico concentrado se deshidratan formando compuestos furfricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos compuestos furfricos reaccionan positivamente con el reactivo de Molish (solucin alcohlica de alfa-naftol). Metodologa: Tomar un tubo de ensayo y colocar 1 ml de las muestras de carbohidratos. Agregar a cada tubo 0.25 ml del reactivo de Molish. Mezclar. Inclinar cada tubo y agregar por las paredes, con mucho cuidado (sin agitar) 1 ml de cido sulfrico concentrado. Anotar resultados.


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Reaccin de Fehling Fundamento: El catin cprico (Cu++) del reactivo de Fehling reacciona con los glcidos reductores pasando a xido cuproso, que es un precipitado de color rojo ladrillo. Esta es una reaccin que resulta positiva slo si el glcido es reductor. Los glcidos reductores se manifiestan en medio alcalino, pero el Cu++ en ese medio tiende a precipitar espontneamente como xido cprico (que en esa forma no reacciona), de manera que es necesaria la presencia de tartrato doble de sodio y potasio en el reactivo para "secuestrar" al catin Cu++, a fin de evitar la formacin del xido cprico, y permitir que reaccione con los glcidos reductores. (da positiva con todos los glcidos reductores). Metodologa: Tomar un tubo de ensayo y colocar 1 ml de reactivo de Fehling (mezclar en partes iguales Fehling A y Fehling B). Mezclar. Calentar a bao mara por 5 min. Anotar resultados. Reaccin del Lugol

Fundamento: El color que dan los polisacridos con el lugol (solucin de I2 y de IK) se debe a que el I2 ocupa espacios vacos en las hlices de la cadena de unidades de glucosa, formando un compuesto de inclusin que altera las propiedades fsicas del polisacrido, especialmente la absorcin lumnica. Esta unin del I2 a la cadena es reversible, y por calentamiento desaparece el color, que al enfriarse reaparece. El lugol da con el almidn color azul y con el glucgeno color rojo caoba. (da positiva con los polisacridos). Metodologa: Tomar 1.0 ml glucgeno o almidn. Agitar vigorosamente para resuspender el carbohidrato. Agregar 2 a 5 gotas de reactivo lugol. Anotar los resultados. Reaccin de Selliwanoff Fundamento: Los glcidos que se clasifican como cetosas, vale decir, que en carbono 2 tienen una funcin cetona, en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina. La sacarosa (un disacrido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya que el CIH del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reaccin positiva). (da positiva con cetosas y negativa con aldosas). Metodologa: En un tubo de ensayo colocar 1 ml de las muestras de carbohidratos. Agregar 2 ml del Reactivo de Seliwanoff. Calentar a bao mara por 5 minutos observando los cambios cada minuto y anotar los resultados.


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Material y reactivos Reactivo de Molish Agua hirviendo Reactivo de Fehling A y B Vaso precipitado Reactivo de Seliwanoff Platina Reactivo de Lugol Tubos de ensayo Reactivo Bial Gradilla cido sulfrico concentrado Resultados:

Carbohidrato Molish Fehling Lugol Seliwanoff

1.

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4.

5.

6.

7.

8.

Cuestionario: Explique cada uno de los resultados. Qu son los compuestos furfricos? Explique a quines se les conoce como glcidos reductores? Investigue la reaccin del Lugol con los polisacridos. Escriba la estructura de una cetosa y de una aldosa. Escriba las estructuras de un monosacrido, de un disacrido y de un polisacrido.

IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

La separacin de mezclas de molculas mediante la cromatografa de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los distintos

componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.


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En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un

soporte slido granulado, tal como gel de slica, almina, cido silcico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequea cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican aadiendo pequeas gotas de solucin en un pequeo crculo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner ms muestra se pueden aplicar ms gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande.

La placa seca se sumerge en un pequeo volumen de fase mvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar.

En cromatografa de capa fina la fase estacionaria est hidratada, por lo que se le considera como la fase polar.

Como slo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase mvil va arrastrando a las substancias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separacin.

La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tia a las substancias de inters. La movilidad relativa o Rf es la relacin entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente.

En un sistema de TLC bien caracterizado, las substancias pueden identificarse comparando los valores de Rf con los de estndares, que se han analizado previamente o durante la cromatografa. Si se desea, las substancias pueden recuperarse raspando la slica de la placa del lugar en el que se detect la mancha. Para ello, es necesario emplear mtodos de revelado que no destruyan a la muestra. OBJETIVO La identificacin de carbohidratos por cromatografa en capa fina, utilizando diferentes reveladores. MATERIALES Cmara de vidrio para cromatografa Papel de celulosa Pipetas pasteur REACTIVOS Carbohidratos al 1% 40 ml de butanol 10 ml de cido actico 50 ml de agua destilada


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160 ml de acetona 2.5 ml de anilina 40 ml de cido actico glacial 81 ml acetato de etilo 18 mil cido actico 18 ml agua Difenilamina PROCEDIMIENTO Preparacin de fase mvil y reveladores. Reactivo de anilina: A 100 ml de acetona se le agregan 2.5 ml de anilina. Inmediatamente

antes de usarse, este se agrega a 1.2 ml de cido fosfrico en 40 ml de cido actico glacial y por ultimo se agregan 60 ml de acetona. Fase mvil: Mezclar 40 ml de butanol, 10 ml de cido actico y 50 ml de agua destilada y

colocarla en la cmara de vidrio. Preparacin del cromatograma Se cortan 3 cuadros de el papel de celulosa que se va utilizar para la cromatografa,

manejndolo con guantes y con precaucin de utilizarlo en direccin correcta. Se colocan gotas de los carbohidratos en la fase estacionaria, las gotas deben de ser pequeas y aproximadamente 1 cm de distancia una de otra.

Colocar las placas (fase estacionaria) dentro de la cmara de vidrio y tapar. Cuando la fase mvil halla recorrido mas de de la placa, sacar y dejar secar. Marque con lpiz la distancia que recorri la fase mvil. Revelacin de las placas Revelacin con ninhidrina: Se roca la placa con el reactivo de ninhidrina, se calienta en la estufa a 100 grados centgrados, cuidando que no se queme el cromatograma, aproximadamente de 3-5 minutos. Revelacin con anilina: Se sumerge el cromatograma en el reactivo recin preparado de anilina, se calienta en la estufa a 100 grados centgrados por 5 minutos. Revelacin con Molish: Se basa en la accin hidrolizante y deshidratante del cido

sulfrico en los CH. El cido sulfrico cataliza la hidrlisis de los enlaces glucosdicos de la muestra y la deshidratacin a furfural (pentosas) o hidroximetilfurfural (hexosas). Estos


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furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch dando un producto coloreado. Calentar las placas en la estufa por unos minutos y con una brocha con cuidado pasamos el reactivo de Molisch para el revelado, una vez hecho esto secamos en la estufa a 120 o 140 C de 1 a 5 minutos, tener cuidado de que las manchas no se vayan a daar, observar de rato en rato hasta que aparezcan las manchas coloreadas. Revelacin con vapores de yodo: En una cmara de vidrio se coloca yodo, y el cromatograma a revelar, se deja el tiempo que sea necesario para que los vapores de yodo impregnen el cromatograma. Sacar relacin de frentes (Rf) de los 3 cromatogramas y conclusiones, que revelador es ms eficiente al utilizar carbohidratos y porque. Identificar los CH problema.


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PRODUCCIN DE PIRUVATO Y ACETALDEHDO DURANTE LA FERMENTACIN DE GLUCOSA POR LEVADURA.

OBJETIVO

Que el alumno produzca piruvato y acetaldehdo a partir de glucosa, y determine su presencia. INTRODUCCIN

La primera etapa de la gluclisis en las levaduras es la formacin de piruvato. La reaccin total podra considerarse como la transferencia de dos pares de tomos de hidrgeno de la glucosa al NAD. Ya que la enzima se encuentra solo en cantidades catalticas, es necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda, y as, el NADH2 formado es convertido a NAD por oxigeno molecular a travs de la cadena respiratoria. Esto no es posible en condiciones anaerbicas y en este caso la reaccin se efecta cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo, y luego en alcohol.

Los metabolitos piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes normalmente en muy bajas concentraciones, por lo tanto, para demostrar su existencia como intermediario en el camino metablico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan caminos metablicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto, que se esta investigando mediante inhibidores. Tambin se pueden cambiar las condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad mxima, o se puede usar un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse.

La piruvato-descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reaccin con nitroprusiato de sodio o 2,4-dinitrofenilhidrazina. En el segundo experimento se aade a la mezcla de incubacin sulfito de sodio que atrapa el acetaldehdo. La presencia de acetaldehdo puede demostrarse por el color azul producido por la reaccin con nitroprusiato de sodio y piperidina. REACTIVOS

Fosfato de sodio bibsico (0.5 mol/lt) 20 ml. Fosfato de potasio monobsico (0.5 mol/lt) 20 ml. Suspensin de levadura en NaHPO4 (100 gr/lt) 5 ml. Suspensin de levadura en KH2PO4 (100 gr/lt) 5 ml. Suspensin de levadura en agua (100 gr/lt) 5 ml. Glucosa (100 gr/lt) 10 ml. Nitroprusiato de sodio (50 gr/lt) 1 ml. Hidrxido de amonio Sulfato de amonio 1 gr. Sulfito de sodio 0.5 gr. Hidrxido de sodio (100 gr/lt) 1 ml. Hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina (solucin saturada en cido clorhdrico 2 mol/lt) 1 ml. Piperidina (30 gr/lt en solucin acuosa) 2 ml.


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cido tricloroactico (100 gr/lt) 2 ml. Agua destilada 5 ml.

Bao de agua a 37C. MATERIALES 8 tubos de ensaye. Pipetas: 4 de 5ml, 4 de 2ml,2 de 1ml y 1 de 0.5ml. 1 Gotero 1 Bao Mara. PROCEDIMIENTO FORMACIN DE PIRUVATO A PARTIR DE GLUCOSA.

En dos tubos de ensaye pipetee 5ml de solucin de glucosa (A y B); al tubo a agrguele 5ml de suspensin de levadura en solucin ligeramente alcalina de Na2HPO4 y al tubo B aada 5ml de la suspensin de levadura en solucin ligeramente cida de

KH2PO4. Coloque los tubos en un bao de agua a 37C durante una hora, luego aada a cada tubo 2ml de la solucin de cido tricloroactico, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm. Separe el sobrenadante y selo para la determinacin de piruvato. DETERMINACIN DE PIRUVATO MEDIANTE NITROPRUSIATO DE SODIO.

En un tubo de ensaye agregue 2ml del sobrenadante hervido previamente a 1 gr., de sulfato de amonio slido. Agregue dos gotas de solucin de nitroprusiato de sodio recin preparada, mezcle vigorosamente y deje deslizar cuidadosamente por las paredes del tubo, amoniaco concentrado hasta que formen dos capas. Si hay piruvato, se forma un anillo verde o azul en la interfase de los lquidos. La formacin de un anillo rosado transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloracin azul o verdosa caracterstica de la reaccin con piruvato. DETERMINACIN DE PIRUVATO CON 2,4-DINITROFENILHIDRAZINA.

Agregue 1ml de solucin saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina a 2ml de sobrenadante, mezcle fuertemente y coloque dos o tres gotas de la mezcla en un tubo de ensaye, agregue 1ml de solucin de hidrxido de sodio y diluya con agua hasta 5ml. La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato. FORMACIN DE ACETALDEHDO A PARTIR DE GLUCOSA.

En dos tubos marcados C y D pipetee 5ml de la solucin de glucosa, agregue a

ambos tubos 5ml; de la suspensin de levadura en agua, al tubo D aada 0.5 gr de sulfito de sodio. Mezcle vigorosamente e incube los dos tubos por 10 minutos, separe el sobrenadante, mezcle 2 ml de piperidina acuosa y agite. Si hay acetaldehdo presente, se observar una coloracin azul.


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PRUEBAS PARA SACAROSA INTRODUCCIN

Este azcar, se obtuvo por primera vez en la India, de los tallos de la caa de azcar. Los rabes la llevaron a Arabia, Egipto y algunas regiones del sur de Espaa, de donde pas a Canarias y de aqu, con el descubrimiento de Amrica, a las Antillas, Mxico y Brasil. Parece ser que los antiguos mexicanos la extraan de los tallos del maz, donde existe en parte invertida.

La sacarosa es el edulcorante universal utilizado para

endulzar toda clase de alimentos y bebidas. En farmacia se emplea para preparar jarabes, como excipiente de muchos preparados y en el grageado de tableado. El caramelo se utiliza como colorante de muchas bebidas.

La sacarosa es el nico disacrido comn no reductor y por tanto, no reduce las soluciones alcalinas de cobre ni forma ozasonas. La sacarosa es hidrolizada en

solucin cida a glucosa y fructosa. MATERIALES.

Solucin de sacarosa (0.5 g / 50 ml de agua destilada) cido clorhdrico concentrado. Hidrxido de sodio (solucin al 10% para neutralizar) Reactivo de Benedict Reactivo de Seliwanoff.


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MTODOLOGIA. Hidrlisis de la sacarosa: A 5 ml de la solucin de sacarosa agregar cinco gotas de HCl concentrado. Calentar la solucin resultante por 5 min. en bao de agua hirviendo, seguido de los 5 min. enfriar y agregar a la muestra solucin de NaOH hasta que la muestra sea neutra o dbilmente alcalina. Con la muestra (ya hidrolizada) realizar las pruebas de Benedict y Seliwanoff. REACCIN DE BENEDICT

Fundamento:

Algunos azcares tiene la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el in Fe3+ o el Cu2+. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. A estos azucares con un grupo carbonilo libre se les llama azcares reductores y aquellos en los que el grupo

carbonilo se encuentra combinado en unin glicosdica se conoce como azcares no reductores. La prueba de Benedict se basa precisamente en la reaccin o no de un azcar con el in Cu2+.

La aparicin de un precipitado amarillo, anaranjado o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azcar reductor.

Metodologa:

En un tubo de ensayo mediano deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict y agregue 6 gotas de sacarosa, repita la prueba en otro tubo con sacarosa sin hidrolizar, coloque los tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos. Observe cualquier cambio de color durante el calentamiento saque los tubos y colquelos en una gradilla y despus de un corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado o amarillo.

REACCIN DE SELLIWANOFF

Fundamento:

Los glcidos que se clasifican como cetosas, vale decir, que en carbono 2 tienen una funcin cetona, en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina. La sacarosa (un disacrido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reaccin positiva). (da positiva con cetosas y negativa con aldosas).


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Metodologa:

En un tubo de ensayo colocar 1 ml de la muestra de sacarosa hidrolizada y en otro tubo 1 ml de la sacarosa inicial. Agregar 2 ml del Reactivo de Seliwanoff a cada tubo. Calentar a bao mara por 5 minutos observando los cambios cada minuto y anotar los resultados.

Prueba de Selliwanoff positiva

Cuestionario:

1.- Por qu se le considera reductor a un azcar?

2.- Cules son ejemplos de azcares reductores?

3.- En qu consisten las pruebas que nos permiten saber si un azcar es reductor?

4.- Escriba la reaccin de cada una de las dos pruebas efectuadas en la prctica.

5.- Investigue y describa la importancia econmica de la Sacarosa.

PREPARACIN DE OSAZONAS FUNDAMENTO Tanto las aldosas como las cetosas son oxidadas por el licor de Fehling (tartrato cprico alcalino) o por el reactivo de Tollens (AgNO3 amoniacal). Los glucsidos no dan reacciones positivas con estos reactivos porque para ello se requiere el grupo carbonilo este libre o en forma de hemiacetal. En consecuencia, la sacarosa no es un azcar reductor, pero la maltosa si. Los azcares no dan la prueba de Schiff y pueden ser diferenciadas de los aldehdos alifticos comunes.


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Las aldosas y las cetosas reaccionan con la fenilhidracina para dar fenilhidrazonas. En presencia de la solucin cida de fenilhidracina en exceso, un grupo CHOH adyacente es oxidado a grupo carbonilo, y este reacciona con una o ms molculas de fenilhidracina para dar una osazona. La velocidad de formacin de la osazona y la estructura cristalina de la osazona son tiles para la identificacin de un azcar. En las cetonas, el tomo de carbono C-1 es oxidado a grupo carbonilo. En consecuencia, los pares de compuestos, tales como glucosa y fructosa dan osazonas idnticas, demostrando la similitud estereoqumica de los tomos de carbono C-3, C-4, C-5, C-6. Se forman las osazonas de cualquier compuesto que tenga la estructura: R-C-CH-R O OH

CHO C6H5NHNH2 CH=NNHC6H5 C6H5NHNH2 CH=NNHC6H5 CHOH CHOH C=NNHC6H5

(osazona) PRERREQUISITOS.

- Dibujar los cristales de las osazonas de los diferentes Carbohidratos. - Cul es la utilidad de la formacin de osazonas? - Un mecanismo de reaccin de la formacin de osazonas. - Estructura molecular de por lo menos dos osazonas. - Escriba la razn por la que Glucosa, Manosa y Fructosa forman la misma osazona. MATERIALES cido actico Pipetas pasteur Solucin de fenilhidracina Papel filtro Acetato de sodio Solucin de azcares Microscopio Tubos de ensaye PROCEDIMIENTO - Acidifique 5 ml de la solucin de los azcares con 10 gotas de cido actico glacial. - Agregue tres gotas de la solucin de fenilhidrazina debe de prepararse y utilizarse inmediatamente y un poco de acetato de sodio slido (en la punta de un cuchillo). - Caliente en un bao de agua durante 5 min. agitando ocasionalmente, filtre y caliente el filtrado en un bao de agua por 20 min. - Dejar enfriar muy lentamente y examine bajo el microscopio los cristales de osazona. - Realice los dibujos de los cristales encontrados. - Investigue y dibuje la forma y apariencia de los cristales de las osazonas de los diferentes Carbohidratos.


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Metodologa opcional:

Coloque en un tubo de ensaye 0.1 g de cada carbohidrato. Agregue 0.2 g de clorhidrato de fenilhidrazina. Luego 0.3 g de Acetato de sdio cristalizado y 4 ml de gua. Agitar energtica y tapar el tubo, con un tapn de papel, que permita la salida de vapor. Coloque el tubo en bao Mara a ebullicin, agitando ocasionalmente. Observe el tiempo que aparecen los cristales. Si en 20 min. de calentamiento no se han formado los cristales, retire el tubo del bao Mara y djelo reposar en fro. Anote el tiempo de cristalizacin y si fue en fro o en caliente.

Carbohidrato Tiempo en precipitar

Fructosa 2 minutos

Glucosa 4 a 5 minutos

Xilosa 7 minutos

Arabinosa 10 minutos

Galactosa 15 a 19 minutos

Lactosa Solubles en agua caliente

Maltosa

Estructura observada Cristal de osazona

Glucosa

Galactosa

Arabinosa


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Lactosa

Maltosa

Xilosa

http://comunidad.uach.mx/carzola/MANUAL_PRACT_BIOQUIMICA.pdf

DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE

OBJETIVO. El alumno aprender a determinar los valores de glucosa srica. PRERREQUISITOS.

Cul es la fuente primaria de energa oxidativa? Cules son los valores normales de glucosa en sangre? Defina los conceptos de Glicemia, Hipoglicemia, Hiperglicemia. Describa el padecimiento Diabetes Mellitus. Qu es la insulina y dnde se produce? Cul es la funcin de la Insulina? Qu es la adrenalina y dnde se produce? Cul es la funcin de la adrenalina? Describa ampliamente procesos de Gluclisis, Glucognesis, Glucogenlisis y Gluconeognesis. Con todos los prerrequisitos construya la introduccin: METODOLOGA:

TCNICA PARA MEDIR GLUCOSA SANGUNEA

Blanco Patrn Problema

Reactivo (ml) 2 2 2

Blanco .020 -- --

Patrn -- .020 --

Problema -- -- .020


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Mezclar, dejar reposar a temperatura ambiente 10 minutos.

Leer los tubos a 505 nm, calibrando a cero con el tubo blanco.

Despus realizar los clculos:

Concentracin de Glucosa en suero: mg/dl de Glucosa = absorbancia del problema Concentracin del patrn Absorbancia del patrn

Valores Normales: ___________________________________________.

CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

FUNDAMENTO: Los carbohidratos son la principal fuente de energa en corto y mediano plazo. En

los animales los carbohidratos se transportan en la sangre en forma de glucosa, la cual es llevada hasta los tejidos para asegurar a las clulas un adecuado suministro energtico.

La concentracin de glucosa sangunea se puede alterar por varias hormonas que actan estimulando o suprimiendo la produccin o la utilizacin de glucosa. La actividad de las hormonas depende de si el paciente est en ayunas o no. La adrenalina, el glucagon, los glucocorticoides, las hormonas pituitaria anterior y las hormonas de la tiroides causan un aumento en la concentracin de glucosa sangunea y se llaman agentes hiperglicemiantes.

En cambio la insulina disminuye el azcar sanguneo y es hipoglicemiante.

La insulina es producida por las clulas del pncreas y cuando estas cesan o dejan de funcionar, tal como ocurre en la diabetes mellitus, el azcar sanguneo aumenta hasta alcanzar valores muy altos y entonces se excreta glucosa en la orina. CUESTIONARIO:

1.- Investigue el papel del pncreas como glndula de secrecin. 2.- En que parte del pncreas se produce la insulina y cul es su papel? 3.- Cul es el papel del glucagon?


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4.- Cmo se encuentra el nivel sanguneo de glucosa en enfermedades del pncreas? (investigue al menos dos enfermedades). 5.- Qu relacin existe entre los valores sanguneos de glucosa y amilasa en una pancreatitis y en una obstruccin intestinal (ya visto). 7.- Qu relacin existe entre el nivel de adrenalina y el nivel de glucosa? 8.- Elabore una tabla comparativa de valores normales de glucosa en sangre de cinco especies animales, adems los del humano. 9.- Cules son las manifestaciones de probable diabetes mellitus en perros y gatos?

Diabetes mellitus: Es un trastorno metablico que se manifiesta por unos niveles de glucosa en sangre

por encima de los lmites normales. Si no se trata adecuadamente, estos niveles alcanzan valores excesivamente altos, dando lugar a las complicaciones agudas o crnicas de la diabetes.

La causa de la diabetes es una anomala en la produccin o el funcionamiento de la insulina por el pncreas. La insulina es una hormona que fabrica el pncreas, cuya misin es facilitar el paso de los azcares de la sangre a las clulas. Cuando no hay insulina como en los diabticos jvenes (Tipo 1), o no funciona correctamente, como ocurre en los adultos (Tipo 2), el azcar no pasa de la sangre a los rganos y el funcionamiento es deficiente. Al tiempo, el azcar se acumula en la sangre en cantidades superiores a las normales, apareciendo hiperglucemia.

Cuando la glucosa en sangre es superior a 180 mg, el organismo no puede retenerla, por lo que la elimina por la orina: Glucosuria.

En un paciente mal controlado o no tratado aparecer hiperglucemia y glucosuria.

La causa ms frecuente de la Diabetes Mellitus es la produccin insuficiente de Insulina por el pncreas. La falta de insulina provoca hiperglucemia y glucosuria.

El estudio de diabetes se realiza mediante la medicin de la glucosa en sangre en ayunas (glucemia basal) y se recomienda en las siguientes circunstancias: En todos los individuos mayores de 45 aos, y repetir cada 3 aos mientras sea normal. En poblacin ms joven cuando existan factores de riesgo.

Cuando aparezcan sntomas o signos que sugieran diabetes: poliuria (orinar mucho). polifagia (aumento del apetito). polidipsia (beber mucho por sed). prdida de peso. retinopata. proteinuria. infecciones urinarias de repeticin. infecciones cutneas de repeticin,...

Cuando el nivel de glucosa plasmtica en ayunas est entre 110 y 125, hay que repetir la glucemia y si persiste, realizar una Curva de Tolerancia de Glucosa (75g de glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en 3-5 minutos). Pacientes con antecedentes de Hipertensin arterial o trastornos del colesterol.


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PROCEDIMIENTO:

La primera muestra de sangre se toma en ayunas, minutos despus se ingiere una solucin de glucosa al 50 % de agua destilada. Se toma una muestra de sangre al haber transcurrido dos horas.

La prueba de dos horas es ordinario suficiente para la evaluacin rutinaria de la diabetes. Los pacientes con insuficiencia adrenal o con tumores en los islotes del pncreas suelen tener los niveles de glucosa bajos en la sangre en ayunas. Los valores de la curva van aumentando hasta una lectura mxima y luego descienden un poco por enzima de valor de glucosa en ayunas y en los pacientes diabticos permanece un valor alto despus de 2 horas.

Los valores en ayunas y los valores mximos aumentan con la edad debido a una disminucin de la tolerancia a la glucosa.

Un aumento en la tolerancia a la glucosa puede encontrarse en los casos de hipofuncin de la tiroides, adrenal o pituitaria o tambin hay un defecto de la absorcin intestinal. INTERPRETACIN DE RESULTADOS:

Normalmente se puede hacer una prueba de tolerancia, en los casos en que se sospecha de diabetes mellitus. En casos de diabetes mellitus, el nivel de glucosa en la sangre est alrededor de 150 mg /dl al final de la primera hora y no vuelve al valor original a las 2 horas; de hecho puede continuar subiendo. Cuando se presenta hiperadrenocorticalismo el resultado de una prueba de tolerancia a la glucosa ser similar al que se ha encontrado en la diabetes mellitus.


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La curva de tolerancia a la glucosa en una persona normal en comparacin a un paciente con diabetes mellitus no insulina dependiente (NIDDM, diabetes tipo 2). Las lneas punteadas indican el rango de la concentracin de glucosa en una persona normal. Los criterios que clnicamente establecen que un individuo tenga diabetes mellitus incluyen: 1. Tener un nivel de glucosa sangunea durante ayunas mayor a 126 mg/dL (7 mmol/L). Los niveles normales deberan ser menores a 100 mg/dL (5.6 mmol/L) 2. Tener niveles de glucosa sangunea mayores a 200mg/dL (11mmol/L) en dos momentos durante la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), uno de los cuales debe ser realizado durante las dos primeras horas de haber ingerido la glucosa.

El rango normal de los niveles de glucosa en el perro y en el gato es del orden de 60-110 mg /dl.

En perros normales el aumento del nivel de glucosa en la sangre, se elevar desde el nivel de ayuno al nivel mximo, alrededor de la hora despus de la administracin de glucosa al 50 % y despus el nivel desciende nuevamente hasta el nivel original al cabo de 2 horas aproximadamente. El valor mximo no sobrepasa generalmente 160 mg /dl.

TCNICA PARA MEDIR GLUCOSA SANGUNEA Blanco Patrn Problema

Reactivo de glucosa

2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml

Blanco .02 ml -- --

Patrn -- .02 ml --

Problema -- -- .02 ml

Mezclar, dejar reposar a temperatura ambiente 10 minutos y luego leer a 505 nm la

absorbancia del patrn y del problema, previa calibracin a cero con el blanco. Realizar los clculos correspondientes.

Clculos: Concentracin de Glucosa = Abs. del Problema [Concentracin del patrn] Abs. del Patrn

INDUCCIN Y REPRESIN HORMONAL EN EL METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS.

OBJETIVO

Conocer y describir detalladamente cada uno de los eventos del equilibrio homeosttico de la glucosa tomando en cuenta el papel que juegan las hormonas insulina y

0.2960.3460.298

98 mg/dl

0.512


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adrenalina en el control de este equilibrio.

PREREQUISITOS

1.- Explicar la diferencia entre induccin y activacin enzimtica. 2.- Explicar la diferencia entre represin e inhibicin enzimtica. 3.- Definir alosterismo y regulacin enzimtica. 4.- Definir hipoglucemia e hiperglucemia. 5.- Explicar funciones y caractersticas de las hormonas insulina, glucagon, adrenalina, ACTH y somatropina.

INTRODUCCIN

La glucosa se considera, en la mayora de los organismos, como la fuente primaria de energa oxidativa y todo el programa metablico celular esta diseado primordialmente

para usar este metabolito como principal materia prima. Este diseo implica que la absorcin de glucosa exgena sea muy eficiente de tal modo que garantice un aporte suficiente de la misma a todas las clulas del organismo. Tal efecto obliga al organismo a mantener sistemas muy eficientes de regulacin para evitar una posible sobresaturacin de glucosa celular. En los mecanismos de control homeosttico de glucosa estn implicadas las principales vas metablicas de los carbohidratos, de hecho estas vas son las que mantienen el equilibrio y son: La gluclisis considerada como la va degradativa principal de la glucosa. La glucognesis que genera al glucgeno como principal fuente almacenable de glucosa. La glucogenlisis mecanismo por el glucgeno puede en caso necesario convertirse en

glucosa. La gluconeognesis donde se puede formar glucosa cuando las necesidades de la

misma llegan a estados crticos. Todas estas vas presentan sistemas muy complejos de autorregulacin enzimtico y de regulacin hormonal que determinar sincrona, actividad e inhibicin de cualquier cambio en la concentracin de glucosa intra y extracelular. Con este experimento nos disponemos a comprobar mediante el uso racional de animales de laboratorio, las implicaciones que diferentes hormonas del organismo tienen sobre las vas metablicas que mantienen el control homeosttico de la glucosa extracelular. Podemos considerar una hiptesis general donde determinamos: si las hormonas insulina y adrenalina estn directamente relacionadas con la regulacin del control homeosttico de la glucosa, entonces, modificando la concentracin de tales hormonas en el organismo se genera un desequilibrio en la concentracin de glucosa extracelular. Esto nos lleva a dos hiptesis ms concretas que nos indican: I. Si la insulina tiene un efecto principalmente inductor en la

captacin de glucosa por parte de las clulas y de la degradacin glucoltica y el almacenamiento glucognico de la


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glucosa, entonces, aumentando la concentracin de insulina circulante, se generar un efecto hipoglicmico a la vez que se mantendr la concentracin mxima de glucgeno heptico en un animal de laboratorio con una concentracin de glucosa extracelular mantenida constantemente alta.

II. Si la adrenalina tiene un efecto primario

inductor de la movilizacin de la glucosa a travs de membranas celulares por su efecto activador de la glucogenlisis, entonces aumentando la concentracin de esta hormona se generar un efecto hiperglicemiante primario y adems disminuir notablemente la concentracin de glucgeno heptico en un animal de laboratorio donde se mantiene la concentracin de glucosa extracelular constantemente alta.

METODOLOGA

Se requiere un lote de 4 ratas adultas, sanas y con un peso promedio de 400 gr con el siguiente tratamiento previo: GRUPO I: Administracin subcutnea de una dosis de 1.0 unidad de insulina NPH (de accin intermedia) los primeros cinco 5 das y 1.0 unidad de insulina de accin rpida los ltimos dos das. La segunda administracin al siguiente da enseguida de la explicacin de la prctica. La tercera ser al tercer da, una hora antes de la realizacin de la prctica.

martes mircoles jueves viernes sbado domingo lunes

1 u Insulina de accin intermedia

1 u Insulina

de accin intermedia

1 u Insulina

de accin intermedia

1 u Insulina

de accin intermedia

1 u Insulina

de accin intermedia

1 u Insulina

de accin rpida

1 u Insulina de

accin rpida

GRUPO AR: Administrar por va subcutnea 1.0 U/Kg. de insulina de Accin Rpida una hora antes de la prctica GRUPO A: Administracin intramuscular de una dosis de 0.01 mg/ml de adrenalina

media hora antes del experimento. GRUPO T: Lote de ratas testigo sin tratamiento hormonal. Nota: A los tres lotes de ratas se les administrar una dieta rica en carbohidratos, grasas y lpidos en una cantidad de 20 gr de purina por da y 100 ml de solucin de dextrosa el 5.0%. (se refrigerar la solucin que no se est utilizando).


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COLECCIN DE MUESTRAS Extraccin de Glucgeno: 1.- Sacrificar a la rata con ter o cloroformo procurando no excitarla demasiado. 2.- Extraer rpidamente el hgado, pesarlo y colocarlo en un recipiente fro. 3.- Cortarlo en trozos pequeos. 4.- Colocar los trozos en un mortero previamente sumergido en hielo al cual se le agrega cido tricloroactico al 10% en una proporcin de 2.0 ml por gramo de tejido y 0.5 gr de arena lavada. Triturar el hgado hasta formar una pasta homognea. 5.- Centrifugar durante 5 minutos 2000 rpm. 6.- Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el volumen. 7.- Aadir dos volmenes de alcohol al 95% por volumen de sobrenadante recuperado. Agitar lentamente hasta que el glucgeno flocule. 8.- Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos.

9.- Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5.0 ml de agua destilada. 10- Aplicar la prueba del lugol, de Fehling y de Molish a la muestra obtenida. Cuantificacin de Glucosa Sangunea: 1.- Extraer el mayor volumen posible de sangre de la rata con una jeringa desechable de 3.0 cc, procurando no causar hemlisis a la muestra. 2.- Introducir la sangre en un tubo y deje reposar durante 5 minutos. 3.- Centrifugar la sangre por 10 min. a 2000 rpm. 4.- Separe el suero y aplicar el siguiente anlisis:

TUBO BLANCO PATRN PROBLEMA

Agua destilada 0.02 ml ----- -----

Solucin patrn de glucosa

----- 0.02 ml -----

Suero problema ----- ----- 0.02 ml

Reactivo de glucosa 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml

Mezclar cada tubo y dejar reposar por 10 minutos.

Leer la absorbancia de la muestra y el patrn a 505 nm ajustando a cero de absorbancia con el blanco. Hacer el siguiente clculo: Abs. problema Glucosa srica = ---------------------- X [ patrn ] = mg/dl Abs. Patrn


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L P I D O S

Concepto.

Los lpidos son biomolculas orgnicas formadas bsicamente por carbono e hidrgeno y generalmente tambin oxgeno; pero en porcentajes mucho ms bajos. Adems pueden contener tambin fsforo, nitrgeno y azufre .

Son un grupo de sustancias muy heterogneas que slo tienen en comn estas dos

caractersticas:

* Son insolubles en agua * Son solubles en disolventes orgnicos, como ter, cloroformo, benceno, etc.

Clasificacin de los cidos Grasos.

Lpidos Simples

-Grasas neutras -Ceras Grasas compuestas - Fosfolpidos -Glucolpidos -Lipoprotenas

Esteroles

Sustancias que acompaan a los lpidos

-Colesterol y sus esteres -Esteroides -Acidos biliares -Vitamina K -Carotenoides

CIDOS GRASOS

Los cidos grasos son molculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de tipo lineal, y con un nmero par de tomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena un grupo carboxilo (-COOH).


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Se conocen unos 70 cidos grasos que se pueden clasificar en dos grupos:

Los cidos grasos saturados slo tienen enlaces simples entre los tomos de carbono. Son ejemplos de este tipo de cidos el mirstico (14C);el palmtico (16C) y el esterico (18C) .

Los cidos grasos insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y sus molculas presentan codos, con cambios de direccin en los lugares dnde aparece un doble enlace. Son ejemplos el olico (18C, un doble enlace) y el linoleco (18C y dos dobles enlaces).

PROPIEDADES DE LOS CIDOS GRASOS

Solubilidad. Los cidos grasos poseen una zona hidrfila, el grupo carboxilo (-COOH) y una zona lipfila, la cadena hidrocarbonada que presenta grupos metileno (-CH2-) y grupos metilo (-CH3) terminales.

Por eso las molculas de los cidos grasos son anfipticas, pues por una parte, la

cadena aliftica es apolar y por tanto, soluble en disolventes orgnicos (lipfila), y por otra, el grupo carboxilo es polar y soluble en agua (hidrfilo). Desde el punto de vista qumico, los cidos grasos son capaces de formar enlaces ster con los grupos alcohol de otras molculas.

Cuando estos enlaces se hidrolizan con un lcali, se rompen y se obtienen las sales de los cidos grasos correspondientes, denominados jabones, mediante un proceso denominado saponificacin.


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FUNCIONES DE LOS LPIDOS

Los lpidos desempean cuatro tipos de funciones:

Funcin de reserva. Son la principal reserva energtica del organismo. Un gramo de grasa produce 9.4 kilocaloras en las reacciones metablicas de oxidacin, mientras que protenas y glcidos slo producen 4.1 kilocalora/gr. Funcin estructural. Forman las bicapas lipdicas de las membranas. Recubren rganos y le dan consistencia, o protegen mecnicamente como el tejido adiposo de pies y manos. Funcin biocatalizadora. En este papel los lpidos favorecen o facilitan las reacciones qumicas que se producen en los seres vivos. Cumplen esta funcin las vitaminas lipdicas, las hormonas esteroideas y las prostaglandinas. Funcin transportadora. El transporte de lpidos desde el intestino hasta su lugar de destino se rabiza mediante su emulsin gracias a los cidos biliares y a los proteolpidos.


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EXTRACCIN DE LPIDOS

INTRODUCCIN A diferencias de las protenas los cidos nucleicos y los polisacridos, los lpidos no son polmeros. Se trata de molculas bastante pequeas que presentan una fuerte tendencia a asociarse mediante fuerzas no covalentes. Generalmente se caracterizan por el tipo de estructura que consiste en una cabeza hidrfila polar, conectada a una cola hidrocarbonada hidrfoba no polar.

Los lpidos son substancias insolubles en solventes polares como el agua (o parcialmente solubles) compuestas de cidos grasos.

Los cidos grasos son los lpidos ms sencillos los cuales son tambin componentes de otros lpidos ms complejos.

En esta prctica se utilizar la yema de huevo para realizar la extraccin de lpidos, por lo que se describe la composicin lipidica de dicha yema. Yema de huevo sin clara cido palmtico (16C) 6.500mg cido esterico (18C) 2.200mg cido oleico (18C) 12.9g cido linoleico (18C) 2.450mg cido linolnico (18C) 220mg cido araquidnico (20C) 375mg Colesterol 1.260mg MATERIAL

Una yema de huevo Solucin de cloruro de potasio Pipetas de 10ml Reactivo de bismuto Vasos de precipitado Reactivo de ninhidrina Varilla de vidrio Metanol Papel filtro Matraz kitasato Vortex Bomba de vaco Cloroformo PROCEDIMIENTO

Extraccin de Lpidos.

Separar la yema del huevo colocarla en un matraz, agitarla con una varilla


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de vidrio para romper la membrana. Agregar al matraz 10ml de cloroformo y 10ml de metanol, agitar en el vortex durante 10min, hasta homogenizar la mezcla. Despus filtrar al vaci, despus al filtrado se coloca en un tubo de ensayo y se le agrega 10ml de solucin de cloruro de potasio y se deja reposar durante 10min. Se formaran dos capas en el tubo, un precipitado de color amarillo, el cual contiene los lpidos de la yema. Cromatografa: Como fase mvil se utilizar la siguiente mezcla: Cloroformo 65ml Metanol 25ml cido actico 8ml Agua destilada 4ml Como fase estacionaria se utilizar silica gel. Para realizar la cromatografa se toman unas gotas del precipitado amarillo formado en el tubo de ensayo y se colocan sobre la placa de slice gel, se deja secar y se revela con: el reactivo de bismuto, reactivo de nihinidrina. RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Reportar los resultados de la cromatografa , explicar por que se da el

corrimiento de los lpidos en sobre la fase mvil, que reacciones se da entre los lpidos y los reveladores.

DETERMINACION DE COLESTEROL SERICO

INTRODUCCIN

Las concentraciones plasmticas de lpidos tienden a aumentar lentamente con la edad. Este efecto es muy claro e importante en el caso de fosfolpidos y colesterol. Los cidos grasos normales, muestran una relacin inversa con la edad. Esto puede deberse a mayores exigencias anablicas y cifras ms altas de hormona del crecimiento en los nios pequeos. El colesterol plasmtico tiende a disminuir tambin en loa ancianos.


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El colesterol es un alcohol esteroide, sus propiedades como alcohol dependen del grupo OH, y la cadena lateral de hidrocarburo, unida al tomo de carbono 17, le confieren sus caracteres de lpido, como solubilidad en ter, cloroformo, etc. Cualquier clula del organismo, prcticamente, puede producir colesterol a partir de compuestos simples de dos carbonos (acetato). El hgado, corteza suprarrenal, ovarios y testculos as como el epitelio intestinal, son focos especialmente activos en la sntesis de colesterol.

La corteza suprarrenal, los ovarios y los testculos, utilizan el colesterol y

sus esteres para producir hormonas esteroideas. Adems de sintetizar colesterol, el hgado tambin lo esterifica, transformando parte de el en cido clico, que excreta con la bilis (un poco menos de 1g/da). Aunque el organismo sintetiza muy fcilmente colesterol, su destruccin es mucho ms problemtica.

El transporte y la excrecin de colesterol se aceleran por efecto de los estrgenos; al respecto, la testosterona parece carecer de accin, o tener un efecto opuesto. Normalmente, casi un 70% del colesterol plasmtico esta esterificado, ms del 50% con cido linoleico, y casi todo el resto con cido oleico; el 30% restante del total se presenta como colesterol libre. Cuantitativamente, despus de los fosfolpidos, el colesterol es el lpido ms importante del plasma. En trminos generales, la relacin entre fosfolpidos y colesterol es bastante constante, salvo en las enfermedades graves del hepatocito, que se acompaan de disminucin espectacular de los esteres de colesterol. El colesterol es el material fundamental para la formacin de muchas otras molculas derivadas de los esteroides, como la vitamina D. Aunque el colesterol es esencial para la vida humana se le atribuye la formacin de placas en las paredes de las arterias (proceso llamado arterosclerosis), que puede provocar tarde o temprano una obstruccin. Este efecto es de particular importancia en las arterias que aporten sangre al corazn. El bloqueo de las mismas produce daos cardiacos que con frecuencia provocan la muerte a consecuencia de un ataque al corazn.

Colesterol (3-hidroxi-5,6-colesteno)


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FUNDAMENTO El cido paratoluensulfnico en medio actico reacciona con el colesterol para formar un complejo que con anhdrido actico y cido sulfrico concentrado, se vuelve de color verde, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de colesterol presente. METODOLOGA

Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20min, y aadir en forma directa sobre la superficie del lquido 0.2ml de H2SO4 concentrado. Dejar 5 min y leer a 640nm.

Sustituir en la siguiente frmula = Abs problema [estndar]= para obtener los mg/dl. Abs patrn Valores normales 120-190mg/dl RESULTADOS

Reactivos problema patrn blanco

Suero no hemolizado

0.05ml ------- -------

Solucin patrn -------- 0.05ml ------- Agua destilada -------- -------- 0.05ml Reactivo de colesterol

2.0ml 2.0ml 2.0ml


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M E T A B O L I S M O P R O T E I C O INTRODUCCIN

Las protenas son macromolculas formadas por unidades bsicas llamadas aminocidos, los cuales poseen en su estructura un grupo amino que los caracteriza, y un esqueleto hidrocarbonado. Las protenas animales estn constituidas por veinte aminocidos diferentes, los cuales son necesarios para la sntesis de protenas corporales y otros compuestos nitrogenados.

En nuestro organismo las protenas estn siendo continuamente degradadas y resintetizadas. El proceso de intercambio de aminocidos entre los diferentes rganos y la permanente sntesis y degradacin es conocido como recambio proteico. Los procesos oxidativos y ciclos metablicos especficos de los aminocidos dan origen a productos nitrogenados residuales que son principalmente eliminados a travs de la va renal. El nitrgeno es adems eliminado por prdidas fecales y otras vas (sudor, piel y anexos), estas prdidas de nitrgeno deben ser compensadas por el aporte proteico de la dieta.

El mecanismo ms importante de eliminacin de nitrgeno es a travs de la orina, traducido en la excrecin de urea (nitrgeno ureico), y otros compuestos nitrogenados tales como amonio, cido rico, creatinina y aminocidos. La cuantificacin de las prdidas proteicas es un elemento importante durante la enfermedad puesto que las prdidas por vas no habituales (drenajes, fstulas, etc.) Pueden estar aumentadas, o bien la tolerancia a las protenas puede ser limitada, de esta forma la medicin de los requerimientos proteicos de cada paciente es importante para su adecuada nutricin.

La determinacin de nitrgeno ureico se puede hacer mediante la medicin de actividad de la ureasa en suero sanguneo, que es una enzima que hidroliza la urea rindiendo ion amonio y CO2. De esta manera multiplicando los valores de nitrgeno por su factor estequiometrico 2.14 obtenemos los valores de urea serica, y evaluar el funcionamiento fisiolgico de los procesos de eliminacin de nitrgeno.

La urea es la principal forma de eliminacin de nitrgeno a travs de los riones excretndola por medio de la orina. Esta urea procedente del suero sanguneo y alimentada por el hgado que es el rgano que realiza el ciclo de la urea.

La serie de reacciones que forman urea es conocido como el ciclo de la urea o el ciclo de krebs-henseleit, el amonio proviene de la glutamina en exceso por accin enzimatica de la glutaminasa rindiendo tambin glutamato.


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Como ya se mencion el nitrgeno se puede eliminar por medio de la creatinina. La creatinina es sintetizada en hgado por metilacin del guanidoacetato usando sam como donador del grupo metilo el guanidoacetato es formado en el rin por los aminocidos arginina y glicina.


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La creatinina es usado como almacn de un enlace fosfato de alta energa.

Un grupo fosfato es transferido a la creatinina, generando creatin fosfato, por accin de la enzima creatin fosfocinasa, la reaccin es reversible de tal manera que cuando se requiera energa la creatina fosfato transfiere su enlace de alta energa a el adp. La creatinina y la creatininfosfato son encontradas en msculo, cerebro y sangre la cantidad de creatinina producida esta relacionada con la masa muscular y se mantiene constante da con da. La creatinina es secretada por los riones y en funcin a el nivel de excrecin de ella se mide el funcionamiento del rin.

DETERMINACIN DE UREA Y CREATININA SRICA

OBJETIVO: Al finalizar esta prctica, el alumno deber tener los fundamentos para poder interpretar desde el punto de vista clnico, los resultados obtenidos de la cuantificacin de urea y creatinina de una muestra de suero de un paciente. PRERREQUISITOS:

1.- Describir los puntos principales del ciclo de la urea. 2.- Describir los mecanismos de produccin de la creatinina. 3.- Identificar los principales tejidos productores de urea y creatinina


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4.- Explicar las razones de la produccin de estos dos metabolitos por el humano. 5.- Cul es la funcin de la urea en el organismo? 6- Por qu los niveles de urea se elevan en el caso de la insuficiencia renal severa? 7.- Cmo estn los niveles de urea durante el embarazo y porque? INTRODUCCIN:

La urea es el principal producto de excrecin, proveniente del catabolismo de las protenas, el cual se origina a partir de los grupos amino de los aminocidos. Esta va, es el principal medio de excrecin de nitrgeno por el organismo. La urea es sintetizada en el hgado por medio del ciclo de la urea(descrito en 1932 por Sir Hans Krebs y Kurt Henseleit) tambin llamado ciclo de la ornitina, cuya funcin

fundamental es convertir el amoniaco y el bixido de carbono en urea. La urea es el producto final del metabolismo proteico; sintetizada por el hgado, transferida al torrente circulatorio y excretada por el rin. El nitrgeno ureico sanguneo (BUN) esta elevado en toda lesin renal, que perturbe su funcin excretora. L a urea tambin se eleva en casos de azoemia prerrenal (elevacin de los productos nitrogenados del metabolismo orgnico POR CAUSAS NO RENALES), que depende un bajo volumen plasmtico circulante, como ocurre en la hemorragia masiva, deshidratacin, hipotensin o choque. Est tambin elevada en los casos que cursen con catabolia protenica elevada, acompaada de baja eliminacin renal. Cuando los niveles de urea pasan de 214 mg/100 ml., aparecen depresin mental, somnolencia y desequilibrio hidroelectroltico, y si los niveles siguen aumentando, aparecer el coma urmico. Los niveles bajos de urea se observan en embarazo, hidratacin excesiva, hepatopatas graves y mal nutricin.

La creatinina se forma en los msculos a partir del fosfato de creatina. Un 2% de esta sustancia se convierte diariamente en esta sustancia. Es excretada por los riones, y en pequea cantidad por las heces. La creatinina libre que aparece en la sangre y orina no vuelve a ser utilizada. Esta se excreta en la orina de manera constante. En condiciones fisiolgicas normales a partir de la creatina en cantidades constantes. La creatinina normal del suero no se modifica ni con la dieta, edad, sexo, catabolia

protenica ni ejercicio. Sin embargo, con una ingesta proteica sustancial, que incluye una cantidad considerable de carne y con ejercicios intensos durante largos perodos, se han observado en sujetos jvenes sanos, excreciones urinarias de creatinina del orden del 2.5 a 2.7 g/24 hrs., pero con niveles sanguneos normales; por lo tanto, se deduce que los niveles


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sanguneos de creatinina en los sujetos normales son ms constantes que los niveles en la orina. La cifra normal esta comprendida entre 0.5 y 1.2 mg/100 ml de suero o plasma, y es proporcional a la masa muscular, por lo que en la mujer los niveles normales son ms bajos(0.5 a 1.0 mg/100ml). sus aumentos generalmente van parejos con los de la urea, aunque la creatinina tarda ms en subir. Cuando en la insuficiencia renal con uremia se encuentran cifras mayores de 5 mg/100 ml., el pronstico es mortal a corto plazo. Esta considerablemente elevada en las nefrosis por txicos. Se observa tambin cifras altas en los casos de obstruccin urinaria, las que se normalizan al ceder la obstruccin. METODOLOGA: Experimento No. 1.

Cuantificacin de urea srica.

REACTIVOS BLANCO PATRN o ESTANDAR PROBLEMA

Diacetil monoxima 1.5 ml. 1.5 ml. 1.5 ml.

Agua 0.05 ml ------- -------

Solucin patrn ------- 0.05 ml -------

Problema -------- --------- 0.05 ml

Reactivo cido 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml

Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 15 minutos. Enfriar al chorro de agua y leer ajustando con el blanco de reactivos a 520 nm. CLCULOS:

Urea = Absorbancia del problema X concentracin del patrn = mg/dl Absorbancia del patrn Urea = Nitrgeno ureico x 2.14 = mg/dl Nitrgeno ureico = Urea / 2.14 = mg/dl Valores normales: Nitrgeno ureico de 10 a 18 mg/dl Urea de 22 a 40 mg/ml. Experimento No. 2.

Determinacin de Creatinina.

El cido sulfrico reacciona con el tungstato de sodio para formar el cido tngstico el cual precipita a las protenas que son separadas por filtracin o centrifugacin.


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REACTIVOS BLANCO ESTANDAR PROBLEMA

AGUA DESTILADA 0.5 ml.

ST. CREATININA 0.5 ml

SUERO --------------- ------------------- 0.5 ml.

AC. PICRICO 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

SOLUCIN AMORTIGUADORA

1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Tomar primera lectura a 490 nm inmediatamente despus de adicionar los reactivos Reposar a Temp. ambiente por 10 min. y leer a 490 nm. Segunda lectura CALCULOS:

[Creatinina] = Abs. del problema(lectura 2- lectura 1) x concentracin del patrn = mg/dl

Abs. del patrn (lectura 2- lectura 1) Valores normales:

Varones: de 0.7 a 1-2 mg/dl Mujeres: de 0.5 a 1.0 mg/dl

CUANTIFICACIN DE PROTENAS SRICAS

OBJETIVO:

Conocer y practicar dos tcnicas de cuantificacin de protenas del suero y analizar los resultados en relacin a posibles anormalidades desde el punto de vista metablico. PRERREQUISITOS:

1.- Analizar el fundamento qumico de la reaccin de Biuret. 2.- Conocer el perfil protenico del suero. 3.- Analizar clnicamente el trmino protenas totales. 4.- Analice la estructura de la albmina y explique como esta protena funciona en el transporte de diferentes tipos de metabolitos por la circulacin sangunea. 5.- Mencione las funciones de las globulinas. INTRODUCCIN:

Una de las fracciones orgnicas ms importantes de la sangre es la de las protenas, tanto por su contenido porcentual como por las funciones que realizan. El contenido total de protenas del plasma es normalmente del orden de 5.7 a 8.0 g/dl. Las protenas sricas constituyen la mayor parte de los slidos del plasma y


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son una mezcla compleja de protenas simples y conjugadas como glucoprotenas y lipoprotenas. Las protenas del plasma estn constituidas en tres grupos principales: Albmina, globulinas y fibringeno. El fibringeno normalmente constituye del 4 al 6 % de las protenas plasmticas, es producido por el hgado y tiene importancia fundamental para la coagulacin de la sangre. La albmina es la principal protena del suero; se halla tambin en los espacios extravasculares, linfa y otros lquidos biolgicos como el amnitico, bilis, jugo gstrico, etc. Se encuentra en la orina de pacientes con enfermedades renales y es uno de los componentes principales del lquido del edema. Las dos funciones principales de la albmina plasmtica son: El mantenimiento de la presin coloidosmtica (que es una de las fuerzas termodinmicas que mantienen una perfusin constante en la circulacin capilar) y el transporte de algunos metabolitos tales como bilirrubinas, aminocidos, cidos grasos, enzimas, medicamentos, etc. La albmina es sintetizada por las clulas hepticas en una cantidad de 12 a 14 g/da. Las globulinas se dividen en tres grupos principales: globulinas alfa, beta y gamma. Las globulinas alfa y beta ejercen diversas funciones en la circulacin tales como transporte de metabolitos y de iones metlicos. Las globulinas gamma actan en la actividad inmunolgica ya que constituyen las inmunoglobulinas que resisten a la infeccin. La mayor parte de las globulinas alfa y beta son de origen heptico pero las gamma se pueden sintetizar en hgado y tejido linftico. El hgado es el centro principal de protenas plasmticas. La formacin de albmina y fibringeno parece estar limitada al hgado; aproximadamente el 80% de las globulinas se fabrican en el hgado, incluyendo las lipoprotenas. El principal papel del hgado en la sntesis protenica del plasma se refleja en la disminucin notable de albmina y fibringeno que tiene un lugar en tejido heptico daado, como se observa en pacientes con cirrosis o a consecuencia de una hepatotectoma experimental. Existen una gran cantidad de compuestos qumicos entre los cuales se incluyen a las drogas y los frmacos que afectan la integridad metablica de los hepatocitos. Algunos de ellos afectan la capacidad de sntesis de metabolitos como la albmina y en la mayora de los casos el efecto es tan drstico que puede llegar a ser letal. Dentro de los compuestos que han sido catalogados como hepato-txicos estn el cloroformo, el dinitrofenol, la clorpromazida, el fluoruracilo y la tetraciclina. Esta ltima afecta al hgado de una manera proporcional a la concentracin que se administra. En pacientes desnutridos la tetraciclina es hepatotxica a dosis mayores de 3 g/da y su efecto comienza a las 48 hrs. de administrarse esta dosis. Si la tetraciclina es un antibitico que a dosis mayores de 3 g/da disminuye el metabolismo del hepatocito y la albmina se sintetiza


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nicamente en el hgado, entonces, es factible encontrar bajos niveles de albmina srica en un individuo que ha sido tratado con altas dosis de este antibitico.

CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES

REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA

Reactivo de Biuret 2.5 ml. 2.5 ml. 2.5 ml.

Suero no hemolizado

------- ------- 0.1 ml

Solucin patrn ------- 0.1 ml -------

Solucin salina 0.89-0.9%)

0.1 ml -------- -------

Agitar los tubos y dejar reposar durante 15 minutos. Medir la absorbancia del patrn y del problema ajustando a cero con el blanco a

550 nm

Protenas totales = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl Absorbancia del patrn

CUANTIFICACION DE ALBMINA

Mezclar y dejar reposar los tubos durante 10 min. a temperatura ambiente. Medir la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el blanco a 640 nm. CALCULOS: ALBMINA = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl Absorbancia del patrn

PROTEINAS TOTALES ALBMINA = GLOBULINAS

REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA

Reactivo verde de bromocresol

3 ml. 3 ml. 3 ml.

Suero no hemolizado

-------- -------- 0.01 ml

Solucin patrn ------- 0.01 ml. ---------

Solucin salina 0.01 ml ------- --------


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CIDO RICO SUMARIO Y EXPLICACIN El cido rico del suero es el producto final del metabolismo de las purinas en los tejidos y es eliminado a travs de los riones por filtracin celular. Altos niveles de cido rico son el resultado de enfermedades como Leucemia, Policitema, la ingestin de comidas ricas en ncleo-protenas (por ejemplo hgado y rin) o cuando la funcin renal esta deteriorada. La gota resulta del deposito de cido rico en las articulaciones. El cido rico ha sido ensayado por una variedad de procedimientos incluyendo la reduccin del cido fosfotngstico (2), por medicin directa a 293 nm antes y despus del tratamiento con Uricasa (3), reduccin frrica (4) y mtodos enzimticos colorimtricos utilizando Uricasa. El procedimiento Uricasa cido rico Eagle es un mtodo enzimtico que utiliza la copulacin del 4 aminoantipirina 3-5 dicloro-2-hidroxibencenosulfonato peroxido de hidrogeno en presencia de peroxidasa para formar un complejo coloreado que se lee a 520 nanmetros. PRINCIPIO

El cido rico es oxidado por la Uricasa en Alantona y Peroxido de Hidrogeno. DHBS+4 amincantipirina + peroxido de hidrogeno, en presencia de peroxidasa forma un compuesto coloreado que se mide a 520 nm. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de cido rico en la muestra. INSTRUMENTOS Utilice un espectrofotmetro o colormetro calibrado a 520 nm. (Intervalo aceptable 500 540 nm.) Para su uso en instrumentos automatizados consulte el manual de aplicaciones. RECOLECCION DE LA MUESTRA PRECAUCIONES 1. Se recomienda el uso de suero no hemolizado 2. Muestras lipmicas requieren blanco de suero 3. Recoleccin de orina por 24 horas, puede ser utilizada. ALMACEN DE LA MUESTRA El cido rico permanece estable en el suero por 7 das a temperatura de 2-8 grados centgrados y por 6 meses en congelacin SUSTANCIAS INTERFERENTES Las muestras lipmicas requieren blanco de suero, la bilirrubina y el cido


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ascrbico pueden causar niveles bajos falsos. PROCEDIMIENTO MATERIAL PROPORCIONADO

Reactivo de Uricasa y Uricasa cido rico calibrador. MATERIAL REQUERIDO, PERO NO SUMINISTRADO 1. Pipetores de 0.05 ml. y 1.0 ml. 2. Incubadora capaz de mantener 37 grados centgrados 3. Cronometro, tubos de cultivo y soporte. CONDICIONES DE LA REACCION

Longitud de Onda 520 nm Seleccin de Filtros 500 550 nm Tipo de Reaccin Punto Final Temperatura de Incub. 37 grados centgrados Tiempo de Incub. 5 minutos Volumen muestra 0.025 ml Volumen reactivo 1.0 ml Volumen total 1.025 ml Normal bajo 1.5 mg/dl Normal alto 7.0 mg/dl Valor de calibrador 5.0 mg/dl PROCEDIMIENTO

1. Coloque 1.0 ml del reactivo de Uricasa dentro de los tubos etiquetados como: blanco de reactivos, calibrador, control, muestra 1, etc. 2. Precaliente tubos a 37 grados centigrados por 5 minutos 3. Aada 0.025 ml de muestra a los tubos respectivos 4. Incube los tubos a 37 grados centigrados por 5 minutos Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 520 nm usando blanco de reactivos. Lea y registre los valores de absorbancia para cada muestra. NOTA Para instrumentos de lectura directa ajuste a cero con el blanco de reactivo y con el calibrador ajuste la mezcla del valor del calibrador. Lea las concentraciones del problema directamente. ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL

Lea las muestras 10 minutos despus de desarrollado el color CALIBRACION El calibrador del cido rico Uricasa es proporcionado. Consulte los valores asignados en la etiqueta. No es necesario hacer curva de calibracin, la linealidad del procedimiento se extiende hasta 25 mg/dl. Valores por arriba


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de 25 mg/dl debern ser diluidos 1:1 con solucin salina y reensayados; el resultado se multiplica por dos. CONTROL DE CALIDAD La variedad de estos resultados deber ser monitoreada de rutina, usando materiales de control de calidad apropiados (normal y anormal) analizados de igual manera que los problemas. CLCULOS DE RESULTADOS

La siguiente ecuacin es usada para determinar la concentracin de la muestra desconocida. PROBLEMA(mg/dl) = ABS PROBLEMA x CONC. CALIBRADOR ABS. CALIBRADOR VALORES NORMALES

HOMBRES 3.5 7.0 mg/dl MUJERES 2.5 6.0 mg/dl ORINA 250 750 mg/dl


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A N E X O S PROTENAS

Estas son macr

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Manual Bioquimica II