7/28/2019 Malate Dehydrogenase Isoenzyme From Cotton Leaves
2/7
O'SULLIVAN AND W E D D I N Gm i x t u r e c o n t a i n e d 5 0
mm t r i s - H C l b u f f e r , pH 9 . 2 ; n e u t r a l i z e ds
o d i u m m a l a t e , 2 5 . 0 mM; DPN a d j u s t e d t o pH 5 .
5 , 1 . 0 mM;a n d t h e r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d b
y t h e a d d i t i o n t o 1 0 A 1 o fe n z y m e . O n e u n i t
o f m a l a t e d e h y d r o g e n a s e i s d e f i n e d a s a
namount o f e n z y m e w h i c h b r i n g s a b o u t t h e a p p
e a r a n c e o f 1 . 0, u m o l e o f DPNH p e r m i n .G e l F i
l t r a t i o n . T h e c o l u m n , S e p h a d e x G - 2 0 0 , B
l u e d e x t r a n ,a n d t h e r e f e r e n c e p r o t e i n s
u s e d f o r t h e g e l f i l t r a t i o n w e r e o b -t a i n
e d f r o m P h a r m a c i a L t d .T h e c o l u m n , 1 . 5 X 9
0 c m , w as p o u r e d w i t h d e a e ra t e dS e p h a d e x G
- 2 0 0 i n 5 0 mm t r i s - H C l b u f f e r , pH 7 . 5 , c o n t
a i n -i n g 0 . 5 M K C I a n d w a s w a s h e d w i t h 3 l i t
e r s o f t h i s b u f f e rb e f o r e e a c h c h r o m a t o g
r a p h i c r u n . S a m p l e s were a p p l i e d a sr e c o m m
e n d e d b y t h e m a k e r s , f o l l o w i n g a n d s u c c e
e d e d b y a na p p l i c a t i o n o f 10% ( w / v ) s u c r o s
e p r e p a r e d i n t h e e l u t i n gb u f f e r . U p w a r d
f l o w was u s e d , a n d 4 - m l f r a c t i o n s w e r e c o l
-l e c t e d i n a G i l s o n f r a c t i o n c o l l e c t o r a
t 4 C .T h e S e p h a d e x G - 2 0 0 c o l u m n w as c a l i b r
a t e d w i t h a l d o l a s e( m o l wt 1 5 8 , 0 0 0 ) , c h y
mo t ry p s i n ( mo l w t 7 5 , 0 0 0 ) , o v a l b u m i n( m o l
wt 4 5 , 0 0 0 ) , a n d r i b o n u c l e a s e ( m o l w t 1 3 ,
7 0 0 ) . B l u ed e x t r a n was u s e d t o d e t e r m i n e t
h e v o i d v o l u m e o f t h e c o l u m n .S a m p l e s o f e
n z y m e p r e p a r a t i o n ( 2 m l ) c o n t a i n i n g 5 0 t
o 1 0 0u n i t s o f m a l a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i
v i t y were a p p l i e d t o t h ec o l u m n a n d a f l o w r a
t e o f 6 m l / h r w as m a i n t a i n e d b y a d j u s t -i n g
t h e b u f f e r r e s e r v o i r .T h e c o l u m n e f f l u e
n t was m o n i t o r e d b y a r e c o r d i n g UVm o n i t o r ,
a n d t h e a b s o r b a n c e a t 2 8 0 nm w as m e a s u r e d i
n aB e c k m a n m o d e l DB-G s p e c t r o p h o t o m e t e r
.P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s .
P o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s was
c a r r i e d o u t a t pH 8 . 3 e s s e n t i a l l y a c c o r d
-i n g t o t h e m e t h o d o f D a v i s ( 7 ) u s i n g g e l s
o f d i f f e r e n t a c r y l a m i d ec o n c e n t r a t i o n
s a s d e s c r i b e d b y H e d r i c k a n d S m i t h ( 1 3 ) .
AB u c h l e r p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h
o r e s i s a p p a r a t u s ( P o l y -a n a l y s t M o d e l 3
- 1 7 5 0 ) was u s e d i n a s s o c i a t i o n w i t h a B u c h
l e rp o w e r s u p p l y , a n d t h e g e l c o l u m n s a n d
l o w e r b u f f e r c h a m b e rw e r e m a i n t a i n e d a t
0 t o 4 C b y c i r c u l a t i o n o f i c e w a t e r .T h e r u
n n i n g g e l w as 0 . 5 x 7 . 0 cm a n d w as p o l y m e r i z
e d w i t hammonium p e r s u l f a t e . T h e s p a c e r g e l w
a s o m i t t e d a n d 1 0 mMt r i s - 5 0 mm g l y c i n e b u f
f e r , pH 8 . 3 , w a s u s e d f o r e l e c t r o -p h o r e s i
s . T h e s a m p l e w a s m i x e d w i t h b r o m p h e n o l b
l u e a n da d d e d u n d e r t h e e l e c t r o d e b u f f e r
t o t h e t o p o f t h e r u n n i n g g e l .E l e c t r o p h o
r e s i s a t a c u r r e n t o f 3 t o 4 ma p e r t u b e w as c o
n -t i n u e d f o r 2 h r b y w h i c h t i m e t h e b r o m p h
e n o l b l u e m a r k e rf r o n t h a d m i g r a t e d t o w i
t h i n 0 . 5 cm o f t h e e n d o f t h e g e l .F o l l o w i n g
e l e c t r o p h o r e s i s , t h e g e l s wer e l o o s e n e d
w i t h an i c h r o m e w i r e u n d e r w a t e r a n d r e m o
v e d f r o m t h e g l a s s c o l -u m n s . T h e p o s i t i o
n o f t h e d y e f r o n t w a s m a r k e d b v i n s e r t -i n
g a s m a l l p i e c e o f w i r e i n t o t h e g e l ( 1 3 ) .P
r o t e i n b a n d s were d e t e c t e d b y s t a i n i n g w i
t h e i t h e r 1%( w / v ) a m i d o b l a c k i n 7% ( v / v ) a
c e t i c a c i d ( 7 ) o r w i t h o n e -t w e n t i e t h d i l
u t i o n o f 1% ( w / v ) c o o m a s s i e b l u e , warmed t o6
0 C , i n 1 2 . 5 % ( w / v ) t r i c h l o r o a c e t i c a c i d
( 6 ) . T h e p r o t e i ns t a i n e d g e l s wer e w a s h e d
f r e e o f e x c e s s d y e w i t h 7% ( v / v )a c e t i c a c i
d o r w i t h 10% ( w / v ) t r i c h l o r o a c e t i c a c i d r
e s p e c t i v e l yu n t i l t h e b a n d s were c l e a r .M a
l a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y w a s d e t e c t
e d b y i n c u b a t i n gt h e g e l s i n t h e d a r k a t 3 7
C i n a d e t e c t i o n medium p r e p a r e de s s e n t i a l l
y a s d e s c r i b e d b y F i n e a n d C o s t e l l o ( 9 ) a n
d c o n -t a i n i n g n e u t r a l i z e d m a l i c a c i d , 0
. 8 3 m M , DPN, a d j u s t e d t opH 5 . 5 , 0 . 1 8 m M , n i t
r o t e t r a z o l i u m b l u e , 0 . 1 m g / m l ; a n dp h e n
a z i n e m e t h o s u l f a t e 5 j t g / m l , p r e p a r e d i
n 1 0 mM t r i s -6 0 mm g l y c i n e b u f f e r , pH 8 . 3 . C o
l o r e d b a n d s were a l l o w e dt o d e v e l o p i n t h e d
a r k , g e n e r a l l y f o r 4 5 m i n , a n d t h e n w a s h e
ds e v e r a l t i m e s w i t h w a t e r .T h e p o s i t i o n o
f e a c h b a n d a p p e a r i n g o n a l l g e l s a n d t h a
to f t h e d y e f r o n t w a s r e c o r d e d t o w i t h i n 0
. 0 5 cm b y m ea nso f a t r a n s p a r e n t r u l e r . T h e r
e l a t i v e m o b i l i t y o f e a c h b a n d w a s
c a l c u l a t e d a n d p l o t s made o f t h e l o g o f r e
l a t i v e m o b i l i t yv e r s u s g e l c o n c e n t r a t i
o n ( 1 3 ) . T h e s l o p e s o f t h e l i n e s w e r eo b t a
i n e d b y f i t t i n g t h e l o g o f r e l a t i v e m o b i l
i t y a g a i n s t g e lc o n c e n t r a t i o n b y means o f a
l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s p r o -g r a m u s
i n g a Wa n g M o d e l 7 0 0 c a l c u l a t o r .S e m i p r e p
a r a t i v e P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o
r e s i s . F o rs e m i p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o
p h o r e s i s , o n e s a m p l e w a s r u n s i -m u l t a n e
o u s l y on t w e l v e 7% ( w /v ) a c r y l am i d e g e l s w i
t h c o n -d i t i o n s i d e n t i c a l t o t h o s e d e s c r
i b e d a b o v e .F o l l o w i n g e l e c t r o p h o r e s i s
, r e p r e s e n t a t i v e g e l s w e r e s t a i n e df o r m
a l a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y , a n d t h e o
t h e r g e l s w e r ep l a c e d i n a P e t r i d i s h a t 0 C
. Whe n t h e m a l a t e d e h y d r o g e n a s es t a i n s h a
d d e v e l o p e d i n t h e i n c u b a t e d g e l s , t h e y w
e r e r e m o v e d ,w a s h e d a n d p l a c e d b e s i d e t h
e u n s t a i n e d g e l s w i t h t h e t o p o ft h e g e l s ,
a n d t h e p o s i t i o n o f t h e b r o m p h e n o l b l u e f
r o n t i n l i n e .R e g i o n s e q u i v a l e n t t o t h e s
t a i n e d b a n d s w e r e t h e n c u t f r o mt h e u n s t a
i n e d g e l s w i t h a s h a r p b l a d e . T h e s e e q u i v
a l e n t b a n dr e g i o n s w e r e p o o l e d a n d m a c e r
a t e d w i t h a g l a s s r o d i n e i t h e r1 m l o f 5 0 mm t
r i s - H C l - 1 0 mm m e r c a p t o e t h a n o l b u f f e r ,
pH7 . 5 , o r i n 1 m l o f 5 0 mm t r i s - 0 . 3 M g l y c i n e
b u f f e r , pH 8 . 3 .RES ULTS
I n e a r l y e x p e r i m e n t s u s i n g p o l y a c r y l
a m i d e d i s c g e l e l e c t r o -p h o r e s i s f o r s e p
a r a t i o n o f m a l a t e d e h y d r o g e n a s e e n z y m e
s , i tw a s f o u n d t h a t t h e n u m b e r o f i s o e n z y
m e s d e t e c t e d was s o m e -w h a t v a r i a b l e . P r e
l i m i n a r y e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h e f a c t
t h a tt h e b a n d s c a n b e s t b e d i s t i n g u i s h e d
w h e n b e t w e e n 0 . 0 1 a n d0 . 1 u n i t o f m a l a t e d
e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y was a p p l i e d t o e a c
hg e l . C on c e n t r a t i on s a b o v e 0 . 1 u n i t l e d t
o b l u r r i n g o f t h es t a i n , a n d l o w e r c o n c e n
t r a t i o n s o f t o t a l m a l a t e d e h y d r o g e n a s
er e v e a l e d o n l y a s i n g l e b a n d t o w a r d s t h e
a n o d e . W h e n t o t a la c t i v i t y i n t h i s r a n g e
i s a p p l i e d t o e a c h g e l , f i v e m a l a t e d e -h y
d r o g e n a s e i s o e n z y m e s a r e r e p r o d u c i b l y
f o u n d i n c o t t o n l e a fp r e p a r a t i o n s . T h e d
i s t r i b u t i o n o f t h e s e f i v e i s o e n z y m e s ( A
, B ,C , D , a n d E ) i s s h o w n i n F i g u r e 1 a , w h e r
e i s o e n z y m e A i st h e most n e g a t i v e l y c h a r g e
d u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d a n d s oh a s moved
f u r t h e s t t o w a r d s t h e a n o d e i n t h i s 7% a c r
y l a m i d eg e l . I s o e n z y m e E g i v e s a f a i n t t h
i n b a n d w i t h c r u d e c o t t o nl e a f p r e p a r a t i
o n s a n d r e m a i n s c l o s e t o t h e o r i g i n u n d e r
n o r -m a l e l e c t r o p h o r e s i s c o n d i t i o n s i n
a 7% g e l .I n a d d i t i o n t o t h e s e f i v e g e n e r a l
l y o b s e r v e d m a l a t e d e h y -d r o g e n a s e i s o e
n z y m e s , t h e c o t t o n l e a f p r e p a r a t i o n s u n
i f o r m l yc o n t a i n e d a m a t e r i a l w h i c h p r o d
u c e d a r e d b a n d i n e a c h g e l( i n d i c a t e d b y
arrow i n F i g . 1 ) . T h e r e d c o l o r o f t h i s b a n d w
a sr e a d i l y d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h e b l u
e f o r m a z a n d e p o s i t s g i v e nb y t h e s u b s t r a
t e - s p e c i f i c m a l a t e d e h y d r o g e n a s e i s o e
n z y m e s .The f a c t t h a t t h i s r e d b a n d i s n o n s
p e c i f i c i s i n d i c a t e d b y c o n -t r o l s i n w h i
c h t h e r e d b a n d w as p r o d u c e d w h e n m a l a t e w
a sa b s e n t f r o m t h e s t a i n i n g m i x t u r e .E l e c
t r o p h o r e t i c D e t e r m i n a t i o n o f M o l e c u l a
r S i z e o f M a l a t eD e h y d r o g e n a s e I s o e n z y m
e s . U s i n g t h e t e c h n i q u e o f H e d r i c ka n d S m
i t h ( 1 3 ) , i n w h i c h p r o t e i n s a r e s e p a r a t e
d b y e l e c t r o -p h o r e s i s i n g e l s o f v a r y i n g
a c r y l a m i d e c o n c e n t r a t i o n , i t i s p o s -s i
b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n c h a r g e a n d s i
z e i s o m e r s a n d t oe s t i m a t e t h e m o l e c u l a r
w e i g h t o f t h e p r o t e i n s . T h e a p p l i c a t i o
no f t h i s t e c h n i q u e t o 3 0 t o 80% ammonium s u l f a t
e p r e c i p i t a t e so f c o t t o n l e a f e x t r a c t s i
s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . H e r e a r es h o w n
p l o t s o f l o g Rm 1 v e r s u s p e r c e n t a g e o f g e l
f o r t h e f i v em a l a t e d e h y d r o g e n a s e i s o e n
z y m e s d e t e c t e d i n t h e s e e x t r a c t s ,p l u s
two o t h e r c h a r a c t e r i s t i c b a n d s w h i c h a p p
e a r i n t h e s e g e l s .M a l a t e d e h y d r o g e n a s e
i s o e n z y m e s A , B , C , a n d D a p p e a r t ob e o f t h
e s a m e m o l e c u l a r s i z e a n d t o d i f f e r o n l y i
n n e t c h a r g e
' Rm i s t h e r a t i o o f t h e d i s t a n c e moved b y t h
e p r o t e i n b a n d t ot h e d i s t a n c e m o v e d b y b ro
m p he n o l b l u e i n c l u d e d i n t h e s a m p l ew h e n a
p p l i e d t o t h e g e l .
1 1 8 P l a n t P h y s i o l . V o l . 4 9 , 1 9 7 2
