Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Laboratorium voor Analytische Chemie
Academiejaar 2009-2010
MAGNESIUM – FARMACEUTISCHE CONTEXT, ANALYTISCHE METHODES EN VALIDATIE VAN EEN
IONENCHROMATOGRAFISCHE METHODE
Renate VAN DE VIJVER
Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor Prof. dr. L. Thienpont
Commissarissen Dr. K. Van Uytfanghe Prof. dr. W. Lambert
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
de resultaten uit deze masterproef.”
14 mei 2010
Promotor Auteur
Prof. dr. L. Thienpont Renate Van de Vijver
DANKWOORD
Hierbij wil ik mijn uitdrukkelijke dank betuigen aan een aantal personen die hebben
bijgedragen tot het tot stand komen van deze masterproef.
Mijn promotor Prof. dr. L. Thienpont voor de algemene leiding van de
onderzoeksstage en voor het nazicht van de afgeleverde masterproef.
Dr. D. Stöckl voor het bijbrengen van de statistische interpretatie, voor het
beantwoorden van alle mogelijke vragen en voor de begeleiding gedurende de hele
onderzoeksstage.
Dr. K. Van Uytfanghe voor het grondig nalezen van mijn masterproef.
De doctoraatsstudenten Hedwig Stepman en Sofie Van Houcke voor hun bijstand bij
het uitvoeren van de experimenten in het laboratorium.
Verder wil ik ook mijn medestudenten Sofie, Stefanie, Hanne, Elise en Lode
vermelden voor de aangename werksfeer in het labo en de toffe babbels.
Als laatste wil ik nog mijn ouders, mijn broer en mijn vriend Jochen bedanken voor de
steun en hun aanmoedigingen.
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING ............................................................................................................. 1
1.1 METHODEVALIDATIE...................................................................................... 1
1.2 MAGNESIUM.................................................................................................... 3
1.2.1 Structuur en eigenschappen ................................................................... 3
1.2.2 Functie....................................................................................................... 4
1.2.3. Voorkomen............................................................................................... 5
2. OBJECTIEVEN ...................................................................................................... 6
3. MATERIALEN EN METHODEN............................................................................. 7
3.1 MATERIALEN ................................................................................................... 7
3.2 STANDAARDEN EN STALEN .......................................................................... 7
3.2.1 Stockoplossing......................................................................................... 7
3.2.2 Stalen voor de verschillende validatie-experimenten ........................... 8
3.3 APPARATUUR................................................................................................ 10
3.3.1 Analyse.................................................................................................... 10
3.3.2 Randapparatuur...................................................................................... 11
3.4 METHODE ...................................................................................................... 11
3.4.1 Systeem functiecontrole........................................................................ 11
3.4.2 Systeem geschiktheidscontrole............................................................ 12
3.4.3 Analyse.................................................................................................... 13
3.5 VALIDATIE EXPERIMENTEN......................................................................... 14
3.5.1 Lineariteit ................................................................................................ 14
3.5.2 Kalibratiecurve........................................................................................ 15
3.5.3 Imprecisie................................................................................................ 15
3.5.4 Detectielimiet .......................................................................................... 16
3.5.5 Juistheid.................................................................................................. 17
3.5.6 Methodevergelijking............................................................................... 18
3.6 DATAVERWERKING EN STATISTIEK........................................................... 19
3.7 SPECIFICATIES ............................................................................................. 20
3.8 LITERATUURONDERZOEK........................................................................... 20
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ........................................................................... 22
4.1 SYSTEEM FUNCTIECONTROLE................................................................... 22
4.2 SYSTEEM GESCHIKTHEIDSCONTROLE..................................................... 22
4.3 LINEARITEIT .................................................................................................. 23
4.4 KALIBRATIECURVE....................................................................................... 24
4.5 IMPRECISIE ................................................................................................... 26
4.6 DETECTIELIMIET........................................................................................... 27
4.7 JUISTHEID ..................................................................................................... 29
4.8 METHODEVERGELIJKING ............................................................................ 31
4.9 LITERATUURONDERZOEK........................................................................... 34
4.9.1 Farmaceutisch gebruik van magnesium .............................................. 34
4.9.3 Analysemethoden voor magnesium ..................................................... 39
4.9.3 Detectielimiet .......................................................................................... 43
5. CONCLUSIE ........................................................................................................ 49
6. LITERATUURLIJST............................................................................................. 50
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
°C Graden Celsius
µg Microgram
µL Microliter
µS Microsiemens
ADP Adenosinedifosfaat
AES Atomaire emissiespectrometrie
AOAC Association Of Analytical Communities
ATP Adenosinetrifosfaat
BCFI Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie
BI Betrouwbaarheidsinterval
CLSI EP Clinical and Laboratory Standards Institute Evaluation Protocols
cm³ Kubieke centimeter
conc. Concentratie
CV Variatiecoëfficiënt (coefficient of variation)
CVBA Binnen-analyseserie variatiecoëfficiënt (coefficient of variation)
CVT Totale variatiecoëfficiënt (coefficient of variation)
DNA Desoxyribonucleïnezuur (deoxyribonucleic acid)
EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
FAAS Vlam (Flame) atomaire absorptiespectrometrie
g Gram
GLR Gewogen lineaire regressie
ICH International Conference on Harmonisation
IQC Interne kwaliteitscontrole (Internal Quality Control)
ISO International Organization for Standardization
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
J Joule
K Kelvin
kg Kilogram
kJ Kilojoule
L Liter
LoD Detectielimiet (Limit of Detection)
mg Miligram
Mg Magnesium
MgSO4x7H2O Magnesiumsulfaat heptahydraat
min Minuten
mL Mililiter
mmol Milimol
NADP+ Nicotineamine adenine dinucleotide fosfaat
ng Nanogram
NMR Nucleaire magnetische resonantie
OLR Ordinary least-squares regressie
PI Predictie-interval
psi Pound-force per square Inch (1 psi = 6,9 kPa)
p-waarde Probabiliteitswaarde
RNA Ribonucleïnezuur (ribonucleic acid)
SBA Binnen-analyseserie standaarddeviatie
SF Systematische fout
ST Totale fout
ST Totale standaarddeviatie
USP United States Pharmacopeia
V Volt
1
1. INLEIDING
1.1 METHODEVALIDATIE Validatie wordt volgens de “International Organization for Standardization”
(ISO) 9000 norm omschreven als de bevestiging, door het verstrekken van objectieve
bewijzen, dat aan de eisen voor een specifiek gebruik of toepassing voldaan is. Bij
een validatie wordt dus nagegaan of de analysemethode geschikt is om het
gewenste analyt te bepalen volgens vooropgestelde specificaties. Uit deze definitie
volgt dat het gebruik van de analysemethode moet gespecificeerd worden, de
aanvaardbaarheidscriteria vooraf moeten gedefinieerd worden, gegevens moeten
verzameld worden aan de hand van validatie-experimenten en de verkregen
validatiegegevens moeten geïnterpreteerd worden (Stöckl et al., 2009).
Voor het uitvoeren van een succesvolle validatie moeten verschillende
stappen ondernomen worden. De stappen die ondernomen worden voor de
methodevalidatie worden beschreven in een validatieplan. In Tabel 1.1 zijn de
stappen weergegeven die het validatieplan ten minste moet bevatten wanneer een
nieuw ontwikkelde analytische methode gevalideerd wordt. In deze masterproef
wordt een methodevalidatie gedaan van een reeds bestaande analysemethode,
enkele stappen van het validatieplan zullen dus niet worden uitgevoerd of zijn reeds
bepaald.
TABEL 1.1: VALIDATIEPLAN GEBRUIKT BIJ DE METHODEVALIDATIE VAN EEN NIEUW
ONTWIKKELDE ANALYSEMETHODE (Stöckl, 2007b).
- Definieer het gebruik, het doel en het bereik van de methode
- Definieer de prestatiekenmerken en de aanvaardbaarheidscriteria
- Ontwikkel een validatieprotocol of werkprocedure voor de validatie
- Bepaal de materialen bv. standaarden, reagentia en stalen
- Voer de validatie-experimenten uit
- Documenteer de validatie-experimenten en de resultaten in een validatierapport
- Interpreteer de validatiegegevens en maak op statistiek gebaseerde beslissingen
De prestatiekenmerken die bij de methodevalidatie kunnen geëvalueerd
worden zijn imprecisie, detectielimiet, werkgebied, lineariteit, terugvinding en
2
interferentie. Naast de evaluatie van deze prestatiekenmerken wordt een
methodevergelijking uitgevoerd waarbij een routinemethode wordt vergeleken met
ionenchromatografie als referentiemethode. Van de prestatiekenmerken die in deze
masterproef onderzocht worden, zijn de definities weergegeven in Tabel 1.2.
TABEL 1.2: DEFINITIES VAN DE PRESTATIEKENMERKEN DIE IN DEZE MASTERPROEF
ONDERZOCHT WORDEN.
Prestatiekenmerk Definitie
Precisie1 Mate van overeenkomst tussen de gemeten
hoeveelheden, verkregen door herhaalde metingen op
dezelfde of soortgelijke stalen onder vastgestelde
condities.
Imprecisie1 Numerieke maat voor de spreiding van de
analyseresultaten bekomen bij de precisie.
Detectielimiet1 Gemeten hoeveelheid, verkregen via een bepaalde
meetprocedure, waarbij de probabiliteit voor het vals
concluderen dat het analyt niet aanwezig is in het staal
β is en de probabiliteit voor het vals concluderen dat het
analyt aanwezig is in het staal α is.
Detectielimiet in analyse2 De detectielimiet, uitgedrukt als concentratie of
hoeveelheid, wordt afgeleid van de laagste meting die
met redelijke zekerheid kan gedetecteerd worden via
een gegeven analytische procedure.
Lineariteit3 Mogelijkheid van een analytische procedure om
resultaten te geven die evenredig zijn met de
concentratie van het analyt.
Juistheid1 Mate van overeenstemming tussen het gemiddelde van
een oneindig aantal herhaalde metingen en een
referentiewaarde. 1: “International vocabulary of metrology” (http://www.bipm.org/en/publications/guides/vim.html) 2: “International Union of Pure and Applied Chemistry” (IUPAC) (http:// goldbook.iupac.org/) 3: (Stöckl, 2007b)
3
De experimenten die gedurende de methodevalidatie uitgevoerd worden zijn
afhankelijk van de prestatiekenmerken die gevalideerd worden. In deze masterproef
worden de in Tabel 1.2 beschreven prestatiekenmerken experimenteel bepaald
volgens de “Clinical and Laboratory Standards Institute Evaluation Protocols” (CLSI
EP).
Om de prestatiekenmerken na de uitgevoerde experimenten te beoordelen
zijn er aanvaardbaarheidscriteria/specificaties nodig. De specificaties kunnen van
statistische, analytische of toepassingsafhankelijke aard zijn.
Toepassingsafhankelijke specificaties worden gedefinieerd in functie van het
specifieke gebruik van de methode. De verkregen testresultaten worden vergeleken
met de specificaties aan de hand van statistische testen of door het opstellen van
betrouwbaarheidsintervallen. Voor het vergelijken met de drie verschillende
specificaties zijn de statistische testen dezelfde, enkel de interpretatie van de
statistische test is verschillend. Bij een statistische specificatie wordt het resultaat
van de test vergeleken met de nulhypothese. Voor een analytische specificatie wordt
er vergeleken met een geschatte waarde voor een stabiel proces (Stöckl, 2007b).
1.2 MAGNESIUM
1.2.1 Structuur en eigenschappen Magnesium (Mg) behoort tot de groep van de aardalkalimetalen en bevat 2
valentie elektronen. Het atoomnummer van magnesium is 12, de atomaire massa
24.305 g/mol. Isotopen van magnesium zijn Mg24 (78.70%), Mg25 (10.13%) en Mg26
(11.17%). Magnesium is een zilverwit metaal met een hexagonale kristalstructuur.
Het oxideert traag in vochtige lucht. Voor de industriële bereiding van magnesium
wordt MgO-houdend materiaal gereduceerd. Magnesium is verkrijgbaar als
metaalstaaf, metaaldraad en als poeder. De reactie met water bij kamertemperatuur
verloopt traag, bij 100°C is magnesium beter oplosbaar in water. Magnesium is goed
oplosbaar in verdunde zuren. In Tabel 1.3 worden enkele andere fysische
eigenschappen van magnesium gegeven (The Merck Index, 2001).
4
TABEL 1.3: FYSISCHE EIGENSCHAPPEN VAN MAGNESIUM.
Smeltpunt 651°C
Kookpunt 1100°C
Specifieke dichtheid bij 20°C 1.738 g/cm³
Specifieke warmte bij 20°C 1020 J/kg.K
Smeltwarmte 8.954 kJ/mol
Standaardelektrodepotentiaal (Mg+2/Mg) -2.37 V
1.2.2 Functie Magnesium is het vierde meest voorkomende kation in het lichaam. De helft
van het totale magnesium komt voor in de beenderen, de andere helft in de spieren
en andere weefsels. Slechts 1% van het totale magnesium is aanwezig in het bloed.
Intracellulair is magnesium het tweede meest voorkomende divalente kation.
Het is betrokken bij meer dan 300 verschillende enzymatische reacties als ofwel een
structurele cofactor of een allosterische activator.
De voornaamste functie van magnesium is het stabiliseren van de structuur
van adenosinetrifosfaat (ATP) in ATP-afhankelijke enzymatische reacties.
Magnesium bindt tussen de fosfaatgroepen van ATP en adenosinedifosfaat (ADP).
Zo neutraliseert het de negatieve lading en vergemakkelijkt het de binding van de
nucleotide fosfaten aan de enzymen die het gebruiken als substraat. Magnesium
interageert dus zelf niet direct met de enzymen, maar is via het nucleotide substraat
verbonden aan het enzymcomplex. Hierdoor speelt magnesium een belangrijke rol in
alle nucleotide tri- of difosfaat afhankelijke enzymatische reacties in het metabolisme.
Binding van magnesium aan sommige enzymen of proteïnen is ook vereist om
hen te stabiliseren in de actieve conformatie of om de vorming van een actieve
bindingsite te activeren.
De enzymatische reacties waarbij magnesium betrokken is maken deel uit van
de cellulaire energieproductie en -opslag, proteïnesynthese, DNA- en RNA-synthese,
celgroei, adenylaatcyclase synthese, onderhouden van de cellulaire elektrolyt
samenstelling en stabilisatie van de mitochondriale membranen. Magnesium speelt
5
een belangrijke rol in de controle van de neuronale activiteit, cardiale prikkelbaarheid,
neuromusculaire geleiding, spiercontractie, vasomotorische tonus en de bloeddruk
(Bohl & Volpe, 2004).
1.2.3. Voorkomen Magnesium is aanwezig in diverse voedingsmiddelen. Groenten en granen
zijn rijk aan magnesium. Vlees en zuivelproducten bevatten minder magnesium.
Behandeling van het voedsel en bereidingstechnieken zorgen ervoor dat de
magnesiuminhoud van bloem, granen, rijst, groenten en suiker vermindert. Mineralen
gaan vaak verloren gedurende de opzuivering en de behandeling van het voedsel.
Ze worden dikwijls niet terug toegevoegd. Voedingsmiddelen rijk aan magnesium zijn
cacao, schelpdieren, garnalen, sojabonen, noten, groene groenten (chlorofyl bevat
een magnesiumatoom), ongepelde granen en noten. Drinkwater kan ook een
belangrijke bijdrage leveren aan de inname van magnesium, afhankelijk van het
magnesiumgehalte van het drinkwater (Bohl & Volpe, 2004).
6
2. OBJECTIEVEN
In het experimenteel gedeelte van deze masterproef wordt een
methodevalidatie van een ionenchromatografische methode voor de bepaling van
magnesium uitgevoerd. Hiervoor worden de lineariteit, imprecisie, juistheid en de
detectielimiet van de methode geëvalueerd. De verschillende validatie-experimenten
worden gepland, uitgevoerd, statistisch geïnterpreteerd en gerapporteerd. Vooraf
wordt ook gekeken welk kalibratiemodel het meest adequaat is om de concentratie
van magnesium te berekenen via de verkregen piekoppervlakte. In het experimenteel
gedeelte wordt verder nog een methodevergelijking uitgewerkt waarbij een
routinemethode voor de bepaling van magnesium wordt vergeleken met
ionenchromatografie als referentiemethode. Voor de methodevergelijking worden de
experimenten niet uitgevoerd, de resultaten worden gesimuleerd.
Naast de methodevalidatie wordt er in het experimenteel gedeelte ook
aandacht besteed aan de optimale werking van het toestel. Hiervoor worden
dagelijks voor de start van de experimenten een systeem functiecontrole en een
systeem geschiktheidscontrole uitgevoerd.
Het tweede deel van de masterproef bestaat uit een literatuuronderzoek.
Hierin worden het farmaceutisch gebruik van magnesium en andere
analysemethoden voor magnesium met hun voor- en nadelen besproken. Daarnaast
worden de verschillende mogelijkheden voor de bepaling van de detectielimiet als
onderdeel van de methodevalidatie besproken.
7
3. MATERIALEN EN METHODEN
3.1 MATERIALEN Voor de aanmaak van de magnesium stockoplossing en de testmix wordt
gebruik gemaakt van magnesiumsulfaat heptahydraat van Sigma Aldrich (St.Louis,
Verenigde Staten) met een zuiverheid van 100%. De testmix bevat ook
calciumdichloride dihydraat van Sigma Aldrich met een zuiverheid van 99%. Als
oplosmiddel wordt steeds gebruik gemaakt van ultrapuur water (GPR rectapur) van
VWR BDH prolabo (Leuven, België).
Voor de aanmaak van het eluens voor de ionenchromatografie wordt 465 mg
L-histidine van Sigma Aldrich afgewogen en gemengd met 300 mL ultrapuur water tot
al het histidine is opgelost. Hierna wordt 800 µL zwavelzuur van Acros Organics
(Geel, België) met zuiverheid 95-97% toegevoegd. Dit mengsel wordt verder
aangelengd tot 1L met ultrapuur water.
Het eluens wordt aangemaakt in plastieken maatkolven van 1L van Brand
(Wertheim, Duitsland).
De verschillende stalen worden aangemaakt en bewaard in plastieken
maatkolven van 100 mL en plastieken potjes met draaidop van Nalgene (Roskilde,
Denemarken).
3.2 STANDAARDEN EN STALEN Alle stalen worden bereid uitgaande van een stockoplossing voor magnesium.
De stalen worden gravimetrisch aangemaakt zodat de exacte concentratie van de
stalen uit de afgewogen hoeveelheden nauwkeurig kan berekend worden. De
aangemaakte stalen worden in de koelkast bewaard bij 4°C.
3.2.1 Stockoplossing Er wordt berekend hoeveel stockoplossing nodig is voor de aanmaak van de
verschillende stalen die nodig zijn voor de methodevalidatie. Uit de berekeningen
volgt dat 100 mL stockoplossing voldoende is voor de aanmaak van de verschillende
stalen. Voor de aanmaak van 100 mL stockoplossing wordt 0.2475 g MgSO4x7H2O
8
afgewogen op een analytische balans en aangelengd tot 100 mL. De finale
concentratie voor de stockoplossing bedraagt 2482 µg/g.
3.2.2 Stalen voor de verschillende validatie-experimenten 3.2.2.1 Lineariteit
De lineariteitsstalen worden aangemaakt volgens het alternatieve
mengprotocol beschreven in het CLSI EP6-protocol. In Tabel 3.1 wordt dit
alternatieve mengprotocol weergegeven.
TABEL 3.1: ALTERNATIEF MENGPROTOCOL VOOR DE AANMAAK VAN DE
LINEARITEITSSTALEN ZOALS BESCHREVEN IN HET CLSI EP6-PROTOCOL.
1. Laag
2. Laag medium: laag + medium (1:1)
3. Medium: laag + hoog (1:1)
4. Hoog medium: hoog + medium (1:1)
5. Hoog
De lineariteitsstalen moeten een concentratie hebben tussen ongeveer 6.163
µg/g en 320.5 µg/g voor een voldoende groot dynamisch bereik. Voor de aanmaak
van 100 mL lineariteitsstaal 5 in ultrapuur water wordt er 13 mL stockoplossing
gepipetteerd. De finale concentratie van lineariteitsstaal 5 is 326.5 µg/g.
Lineariteitsstaal 1 wordt aangemaakt uit lineariteitsstaal 5. Voor lineariteitsstaal 1 met
een concentratie van 6.112 µg/g wordt 1.887 mL lineariteitsstaal 5 aangelengd tot
100 mL. Voor de aanmaak van de andere lineariteitsstalen wordt het mengprotocol
beschreven in Tabel 3.1 gevolgd. Aan de hand van de massa’s van de gepipetteerde
stalen en toegevoegd oplosmiddel kan de concentratie van de verschillende stalen
berekend worden.
3.2.2.2 Kalibratiecurve
De stalen voor de kalibratiecurve worden op dezelfde manier aangemaakt als
de lineariteitsstalen onder 3.2.2.1 lineariteit besproken.
9
3.2.2.3 Imprecisie
Voor de bepaling van de imprecisie worden twee interne kwaliteitscontrole
(“Internal Quality Control”, IQC) stalen aangemaakt, een staal met een lage
concentratie en één met een hoge concentratie. Beide stalen worden bereid
uitgaande van de stockoplossing. Voor de aanmaak van het lage IQC-staal wordt 3
mL stockoplossing gepipetteerd en aangelengd tot 100 mL. Voor het hoge IQC-staal
wordt 10 mL stockoplossing aangelengd tot 100 mL. De finale concentraties voor het
lage en het hoge IQC-staal zijn respectievelijk 73.07 µg/g en 249.7 µg/g.
3.2.2.4 Detectielimiet
Voor de evaluatie van de detectielimiet wordt een staal aangemaakt waarvan
de signaal-over-ruisverhouding 5 tot 6 bedraagt. Dit staal wordt gemaakt uit
lineariteitsstaal 1. Om te weten hoeveel keer lineariteitsstaal 1 verdund moet worden,
wordt voor lineariteitsstaal 1 de gemiddelde signaal-over-ruisverhouding bepaald van
10 metingen (55). Lineariteitsstaal 1 wordt eerst 5 keer verdund. Bij deze eerste
verdunning wordt een signaal-over-ruisverhouding van 10 verkregen. Vervolgens
wordt nog 2 keer verdund. Bij het testen van het verkregen detectielimiet (“limit of
detection”, LoD) staal met een concentratie van 0.6159 µg/g wordt een signaal-over-
ruisverhouding van 7.0 gevonden.
3.2.2.5 Juistheid
De 5 stalen voor de evaluatie van de juistheid worden ter beschikking gesteld
door het labo analytische chemie. De stalen hebben een bereik van 10.92 µg/g tot
198.9 µg/g.
3.2.2.6 Systeemgeschiktheidstesten
Voor het testen van de geschiktheid van het systeem wordt een testmix ter
beschikking gesteld door het labo analytische chemie. De testmix bevat 107.9 µg/g
magnesium en 109.8 µg/g calcium.
3.2.2.7 Overzicht
De concentraties van de verschillende gebruikte stalen voor de
methodevalidatie worden weergegeven in Tabel 3.2.
10
TABEL 3.2: OVERZICHT VAN DE CONCENTRATIES VAN DE GEBRUIKTE STALEN
VOOR DE METHODEVALIDATIE VAN MAGNESIUM.
Prestatiekenmerk Staal Concentratie (µg/g)
Lineariteit Lin 1
Lin 2
Lin 3
Lin 4
Lin 5
6.112
85.87
165.7
246.2
326.5
Kalibratiecurve Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Cal 5
6.005
85.11
164.2
243.2
322.1
Imprecisie Lage IQC
Hoge IQC
73.07
249.7
Detectielimiet LoD 0.6159
Juistheid Onbekende 1
Onbekende 2
Onbekende 3
Onbekende 4
Onbekende 5
10.92
43.14
101.1
127.6
198.9
Systeemgeschiktheidstesten Testmix
Magnesium
Calcium
107.9
109.8
3.3 APPARATUUR
3.3.1 Analyse De analyse wordt uitgevoerd met een DX-100 ionenchromatograaf van
Dionex® (Sunnyvale, Verenigde Staten) uitgerust met een injectieloop van 40µL.
Voor de chromatografische scheiding wordt gebruik gemaakt van 2 Dionex® IonPac®
CG 10 kolommen (4 x 50 mm en partikelgrootte 8.5 µm). Het systeem bevat een
hulppomp die de kolomschakeling mogelijk maakt. De detectie van de ionen in de
mobiele fase is gebaseerd op conductiviteitsmeting. Het meten van de conductiviteit
11
van de ionen in de mobiele fase gebeurt na suppressie van de conductiviteit van de
achtergrondelektrolyten door de Dionex® “Cation Self-Regenerating Suppressor 300”
(CSRS®). De suppressor zet het sterke zuur aanwezig in het eluens om in H2O, H2
en O2.
Voor de besturing van het chromatografisch systeem wordt gebruik gemaakt
van de Chromeleon 6.8 (2002) software van Dionex®. Met dit programma worden ook
de chromatogrammen geregistreerd en de pieken geïntegreerd.
3.3.2 Randapparatuur Voor het afwegen van de materialen wordt gebruik gemaakt van de AT261
DeltaRange® analytische balans van Mettler Toledo (Greifensee, Zwitserland). Deze
balans weegt tot op 0.01 mg nauwkeurig af.
Het pipetteren van de stalen gebeurd met de 1-10 mL autoclavable pipet
Calibra 832 van Socorex (Ecublens, Zwitserland) en de 0.2-2 mL macropipette
Calibra 832 van Socorex.
Injectie van het staal in de ionenchromatograaf gebeurt met een 1mL spuit van
Becton Dickinson (Madrid, Spanje).
3.4 METHODE
3.4.1 Systeem functiecontrole Na het opstarten van het systeem worden enkele systeemparameters
gecontroleerd. Tot deze systeemparameters behoren de druk op de kolommen (psi),
de achtergrondconductiviteit (µS), de druk op de suppressor (psi) en de flow van de
suppressor (mL/min). De verkregen waarden voor de systeemparameters worden
vergeleken met normale waarden, ± 850 psi voor de druk op de kolommen en 2 à 3
µS voor de achtergrondconductiviteit. De druk op de suppressor wordt zo geregeld
dat de flow rond de 4 mL/min schommelt. De druk op de suppressor mag maximaal
25 psi bedragen.
12
3.4.2 Systeem geschiktheidscontrole Bij het begin van de dag wordt gecontroleerd of het systeem geschikt is om de
metingen uit te voeren. Dit wordt gedaan door een testmix te injecteren en hiervan de
chromatografische parameters te vergelijken met de vooropgestelde limieten in Tabel
3.3. In Tabel 3.4 worden enkele van deze chromatografische parameters
weergegeven met hun “United States Pharmacopeia” (USP) formules. Naast de
chromatografische parameters weergegeven in Tabel 3.4 wordt ook gekeken naar de
retentietijd, de piekoppervlakte en de piekhoogte.
TABEL 3.3: OVERZICHT VAN DE VOOROPGESTELDE LIMIETEN VOOR DE GEBRUIKTE
CHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS BIJ DE SYSTEEM
GESCHIKTHEIDSCONTROLE VOOR MAGNESIUM EN CALCIUM.
Chromatografische parameter
Limiet voor magnesium Limiet voor calcium
Retentietijd (min) 2.0 ± 0.2 3.5 ± 0.2
Piekhoogte (µS) > 140 > 200
Piekoppervlakte (µS*min) > 23.5 > 54
Capaciteitsfactor > 3 > 6
Resolutie > 4 > 4
Asymmetriefactor < 1.6 < 1.8
Theoretische platen > 800 > 1100
13
TABEL 3.4: GEBRUIKTE CHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS VOOR DE SYSTEEM
GESCHIKTHEIDSCONTROLE MET HUN USP-FORMULES.
Chromatografische
parameter
USP formule Verklaring van de symbolen
Capaciteitsfactor k’= t/t0-1 k’ = capaciteitsfactor
t = retentietijd (min)
t0 = dode tijd (min)
Resolutie R = 2 x tR-tRp/W+Wp
R = resolutie
tR = retentietijd van de laatst eluerende
piek (min)
tRp = retentietijd van de vorige piek
(min)
W = piekbreedte op de basislijn van de
laatst eluerende piek (min)
Wp = piekbreedte op de basislijn van de
vorige piek (min)
Asymmetriefactor Tf = W0.05/2 x a0.05 Tf = asymmetriefactor
W0.05 = piekbreedte op 5% van de
piekhoogte (min)
a0.05 = piekbreedte op 5% piekhoogte
van de start van de piek tot aan het
snijpunt van de loodrechte uit de top
van de piek (min)
Theoretisch
plaatgetal
N = 16 x (tR/W)² N = theoretisch plaatgetal
tR = retentietijd (min)
W = piekbreedte op de basislijn (min)
3.4.3 Analyse Voor de analyse van magnesium wordt gewerkt met een isocratisch systeem
waarbij een eluens wordt gebruikt dat bestaat uit 465 mg histidine en 800 µL
zwavelzuur aangelengd tot 1 L. Het debiet van de pomp wordt gedurende de analyse
ingesteld op 1.1 mL/min, de druk op de kolommen bedraagt ± 850 psi. De stalen
worden manueel geïnjecteerd in een injectieloop van 40 µL. Bij de injectie van de
14
stalen in de injectieloop wordt gebruik gemaakt van de overvultechniek. Er wordt 500
µL staal geïnjecteerd. De totale analysetijd bedraagt 5 minuten.
Gedurende de eerste 48 seconden van de analyse loopt het staal enkel over
de eerste kolom. Hierbij zullen vroeg eluerende componenten waarin we niet
geïnteresseerd zijn worden afgeleid naar het afvalvat. Calcium en magnesium
worden weerhouden. Na 48 seconden treedt er kolomschakeling op, het staal loopt
nu ook over de tweede kolom waarbij calcium en magnesium van elkaar gescheiden
worden. Vervolgens kan de concentratie van magnesium aanwezig in het staal
bepaald worden uit de piekoppervlakte. Via de kalibratiecurve van die dag wordt
gekeken met welke concentratie deze piekoppervlakte overeen komt.
3.5 VALIDATIE EXPERIMENTEN
3.5.1 Lineariteit Voor de evaluatie van de lineariteit wordt het CLSI EP5-protocol gevolgd. Er
worden 5 stalen 4 keer per dag gemeten gedurende 3 dagen. De stalen worden
achtereenvolgens gemeten in oplopende en aflopende volgorde.
Van de lineariteitsgegevens wordt een spreidingsdiagram en een residuplot
gemaakt. Deze geven een eerste aanwijzing voor lineariteit. Met behulp van de
residuplot worden de data visueel onderzocht op uitschieters. Potentiële uitschieters
worden aan een Grubbs-test onderworpen. Voor verdere interpretatie van de
gegevens wordt de uitschieter weggelaten.
De lineariteitsgegevens worden verder geëvalueerd met de “lack-of-fit” test en
de polynomiale fit test in CB-stat. De “lack-of-fit” test is een F-test waarbij gekeken
wordt of de variantie tussen de verschillende stalen groter is dan de variantie tussen
de verschillende metingen. Naargelang de gegevens homoscedastisch of
heteroscedastisch verdeeld zijn wordt er gebruik gemaakt van de “Ordinary least
squares” regressieanalyse of de gewogen lineaire regressieanalyse. Dit model is
echter gevoelig aan de spreiding van de resultaten, daarom wordt ook een tweede
orde polynomiale fit-test uitgevoerd. De tweede orde polynomiale fit-test is een t-test
waarbij wordt bepaald of de a-coëfficiënt in de vergelijking ax²+bx+c niet significant
15
verschillend is van 0. Wanneer de probabiliteitswaarde (p-waarde) voor beide testen
groter is dan 0.05 kan de nulhypothese voor lineariteit weerhouden worden.
3.5.2 Kalibratiecurve Afhankelijk van de uitkomst van de bepaling van de lineariteit van de methode
besproken onder 3.5.1 zal een lineaire of een tweedegraads kalibratiecurve worden
opgesteld.
Hierna wordt gekeken welk regressiemodel het meest adequaat is voor de
bepaling van de concentratie uit de piekoppervlakte aan de hand van de
kalibratiecurve. Indien de methode voldoet aan de voorwaarden voor lineariteit wordt
voor 5 verschillende meetdagen de kalibratiecurve opgesteld via 3 verschillende
regressiemodellen. Deze 3 verschillende regressiemodellen zijn de “ordinary least-
squares” regressie (OLR) analyse, de OLR-analyse waarbij de trendlijn wordt
geforceerd door 0 en de gewogen lineaire regressie (GLR) analyse. Vervolgens
worden voor de 5 verschillende meetdagen de concentraties van de LoD- en
imprecisiestalen via de 3 verschillende kalibratiecurven berekend. De gemiddelde
bekomen concentratie van de 5 meetdagen wordt bepaald voor de verschillende
regressiemodellen. Van deze gemiddelde concentraties worden de variatiecoëfficiënt
(“coefficient of variation”, CV) en de terugvinding (Formule 3.1) van de gravimetrisch
bepaalde concentratie van de stalen berekend. De regressieanalyse met de laagste
CV en de beste juistheid is de meest adequate.
Terugvinding % = (experimentele conc. – werkelijke conc.)*100 (3.1)
3.5.3 Imprecisie Voor de evaluatie van de imprecisie wordt het CLSI EP-5 protocol gevolgd.
Hiervoor worden 2 IQC-stalen, waarvan één met een lage concentratie en één met
een hoge concentratie gedurende 20 dagen in duplicaat gemeten.
Zowel voor het lage als het hoge IQC-staal wordt het verschil in concentratie
tussen de duplicaten berekend. De spreiding van de resultaten wordt beoordeeld in
een puntendiagram. Dit diagram geeft ons inzicht in de binnen-analyseserie
spreiding van de resultaten. Wanneer in dit diagram visueel een potentiële uitschieter
wordt waargenomen, wordt deze onderworpen aan een Grubbs-test. Voor verdere
16
interpretatie van de gegevens wordt de uitschieter weggelaten. Er wordt verder
gewerkt met het overblijvende meetresultaat van die dag en niet met het
daggemiddelde.
Van de aangepaste dataset worden de daggemiddelden uitgezet in een
puntendiagram. Dit puntendiagram geeft ons een beeld over de tussendag spreiding
van de resultaten. Wanneer in dit diagram een potentiële uitschieter wordt
waargenomen wordt deze onderworpen aan een Grubbs-test. De uitschieter wordt
weggelaten voor de eigenlijke evaluatie van de imprecisie.
Voor beide stalen worden het gemiddelde, de binnen-analyseserie
standaarddeviatie, de totale standaarddeviatie, de binnen-analyseserie CV en de
totale CV berekend. De verkregen CV’s worden zowel voor het lage als het hoge
IQC-staal vergeleken met de doelwaarden voor een stabiel proces. De doelwaarde
voor de binnen-analyseserie CV is 2%, voor de totale CV bedraagt deze 5%. Er is
aan de specificaties voldaan als de experimentele CV’s < doelwaarde voor de CV’s.
Als de experimentele CV’s groter zijn dan de doelwaarden voor een stabiel proces
wordt een Chi²-test uitgevoerd. Dit is een 1-zijdige “one sample” F-test waarbij wordt
gekeken of het 95% betrouwbaarheidinterval van de variantie van een
gegevensreeks de doelwaarde van de variantie voor een stabiel proces insluit. Er
wordt dus getest of de onderlimiet van het 95% betrouwbaarheidsinterval onder de
doelwaarde gelegen is. Er is aan de specificaties voldaan als de experimentele Chi²-
waarde ≤ de kritische Chi²-waarde.
3.5.4 Detectielimiet De validatie van de detectielimiet gebeurt via een algemeen aanvaard
protocol. Volgens dat protocol is de detectielimiet de absolute hoeveelheid
magnesium die aanleiding geeft tot een signaal-over-ruisverhouding van 3.
Om de detectielimiet te bepalen wordt een staal met een signaal-over-
ruisverhouding van ± 5/6 gedurende 20 dagen eenmaal per dag gemeten. Voor elke
meting wordt de signaal-over-ruisverhouding van het LoD-staal bepaald. Vanuit deze
signaal-over-ruisverhouding en met de kennis van de concentratie van het LoD-staal
kan de concentratie berekend worden die overeenstemt met een signaal-over-
17
ruisverhouding van 3. Door deze concentratie vervolgens te vermenigvuldigen met
het injectievolume (40 µL) wordt de absolute hoeveelheid (ng) van de detectielimiet
bepaald.
Van de verkregen absolute hoeveelheden wordt een puntendiagram gemaakt
waarbij de waarden worden gecontroleerd op de aanwezigheid van uitschieters.
Wanneer er visueel een potentiële uitschieter aanwezig is, wordt deze onderworpen
aan een Grubbs-test. Als deze test positief is, wordt de uitschieter voor de verdere
evaluatie weggelaten. De detectielimiet wordt berekend uit het gemiddelde van de
absolute hoeveelheden met het 95% betrouwbaarheidsinterval (Formule 3.2). De
bovengrens van dit 95% betrouwbaarheidsinterval wordt vergeleken met de gestelde
limiet van 30.0 ng.
95% BI = gemiddelde ± t α,n-1 • s/√n (3.2)
Waarin: 95% BI = 95% betrouwbaarheidsinterval
s = standaarddeviatie
n = aantal gegevens
α = probabiliteit (1-zijdig, 95%)
3.5.5 Juistheid Voor de evaluatie van de juistheid worden 5 stalen in duplicaat gemeten
gedurende 5 dagen. De spreiding van de data wordt eerst beoordeeld in het
puntendiagram waarin het verschil tussen de concentraties van de duplicaten is
uitgezet. Wanneer uit dit diagram blijkt dat er het vermoeden is van een uitschieter
dient dit onderzocht te worden met een Grubbs-test. Als uit de Grubbs-test het
vermoeden van een uitschieter bevestigd wordt, dan wordt deze verwijderd. Dit
omdat de uitschieters de ligging van het gemiddelde zullen beïnvloeden. Er wordt
verder gewerkt met het overblijvende meetresultaat van die dag en niet met het
daggemiddelde.
Van de aangepaste dataset worden de daggemiddelden uitgezet in een
puntendiagram voor alle onbekenden. Voor de uitschieterdetectie wordt dezelfde
procedure gevolgd als hierboven beschreven. Wanneer er een uitschieter aanwezig
is in de daggemiddelden voor een bepaalde onbekende wordt deze verwijderd. Na
18
deze eventuele aanpassingen mogen er in het verschildiagram geen uitschieters
meer aanwezig zijn.
Voor de eigenlijke interpretatie van de gegevens wordt gekeken naar het
procentueel verhoudingsdiagram. In deze grafiek wordt de terugvinding van de
doelwaarde (Formule 3.3) voor alle onbekenden uitgedrukt in percent.
Terugvinding (%) = 100 * (gemeten waarde/doelwaarde) ± 95%BI (3.3)
Waarin: BI= betrouwbaarheidsinterval
Bij de evaluatie van de juistheid mogen de limieten van 95% en 105% niet
overschreden worden. De overschrijding van deze limieten wordt ook onderzocht met
een 1-zijdige “one sample” t-test.
3.5.6 Methodevergelijking Voor deze methodevergelijking worden de resultaten van de analyse met een
routinemethode vergeleken met de resultaten van een referentiemethode voor
eenzelfde staal. Volgens het CLSI EP9-protocol moeten minstens 40 stalen in
duplicaat gemeten worden gespreid over 5 dagen. Voor onze methodevergelijking
worden 80 resultaten gesimuleerd met de DataGeneration Excel file, ter beschikking
gesteld door Dr. Stöckl, STT consulting. Voor de referentiemethode,
ionenchromatografie wordt het bereik van de meetwaarden bepaald door de
serumwaarden voor hypo- en hypermagnesemie. Deze waarden zijn respectievelijk
0.3 mmol/L (Cundy & Dissanayake, 2008) en 3.5 mmol/L (Zaman & Abreo, 2003). Als
routinemethode wordt de OSR 6189 Beckman Coulter magnesiumtest gebruikt. Dit is
een fotometrische test voor de kwantitatieve bepaling van magnesium in humaan
plasma. De CV voor deze methode is 1.20% (Beckman Coulter®, 2009).
Om te kijken of aan de vooropgestelde specificaties voldaan is, wordt gebruik
gemaakt van een Bland-Altman grafiek en de lineaire regressieanalyse. In de Bland-
Altman grafiek wordt het procentueel verschil tussen de meetresultaten van de
routinemethode en de referentiemethode uitgezet in functie van de meetresultaten
van de referentiemethode. In de grafiek worden ook het gemiddelde verschil en het
1.96 CV verschil tussen beide methoden met hun 95% betrouwbaarheidsintervallen
19
weergegeven. Voor de interpretatie van de Bland-Altman grafiek wordt gekeken of
het gemiddelde verschil met zijn 95% betrouwbaarheidsinterval binnen de limieten
voor de systematische fout valt en of het 1.96 CV verschil met zijn 95%
betrouwbaarheidsinterval binnen de limieten voor de totale fout valt.
De meetresultaten van de routinemethode versus de referentiemethode
worden ook onderzocht via de lineaire regressieanalyse. Hierbij wordt gekeken of de
richtingscoëfficiënt van de verkregen regressievergelijking verschillend is van 1 en of
het snijpunt met de y-as verschillend is van 0. Wanneer de richtingscoëfficiënt
verschillend is van 1 wijst dit op een proportionele systematische fout. Is het snijpunt
met de y-as verschillend van 0 wijst dit op een constante systematische fout. Indien
deze fouten aanwezig zijn, wordt gekeken of de afwijking binnen de vooropgestelde
specificaties ligt voor de systematische en totale fout. Hiervoor worden voor de
minimum en maximum verkregen concentraties bij de referentiemethode de
bijhorende y-waarden berekend met behulp van de regressievergelijking. Er wordt
gekeken of deze voorspelde y-waarden met hun 95% betrouwbaarheidsinterval
binnen de specificaties voor de systematische fout vallen. Hierna wordt ook het 95%
predictie-interval rond de voorspelde y-waarden berekend. Dit interval moet binnen
de specificaties voor de totale fout liggen.
3.6 DATAVERWERKING EN STATISTIEK Het opstellen van de kalibratiecurve en het berekenen van de concentratie die
bij een bepaalde piekoppervlakte hoort, gebeurt in Microsoft Office Excel 2003
(Microsoft Corporation, Verenigde Staten).
Voor de statistische evaluatie van de resultaten wordt gebruik gemaakt van de
MethVal Excel file opgesteld in Microsoft Office Excel 2003 ter beschikking gesteld
door Dr. Stöckl, STT consulting. Voor de statistische interpretatie van de gegevens
wordt gebruik gemaakt van twee boeken die ter beschikking werden gesteld door Dr.
Stöckl, STT consulting. Deze boeken zijn Laboratory Statistics & Graphics with
excel® (Stöckl, 2007a) en Method validation With Confidence (Stöckl, 2007b).
20
De “lack-of-fit” test en de polynomiale fit test die worden gebruikt voor de
evaluatie van de lineariteit en het opstellen van de kalibratiecurve via de gewogen
lineaire regressieanalyse gebeuren in CBstat5 versie 5.1.0 (2005, Kristian Linnet,
Charlottenlund, Denemarken).
3.7 SPECIFICATIES In Tabel 3.5 wordt een overzicht gegeven van de specificaties die horen bij de
verschillende prestatiekenmerken die bij deze methodevalidatie worden geëvalueerd.
TABEL 3.5: OVERZICHT VAN DE SPECIFICATIES VOOR DE VERSCHILLENDE
PRESTATIEKENMERKEN DIE WORDEN ONDERZOCHT BIJ DEZE
METHODEVALIDATIE.
Prestatiekenmerk Specificatie
Lineariteit 5%a
Imprecisie: binnen-analyseserie CV 2%b
Imprecisie: totale CV 5%b
Detectielimiet 30.0 nga
Juistheid 5%a
Methodevergelijking: systematische fout 5%a
Methodevergelijking: totale fout 15%a a: limiet b: doelwaarde voor een stabiel proces
3.8 LITERATUURONDERZOEK Voor het literatuuronderzoek wordt naar informatie gezocht over het
farmaceutisch gebruik van magnesium, andere analysemethoden voor de bepaling
van magnesium en methodevalidatie meer bepaald de verschillende mogelijkheden
voor de bepaling van de detectielimiet. In Tabel 3.6 wordt een overzicht gegeven van
de geraadpleegde informatiebronnen voor deze verschillende zoekopdrachten. De
gebruikte zoekwoorden, aantal hits en opmerkingen bij de zoekopdracht worden voor
de verschillende onderdelen van het literatuuronderzoek apart besproken bij
resultaten en discussie.
21
TABEL 3.6: OVERZICHT VAN DE GEBRUIKTE INFORMATIEBRONNEN BIJ HET
LITERATUURONDERZOEK.
Algemene zoekmachines Google (http://www.google.be)
Wetenschappelijke
zoekmachines
- Pubmed
- Web of science
- Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische
Informatie (BCFI) (http://www.bcfi.be)
- farmaceutisch kompas (http://www.fk.cvz.nl)
22
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1 SYSTEEM FUNCTIECONTROLE De druk op de kolommen was gedurende de verschillende meetdagen
gemiddeld 860 psi. Deze druk schommelde tussen 800 en 940 psi. De
achtergrondconductiviteit bleef gedurende de verschillende meetdagen constant rond
de 2 µS. De druk op de suppressor werd zo geregeld dat de flow bij elke meetdag
rond de 4 mL/min schommelde. Om een flow van 4 mL/min te bekomen varieerde de
druk op de suppressor van 9 tot 17 psi. Dit toont aan dat het systeem tijdens de
methodevalidatie naar behoren werkte.
4.2 SYSTEEM GESCHIKTHEIDSCONTROLE Voor de systeem geschiktheidscontrole wordt bij het begin van de dag de
testmix geïnjecteerd. In Figuur 4.1 wordt een voorbeeld chromatogram van de
testmix gegeven.
0
50
100
150
200
250
0 1 2 3 4 5
Tijd (min)
Piek
hoog
te (µ
S)
FIGUUR 4.1: VOORBEELD CHROMATOGRAM VAN DE TESMIX. DE EERSTE PIEK IS
AFKOMSTIG VAN MAGNESIUM, DE TWEEDE VAN CALCIUM.
In Tabel 4.1 en 4.2 wordt een overzicht gegeven van het gemiddelde ± de
standaarddeviatie van de onderzochte chromatografische parameters voor
magnesium en calcium. Voor alle chromatografische parameters voldoet het
gemiddelde ± standaarddeviatie aan de vooropgestelde limieten. Het systeem wordt
geschikt bevonden om de metingen uit te voeren.
23
TABEL 4.1: OVERZICHT VAN DE CHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS MET HUN
LIMIETEN VOOR MAGNESIUM.
Gemiddelde -SD +SD Limieten Retentietijd (min) 2.06 2.03 2.08 2.0 ± 0.2 Piekhoogte (µS) 159 152 167 > 140 Piekopp (µS*min) 28.5 26.3 30.7 > 23.5 Capaciteitsfactor 3.48 3.42 3.53 > 3 Resolutie 4.11 4.08 4.15 > 4 Asymmetriefactor 1.42 1.35 1.48 < 1.6 Theoretisch plaatgetal
897 851 944 > 800
TABEL 4.2: OVERZICHT VAN DE CHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS MET HUN
LIMIETEN VOOR CALCIUM.
Gemiddelde -SD +SD Limieten Retentietijd (min) 3.45 3.40 3.50 3.5 ± 0.2 Piekhoogte (µS) 208 205 211 > 200 Piekopp (µS*min) 56.5 55.6 57.5 > 54 Capaciteitsfactor 6.50 6.39 6.61 > 6 Asymmetriefactor 1.68 1.65 1.72 < 1.8 Theoretisch plaatgetal
1183 1160 1206 > 1100
4.3 LINEARITEIT Voor de evaluatie van de lineariteit worden 5 stalen 4 keer per dag gemeten
gedurende 3 dagen. Vooraleer de lineariteitsgegevens worden geïnterpreteerd wordt
er gekeken of er geen uitschieters aanwezig zijn in de residuplot. Figuur 4.2A en B
geven als voorbeeld de data weer van de metingen op 10/03/2010. Uit Figuur 4.2B
kunnen we vermoeden dat er bij staal 5 een uitschieter aanwezig is. Om dit te testen
wordt een Grubbs-test uitgevoerd. Deze test is positief dus er is een uitschieter
aanwezig. De Grubbs test is ook positief voor staal 3 van de lineariteitsmetingen op
11/03/2010. Voor de verdere interpretatie van de gegevens worden de uitschieters
weggelaten.
Uit Figuur 4.2A kan geen besluit genomen worden met betrekking tot lineariteit
van de gegevens. Het is beter om te kijken naar de residuplot in Figuur 4.2B. Uit
deze figuur vermoeden we een lineair verloop van de gegevens.
24
y = 0.2314x + 0.1768R2 = 0.9999
0.010.020.030.040.050.060.070.080.0
0 100 200 300
A Concentratie (µg/g)
Pie
kopp
ervl
akte
(µS
*min
)
-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.0
0 100 200 300
B Concentratie (µg/g)
Resi
du (µ
g/g)
FIGUUR 4.2 (A) SPREIDINGSDIAGRAM VAN DE LINEARITEITSMETINGEN OP
10/03/2010. (B) RESIDUPLOT VAN DE LINEARITEITSMETINGEN OP 10/03/2010.
De lineariteitsdata worden verder geëvalueerd via de “lack-of-fit” test en de
polynomiale fit test. Voor de “lack-of-fit” test wordt de gewogen lineaire
regressieanalyse gebruikt omdat er een trend is van spreiding van de resultaten. De
p-waarde voor de “lack-of-fit” test is 0.1333. Voor de andere meetdagen is de p-
waarde voor de “lack-of-fit” test 0.9237 en 0.9119. De nulhypothese voor lineariteit
kan weerhouden worden. Voor de polynomiale fit test wordt een p-waarde van
0.0606 verkregen. Voor de andere meetdagen is de p-waarde voor deze test 0.2680
en 0.2424. De nulhypothese van lineariteit kan ook hier weerhouden worden.
4.4 KALIBRATIECURVE Er wordt gekeken welk regressiemodel het meest adequaat is om de
concentratie te berekenen uitgaande van de piekoppervlakte. De CV’s en de
terugvinding van de concentraties van het lage IQC-staal, het hoge IQC-staal en het
LoD-staal berekend via de verschillende kalibratiecurven worden weergegeven in
Tabel 4.3. Uit Tabel 4.3 kunnen we afleiden dat het OLR-model waarbij de trendlijn
wordt geforceerd door 0 de laagste CV geeft en dus het meest robuuste
regressiemodel is. Ook kunnen we uit Tabel 4.3 afleiden dat het OLR-model waarbij
de trendlijn wordt geforceerd door 0 de beste terugvinding geeft van de werkelijke
concentratie.
25
TABEL 4.3 OVERZICHT VAN DE CV’S EN DE TERUGVINDING VOOR DE BEREKENDE
CONCENTRATIES VAN HET LAGE IQC-STAAL, HET HOGE IQC-STAAL EN HET LOD-
STAAL UITGAANDE VAN DE VERSCHILLENDE KALIBRATIECURVEN.
OLR OLR geforceerd door 0 GLR
Lage IQC
CV (%) 2.8 2.2 2.8
Terugvinding (%) 98.2 98.8 98.1
Hoge IQC
CV (%) 2.2 2.2 2.9
Terugvinding (%) 100.1 100.1 100.4
LoD
CV (%) 2217 11.1 559
Terugvinding (%) 14.4 122.4 -37.9
Voor het opstellen van de kalibratiecurve wordt het OLR-model gebruikt
waarbij de trendlijn wordt geforceerd door 0. Dit regressiemodel is het meest
robuuste en juiste voor de berekening van de concentratie uit de piekoppervlakte. In
Figuur 4.3 wordt een voorbeeld gegeven van een kalibratiecurve opgesteld via de
OLR geforceerd door 0.
y = 0.2271xR2 = 0.9998
0
20
40
60
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Concentratie (µg/g)
Piek
oppe
rvla
kte
(µS*
min
)
FIGUUR 4.3: VOORBEELD VAN EEN KALIBRATIECURVE OPGESTELD VIA DE OLR
GEFORCEERD DOOR 0.
26
4.5 IMPRECISIE Voor de evaluatie van de imprecisie worden een laag en hoog IQC-staal
gedurende 20 dagen 2 keer per dag gemeten. Er wordt eerst gekeken naar de
binnen-analyseserie spreiding van de resultaten. In Figuur 4.4A wordt deze spreiding
als voorbeeld weergegeven voor het lage IQC-staal. De resultaten vertonen een
regelmatige spreiding. De resultaten worden verder onderworpen aan een Grubbs-
test waarbij geen uitschieter wordt gevonden. Voor de tussendag spreiding wordt
gekeken naar het puntendiagram van de daggemiddelde concentratie. Dit diagram is
als voorbeeld weergegeven in Figuur 4.4B voor het lage IQC-staal. In deze figuur
wordt een potentiële uitschieter waargenomen. De resultaten worden onderworpen
aan een Grubbs-test die de uitschieter bevestigt. Deze uitschieter wordt voor de
verdere interpretatie van de resultaten weggelaten.
-3
-2
-1
0
1
2
3
1
A Lage IQC
Ver
schi
l in
conc
entra
tie tu
ssen
de
dupl
icat
en (µ
g/g)
63
68
73
78
B Lage IQC
Dag
gem
idde
lde
conc
entra
tie (µ
g/g)
FIGUUR 4.4: (A) PUNTENDIAGRAM VAN HET VERSCHIL IN CONCENTRATIE TUSSEN
DE DUPLICATEN VOOR HET LAGE IQC-STAAL. (B) PUNTENDIAGRAM VAN DE
DAGGEMIDDELDE CONCENTRATIES VOOR HET LAGE IQC-STAAL.
Voor het hoge IQC-staal kunnen dezelfde diagrammen gemaakt worden. In
het puntendiagram van het verschil in concentratie tussen de duplicaten bestaat het
vermoeden dat twee punten uitschieters zijn. De gegevens worden onderworpen aan
een Grubbs-test. Het resultaat van deze test is negatief. Er wordt verder gekeken
27
naar de tussendag spreiding van de resultaten. Ook hier bestaat het vermoeden van
een uitschieter. Het vermoeden van de uitschieter wordt bevestigd door de Grubbs-
test. De uitschieter wordt voor de verdere interpretatie weggelaten.
Voor de evaluatie van de imprecisie worden het gemiddelde, de binnen-
analyseserie standaarddeviatie (SBA), de totale standaarddeviatie (ST), de binnen-
analyseserie CV (CVBA) en de totale CV (CVT) berekend. De resultaten van deze
berekeningen worden zowel voor het lage als het hoge IQC-staal weergegeven in
Tabel 4.4.
TABEL 4.4: OVERZICHT VAN HET BEREKENDE GEMIDDELDE, SBA ,ST ,CVBA ,CVT VOOR
HET LAGE EN HOGE IQC-STAAL.
Gemiddelde (µg/g) SBA (µg/g) ST (µg/g) CVBA (%) CVT (%)
Lage IQC 73.5 1.21 2.00 1.7 2.7
Hoge IQC 250 2.51 3.88 1.0 1.6
De berekende CVBA en CVT worden vergeleken met de doelwaarden
voor een stabiel proces. Zowel voor het lage- als het hoge IQC-staal is de berekende
CVBA kleiner dan de doelwaarde van 2%. Ook de berekende CVT is voor beide stalen
kleiner dan de doelwaarde van 5%. Beide stalen voldoen aan de specificaties voor
de binnen-analyseserie CV en de totale CV.
4.6 DETECTIELIMIET Voor de evaluatie van de detectielimiet wordt een staal met een signaal-over-
ruisverhouding van 5/6 gedurende 20 dagen één keer per dag gemeten. In Figuur
4.5 wordt een voorbeeld chromatogram gegeven voor de bepaling van de signaal-
over-ruisverhouding van het LoD-staal.
28
FIGUUR 4.5: VOORBEELD CHROMATOGRAM VOOR DE BEPALING VAN DE SIGNAAL-
OVER-RUISVERHOUDING VAN HET LOD-STAAL WAARIN 1 HET SIGNAAL IS EN 2 DE
RUIS.
De absolute hoeveelheden die aanleiding geven tot een signaal-over-
ruisverhouding van 3 worden berekend en uitgezet in een puntendiagram. In het
puntendiagram in Figuur 4.6 wordt een regelmatige spreiding van de resultaten
verkregen. Er bestaat geen vermoeden van een uitschieter. De gegevens worden
onderworpen aan een Grubbs-test. Deze test is negatief. Er is dus geen uitschieter
aanwezig in de resultaten.
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
LoD
Abs
olut
e ho
evee
lhei
d m
agne
sium
(n
g)
FIGUUR 4.6: PUNTENDIAGRAM VAN DE ABSOLUTE HOEVEELHEID MAGNESIUM DIE
AANLEIDING GEEFT TOT EEN SIGNAAL-OVER-RUISVERHOUDING VAN 3.
1
2
29
De gemiddelde absolute hoeveelheid die aanleiding geeft tot een signaal-over-
ruisverhouding van 3 is 17.93 ng met 95% betrouwbaarheidsinterval [16.18ng –
19.68ng]. De bovengrens van het 95% betrouwbaarheidsinterval overschrijdt de
specificatie van 30 ng niet.
4.7 JUISTHEID Voor de evaluatie van de juistheid worden 5 stalen in duplicaat gemeten
gedurende 5 dagen. Er wordt eerst gekeken of er uitschieters aanwezig zijn in het
puntendiagram van de verschillen in concentratie tussen de duplicaten. Figuur 4.7A
toont als voorbeeld het resultaat voor onbekende 1. Voor alle onbekenden zijn in dit
diagram geen uitschieters aanwezig. Het puntendiagram van de daggemiddelden
wordt geconstrueerd met de oorspronkelijke dataset. Het puntendiagram van de
daggemiddelden wordt als voorbeeld weergegeven voor onbekende 1 in Figuur 4.7B.
In deze figuur wordt voor onbekende 1 een uitschieter gezien. Deze uitschieter wordt
bevestigd in de Grubbs-test en zal voor de verdere evaluatie weggelaten worden. Op
de uitschieter na zijn de gegevens in Figuur 4.7B gelijkmatig verdeeld. Eenzelfde
gelijkmatige verdeling wordt ook voor de andere onbekenden verkregen.
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
1
A Onbekende 1
Vers
chil
in c
once
ntra
tie tu
ssen
de
dupl
icat
en (µ
g/g)
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
B Onbekende 1
Dagg
emid
deld
e co
ncen
tratie
(µ
g/g)
FIGUUR 4.7: (A) PUNTENDIAGRAM VAN HET VERSCHIL IN CONCENTRATIE TUSSEN
DE DUPLICATEN VOOR ONBEKENDE 1. (B) PUNTENDIAGRAM VAN DE
DAGGEMIDDELDE CONCENTRATIE VOOR ONBEKENDE 1.
30
Het verschildiagram in Figuur 4.8 toont dat alle waarden voor de onbekenden
gelijkmatig verdeeld zijn rond het gemiddelde.
-4.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
0 50 100 150 200
Gemiddelde concentratie (µg/g)
Ver
schi
l van
de
dagg
emid
deld
e co
ncen
trat
ie
tov
de g
emid
deld
e co
ncen
tratie
(µg/
g)
FIGUUR 4.8: VERSCHILDIAGRAM VOOR ALLE ONBEKENDEN. HET VERSCHIL VAN DE
DAGGEMIDDELDE CONCENTRATIE EN DE GEMIDDELDE CONCENTRATIE WORDT
UITGEZET IN FUNCTIE VAN DE GEMIDDELDE CONCENTRATIE. VOOR ONBEKENDE 1
IS DE UITSCHIETER VERWIJDERD.
Het procentueel verhoudingsdiagram in Figuur 4.9 toont dat alle onbekenden
binnen de [95%-105%] limiet vallen. Hetzelfde besluit kan getrokken worden uit de 1-
zijdige “one sample” t-test. Voor alle onbekenden is de p-waarde voor de 105%
testwaarde kleiner dan 0.05. De onbekenden overschrijden de 105% limiet dus niet.
Ook voor de 95% testwaarde is de p-waarde voor alle onbekenden kleiner dan 0.05.
De 95% limiet wordt door geen enkele onbekende overschreden.
31
Onb
1
Onb
2
Onb
3
Onb
4
Onb
5
80
85
90
95
100
105
110
0
Onbekenden
Teru
gvin
ding
van
de
doel
waa
rde
(%)
FIGUUR 4.9: PROCENTUEEL VERHOUDINGSDIAGRAM WAARBIJ DE TERUGVINDING
VAN DE DOELWAARDE VOOR ALLE ONBEKENDEN WORDT UITGEDRUKT IN %.
4.8 METHODEVERGELIJKING De dataset voor deze methodevergelijking wordt gemaakt in de
DataGeneration Excel file. Voor ionenchromatografie is het concentratiebereik 0.3 tot
3.5 mmol/L. De routinemethode heeft een CV van 1.20%. Er worden resultaten voor
80 stalen gesimuleerd.
Van de gegevens wordt een Bland-Altman grafiek gemaakt die wordt
weergegeven in Figuur 4.10. Uit deze grafiek blijkt dat het gemiddelde verschil met
zijn 95% betrouwbaarheidsinterval (BI) buiten de grenzen van de systematische fout
(SF) specificatie (5%) valt. Het 1.96 CV verschil ligt met zijn 95%
betrouwbaarheidsinterval binnen de grenzen van de totale fout (TF) specificatie
(15%).
32
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5
Referentie (mmol/L)
Rou
tine
- Ref
eren
tie (%
)
Gemiddeldverschil
±1,96 CVverschil
±95% BI's
SF limiet
TF limiet
FIGUUR 4.10: BLAND-ALTMAN GRAFIEK VOOR DE METHODEVERGELIJKING TUSSEN
IONENCHROMATOGRAFIE EN EEN ROUTINEMETHODE VOOR DE BEPALING VAN
MAGNESIUM IN SERUM. DE SPECIFICATIES VOOR DE SYSTEMATISCHE FOUT EN DE
TOTALE FOUT ZIJN RESPECTIEVELIJK 5% EN 15%.
De resultaten verkregen uit de lineaire regressieanalyse zijn weergegeven in
Tabel 4.5. Uit deze tabel blijkt dat de richtingscoëfficiënt (1.094) en het snijpunt met
de y-as (0.038) verschillend zijn van respectievelijk 1 en 0. Er is dus zowel een
proportionele als een constante fout aanwezig op de meetresultaten verkregen met
de routinemethode. In Tabel 4.6 wordt verder onderzocht of deze fouten binnen de
systematische en totale fout specificatie vallen.
TABEL 4.5: RESULTATEN VAN DE LINEAIRE REGRESSIEANALYSE.
Lineaire regressievergelijkinga y = 1.094x-0.038
Richtingscoëfficiënt ± betrouwbaarheidsinterval 1.094 ± 0.004
Snijpunt y-as ± betrouwbaarheidsinterval -0.038 ± 0.001
Sy/x 0.0193 a Waarin x de referentiemethode voorstelt en y de routinemethode
33
In Tabel 4.6 worden de resultaten van de lineaire regressieanalyse
weergegeven. Uit deze tabel kunnen we afleiden dat de 5% specificatie voor de
systematische fout voldaan is bij lage magnesiumconcentraties (gemiddelde
systematische fout is -2.2% met BI: [-4.4% - 0.1%]). Voor hoge serumconcentraties
van magnesium wordt deze limiet overschreden (gemiddelde systematische fout is
8.3% met BI: [8.1% - 8.5%]). De 15% specificatie voor de totale fout is voor lage
magnesiumconcentraties voldaan (gemiddelde totale fout is -2.1% met PI: [-12.1% -
7.9%]). Ook voor de hoge concentraties wordt deze limiet niet overschreden
(gemiddelde totale fout is 8.3% met PI: [7.3% - 9.2%]).
TABEL 4.6: RESULTATEN VOOR DE LINEAIRE REGRESSIEANALYSE VAN DE
METHODEVERGELIJKING TUSSEN IONENCHROMATOGRAFIE EN EEN
ROUTINEMETHODE VOOR DE BEPALING VAN MAGNESIUM IN SERUM. DE
SPECIFICATIES VOOR DE SYSTEMATISCHE FOUT EN DE TOTALE FOUT ZIJN
RESPECTIEVELIJK 5% EN 15%. DE GEGEVENS DIE DE LIMIETEN OVERSCHRIJDEN
ZIJN AANGEDUID.
Minimum x
(0.33 mmol/L)a
Maximum x
(3.50 mmol/L)a
Gemiddelde systematische fout (%) -2.2 8.3
+ betrouwbaarheidsinterval (%) 0.1 8.5
- betrouwbaarheidsinterval (%) -4.4 8.1
Gemiddelde totale fout (%) -2.1 8.3
+ predictie-interval (%) 7.9 9.2
- predictie-interval (%) -12.1 7.3 a Voor de minimale en maximale meetwaarden die via de referentiemethode worden verkregen wordt
de y-waarde voorspeld met behulp van de regressievergelijking. Op deze voorspelde y-waarde
worden de systematische fout en de totale fout bepaald.
34
4.9 LITERATUURONDERZOEK
4.9.1 Farmaceutisch gebruik van magnesium De zoekopdracht naar het farmaceutisch gebruik van magnesium wordt
gestart met het zoeken van informatie in het gecommentarieerd
geneesmiddelenrepertorium 2010 van het BCFI (http://www.bcfi.be). Nadien wordt
ook gekeken naar informatie van het farmaceutisch kompas (http://www.fk.cvz.nl).
Verder wordt gezocht naar informatie in wetenschappelijke artikels. De verschillende
zoekopdrachten die hiervoor gebruikt worden zijn weergegeven in Tabel 4.7.
TABEL 4.7: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE ZOEKOPDRACHTEN GEBRUIKT BIJ
DE LITERATUURSTUDIE NAAR HET FARMACEUTISCH GEBRUIK VAN MAGNESIUM.
Gebruikte zoekmachine
Ingegeven zoekwoorden Aantal hits
Opmerkingen
PubMed magnesium AND
‘therapeutic use’
1 Levert niet het gewenste
resultaat.
PubMed magnesium AND
therapeutic use
13910 Gezocht naar reviewartikels
(1859). Eerste 50 artikels
bekeken. 1 artikel gebruikt.
Web of
Science
magnesium (Topic) AND
”therapeutic use” (Topic)
26 Gezocht naar reviewartikels
(6). Levert niet het
gewenste resultaat
PubMed magnesium AND
therapeutic usage
38 Gezocht naar reviewartikels
(14). 1 artikel gebruikt
PubMed magnesium AND
pharmacology
1954 Te veel resultaten,
zoekopdracht verfijnt.
PubMed magnesium [Title/Abstract]
AND pharmacology
[Title/Abstract]
76 Naar reviewartiels gezocht
(26). 1 artikel gebruikt
Magnesium wordt aangewezen bij een duidelijk magnesiumtekort. Preparaten
die ter beschikking zijn voor de behandeling van magnesiumtekort zijn
magnesiumlactaat en magnesiumgluconaat. Verder zijn er ook
magnesiumpreparaten die worden gebruikt als antacida. Deze preparaten bevatten
35
magnesiumcarbonaat, magnesiumhydroxide en magnesiumtrisilicaat
(http://www.bcfi.be/).
Antacida zijn geïndiceerd bij lichte tot matige intermitterende maagklachten.
Ze worden gebruikt om snelle verlichting van de maagklachten te verkrijgen. Ze
oefenen hun werking uit door partiële neutralisatie van het maagzuur. Door de
stijging van de zuurtegraad neemt de proteolytische werking van pepsine af. Als
toedieningsvorm voor het antacidum zijn poeders en suspensies het meest effectief,
omdat deze sneller zullen vermengen met de maaginhoud en er een snellere
zuurbinding optreedt.
Magnesiumhydroxide wordt in combinatie met algedraat
(aluminiumoxidehydraat) als eerste keuze antacidum toegediend. Algedraat en
magnesiumhydroxide samen hebben een sterk en snel zuurneutraliserend
vermogen. De verhouding algedraat, magnesiumhydroxide is zo gekozen dat de
obstiperende werking van algedraat wordt tegengegaan door de laxerende werking
van magnesiumhydroxide.
Een combinatie van calciumcarbonaat en magnesiumcarbonaat wordt ook
gebruikt als antacidum. Ze hebben beiden een sterk en snel zuurneutraliserend
vermogen. De magnesiumverbinding werkt ook hier laxerend, vandaar is de
verhouding van het preparaat zo gekozen dat de laxerende werking van
magnesiumcarbonaat wordt tegengegaan door het obstiperend effect van
calciumcarbonaat.
Magnesiumoxide en magnesiumperoxide alleen of in combinatie (75%
magnesiumoxide en 25% magnesiumperoxide) kunnen ook als antacidum gebruikt
worden. Het gebruik hiervan is enkel aan te raden in beperkte situaties waarbij het
gebruik van het eerste keuze antacidum algedraat gecontraïndiceerd is.
De belangrijkste bijwerkingen te wijten aan de magnesiumverbindingen in de
hierboven vermelde antacida zijn diarree en hypermagnesiëmie. Diarree is te wijten
aan het laxatief effect van de magnesiumverbindingen. Bij de combinaties met
calciumcarbonaat en algedraat kan ook obstipatie als bijwerking optreden.
36
Hypermagnesiëmie kan optreden bij patiënten die langdurig hoge dosissen antacida
gebruiken, vooral patiënten met ernstige nierfunctiestoornissen zijn hier gevoelig
aan. Mogelijke symptomen van hypermagnesiëmie zijn sedatie, spierzwakte,
hypotensie, bradycardie en coma.
Als contra-indicatie geldt voor al de verbindingen een ernstige
nierfunctiestoornis, omdat bij deze patiënten veel sneller hypermagnesiëmie zal
optreden.
De magnesiumverbindingen tonen verschillende interacties met andere
geneesmiddelen. Gelijktijdige inname met onder andere tetracyclinen, digoxine, ijzer,
isoniazide of ciprofloxacine kan de resorptie van deze geneesmiddelen aanzienlijk
verminderen. Deze geneesmiddelen moeten daarom ten minste 1 à 2 uur voor het
antacidum worden ingenomen. Magnesiumcarbonaat kan ook de opname van
fosfaten bemoeilijken (http://www.fk.cvz.nl/)
Uit een review artikel van Guerrera et al. (2009) kan besloten worden dat
magnesiumverbindingen in antacida veel gebruikt worden voor de behandeling van
dyspepsie. Nochtans bestaan er weinig studies waarbij het gebruik van antacida voor
de behandeling van dyspepsie wordt vergeleken met het gebruik van histamine-2-
receptor antagonisten. De verschillende magnesiumverbindingen die in antacida
voorkomen zijn hydroxide, oxide, carbonaat, fosfaat, trisilicaat en citraat zouten van
magnesium. Het zout dat gebruikt wordt beïnvloedt het begin en de duur van de
activiteit. Zo hebben magnesiumcarbonaat en magnesiumtrisilicaat een traag begin
van activiteit. Het trisilicaat zout van magnesium heeft wel de langste werkingsduur
(Swain & Kaplan-Machlis, 1999) .
Naast het gebruik als antacidum zijn er ook preparaten beschreven van
magnesium als laxativum. Magnesiumsulfaat poeder zal werken als een osmotisch
laxans. Het houdt water vast in de darm waardoor de darminhoud vloeibaarder wordt.
Daarnaast stimuleert magnesiumsulfaat het vrijkomen van cholecystokinine uit de
darmwand. Deze stof stimuleert de secretie van water en elektrolyten en de
peristaltiek. Voor de bijwerkingen, contra-indicaties en de interacties met andere
37
geneesmiddelen geldt hetzelfde als voor de andere magnesiumverbindingen
(http://www.fk.cvz.nl/).
Voor het gebruik van magnesiumverbindingen bij de behandeling van
constipatie bestaan er ook weinig studies die de effectiviteit van deze verbindingen
aantonen. Ondanks dit zijn er toch veel artsen en patiënten die deze behandeling
nuttig vinden. Een gebrek aan evidentie is dus niet noodzakelijk gelijk aan een
gebrek aan effect (Guerrera et al., 2009). Magnesiumzouten gebruikt in laxativa zijn
het sulfaat, hydroxide en het citraat zout. Sulfaat zouten zijn de meest potente
laxativa (Swain & Kaplan-Machlis, 1999).
Magnesiumsulfaat bestaat ook als injectiepreparaat. Dit preparaat wordt
gebruikt bij ernstige magnesiumdeficiëntie en voor de behandeling van convulsies bij
ernstige preëclampsie en eclampsie (http://www.fk.cvz.nl/).
Preëclampsie is een aandoening tijdens de zwangerschap die gepaard gaat
met hypertensie, oedemen en proteïnurie. Bij eclampsie zijn de symptomen dezelfde
als bij preëclampsie, bovendien treden er bij deze ziekte ook stuipen op. Beide
ziekten vormen zowel voor de moeder als het ongeboren kind een bedreiging
(Fawcett et al., 1999). Er is in 2 Cochrane reviews aangetoond dat het gebruik van
intraveneus magnesiumsulfaat voor de behandeling van eclampsie beter is dan de
behandeling met fenytoïne. Wanneer intraveneus magnesiumsulfaat wordt
toegediend bij patiënten met preëclampsie daalt het risico dat ze evolueren tot
eclampsie met meer dan de helft. Het gebruik van magnesium blijkt niet schadelijk te
zijn voor de moeder en het ongeboren kind (Guerrera et al., 2009). Magnesium wordt
ook als tocolyticum gebruikt voor de behandeling van premature arbeid. Nochtans is
de evidentie voor het gebruik in deze conditie niet overtuigend en kan het beter
beperkt worden (Fawcett et al., 1999; Swain & Kaplan-Machlis, 1999).
Magnesium onder de vorm van magnesiumchloride wordt gebruikt in
baxteroplossingen voor peritoneale dialyse bij patiënten met chronisch nierfalen.
Magnesiumchloride helpt bij de regulatie van de vocht- en elektrolytbalans
(http://www.baxter.com/downloads/patients_and_caregivers/products/dianeal_ultrapd
2.pdf).
38
Er wordt veel onderzoek gedaan naar het gebruik van magnesium in de
cardiologie. Meer bepaald bij de behandeling van acuut myocard infarct en van
aritmieën. Over het gebruik van magnesium bij acuut myocard infarct bestaat
discussie. Studies hebben aangetoond dat patiënten met een laag mortaliteitsrisico
en die voordeel ondervinden van therapie met trombolytica en aspirine geen nut
ondervinden van de toediening van magnesium. Bij hoge risico patiënten die niet
geholpen zijn met het gebruik van trombolytica blijkt magnesium wel nuttig te zijn.
(Fawcett et al., 1999). Patiënten met hypomagnesiëmie gerelateerde aritmieën
reageren goed op de behandeling met magnesium. De therapie wordt onderhouden
tot zowel de kalium- als magnesiumspiegels terug genormaliseerd zijn. Behandeling
bestaat er dus in om kalium en magnesium toe te dienen (Fawcett et al., 1999).
Naast aritmiën gerelateerd aan hypomagnesiëmie reageren ook aritmiën waarbij
normale magnesiumspiegels optreden positief op de behandeling met magnesium.
Dit is het geval bij digitalis gerelateerde aritmie (Swain & Kaplan-Machlis, 1999).
Er is ook onderzoek gedaan naar het gebruik van magnesium bij
astmapatiënten. Uit het merendeel van de studies kan besloten worden dat
intraveneuze toediening van magnesiumsulfaat effectief is voor patiënten met
ernstige astma die niet reageren op de standaardtherapie. Ook is aangetoond dat
inhalatie van magnesiumsulfaat de longfunctie verbetert (Guerrera et al., 2009;
Swain & Kaplan-Machlis, 1999).
Als laatste wordt het gebruik van magnesium in de behandeling van hoofdpijn
bij migraine besproken. Een enkele dosis van 600 mg oraal trimagnesium dicitraat
reduceert de frequentie van het optreden van migraine. Bij de acute behandeling van
migraine toont de intraveneuze toediening van magnesiumsulfaat een significante
verbetering in de behandeling van alle symptomen (Guerrera et al., 2009).
Op dit moment zijn er enkel magnesiumpreparaten op de markt die worden
gebruikt als antacidum, laxativum, behandeling van hypomagnesiëmie, preëclampsie
en eclampsie. Magnesium is ook aanwezig in baxteroplossingen voor peritoneale
dialyse. Naar de andere toepassingsdomeinen van magnesium wordt nog steeds
verder onderzoek gedaan.
39
4.9.3 Analysemethoden voor magnesium In deze masterproef wordt een validatie gedaan van
ionenuitwisselingschromatografie als analysemethode voor magnesium. Voor het
literatuuronderzoek wordt op zoek gegaan naar andere analysemethoden voor
magnesium. De verschillende zoekopdrachten die hiervoor gebruikt zijn worden
weergegeven in Tabel 4.8.
TABEL 4.8: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE ZOEKOPDRACHTEN BIJ DE
LITERATUURSTUDIE NAAR ANALYSEMETHODEN VOOR MAGNESIUM
Gebruikte
zoekmachine
Ingegeven zoekwoorden Aantal
hits
Opmerkingen
Google “determination” AND
“magnesium”
3.370.0
00
Er werden vooral oude
artikels gevonden.
Van andere artikels kon de
volledige tekst niet
geraadpleegd worden.
Verder gezocht via PubMed
en Web of science.
PubMed (analysis[Title]) AND
magnesium[Title]
208 Levert niet de verwachte
resultaten op
PubMed (determination[Title]) AND
magnesium[Title]
449 Eerste 50 artikels bekeken.
7 artikels gebruikt.
Ook referenties in gevonden
artikels bekeken. Hiervan 4
artikels gebruikt.
Web of
science
determination (title) AND
magnesium (title)
1290 Eerste 50 artikels bekeken.
Levert na PubMed geen
extra informatie op.
Web of
science
“determination” (topic)
AND “divalent cations”
(topic)
195 Eerste 50 artikels bekeken.
Levert niet de verwachte
resultaten op.
PubMed “complexometric titration”
AND magnesium
13 1 artikel gebruikt
40
Als meest frequent gebruikte analysemethode voor de bepaling van
magnesium in verschillende stalen wordt vlam atomaire absorptiespectrometrie
(Flame Atomic Absorption Spectrometry, FAAS) aangewend. Het is een relatief
goedkope techniek en vertoont een hoge analytische performantie. Deze
analysemethode bevat echter enkele nadelen. Het organische materiaal in een staal
kan aanleiding geven tot spectrale interferenties, vandaar dat het organische
materiaal tijdens de staalvoorbereiding moet verwijderd worden. Een ander nadeel
van vlam atomaire absorptiespectrometrie is het smalle lineaire respons bereik van
de atomaire absorptiespectrometer. Dit stelt op zich geen probleem aangezien de
stalen kunnen verdund worden zodat ze toch kunnen geanalyseerd worden. Dit vergt
echter wel extra tijd waardoor de bepaling langer zal duren (López-García et al.,
1999).
Naast atomaire absorptiespectrometrie wordt ook inductief gekoppeld plasma
atomaire emissiespectrometrie (AES) vaak gebruikt als analysemethode voor
magnesium. Deze analysemethode is gevoeliger en heeft een groter lineair
dynamische bereik dan atomaire absorptiespectrometrie (Yang et al., 2002).
Een vaak gebruikte routinemethode voor de analyse van magnesium is UV-
Vis spectrofotometrie. UV-Vis spectrofotometrie is een eenvoudige, snelle en
goedkope techniek voor de bepaling van magnesium. Hierbij zal magnesium
reageren met een kleurreagens waarbij een kleurcomplex wordt gevormd. Dit
kleurcomplex kan gedetecteerd worden bij zijn absorptiemaximum. Er kan geen
onderscheid gemaakt worden in het kleurcomplex gevormd met calcium. Vandaar
moet in stalen waarbij magnesium en calcium samen aanwezig zijn interferentie
vermeden worden door het toevoegen van een “masking agent”. De UV-Vis
spectrofotometrische analyse van magnesium kan worden aangewend voor
verschillende soorten stalen. UV-Vis detectie krijgt de voorkeur boven FAAS detectie
vanwege de lagere kosten en de milieuvriendelijkheid (Tesfaldet et al., 2004).
Manuele spectrofotometrische analysen zijn gevoelig aan fouten. Vandaar
worden methoden ontwikkeld om de spectrofotometrische analysen te
automatiseren. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van flowanalysen. De meest
gebruikte flowanalysemethoden zijn “flow injection” analyse en “sequential injection”
41
analyse. “Sequential injection” analyse krijgt de voorkeur, omdat er minder staal en
reagens verbruikt wordt (Tesfaldet et al., 2004). Deze flowanalysemethoden worden
ook gebruikt bij de fluorimetrische bepalingen (de Armas et al., 2000) van
magnesium.
Zoals hierboven al vermeld worden er ook fluorimetrische analysemethoden
gebruikt. Magnesium aanwezig in het te onderzoeken staal zal een complex vormen
met een fluorescerende stof, in dit geval 8-hydroxychinoline-5-sulfonzuur. De
fluorescentie van het gevormde complex kan worden bepaald via fluorimetrie. Ook
hier kan er geen onderscheid worden gemaakt tussen het complex dat met calcium
gevormd wordt. Vandaar wordt er een “masking agent” voor calcium toegevoegd. (de
Armas et al., 2000).
Andere analysemethoden voor magnesium maken gebruik van
elektroforetische scheidingstechnieken. Hieronder vallen capillaire zone elektroforese
en isotachoforese.
Bij capillaire zone elektroforese is de scheiding gebaseerd op het verschil in
elektroforetische mobiliteit van de analyten. Deze mobiliteit is afhankelijk van de
grootte, lading en de vorm van het ion (Pantsar-Kallio & Manninen, 1995). De
detectie van de analyten kan gebeuren via indirecte meting van de UV-absorptie en
via conductiviteitsmeting. Voor detectie via UV-absorptie moeten er UV-
absorberende additieven worden toegevoegd aan de buffer en zijn er complexere
buffersystemen nodig. Vandaar zal de detectie via conductiviteitsbepaling de
voorkeur krijgen (Nussbaumer et al., 2010) .
Capillaire elektroforese heeft als voordeel ten opzichte van
ionenchromatografie dat de bepaling van magnesium veel sneller en efficiënter zal
verlopen. Ook kan bij capillaire elektroforese de analyse direct gestopt worden nadat
de gewenste component geëlueerd is. Dit heeft als voordeel dat er minder elektrolyt
verbruikt wordt. Een bijkomend voordeel van capillaire elektroforese is dat er een
kleiner volume staal moet geïnjecteerd worden. Hierdoor zijn de kosten voor
capillaire elektroforese in het algemeen lager dan voor ionenchromatografie. Nadelen
van capillaire elektroforese zijn de lagere detectielimiet en de kleinere
42
reproduceerbaarheid van de metingen (Pantsar-Kallio & Manninen, 1995;
Nussbaumer et al., 2010). Capillaire elektroforese kan worden gebruikt voor de
analyse van magnesium in verschillende soorten stalen zoals serum, urine, zeewater
(Prest el al., 2009).
Isotachoforese is een andere vorm van elektroforetische scheiding. Bij
isotachoforese wordt een staal tussen een voorste en achterste elektrolyt geplaatst.
Het voorste elektrolyt bestaat uit ionen met een hoge mobiliteit, dit elektrolyt heeft
een hogere mobiliteit dan de ionen in het staal en dan het achterste elektrolyt. Het
achterste elektrolyt bevat ionen met een lage mobiliteit. Ionen in het staal worden
ingesloten tussen het voorste en achterste elektrolyt. Gedurende de elektroforetische
scheiding worden de analyten in het staal gerangschikt in afzonderlijke zones
volgens mobiliteit. De zone met de hoogste mobiliteit (het voorste elektrolyt) leidt de
andere zones en legt de snelheid op waarmee ze migreren (Chen et al., 2006).
Isotachoforese wordt minder vaak gebruikt dan capillaire elektroforese. Toch
bezit het enkele voordelen ten opzichte van capillaire elektroforese. Bij
isotachoforese worden verdunde stalen aangeconcentreerd en kunnen componenten
met verschillende concentraties bepaald worden. De detectie gebeurt met een
conductiviteitsdetector. Er is een selectieve isotachoforese methode ontwikkeld voor
magnesium die kan toegepast worden voor de analyse op verschillende soorten
stalen. De methode is zowel geschikt voor de analyse van magnesium in water,
bloed en urine (Prest el al., 2009).
Nog een andere analysemethode maakt gebruik van magnesium selectieve
elektroden. Er zijn maar enkele ion selectieve elektroden gerapporteerd voor
magnesium. De meeste van de ontwikkelde magnesium selectieve elektroden
ondergaan interferentie met calcium en hebben een smal concentratie bereik (Gupta
et al., 2002).
Bij Complexometrische titraties wordt magnesium getitreerd tegenover EDTA
(ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Het eindpunt van de titratie wordt bepaald via de
kleurverandering van een indicator (Somashekar et al., 2006). De bepaling van het
eindpunt van de titratie via een kleurindicator zorgt voor variabiliteit en fouten in het
43
resultaat. De gebruikte kleurindicators zijn vaak instabiel en kunnen gemaskeerd
worden door proteïnen en andere metaalionen aanwezig in het staal (Jones &
McGuckin, 1964).
Er zijn ook methoden beschreven voor de analyse van magnesium via
nucleaire magnetische resonantie (NMR). Hierbij wordt het 1H-NMR signaal gemeten
van het magnesium-EDTA-complex. De 1H-NMR spectra zijn zeer rijk aan informatie,
maar de analyse van de data is complex door de overlap van de resonanties van
proteïnen, lipoproteïnen en andere metabolieten aanwezig in serum. Vandaar dat
deze analysemethode enkel wordt toegepast op eenvoudige oplossingen
(Somashekar et al., 2006).
Nog andere analysemethoden maken gebruik van enzymatische bepalingen.
Een voorbeeld van zo’n bepaling is deze die gebaseerd is op de activatie van
isocitraatdehydrogenase. In de aanwezigheid van kaliumisocitraat, magnesium en
NADP+ (nicotineamine adenine dinucleotide fosfaat) wordt isocitraatdehydrogenase
geactiveerd. Er wordt NADPH gevormd dat het licht absorbeert bij een golflengte van
340 nm. De hoeveelheid NADPH gevormd is evenredig met de hoeveelheid
magnesium aanwezig in het staal (Stone et al., 1996).
4.9.3 Detectielimiet Er wordt naar informatie gezocht over de verschillende mogelijkheden voor de
bepaling van de detectielimiet. De zoekopdrachten die hiervoor gebruikt zijn, worden
weergegeven in Tabel 4.9.
De bepaling van de detectielimiet is nog steeds één van de meest
controversiële in de analytische chemie. Dit komt doordat er verschillende definities
en methoden voor de berekening van de detectielimiet bestaan. Hierna worden de
verschillende definities en mogelijkheden voor de bepaling van de detectielimiet
besproken.
44
TABEL 4.9: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE ZOEKOPDRACHTEN BIJ DE
LITERATUURSTUDIE OVER DE DETECTIELIMIET.
Gebruikte
zoekmachine
Ingegeven zoekwoorden Aantal
hits
Opmerkingen
PubMed “method validation” AND
“limit of detection”
93 Eerste 50 artikels bekeken.
1 artikel gebruikt.
PubMed “method evaluation” AND
“limit of detection”
6 Levert niet het gewenste
resultaat
Web of
science
“method validation” (topic)
AND “limit of detection”
(topic)
211 Eerste 50 artikels bekeken
2 artikels gebruikt, waarvan
1 hetzelfde als bij Pubmed
Web of
science
“method evaluation”
(topic) AND “limit of
detection” (topic)
15 Levert niet het gewenste
resultaat
Web of
science
method validation (topic)
AND limit of detection
(topic)
2323 Gezocht naar reviewartikels
(10). Hiervan 1 artikel
gebruikt.
Web of
science
“limit of detection” (title) 196 Eerste 50 resultaten
bekeken. 1 artikel gebruikt.
In Tabel 4.10 worden de verschillende definities weergegeven voor de
detectielimiet volgens de IUPAC (http://goldbook.iupac.org/), “International
Conference on Harmonisation” (ICH), “Association Of Analytical Communities”
(AOAC), de USP (Chandran & Singh, 2007) en de ISO (Boqué & Vander Heyden,
2009).
Er zijn verschillende mogelijkheden beschreven om de detectielimiet te
bepalen. De meest gebruikte is deze waarbij rekening wordt gehouden met α- en β-
fouten (Stöckl et al., 2009). De detectielimiet wordt gedefinieerd als k keer de
standaarddeviatie van het blanco staal (SDblanco). De k-waarde wordt bepaald door
rekening te houden met de α- en β-fouten. Wanneer de α- en β-fouten gelijk zijn aan
5% is de k-waarde gelijk aan 3.3. Hierna wordt verder uitgelegd hoe deze waarde
van 3.3 x SDblanco wordt bekomen
45
TABEL 4.10: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE DEFINITIES VOOR DE
DETECTIELIMIET.
Organisatie Definitie
IUPAC De detectielimiet, uitgedrukt als concentratie of hoeveelheid, wordt
afgeleid van de laagste meting die met redelijke zekerheid kan
gedetecteerd worden via een gegeven analytische procedure.
ICH Laagste hoeveelheid analyt in een staal dat kan gedetecteerd, maar
niet noodzakelijk gekwantificeerd worden onder de gegeven
experimentele condities.
AOAC Laagste gehalte dat kan gemeten worden met redelijke statistische
zekerheid.
USP Laagste hoeveelheid analyt in een staal dat kan gedetecteerd, maar
niet noodzakelijk gekwantificeerd worden onder de gegeven
experimentele condities.
ISO De concentratie of hoeveelheid van de component in het
geanalyseerde staal die met een probabiliteit van (1-β) tot de
conclusie leidt dat de concentratie van de component in het
geanalyseerde staal groter is dan deze van een blancostaal.
De blancolimiet kan geschat worden door enkel het blancostaal te meten. De
meetwaarden vertonen een normale gaussiaanse verdeling rond nul. De limiet is
gelijk aan de eenzijdige z-waarde van de populatie, die overeen komt met de α- fout
waarbij het analyt wordt gedetecteerd wanneer het niet aanwezig is. Een z-waarde
van 1.645 komt overeen met een α- fout van 5%. De blancolimiet is dus gelijk aan
1.65 x SDblanco bij een α- fout van 5%. De z-waarde kan enkel worden gebruikt
wanneer de standaarddeviatie van de blanco wordt bepaald uit meer dan 20
metingen. Wanneer de standaarddeviatie van de blanco wordt bepaald uit minder
metingen wordt er gebruik gemaakt van de t-waarde die overeen komt met een α-
fout van 5%.
Wanneer blancostalen en laag geconcentreerde stalen worden gemeten is de
blancolimiet te laag. Er bestaat een kans op het maken van β-fouten, waarbij het
analyt niet wordt gedetecteerd wanneer het wel aanwezig is in het staal. In Figuur
4.11 zien we dat voor de blancolimiet populatie de kans op β-fouten 50% is. Deze
46
kans is veel te groot, vandaar moet de limiet worden opgeschoven naar rechts. De
detectielimiet wordt gedefinieerd bij 2 x 1.65 = 3.3 x SDblanco. Bij deze concentratie
zijn zowel de α-fout van het blancostaal als de β-fout van het staal met een
gemiddelde concentratie van 3.3 x SDblanco gelijk aan 5% (Stöckl et al., 2009; Boqué
& Vander Heyden, 2009). Dit wordt ook weergegeven in Figuur 4.11. Bij een
concentratie van 3.3 x SDblanco is het mogelijk om te besluiten dat de concentratie of
hoeveelheid analyt in het onderzochte staal groter is dan in het blancostaal met een
statistische power van 95% (1-β).
FIGUUR 4.11: BEPALING VAN DE DETECTIELIMIET REKENINGHOUDEND MET α- EN β-
FOUTEN (Stöckl et al., 2009).
In een ander artikel (Araujo, 2009) wordt de blancolimiet (in dit artikel
beslissingslimiet genoemd) gedefinieerd als 2 x SDblanco. De beslissingslimiet bij het
95% betrouwbaarheidsinterval van de blancoverdeling is de probabiliteit die aangeeft
of een signaal afkomstig is van het staal of van de blanco. In dit voorbeeld wordt de
2-zijdige z-waarde gebruikt die overeen komt met een α-fout van 5%. Het is beter om
de 1-zijdige z-waarde te gebruiken, omdat de limiet enkel moet bekeken worden aan
de rechterkant van de verdeling. Voor de detectielimiet wordt ook hier aangeraden
om stalen te meten met een concentratie van 3 x SDblanco. De probabiliteit voor het
verkrijgen van een vals negatief resultaat is 16%. Het is mogelijk om een besluit te
trekken met 84% statistische power.
47
De hiervoor vermelde parametrische benadering is enkel geldig wanneer de
meetwaarden gaussiaans verdeeld zijn. Voor klinische bepalingen is de verdeling
van de blancometingen gecentraliseerd rond 0. Veel instrumenten zetten de
negatieve signalen om in 0 of in kleine positieve resultaten. De verdeling voor deze
metingen is dus asymmetrisch en niet gaussiaans. In dit geval wordt de niet-
parametrische benadering gebruikt voor de bepaling van de detectielimiet. De
detectielimiet is de concentratie waarvan het 5de percentiel van de verdeling van de
metingen gelijk is aan de blancolimiet. De blancolimiet is het 95ste percentiel van de
verdeling van de blancometingen. Het 95ste percentiel van de blancometingen wordt
bepaald door het rangschikken van de meetwaarden volgens grootte. Het 95ste
percentiel is de waarde van de nB x (95/100)+0.5 (nB is het aantal blancometingen)
gerangschikte meting. Wanneer dit een niet geheel getal is, wordt de waarde
bepaald door interpolatie via de naburige metingen. Het 5de percentiel van de
metingen van de detectielimietstalen kan op dezelfde manier bepaald worden (Linnet
& Kondratovich, 2004).
Voor chromatografische analysen wordt de detectielimiet vaak bepaald als de
concentratie van de component die een signaal-over-ruisverhouding van 3 geeft. Het
chromatografisch signaal van verschillende standaardoplossingen met een dalende
concentratie wordt gemeten tot dat een piek wordt gevonden waarvan de hoogte 3
keer groter is dan de maximum hoogte van de basislijn (gemeten aan beide kanten
van de piek). De concentratie van de standaardoplossing die overeenkomt met die
piek is gelijk aan de detectielimiet (Boqué & Vander Heyden, 2009).
De detectielimiet kan ook visueel bepaald worden in het chromatogram.
Hiervoor worden verdunningen aangemaakt van een staal met gekende concentratie
van het analyt. De stalen worden verdund tot een concentratie waarbij het analyt niet
langer visueel kan waargenomen worden. Wanneer de detectielimiet visueel wordt
bepaald moeten relevante chromatogrammen bij het validatierapport aanwezig zijn
(Araujo, 2009).
Een andere benadering voor de detectielimiet is gebaseerd op de verhouding
3.3 SD/H, waarbij SD de standaarddeviatie van de respons is en H de helling van de
kalibratiecurve. De standaarddeviatie van de respons kan verkregen worden door het
48
bepalen van de standaarddeviatie van de blanco, door het berekenen van de
residuele standaarddeviatie van de regressiecurve of door het berekenen van de
standaarddeviatie van het snijpunt van de regressiecurve (Chandran & Singh, 2007).
De bepaling van de detectielimiet moet gebeuren door verschillende metingen
van de stalen op verschillende dagen. De intra-analyse variatie voor de detectielimiet
is verwaarloosbaar ten opzichte van de inter-analyse variatie, singlicate metingen per
dag volstaan dus. Aanbevelingen over het aantal dagen dat de stalen gemeten
moeten worden zijn verschillend, ze variëren van 6 tot 60 metingen (Stöckl et al.,
2009).
De verkregen detectielimiet wordt vergeleken met de vooropgestelde
specificatie door gebruik te maken van statistische testen of door het bepalen van het
95% betrouwbaarheidsinterval waarvan de bovengrens wordt vergeleken met de
specificatie. In twee artikels wordt een andere manier gegeven voor het opstellen van
het betrouwbaarheidsinterval. Volgens IUPAC (Currie, 1995) wordt het
betrouwbaarheidsinterval berekend uit de verdeling van de standaarddeviaties.
Volgens Linnet & Kondratovich (2004) wordt het betrouwbaarheidsinterval bepaald
door de onzekerheid van het percentiel.
Bij het bepalen van de detectielimiet moet het gevolgde experimentele
protocol en de gevolgde definitie gerapporteerd worden. In Tabel 4.11 volgt een kort
overzicht van de gebruikte definities in de verschillende domeinen (Stöckl et al.,
2009).
TABEL 4.11: OVERZICHT VAN DE GEBRUIKTE DEFINITIES VOOR DE BEPALING VAN
DE DETECTIELIMIET IN VERSCHILLENDE DOMEINEN.
Domein Definitie
Farma 3.3 x SD / Chromatografisch: S/Ra = 2 of 3
Milieu Stalen met lage conc. (7 metingen), 3.143 x SD (1-zijdige t-waarde)
Voeding Gebaseerd op α- en β- fouten (3 x SD) / Chromatografisch: S/Ra = 3
Medisch labo k x SD, k is afhankelijk van de α- en β- fouten a: signaal-over-ruisverhouding
49
5. CONCLUSIE
Uit de validatie-experimenten die bij deze methodevalidatie uitgevoerd zijn kan
besloten worden dat de methode voldoet aan de specificaties voor de lineariteit,
imprecisie, detectielimiet en de juistheid. Het meest adequate kalibratiemodel voor de
berekening van de concentratie van magnesium uit de piekoppervlakte is de OLR
geforceerd door 0.
Bij de methodevergelijking worden verschillende conclusies getrokken uit de
Bland-Altman grafiek en de lineaire regressie analyse. In de Bland-Altman grafiek
wordt de vooropgestelde specificatie voor de systematische fout overschreden.
Hieruit kunnen we besluiten dat de routinemethode significant verschillend is van de
referentiemethode op het 5% significantieniveau. Uit de lineaire regressie analyse
blijkt dat dit enkel geldig is voor hoge concentraties. Bij de Bland-Altman interpretatie
kan er geen onderscheid gemaakt worden tussen de hoge en lage magnesium
serumconcentraties. Er kunnen dus verkeerde conclusies uit volgen. Als algemeen
besluit voor de methodevergelijking geldt dat de routinemethode niet significant
verschillend is van de referentiemethode op het 5% significantieniveau voor lage
magnesiumconcentraties. Voor hoge serumconcentraties kan de
magnesiumconcentratie via de routinemethode niet met voldoende juistheid bepaald
worden.
Uit het literatuuronderzoek kan besloten worden dat magnesium
farmaceutisch wordt gebruikt als antacidum, laxativum, voor de behandeling van
hypomagnesiëmie, preëclampsie en eclampsie. Naar de andere
toepassingsdomeinen van magnesium wordt nog steeds verder onderzoek gedaan.
De meest frequent gebruikte analysemethoden voor magnesium zijn FAAS, inductief
gekoppeld plasma AES en UV-Vis spectrofotometrie. Er zijn ook nog enkele andere
analysemethoden voor magnesium beschreven. Uit de wetenschappelijke informatie
over de detectielimiet kan besloten worden dat de detectielimiet op verschillende
manieren kan bepaald worden. De meest gebruikte mogelijkheid voor de bepaling
van de detectielimiet is deze waarbij rekening gehouden wordt met de α- en β-
fouten. Bij chromatografische analysen wordt de detectielimiet meestal bepaald bij
een signaal-over-ruisverhouding van 3.
50
6. LITERATUURLIJST
Araujo, P. (2009). Key aspects of analytical method validation and linearity
evaluation. Journal of Chromatography B, 877, 2224-2234. Beckman Coulter ® (2009). Package insert Magnesium OSR 6189 assay. Bohl, C. H.; Volpe, S. L. (2004). Magnesium and exercise. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 42, 533-563. Boqué, R.; Vander Heyden, Y. (2009). The limit of detection. LC GC Europe, 22, 82-
85. Chandran, S.; Singh R. S. P. (2007). Comparison of various international guidelines
for analytical method validation. Pharmazie, 62, 4-14. Chen, L.; Prest, J. E.; Fielden, P. R.; Goddard, N. J.; Manz, A.; Day, P. J. R. (2006).
Miniaturised isotachophoresis analysis. Lab on a Chip, 6, 474-487. Cundy, T.; Dissanayake, A. (2008). Severe hypomagnesaemia in long-term users of
proton-pump inhibitors. Clinical Endocrinology, 69, 338-341. Currie, L. A. (1995). Nomenclature in evaluation of analytical methods including
detection and quantification capabilities. Pure & Appl. Chem., 67, 1699-1723. de Armas, G.; Cladera, A.; Becerra, E.; Estela, J. M.; Cerdà, V. (2000). Fluorimetric
sequential injection determination of magnesium using 8-hydroxiquinoline-5-sulfonic
acid in a micellar medium. Talanta, 52, 77-82. Fawcett, W. J.; Haxby, E. J.; Male, D. A. (1999). Magnesium: physiology and
pharmacology. British Journal of Anaesthesia, 83, 302-320. Guerrera, M. P.; Volpe, S. L.; Mao, J. J. (2009). Therapeutic uses of magnesium.
American Family Physician, 80, 157-162. Gupta, V. K.; Chandra, S.; Mangla, R. (2002). Magnesium-selective electrodes.
Sensors and Actuators B, 86, 235-241. Jones, J. D.; McGuckin, W. F. (1964). Complexometric titration of calcium and
magnesium by a semiautomated procedure. Clinical Chemistry, 10, 767-780.
51
Linnet, K.; Kondratovich, M. (2004). Partly nonparametric approach for determining
the limit of detection. Clinical Chemistry, 50, 732-740. López-García, I.; Viñas, P.; Blanco, C.; Hernández-Córdoba, M. (1999). Fast
determination of calcium, magnesium and zinc in honey using continuous flow flame
atomic absorption spectrometry. Talanta, 49, 597-602. Nussbaumer, S.; Fleury-Souverain, S.; Bouchoud, L.; Rudaz, S.; Bonnabry, P.;
Veuthey, J. (2010). Determination of potassium, sodium, calcium and magnesium in
total parenteral nutrition formulations by capillary electrophoresis with contactless
conductivity detection. J. Pharm.Biomed.Anal, published ahead-of-print as
doi:10.1016/j.jpba.2010.01.042. Pantsar-Kallio, M.; Manninen, P. K. G. (1995). Determination of sodium, potassium,
calcium and magnesium cations by capillary electrophoresis compared with ion
chromatography. Analytica Chimica Acta, 314, 67-75. Prest, J. E.; Baldock, S. J.; Fielden, P. R.; Goddard, N. J.; Treves Brown, B. J.
(2009). A miniaturised isotachophoresis method for magnesium determination. Anal.
Bioanal. Chem., 394, 1299-1305. Somashekar, B. S.; Ijare, O. B.; Nagana Gowda, G. A.; Ramesh, V.; Gupta, S.
Khetrapal, C. L. (2006). Simple pulse-acquire NMR methods for the quantitative
analysis of calcium, magnesium and sodium in human serum. Spectrochimica Acta
Part A, 65, 254-260. Stöckl, D. (2007a). Laboratory Statistics & Graphics with EXCEL®. STT consulting,
Horebeke, België, 141p. Stöckl, D. (2007b). Method validation With Confidence. STT consulting, Horebeke,
België, 52 p. Stöckl, D.; D’Hondt, H.; Thienpont, L. M. (2009). Method validation across the
disciplines - Critical investigation of major validation criteria and associated
experimental protocols. Journal of Chromatography B, 877, 2180-2190.
52
Stone, M. J.; Chowdrey, P. E.; Miall, P.; Price, C. P. (1996). Validation of an
enzymatic total magnesium determination based on activation of modified isocitrate
dehydrogenase. Clinical Chemistry, 42, 1474-1477. Swain, R.; Kaplan-Machlis, B. (1999). Magnesium for the next millennium. Southern
Medical Journal, 92, 1040-1047. Tesfaldet, Z. O.; van Staden, J. F.; Stefan, R. I. (2004). Spectrophotometric
determination of magnesium in pharmaceutical preparations by cost-effective
sequential injection analysis. Talanta, 64, 981-988. The Merck Index, an encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals, 13e editie
(2001). Merck Research Laboratories, Whithouse Station, NJ, Verenigde Staten.
United States Pharmacopeia (USP). Volume 32, NF 27 (2009). Yang, Z.; Hou, X.; Jones, B. T.; Sane, D. C.; Thomas, M. J.; Schwenke, D. C. (2002).
Determination of calcium, iron and magnesium in rabbit arteries by inductively
coupled plasma atomic emission spectrometry. Microchemical Journal, 72, 49-54. Zaman, F.; Abreo, K. (2003). Severe hypermagnesemia as a result of laxative use in
renal insufficiency. Southern Medical Journal, 96, 102-103. http://goldbook.iupac.org/ (26-4-2010) en (3-5-2010) http://www.baxter.com/downloads/patients_and_caregivers/products/dianeal_ultrapd
2.pdf (10-05-2010) http://www.bcfi.be/ (19-4-2010) http://www.bipm.org/en/publications/guides/vim.html (3-5-2010) http://www.fk.cvz.nl/ (19-4-2010)
