Lunes 04.03.13

Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de

la polimerasa cuantitativa en tiempo real RT-qPCR

Teórico Práctico

Modelo Experimental

Resultado Esperado…

Sangre

Hígado

DIA 0

DIA 1

100 ulSangre + 1 mL TriPure -80°C

C1C2C3C4

AA1AA2AA3AA4

10 mgHígado + 1 mL TriPure -80°C+ Homog

DIA 2Extracción de ARN

Lisis

Desnaturalización de proteínas

Conservación de ácidos nucleicos

Separación de fases

1) TriPure (TriZol)

Isotiocianato de GuanidinaFenol

Lisis

Desnaturalización de proteínas

Conservación de ácidos nucleicos

Membranas de sílica (unión al ARN)

2) PureLink RNA Minikit

Isotiocianato de GuanidinaColumnas de purificación

Método rápido

Mínima contaminación con ADN

Alto rendimiento de purificación de ARN

ARN de alta calidad y pureza

ARN obtenido…

1) Cuantificación (A260)

2) Estimación de la pureza (A260/280)

3) Chequeo de la integridad (Gel Agarosa 1.5%)

DIA 3

No “estrictamente” necesario si se diseñan primers que hibriden en la unión intrón-exón

Tratamiento con DNasa

Control del tratamiento con DNasa Sin retrotranscriptasa

The SuperScript III enzyme is a version of MMLV reverse transcriptase that has reduced RNaseH activity, a longer

half-life (220 minutes) and is more thermostable, resulting in increased specificity and higher yields.

Síntesis de cDNA

Mix I

• Oligo-dT• dNTP• Mix Oligos

SLO – miR-122SLO – miR-16SLO – miR-Let7a5S RT18S RT

Moloney Murine Leukemia Virus(MMLV)

Mix II

• Buffer• DTT• RNase OUT

Mix III

• Buffer• DTT

H20

DIA 4

Real Time PCR

FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)

(ROCHE)

SYBR Select Master Mix

(APPLIED BIOSYSTEM)

miR-122miR-16

miR-Let7a18S5S

• Control negativo (No template control, NTC)• Control positivo

FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (ROCHE)

SYBR Select Master Mix (APPLIED BIOSYSTEM)

Heat-labile Uracil-DNA Glycosylase (UDG)

dNTP blend containing dUTP/dTTP

Treatment with heat-labile UDG can prevent the reamplification of carryover PCR products by removing any uracil incorporated into single- or double-stranded amplicons (Longo et al., 1990).

ROX: reactivo fluorescente pasivo Normaliza diferentes fuentes de variabilidad entre wells

• Errores de pipeteo• Limitaciones del instrumental (óptica del sistema)

DIA 5

Análisis de resultados

• Curvas de amplificación y de melting

• Threshold, línea de base

• NTC: contaminación o dímeros de primer?

• Control positivo

• Desviación estándar de las réplicas técnicas

• Desviación estándar de las réplicas de RT

• Control de la Normalización

• Procesamiento analítico de los Cq

Análisis Estadístico