LUAN VAN Tran Thi Hao (119).p… · 3 1.3.2.Ph ương pháp ñánh giá thông qua vi ệc giám sát các thông s ố của h ệ th ống t ự ñộng ho ặc thông qua vi ệc

1

ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN

*******

Tr ần Thị Hảo

ðÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG THÍCH GI ỮA PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

VI SINH V ẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ðO ATP

QUANG SINH HỌC TRONG QUÁ TRÌNH KI ỂM TRA V Ệ SINH CỦA

DÂY CHUYỀN SẢN XUẤT BIA Ở VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội -2011

2

ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN

*******

Tr ần Thị Hảo

ðÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG THÍCH GI ỮA PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

VI SINH V ẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ðO ATP

QUANG SINH HỌC TRONG QUÁ TRÌNH KI ỂM TRA V Ệ SINH CỦA

DÂY CHUYỀN SẢN XUẤT BIA Ở VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Phạm Văn Thành

Hà Nội -2011

1

1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATP: Adenozin triphotphat

CFU: Colony-forming units

CPP: Critical Control Point

E.coli: Escherichia coli

HACCP: Hazard Analytical Critical Control Point (Hệ thống phân tích và

kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất chế biến

thực phẩm)

GMP: Good Manufacturing Practice (tiểu chuẩn thực hành sản xuất tốt)

RLU: Relative light unit (ñơn vị ánh sáng tương ñối)

PCA: Plate count agar

QA: Quality assurance

UV-VIS: Ultraviolet visiable (vùng tử ngoại khả kiến)

2

MỤC LỤC

MỞ ðẦU ....................................................................................................... 8

Chương 1 ..................................................................................................... 10

TỔNG QUAN .............................................................................................. 10

1.1.Tình hình ngộ ñộc thực phẩm ở Việt Nam, thực trạng vệ sinh ở một số cơ

sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ ñộc thường gặp trong

thực phẩm .................................................................................................... 10

1.1.1. Tình hình ngộ ñộc thực phẩm và thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở

chế biến thực phẩm ở Việt Nam…………………………………………..10

1.1.2. Nguyên nhân khiến thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh ........... ..11

1.1.3. Một số vi sinh vật chủ yếu thường gây ngộ ñộc có trong thực phẩm

và vi khuẩn chỉ ñiểm trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm .......................... 12

1.1.3.1. Ngộ ñộc do E.coli……………………………………………...12

1.1.3.2. Ngộ ñộc do Clotridium perfringens……………………………12

1.1.3.3. Ngộ ñộc Salmonella……………………………………………12

1.1.3.4. Vi khuẩn chỉ ñiểm trong thực phẩm …………………………..13

1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công ñoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh

trong sản xuất ............................................................................................... 14

1.2.1.Quá trình nấu, ñường hóa................................................................. 14

1.2.2. Lên men .......................................................................................... 15

1.2.3. Vấn ñề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản

xuất bia nói riêng ...................................................................................... 16

1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm ................................................................... 16

1.2.3.2. Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia ......................................... 18

1.3. Các phương pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay ................... 19

1.3.1. Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường …………………………..19

3

1.3.2.Phương pháp ñánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ

thống tự ñộng hoặc thông qua việc kiểm tra nống ñộ các chất tham gia vào

quá trình …………………………………………………………………..19

1.3.3. Phương pháp ñánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống ……20

1.3.4. Phương pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học…………………..20

1.4. Giới thiệu về phương pháp ATP quang sinh .......................................... 21

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp ATP quang sinh học ........................ 21

1.4.2. Ưu ñiểm của phương pháp ño ATP quang sinh trong ngành công

nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm ..................................................... 22

Chương II ..................................................................................................... 24

ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 24

2.1. ðối tượng nghiên cứu ............................................................................ 24

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu .............................. 24

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất ........................................................... 24

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 26

2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống .. 26

2.2.2.1.1. Phương pháp xác ñịnh tổng số Coliforms và E.coli ........... 27

2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc ...................................... 27

2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí ................................................... 28

2.2.2.2. Phương pháp xác ñịnh ñộ sạch bằng ATP quang sinh .............. 28

2.2.2.3. Ứng dụng máy ño quang UV-VIS U-1900 ............................... 30

Chương III ................................................................................................... 32

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 32 3.1. Phương pháp phân tích truyền thống ..................................................... 32

3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men .............................................................. 32

3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm .......................................................... 33

3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm ........................................................... 34

3.2. Phương pháp ATP quang sinh học ......................................................... 36

4

3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men .............................................................. 36

3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm .......................................................... 36

3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm ........................................................... 37

3.3. ðánh giá sự tương thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phương pháp

truyền thống và ño ATP quang sinh ............................................................. 37

3.3.1. Mẫu ñã biết trước nồng ñộ .............................................................. 37

3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia .................................................... 38

3.4. Khảo sát ứng dụng phương pháp tạo màu xác ñịnh tổng số Coliforms trên

máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre)................................. 43

Chương IV. .................................................................................................. 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 50 TÀI LI ỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

Tiếng Việt ................................................................................................ 52

Tiếng Anh ................................................................................................ 53

5

DANH M ỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Thống kê tình hình ngộ ñộc thực phẩm của Bộ Y tế 2008-2010 .... 10

Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2 ....................................... 32

Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3 ....................................... 33

Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 1 ....................... 33



Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1 .................................. 34



Bảng 10: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở các tec lên men ............................................................................................................. 36

Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm ..................................................................................................... 36

Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm ........................................................................................................... 37

Bảng 13: Kết quả phân tích mẫu ñã biết trước nồng ñộ bằng cả phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh. .................................. 38

Bảng 14: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ................................................................ 38



Bảng 17: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ........................................... 40



6

Bảng 20: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ...................................................... 41



Bảng 23: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 10-2 ở bước sóng 190 – 1100nm ....................................................................................................... 43



Bảng 26: Kết quả scan mẫu M ở bước sóng 400 – 800nm .......................... 46

Bảng 27: Kết quả scan mẫu M x 5-1 ở bước sóng 400 – 800nm .................. 47

Bảng 28: Kết quả scan mẫu M x 10-1 ở bước sóng 400 – 800nm ................. 47

Bảng 29: Kết quả scan mẫu M x 10-2ở bước sóng 400 – 800nm .................. 47

Bảng 30: Kết quả scan mẫu M x 10-3ở bước sóng 400 – 800nm .................. 47

Bảng 31: Kết quả phân tích mẫu lấy ở bể chứa nước thải sau khi vệ sinh bằng phương pháp truyền thống và ño bằng máy UV-VIS 1900 của Hitachi. ........ 48

7

DANH M ỤC HÌNH MINH H ỌA

Hình 1: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 190 – 1100 nm ............................. 45

Hình 2: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 200 – 800 nm ............................... 46

Hình 3: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 400 – 800 nm ............................... 48

8

MỞ ðẦU Thực phẩm là nhu cầu thiết yếu hàng ngày của mỗi con người. An toàn

thực phẩm ñã trở thành vấn ñề toàn cầu; trước những hiểm họa luôn rình rập,

ñe dọa ñời sống con người bởi các thực phẩm không an toàn, ñòi hỏi mỗi

quốc gia phải có những quốc sách ñể ñảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.

Trên thực tế, một thực trạng còn bức xúc trong ngành sản xuất chế biến

thực phẩm ở nước ta là chất lượng vệ sinh còn rất kém ở nhiều cơ sở sản xuất.

Những yêu cầu nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất chưa

ñược quan tâm và ñầu tư thích ñáng. Mặt khác do lợi nhuận mà một số ít nhà

cung cấp ñã sử dụng các hóa chất ñộc hại ñể chế biến, nuôi trồng và sản xuất

các sản phẩm thực phẩm; gây ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe người tiêu

dùng. Việc sử dụng các thực phẩm không ñảm bảo chất lượng vệ sinh có thể

gây ngộ ñộc và gây ra các bệnh tiêu hóa cấp tính cho người sử dụng, nghiêm

trọng hơn có thể dẫn tới tử vong. Về lâu dài, nếu các ñộc tố tích lũy dần dần

tới một ngưỡng nhất ñịnh có thể sẽ phát sinh các bệnh nguy hiểm, làm biến

ñổi cấu trúc gen gây dị tật, dị dạng cho các thế hệ tiếp theo.

Trước thực trạng trên, ngoài việc khuyến khích các cơ sở sản xuất thực

hiện vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà nước và chính phủ còn chỉ thị về việc

tăng cường công tác bảo ñảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm ñể từng

bước nâng cao chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên phương thức quản lý kiểm tra

chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm dựa trên việc kiểm tra chất lượng sản

phẩm cuối cùng không ñảm bảo ñược chất lượng vệ sinh sản phẩm trong khi

sản xuất. ðiều này chỉ ñược ñảm bảo khi có sự kiểm soát chủ ñộng và hệ

thống các yếu tố chất lượng và ñiều kiện vệ sinh trong toàn bộ quá trình sản

xuất, chế biến, cung ứng mới có khả năng ñảm bảo an toàn thực phẩm. ðể

ñáp ứng ñược yêu cầu này không gì khác là phải áp dụng các phương pháp

kiểm tra nhanh mức ñộ vệ sinh trong các dây chuyền sản xuất, chế biến thực

phẩm .

Góp phần vào sự kiểm soát vệ sinh an toàn trong sản xuất ñồ uống nói

chung và sản xuất bia nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện kiểm tra vệ sinh

trong dây chuyền sản xuất bia, với ñề tài:

9

“ ðánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống

và phương pháp ño ATP quang sinh học trong quá trình kiểm tra vệ sinh của

dây chuyền sản xuất bia ở Viện công nghiệp thực phẩm”.

10

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 .Tình hình ngộ ñộc thực phẩm ở Việt nam, thực trạng vệ sinh ở một

số cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ ñộc

thường gặp trong thực phẩm

1.1.1. Tình hình ngộ ñộc thực phẩm và thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở chế biến thực phẩm ở Việt Nam.

Hàng năm ở Việt Nam xảy ra hàng trăm vụ ngộ ñộc thực phẩm, con số người mắc bệnh có năm lên tới chục ngàn người. Theo thống kê của Bộ Y tế, tình hình ngộ ñộc thực phẩm trong ba năm gần ñây như sau (11):

Bảng 1: Thống kê tình hình ngộ ñộc thực phẩm của Bộ Y tế 2008-2010

STT Chỉ số Năm thống kê

2008 2009 2010

1 Số vụ 205 152 132

2 Số người mắc 7.828 5.212 4.676

3 Số người chết 61 35 41

Trong số các nguyên nhân gây ngộ ñộc thực phẩm thì nguyên nhân chủ yếu do nhiễm vi sinh vật (thường chiếm tỷ lệ từ 50 ñến 58% số vụ). ðây là thực trạng ñáng báo ñộng về tình hình vệ sinh trong sản xuất, chế biến và lưu thông thực phẩm. Những nguy cơ gây ô nhiễm vi sinh vật có thể kể ñến gồm: nguồn nước, ñiều kiện môi trường sản xuất, trang thiết bị máy móc, bao bì, dụng cụ, người trực tiếp chế biến…

ðối với thực trạng vệ sinh của các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm, theo báo cáo ở một số ñịa phương thì cũng không mấy khả quan.

Theo báo cáo ñánh giá thực trạng tại các cơ sở sản xuất, chế biến rượu, bia, nước giải khát, kem, nước chấm… tại Hải Phòng của tác giả Trần Văn Thọ và cộng sự năm 2005 cho thấy có tới 76,4% mẫu không ñạt tiêu chuẩn vệ

11

sinh. Các mẫu thức ăn ñường phố có tỷ lệ ô nhiễm cao về vi sinh vật, trong ñó 100% không ñạt về chỉ tiêu nấm men, nấm mốc; 90,9% không ñạt về chỉ tiêu Coliforms. Ở tỉnh Bắc Giang, theo ñiều tra khảo sát một số cơ sở sản xuất nước giải khát, bia, rượu, bánh kẹo… của tác giả Ngô Thị Oanh và cộng sự năm 2005 cho thấy 33,3% cơ sở có mức vệ sinh kém, 40% ở mức trung bình, chỉ có 26,7% ñạt loại tốt.

Từ một vài số liệu trên cho thấy, vấn ñề vệ sinh và kiểm soát vệ sinh trong các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm rất ñáng ñể các nhà sản xuất và các nhà quản lý lưu tâm nhiều hơn nữa.

1.1.2. Nguyên nhân khiến thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh

Các yếu tố cơ hội có thể dẫn tới thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây

bệnh như:

+ Nhóm gây ô nhiễm thực phẩm: Quá trình sản xuất, chế biến, thu

hoạch không ñảm bảo các yêu cầu vệ sinh an toàn dẫn tới thực phẩm bị ô

nhiễm.

+ Nhóm các yếu tố gây ảnh hưởng tới sự tồn tại của mầm bệnh trong

thực phẩm như việc không ñun nấu kỹ, không xử lý ñầy ñủ các yêu cầu vệ

sinh chung

+ Nhóm các yếu tố gây tái nhiễm: Do quá trình bảo quản không ñảm

bảo, gây tái nhiễm từ người chế biến, phục vụ, môi trường hay từ dụng cụ

sang thực phẩm. Nếu người làm công tác thực phẩm bị ốm hay mang vi trùng

gây bệnh thì trong quá trình chế biến vi trùng sẽ vướng vào thực phẩm. Theo

cách này, trứng giun hay vi trùng lao, lỵ có thể bị nhiễm vào thực phẩm. Nguy

hiểm hơn nữa là những người mang sẵn vi trùng gây bệnh nhưng không có

biểu hiện của bệnh, như vi trùng thương hàn sống lâu trong gan người ñã khỏi

bệnh làm phân của họ bị nhiễm trùng, người mắc bệnh lỵ cũng mang vi trùng

trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh.

Ngoài ra, chuột gián hay ruồi là những sinh vật hay làm nhiễm trùng

thực phẩm. Người ta thấy rằng, trong một vùng có bệnh dịch tả thì hầu hết

ruồi ñều có vi trùng dịch tả. Trong phân và nước ñái của chuột rất dễ tìm thấy

vi trùng thương hàn. Chuột cũng rất hay truyền bệnh cho lợn, gà từ ñó vào

12

thực phẩm. Hay trên mình gián, người ta thấy có rất nhiều vi trùng ñường

ruột. Vi trùng ñường ruột thường có nhiều trong phân, phân lại ñược dùng

bón cho rau nên cũng có rất nhiều vi trùng nguy hiểm. Các loại tôm cua, ốc,

… sống trong nước bẩn cũng hay có trứng hoặc vi trùng gây bệnh. Có rất

nhiều trường hợp bị bệnh thương hàn nguyên nhân do người bệnh ăn phải hải

sản, tôm cua có vi trùng gây bệnh. Cuối cùng, yếu tố gây nhiễm trùng nữa là

dụng cụ chế biến không vệ sinh sạch sẽ, khu vực chế biến có ñiều kiện vệ sinh

kém.

1.1.3. Một số vi sinh vật chủ yếu thường gây ngộ ñộc có trong thực phẩm và

vi khuẩn chỉ ñiểm trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm

1.1.3.1. Ngộ ñộc do E.coli

E. coli sống trong tự nhiên thường không hay gây ngộ ñộc, nhưng ở một ñiều kiện nhất ñịnh sẽ gây bệnh (vi khuẩn gây ngộ ñộc có ñiều kiện). E. coli gây bệnh truyền nhiễm như bệnh tả ở các tiểu gia súc, bệnh ỉa chảy ở trẻ em, bệnh trúng ñộc nhiễm huyết ở trẻ sơ sinh.

Cấu trúc kháng nguyên E. coli chia ra ba loại: O, N và K. Vi khuẩn gây bệnh nặng nhất là loại có kháng nguyên K. Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì gây bệnh cũng không giống nhau, trong gây bệnh thực nghiệm thì người nhạy hơn ñộng vật. Thời kỳ ủ bệnh thường từ 2 ñến 20 giờ. Bệnh phát ñột ngột, người bị bệnh thấy ñau bụng dữ dội, ít bị nôn mửa. Nhiệt ñộ cơ thể bình thường hoặc hơi sốt.

1.1.3.2. Ngộ ñộc do Clostridium perfringens

Clostridium perfringens sản sinh ra 6 tuýp ñộc tố: A, B, C, D, E, F. Trong 6 tuýp này thì ñộc tố A là ñộc tố chủ yếu gây ngộ ñộc sau ñó ñến tuýp F. Thời gian ủ bệnh trung bình 10 -12 giờ, có khi 6 ñến 8 giờ cũng có thể dài hơn. Bệnh xuất hiện với những triệu chứng viêm ruột, dạ dày, ñau bụng ỉa chảy, phân lỏng hoặc toàn nước; thỉnh thoảng có trường hợp nôn mửa, nhức ñầu, sốt.

1.1.3.3. Ngộ ñộc do Salmonella

Vi khuẩn gây ngộ ñộc thường là Salmonella typhymurium, Salmonella choleraesuls và salmonella enteritidis. Về cơ chế, các nhà khoa học cho rằng vi khuẩn Salmonella sinh ra ngoại tố chịu nhiệt, loại ñộc tố này gây bệnh cho

13

người và ñộng vật. Cũng có tác giả cho rằng ngộ ñộc Salmonella do ñường tiêu hóa hấp thụ phải một lượng lớn vi khuẩn Salmonella sống. Khi vào ñến máu vi khuẩn bị phá vỡ và tiết ra một lượng ñộc tố gây ñộc cho cơ thể. Tuy nhiên cùng ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella, không phải ai cũng bị ngộ ñộc. Ngoài số lượng vi khuẩn bị nhiễm, phản ứng của từng cơ thể là yếu tố quan trọng khiến người ñó có bị ngộ ñộc hay không. Ngộ ñộc Salmonella thường có các triệu chứng nôn mửa, ỉa chảy, sốt. Thời gian ủ bệnh trung bình từ 12 ñến 24 giờ. Trước khi phát bệnh thường có hiện tượng nhức ñầu, chán ăn, mặt tái nhợt, ra mồ hôi.

1.1.3.4. Vi khuẩn chỉ ñiểm trong thực phẩm

Vi khuẩn chỉ ñiểm trong thực phẩm ñược chia làm hai loại: Vi khuẩn

chỉ ñiểm vệ sinh và vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất.

� Vi khuẩn chỉ ñiểm vệ sinh (y tế)

Vi khuẩn chỉ ñiểm vệ sinh là những vi khuẩn mà sự có mặt của chúng

trong thực phẩm chứng tỏ thực phẩm ñã bị nhiễm phân.

Việc xác ñịnh trực tiếp những vi sinh vật gây bệnh gặp rất nhiều khó

khăn và mất nhiều thời gian. ðể ñơn giản hơn cho quá trình kiểm tra vệ sinh

thực phẩm, người ta xác ñịnh gián tiếp sự có mặt của vi sinh vật gây bệnh

bằng cách xác ñịnh các trực khuẩn ñường ruột E.coli, Clostridium Welchii,…

Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt ñộ trung bình là một trong những chỉ ñiểm

có ích. Khi kiểm tra ta thấy sự có mặt của vi khuẩn sống, chứng tỏ nguyên

liệu ñã bị nhiễm bẩn, ñiều kiện vệ sinh không ñạt, ñiều kiện nhiệt ñộ sản xuất,

qui trình bảo quản không thích hợp báo hiệu thực phẩm có nguy cơ bị hư

hỏng.

Vi khuẩn kị khí ưa nhiệt ñộ trung bình ñược dùng như một vi khuẩn chỉ

ñiểm. C. Welchii thường hay có trong phân người và ñộng vật nên dễ bị

nhiễm vào thịt gia súc, gia cầm. Khi gặp ñiều kiện không thuận lợi các vi

khuẩn này chuyển thành dạng nha bào, chịu nhiệt khi ñun ở nhiệt ñộ thấp,

phát triển mạnh ở 20-30oC, mạnh nhất ở 43-47oC và chỉ trong ñiều kiện yếm

khí. Vi khuẩn này sinh ñộc tố trong ruột người và ñộng vật, gây ra bệnh ñau

dạ dày và ỉa chảy khi ăn phải một số lượng lớn vi khuẩn.

14

� Vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất

Vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất là những vi khuẩn mà sự có mặt của nó

chứng tỏ thực phẩm ñã bị kém phẩm chất, ảnh hưởng tới giá trị dinh dưỡng,

sức khỏe người sử dụng. Bao gồm các vi khuẩn thối rữa, Proteus, Clotridium

pefringer…

ðánh giá vệ sinh thực phẩm thường dựa vào các chỉ tiêu cảm quan, lý

hóa, vi sinh vật như: số lượng vi sinh vật hiếu khí trong một gam (hoặc 1 mL)

thực phẩm ở phạm vi cho phép. Phạm vi này do cơ quan kiểm soát vệ sinh qui

ñịnh, khác nhau tùy theo từng loại thực phẩm và tùy theo mức ñộ yêu cầu vệ

sinh của từng ñịa phương, từng nước, từng khu vực. Và ñiều quan trọng là

tuyệt ñối không có vi sinh vật gây bệnh vì phần lớn các vi sinh vật gây bệnh

có trong thực phẩm là vi sinh vật gây bệnh ñường ruột (tả, lỵ, thương hàn,…)

Do vậy vi sinh vật chỉ ñiểm có vai trò rất quan trọng trong ñánh giá vệ sinh

1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công ñoạn cần thiết phải ki ểm tra vệ

sinh trong sản xuất

Quá trình sản xuất bia trải qua các công ñoạn: nấu, ñường hóa, lên men

(lên men chính, lên men phụ), lọc sản phẩm, bão hòa CO2, ñóng gói sản

phẩm. Quá trình sản xuất có thể tóm tắt như sau:

1.2.1. Quá trình nấu, ñường hóa

Quá trình nấu gồm một số bước sau: nghiền nguyên liệu, thủy phân

(ñường hóa), lọc nước nha, nấu hoa houblon, làm lạnh nhanh nước nha.

+ Nghiền nguyên liệu:

Nghiền nguyên liệu là quá trình nghiền nhỏ nguyên liệu nhằm phá vỡ

cấu trúc của hạt ñể tăng bề mặt tiếp xúc với nước, làm cho nước xâm nhập

vào các thành phần chất nội nhủ nhanh hơn, thúc ñẩy quá trình ñường hóa và

các quá trình thủy phân khác nhanh và triệt ñể hơn. Tạo ñiều kiện ñể tăng tốc

ñộ các quá trình lý học và hóa sinh học trong giai ñoạn nấu ñể nâng cao hiệu

suất và chất lượng dịch ñường

Nghiền có nhiều phương pháp: nghiền khô, nghiền ướt và nghiền ẩm.

Nghiền ướt, nghiền ẩm nhằm giữ nguyên vỏ malt ñể rút ngắn thời gian lọc.

15

Nhưng phương pháp này tốn năng lượng, thao tác phức tạp, còn nghiền khô

thì ñơn giản, dễ thực hiện và tiết kiệm năng lượng. Do vậy phương pháp

nghiền khô thường ñược chọn hơn.

+ Quá trình nấu: thực chất là quá trình thủy phân nhằm chuyển hóa các

thành phần chính trong malt và nguyên liệu thay thế ở nhiệt ñộ thích hợp

thành các chất hòa tan trong nước, trong ñó chủ yếu là các hydrat cacbon và

axit amin thủy phân nhờ enzym và sự thủy phân này phụ thuộc rất nhiều vào

nhiệt ñộ, pH, tỷ lệ nguyên liệu trong nước, tỷ lệ enzym.

+ Lọc dịch ñường (nước nha):

Dịch ñường gồm các chất hòa tan và không hòa tan, do ñó cần phải lọc

ñể tách hết các chất hòa tan ra khỏi các chất không hòa tan. Quá trình diễn ra

theo hai bước: lọc hỗn dịch thủy phân và thu ñược nước nha ban ñầu, dùng

nước nóng rửa bã rồi lọc thu nước nha cuối.

+ Nấu hoa houblon:

Mục ñích ñun sôi hoa houblon là ổn ñịnh thành phần dịch ñường hóa và

làm cho dịch ñường hóa có mùi thơm của hương chiết từ hoa houblon. ðun

sôi hoa nhằm trích ly và các chất thơm và chất ñắng, ñông tụ protein, thanh

trùng nước ñường hóa. Lượng hoa houblon sử dụng nhiều hay ít tùy thuộc

vào từng loại bia và vào thị hiếu người tiêu dùng.

+ Lạnh nhanh và lắng trong:

Mục ñích quan trọng này là giảm nhiệt ñộ nước nha xuống, ñưa oxy từ

không khí vào dịch thể và kết lắng các cặn bẩn, làm trong dịch ñường. Lạnh

nhanh và lắng trong thường tiến hành theo hai bước: giảm nhiệt ñộ xuống 60-

70oC, kết tủa nóng lắng xuống và bị loại hết khỏi nước nha. Khi nhiệt ñộ giảm

ñến 60oC, dịch nước nha ñược bơm qua thiết bị lạnh nhanh, dịch ñược ñưa

qua một thiết bị lọc ñể loại bỏ các cặn bẩn và kết tủa nóng. Tốc ñộ hạ nhiệt ñộ

của dịch ñường nhanh nên hạn chế ñược sự hoạt ñộng của vi sinh vật.

1.2.2. Lên men

Có hai kiểu lên men là lên men nổi và lên men chìm tùy thuộc vào việc

sử dụng hai loại nấm men khác nhau. Nấm men nổi lên men ở nhiệt ñộ cao,

16

nấm men chìm lên men ở nhiệt ñộ thấp. Lên men nổi hay chìm ñều trải qua

hai qua trình lên men, lên men phụ và lên men chính.

a. Lên men chính:

Mục ñích: nhờ tác dụng của enzym, vi sinh vật chuyển hóa ñường

thành rượu, CO2 và các sản phẩm khác góp phần tạo nên hương vị cho bia.

Sự tiêu hao cơ chất diễn ra mạnh mẽ, một lượng ñường khá lớn sẽ ñược

chuyển hóa thành cồn và CO2. Thời gian lên men chính tùy thuộc vào nồng

ñộ chất hòa tan ban ñầu của nước nha và tùy thuộc vào yêu cầu chất lượng

của các loại bia, thời gian có thể là 4-8 ngày. Sản phẩm chủ yếu của quá trình

lên men là etanol và khí CO2. Các sản phẩm thứ cấp ñược tích tụ trong dịch

nước nha ñã lên men là: glyxerin, axetaldehit, axit pyruvic, axit acetic, axit

lactic… các loại rượu bậc cao ñược hình thành từ axit amin.

b. Lên men phụ và ủ chín:

Là quá trình lên men diễn ra chậm. tiêu hao một lượng ñường không

ñáng kể, lắng trong và bảo hòa CO2. Quá trình lên men phụ và ủ chín bia

ñược tiến hành ở nhiệt ñộ từ 1-3oC.

Mục ñích của quá trình lên men phụ và ủ chín là lên men phần ñường

còn lại ñể bổ sung CO2 cho bia và hoàn thiện chất lượng bia, thu ñược một

loại nước uống bão hòa CO2 và có hương thơm dễ chịu.

1.2.3. Vấn ñề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản

xuất bia nói riêng

1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm

Nói tới vệ sinh trong sản xuất thực phẩm người ta hay ñề cập tới hai

yêu cầu cần ñược thực hiện ñấy là GMP và HACCP.

� GMP (Good Manuafacturing Practice) - Tiêu chuẩn thực hành sản

xuất tốt.

GMP là hệ thống ñảm bảo ñiều kiện chất lượng áp dụng cho tất cả các

cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm, ñiều kiện vệ sinh tiên quyết của cơ sở

sản xuất và chế biến thực phẩm. ðối tượng của GMP là tất cả các yếu tố có

ảnh hưởng tới chất lượng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm.

17

Nội dung cơ bản của GMP: qui ñịnh các chuẩn mực về yêu cầu vệ sinh

với cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm như vị trí, xí nghiệp, thiết kế nhà

xưởng và các khu vực lân cận, yêu cầu lắp ñặt thiết bị cũng như phương tiện

sản xuất, yêu cầu về nguyên liệu, công nghệ chế biến, chế ñộ làm sạch, khử

trùng; yêu cầu về vệ sinh con người trực tiếp tham gia sản xuất, hệ thống an

toàn sản xuất và hệ thống quản lý chất lượng ở doanh nghiệp; thực hiện

nghiêm ngặt, luôn luôn duy trì, cải tiến và ñổi mới.

� HACCP (Hazards Analysia critical Control Point) - Hệ thống phân

tích và kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất

chế biến thực phẩm

HACCP là hệ thống ñảm bảo chất lượng ñược áp dụng ñối với các

doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm, ñặc biệt là các cơ sở sản xuất

chế biến sản phẩm thủy sản.

ðối tượng của HACCP tập trung vào các công ñoạn trong công nghệ

chế biến, nơi có thể có các mối nguy về vật lý, vi sinh vật và hóa học

Nội dung cơ bản của hệ thống HACCP: Phân tích các mối nguy hại,

xác ñịnh tầm quan trọng của các mối nguy ñó trong nguyên liệu cũng như

trong các công ñoạn, công nghệ chế biến. ðây là yếu tố hết sức quan trọng

trong quá trình HACCP; xác ñịnh các ngưỡng giới hạn và các ngưỡng vận

hành; xác ñịnh các biện pháp, phương thức quản lý, kiểm soát các ngưỡng tới

hạn ñó và ñề ra các hoạt ñộng nhằm khắc phục trong trường hợp các ngưỡng

trên vi phạm hoặc sai lệch; thiết lập hệ thống biểu mẫu trong việc thẩm ñịnh

và tính toán kết quả.

GMP và HACCP là hai hệ thống ñảm bảo chất lượng của sản phẩm

ñược áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm cho dù qui mô

sản lượng nào. GMP và HACCP ñều có mục tiêu là ngăn chặn phòng ngừa sự

nhiễm bẩn trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm. Cả hai hệ thống ñều

yêu cầu ñòi hỏi các ñiều kiện với doanh nghiệp trong việc ñầu tư vật chất kỹ

thuật, thời gian, con người trong quá trình áp dụng. Tuy nhiên GMP là ñiều

kiện bắt buộc còn HACCP mang tính chất tự nguyện.

18

Trong quá trình sản xuất, tùy thuộc vào mỗi loại sản phẩm mà có

những nguy cơ nhiễm bẩn mà gây mất an toàn cho người sử dụng rất ña dạng

và khác nhau. Người ta chia các nguy cơ gây mất an toàn cho người sử dụng

ra làm ba nhóm:

+ Mối nguy hai có nguồn gốc sinh học như: vi sinh vật gây bệnh, kí

sinh trùng, nấm men, nấm mốc, hay các sản phẩm biến ñổi gen.

+ Mối nguy hại có nguồn gốc hóa học như: dư lượng thuốc trừ sâu,

thuốc thú y; các loại phụ gia phẩm màu thực phẩm; hàm lượng kim loại quá

giới hạn.

+ Mối nguy hại vật lý: tạp chất lạ, các mảnh kim loại, ñá thủy tinh.

Nguồn gây hại có thể sinh ra từ các cơ sở sản xuất hay các sản phẩm

phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, hoặc ñưa ñến ngẫu nhiên từ quá trình vận

chuyển, tiêu thụ.

1.2.3.2.Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia

Trong quá trình sản xuất bia có các yêu cầu vệ sinh riêng như: vệ sinh

nhà xưởng, vệ sinh cá nhân của nhân viên, vệ sinh trong quá trình bảo quản,

vệ sinh về phương tiên vận chuyển, cơ sở phân phối và trong quá trình chế

biến.

+ Yêu cầu nhà xưởng: quá trình sản xuất ñi theo dây chuyền một chiều,

do ñó các kho, phân xưởng cũng phải thiết kế theo nguyên tắc ñó. Phân xưởng

sản xuất phải ñảm bảo thông thoáng, cao ráo, sạch sẽ, nguồn nước cung cấp

cho sản xuất phải ñầy ñủ ñảm bảo vệ sinh.

+ Yêu cầu vệ sinh trong quá trình sản xuất: qui trình sản xuất liên tục,

thời gian sản xuất càng ngắn càng tốt, tránh tiếp xúc trực tiếp của tay công

nhân với thực phẩm ñề phòng sự nhiễm bẩn, cần tự ñộng hóa qui trình sản

xuất. Nguyên liệu sản xuất không có mùi vị bất thường, không nhiễm bẩn, có

giá trị dinh dưỡng phù hợp. Dụng cụ thiết bị, vật liệu không thôi nhiễm ra

thực phẩm, dễ vệ sinh và tiệt khuẩn dễ dàng. Quá trình sản xuất nên theo qui

trình tự ñộng hóa và khép kín ñể tránh làm bẩn. Sản phẩm trước khi xuất

xưởng phải ñược kiểm tra theo lô, mẻ, ca, thành phẩm không ñạt yêu cầu vệ

19

sinh phải có biện pháp xử lý, không ñược xuất xưởng như sản phẩm bình

thường.

+ Vệ sinh cá nhân của nhân viên: Phải có khả năng tối thiểu về vệ sinh

thực phẩm, nâng cao ý thức vệ sinh, giữ vệ sinh cho bản thân trong quá trình

chế biến không mang bệnh truyền nhiễm.

+ Yêu cầu vệ sinh trong bảo quản: Kho chứa thực phẩm phải thông

thoáng, có cửa sổ và quạt gió, các bao túi chứa bia phải ñể trên các sàn cao,

sắp xếp trật tự, nhiệt ñộ bảo quản ổn ñịnh, phải có máy ghi nhiệt ñộ và ñộ ẩm

hàng ngày.

+ Phương tiện vận chuyển và cơ sở phân phối: Có phương tiện vận

chuyển riêng, có chế ñộ cọ rửa và sát khuẩn ñịnh kỳ các phương tiện. Cơ sở

phân phối phải ñạt yêu cầu vệ sinh, thông thoáng, sạch sẽ.

1.3. Các phương pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay

Hiện nay các phương pháp kiểm tra vệ sinh thường ñược áp dụng trong các cơ sở sản xuất bao gồm:

1.3.1. Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường

Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường là phương pháp chủ yếu dựa vào quan sát bằng mắt ñể phát hiện các vết bẩn, tồn dư của quá trình chế biến còn tồn ñọng trên dụng cụ thiết bị…

Ưu ñiểm:

- Cho kết quả nhanh, tức thời

- Kinh phí ñầu tư, chi phí ñánh giá thấp

- Tính cơ ñộng cao, có thể áp dụng cho nhiều loại hình sản xuất

Nhược ñiểm:

- ðộ nhạy rất thấp, chỉ cho phép nhận biết những sự mất vệ sinh lớn quá rõ

- Mang tính chủ quan, dễ gây tranh cãi

- Chỉ thực hiện ở những nơi mà con người có thể tiếp xúc ñược

Phương pháp này chỉ mang tính hỗ trợ ban ñầu.

20

1.3.2. Phương pháp ñánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ thống tự ñộng hoặc thông qua việc kiểm tra nồng ñộ các chất tham gia vào quá trình

Ưu ñiểm:

- Cho kết quả nhanh, tức thời từ ñó có giải pháp xử lý kịp thời

- ðộ nhạy cao

- ðộ tin cậy lớn, mang tính khách quan.

Nhược ñiểm:

- Kinh phí ñầu tư cao, phải có trang thiết bị hiện ñại, ñồng bộ, cán bộ có chuyên môn cao

- Tính cơ ñộng thấp.

1.3.3. Phương pháp ñánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống

ðây là phương pháp ñánh giá dựa trên việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trên dụng cụ, thiết bị sản xuất, sản phẩm, trên tay người vận hành…

Ưu ñiểm:

- Kết quả phân tích khách quan

- Xác ñịnh ñược số lượng và chủng loại vi sinh vật trong mẫu thử

Nhược ñiểm:

- Phải có trang bị phòng thí nghiệm, yêu cầu cán bộ có chuyên môn cao

- Tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm (từ 2 ñến 5 ngày) vì vậy không thể có giải pháp xử lý kịp thời

- Không ñánh giá ñược tồn dư các chất dinh dưỡng.

1.3.4. Phương pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học

Phương pháp này dựa trên phép ño ATP- nguồn năng lượng dùng cho mọi tế bào ñộng, thực vật, vi khuẩn, nấm men, nấm mốc… Từ kết quả ño ATP ta sẽ

21

phát hiện ñược không chỉ số lượng vi sinh vật mà còn kiểm tra ñược cả tồn dư các chất dinh dưỡng làm môi trường cho vi sinh vật phát triển.

ðây là phương pháp mới, tiên tiến ñang ñược nhiều nước trên thế giới áp dụng cho các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm.

1.4. Giới thi ệu về phương pháp ATP quang sinh

ATP- Adenozin triphotphat là một dạng liên kết cao năng trong các tế

bào sinh vật. Năng lượng ở dạng liên kết này có tính chất linh ñộng, cho phép

chuyển hóa dễ dàng sang các dạng năng lượng khác: hóa năng, nhiệt năng, cơ

năng cần cho hoạt ñộng sống của tế bào.

ATP chiếm vị trí ñặc biệt trong số các hợp chất cao năng. Sự tạo thành

hợp chất cao năng ATP luôn là giai ñoạn thu năng lượng cuối cùng của các

quá trình oxy hóa khử. ATP cũng là chất cho năng lượng trực tiếp ñối với các

phản ứng thu nhiệt của sự trao ñổi chất. Các hợp chất trung gian khác chỉ là

sản phẩm trung gian ñể tạo ra ATP hoặc ñược tạo thành từ ATP. Như vậy

ATP có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chuyển hóa năng lượng và là

mắt xích liên hợp giữa các phản ứng thu nhiệt và tỏa nhiệt. Do ñó ATP là chất

cho năng lượng vạn năng, tạo nguồn năng lượng dự trữ chung cho mọi tế bào,

lượng ATP có trong các tế bào khoảng từ 0.22-1.03 fg (1). Hợp chất cao năng

ATP có mặt trong tất cả các tế bào sống, ñặc biệt là trong tất cả các tế bào vi

khuẩn. Sự khác nhau về lượng ATP như một chức năng thuộc trạng thái sinh

học, như một chức năng quan trọng của loài.

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp ATP quang sinh học

ATP trong tế bào ñược giải phóng nhờ các tác nhân cation, dưới tác

dụng của enzym luciferin và sự có mặt của Mg2+ sẽ tạo ra phản ứng phát

quang. Dùng máy ño chuyên dụng có ñộ nhạy cao ñể ño cường ñộ sáng.

Cường ñộ này cao hay thấp tùy thuộc vào lượng ATP có trong mẫu.Từ ñó ta

xác ñịnh ñược lượng vi sinh vật và sự nhiễm bẩn trong mẫu hay dư lượng

thực phẩm có trong mẫu….

Sơ ñồ phương trình phản ứng:

ATP + Luciferin/luciferase → AMP + PP + light

22

1.4.2. Ưu ñiểm của phương pháp ño ATP quang sinh trong ngành công

nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm

Phương pháp kiểm tra vệ sinh truyền thống ñòi hỏi mất nhiều thời gian

từ 2 ñến 5 ngày, có khi còn lâu hơn nữa. Việc xử lý kết quả ngay khi có sự cố

là không ñáp ứng ñược. ðể khắc phục những hạn chế này, ngày nay người ta

sử dụng ATP quang sinh.

+ ATP quang sinh là phương pháp ño lường cho kết quả tức thì.

+ Kiểm tra có kết quả nhanh ñể có biện pháp khắc phục kịp thời trước

và trong sản xuất.

+ Giám sát vệ sinh toàn diện: Nhận dạng ñầy ñủ cả vệ sinh lẫn dư

lượng thực phẩm, nguồn môi trường cho vi sinh vật phát triển.

+ Có thể kiểm tra trực tiếp lượng vi sinh vật hoặc chỉ dư lượng thực

phẩm tồn dư.

Ngành công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu, người ta dùng hệ thống

kiểm tra nhanh ñể nhanh chóng xuất hàng trước khi bắt ñầu sản xuất ñợt hàng

mới, cũng như nhận dạng khu vực có vấn ñề về ñộ sạch vệ sinh, xây dựng chế

ñộ vệ sinh nghiêm ngặt, giảm thiểu tỷ lệ hàng hỏng/loại, hoàn thiện thiết kế

các dòng sản phẩm, huấn luyện và ñánh giá kỹ năng của các nhân viên vệ sinh

và giải quyết các trở ngại về vệ sinh. Qua việc sử dụng hệ thống này, các công

ty cũng giới thiệu ñược chất lượng và giá trị sản phẩm của mình ñúng với yêu

cầu người tiêu dùng và các cơ quan quản lý.

Phương pháp ATP quang sinh ñã phát huy mạnh mẽ tác dụng, hiệu quả

trong ngành chế biến thực phẩm và nước giải khát. Các công ty như Pepsi

Cola, Nestle, Cadburge, Campbell, Bass và nhiều công ty khác ñã ñưa ATP

vào chương trình QA (ñảm bảo chất lượng) của họ (16). Ưu ñiểm chính của

phương pháp ATP là cho kết quả tức thì, cho biết dây chuyền sản xuất của họ

là sạch hay không sạch, ñiều ñó có nghĩa là có thể sản xuất tiếp trên dây

chuyền ñấy ñược hay không. ðiều này sẽ giúp công ty giảm thiểu những tổn

thất về tài chính do sản phẩm bị nhiễm bẩn hoặc sản phẩm trên dây chuyền

không ñáp ứng chỉ tiêu vệ sinh. ATP là phương tiện diễn giải nhanh chóng,

23

giảm ñi nhu cầu kiểm tra vệ sinh, ñáp ứng ñược yêu cầu của qui trình GMP và

HACCP.

24

Chương II

ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ðối tượng nghiên cứu

Kiểm tra quá trình vệ sinh trong dây chuyền công nghệ sản xuất bia ở

cơ sở sản xuất của Viện Công nghiệp thực phẩm. Các vị trí kiểm tra là các vị

trí trọng yếu của quá trình như các tec lên men và các tec sản phẩm, máy lọc

sản phẩm.

Chỉ tiêu lựa chọn kiểm tra là: tổng nấm men, nấm mốc, tổng Coliforms

và E.coli, tổng vi sinh vật hiếu khí

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất

a. Dụng cụ thiết bị

+ Máy ño ATP HY_LITE 2

+ Máy quang phổ UV-VIS U-1900

+ Nồi khử trùng

+ Tủ ấm

+ Tủ cấy

+ Máy ño pH

+ Pipet tự ñộng, ñầu hút

+ ðĩa petri, giấy nhôm, ñèn cồn, bình xịt cồn, ñũa thủy tinh,…

b. Hóa chất

+ Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+

gluco 1,0g; agar 14,0g)

Cách pha:

Hòa tan 22,5 g PCA trong 1000 mL nước cất. Hấp khử trùng ở 121oC,

15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 ở 25 oC.

25

+ Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nước cất

1000 mL).

Cách pha:

Môi trường ñơn: hòa tan 13g lactose broth trong 1000mL nước cất.

Môi trường kép: hòa tan 26g lactose broth trong 1000 mL nước cất.

Hòa tan môi trường, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử

trùng pH: 6,9 ± 0,2 ở 25 oC.

+ Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX

bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nước cất 1000 mL).

Cách pha:

Môi trường ñơn: hòa tan 40g trong 1000 mL nước cất.

Môi trường kép: hòa tan 80g trong 1000 mL nước cất.

Hòa tan môi trường, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử

trùng pH: 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.

+ Tryptone

Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g.

NaCl: 5g.

Nước cất 1000 mL.

Cách pha:

Hòa tan môi trường, sau ñó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng

pH: 7,5 ± 0.2 ở 25 oC.

+ R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat

0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4

0,05; agar 12,0).

Cách pha:

Hòa tan 15.2 g trong 1000 mL nước cất. ðem hấp khử trùng ở 121oC trong

vòng 15 phút. Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.

26

+ Kovacs

+ Oxidase

+ Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4-

brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4-

metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside 0.1 ).

Cách pha:

Môi trường ñơn: cân 17g/1000mL nước cất

Môi trường kép: cân 34g/1000mL nước cất

Hòa tan môi trường, sau ñó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng

pH: 6,8 ± 0,2 ở 25 oC.

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống

Phương pháp truyền thống là phương pháp phổ biến nhất trong các

nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trường ñặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển

thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện ñục ở ống nghiệm. Dựa trên

ñấy có thể kiểm tra số lượng vi sinh vật trong mỗi ñơn vị thể tích của dịch

nghiên cứu. Phương pháp ñếm khuẩn lạc thường ñược sử dụng ñể kiểm tra số

lượng nấm men, nấm mốc.

+ Ưu ñiểm của phương pháp là không phát hiện nhầm các vi sinh vật

chết hoặc các mảnh xác hữu cơ, vì chỉ có bào tử hoặc các tế bào sống mới

phát triển thành khuẩn lạc hoặc cho phản ứng sinh khí.

+ Nhược ñiểm: Khi làm dịch pha loãng không phải mọi vi sinh vật ñều

có thể tách khỏi bề mặt chất rắn ñể hòa tan vào nước. Không có loại môi

trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.

Các vi sinh vật phát triển trên mỗi loại môi trường chỉ tồn tại một nhóm sinh

lý nhất ñịnh.

ðối với vi sinh vật mà những bào tử thường dính chặt vào nhau thành

từng chuỗi, từng ñôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, thì mỗi

27

chuỗi, mỗi khối chỉ hình thành một khuẩn lạc. Vì vậy số khuẩn lạc chưa phản

ánh ñược chính xác số tế bào, bào tử trong dịch nghiên cứu.

Khi cấy dịch pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy ñược số

khuẩn lạc chênh nhau 10 lần. Vì vậy muốn kết quả phân tích có giá trị so sánh

tốt, chúng ta nên sử dụng một ñộ pha loãng thống nhất với từng nhóm vi sinh

vật.

2.2.2.1.1. Phương pháp xác ñịnh tổng số Coliforms và E.coli

Cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang lỏng nồng ñộ kép với một

lượng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả

ống duham lộn ngược. Tiếp theo, cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang

lỏng nồng ñộ ñơn với một lượng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng),

trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược. Cấy vào 5 ống ñựng môi trường

canh thang lỏng nồng ñộ ñơn với một lượng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch

mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược.

Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt ñộ 35oC trong 24 hoặc 48 h và

quan sát. Với những ống có biểu hiện ñục và sinh khí, chuyển tiếp lần lượt 10

mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trường brilliant kép và 5; 5 ống môi trường

Brilliant ñơn, nuôi tiếp ở 35oC sau 48 h. sau ñấy quan sát và ñọc kết quả theo

bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có Coliforms với biểu hiện ñục và

sinh khí ở ống.

Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trường tryptone kép

và 5; 5 ống môi trường Tryptone ñơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi

ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt

của E.coli.

2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc

Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trường ñĩa thạch. Nấu từng loại môi

trường thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trường rồi phân phối

vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL

mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất ñịnh cho vào các hộp ñĩa thạch ñã ñược khử

trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 ñĩa thạch. Sau ñấy rót vào mỗi hộp ñĩa

khoảng 10 mL môi trường thạch sau khử trùng và ñể nguội ở 40-50oC. ðậy

28

nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, ñể nguội ñến khi mặt thạch ñông

lại, ghi số mẫu và nồng ñộ pha loãng lên mỗi ñáy hộp petri và bọc giấy báo

rồi ñem nuôi ở 35oC và ñọc kết quả sau 48h ± 3.

2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí

Sử dụng môi trường R2A agar, hòa tan với lượng 15,2g/1000 mL, tiếp

theo ñem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu ñã pha loãng cho vào hộp petri ñã ñược khử

trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trường R2A agar ñã khử trùng, ñậy nắp và

xoay tròn ñều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, ñể nguội, ñợi khi mặt thạch ñông lại

hoàn toàn sau ñấy ghi tên mẫu và nồng ñộ pha loãng lên ñáy hộp petri, bao

giấy rồi ñem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi ñủ thời gian, ñem ra ñọc

kết quả bằng cách ñếm các khuẩn lạc trên ñĩa thạch. Sau ñấy báo cáo số

khuẩn lạc trên một ñơn vị thể tích mẫu tương ứng.

2.2.2.2. Phương pháp xác ñịnh ñộ sạch bằng ATP quang sinh

ðể nghiên cứu ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng ño ATP quang sinh, các bước cần phải tiến hành như sau:

- Nhận dạng các ñiểm kiểm tra: Các ñiểm kiểm tra ñược coi là các ñiểm kiểm soát tới hạn (CCP), ñại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu ñược sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh.

Các ñiểm kiểm tra nói chung ñược chia làm hai nhóm:

Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm.

- Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ ñồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra.

- Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thường quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái ñã vệ sinh sạch sẽ.

29

- Xác ñịnh các giá trị giới hạn: Sau khi có ñủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thường sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh.

- ðo ATP quang sinh bằng thiết bị ño HY_LITE 2.

ðặc tính kỹ thuật của máy:

+ Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU

+ Có thể lưu hơn 2000 kết quả ño

+ Tín hiệu nền < 10 RLU

+ Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only

+ ðầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải

Trong phương pháp xác ñịnh bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy

mẫu ñược sử dụng

+ Que lấy mẫu bề mặt:

Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt

kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2

Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận ñặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và

lắc ñể hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.

ðọc kết quả: ðặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và ñợi

ñọc kết quả khoảng 10 giây sau ñấy.

+ Que lấy mẫu nước:

Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy

mẫu vào dung dịch kiểm tra

Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận ñặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc ñể hoạt

hóa mẫu trong vòng 10 giây.

ðọc kết quả: ðặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và ñợi

ñọc kết quả trong vòng 10 giây sau ñấy.

30

2.2.2.3. Ứng dụng máy ño quang UV-VIS U-1900

ðặc tính kỹ thuật

Hệ quang: Ratio beam

Bươc sóng: 190-1100nm

ðộ rộng dải quang phổ: 4 nm

Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2)

ðộ chính xác bước sóng: ± 0.5 nm

ðộ tái lặp bước sóng: ± 0.3 nm

Dạng ño: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength

measurement

Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000)

% T (0 tới 300%T)

Nồng ñộ (0.000 tới 9999)

Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)

± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)

% 0.3 T

Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)

± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)

% 0.15 T

Tốc ñộ scan bước sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút

Baseline stability (ñộ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy)

Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm)

Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm)

Nguồn sáng: WI và ñèn D2

Detector: Silicon photodiode

31

Tiến hành: Các mẫu môi trường phát quang ñược chuẩn bị. Sử dụng

cuvet 20 mm cho phép ño. Chọn dải quét bước sóng tà 190 nm - 1100 nm.

32

Chương III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chúng tôi thực hiện kiểm tra vệ sinh ở một số ñiểm trọng yếu trong dây

chuyền sản xuất bia như:

+ Các tec lên men

+ Máy lọc sản phẩm

+ Các tec sản phẩm

3.1. Phương pháp phân tích truyền thống

3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men

� Tec lên men 1

Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 1

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103

Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103 3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102

Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0

Tổng Coliforms (MPN) 4 2,0 2,0 <2,0

� Tec lên men 2




Tổng nấm men, nấm mốc 3.6 x103 3.7x103 1.9 x103 1.0 x102

33



Tổng Coliforms (MPN) 2,0 4,0 2,0 2,0

� Tec lên men 3




Tổng nấm men, nấm mốc 3.4 x103 3.3x103 2.6 x103 0.5 x 102


Tổng Coliforms (MPN) 4,0 2,0 <2,0 2,0

3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm

� Máy lọc sản phẩm ñợt 1

Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 1



Tổng nấm men, nấm mốc 5.6 x102 5.7x102 2.0 x102 1.3 x 10


Tổng Coliforms (MPN) 2,0 2,0 4,0 <2,0

34




Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.1 x103 6.0 x103 2.0 x102 5 x10

Tổng nấm men, nấm mốc 4.7 x102 4.8 x102 3.0 x102 12


Tổng Coliforms (MPN) 4,0 <2,0 2,0 <2,0




Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.9 x103 5.7 x103 1.0 x102 20




3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm

� Tec sản phẩm 1

Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1


35


Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.3 x103 6.2 x103 10 x102 20







Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.0 x103 6.1 x103 8.0 x102 12







Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x103 4.8 x103 9 x102 17



36


3.2. Phương pháp ATP quang sinh học

3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men

Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở

các tec lên men

Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)

1 Vệ sinh lần 1 6608 5500 6740

2 Vệ sinh lần 2 5460 4673 6580

3 Vệ sinh lần 3 520 510 495

4 Vệ sinh lần 4 295 297 285

Khi vệ sinh các tec lên men ở lần rửa thứ 1 và thứ 2 nước còn bẩn, ở

các tec ño ñược ñều ở khoảng 6000 RLU. Từ lần 3 trở ñi mức ñộ vệ sinh ñã

khá hơn, ở các tec ño ñược khoảng 500 RLU. Kết thúc quá trình kiểm tra (lần

4) mẫu ño ñược ñạt ở mức dưới 300 RLU ở cả 3 tec

3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm

Mẫu lấy ở máy lọc sản phẩm ñược tiến hành sau khi xả tháo vải lọc, xả

bỏ cặn lần ñầu tiên trên các bản lọc.


máy lọc sản phẩm

Số thứ tự Tên mẫu ðợt 1 (RLU) ðợt 2 (RLU) ðợt 3 (RLU)

1 Vệ sinh lần 1 790 795 787

2 Vệ sinh lần 2 792 620 690

37

3 Vệ sinh lần 3 254 265 235

4 Vệ sinh lần 4 150 120 137

Ở hai lần vệ sinh ñầu, máy lọc sản phẩm vẫn chưa ñược sạch, sau lần

thứ 3 vệ sinh kết quả RLU ở cả ba ñợt ñều nhỏ hơn 300 RLU. Ở máy lọc sản

phẩm chỉ sau 3 lần ñã có thể ñạt yêu cầu vệ sinh.

3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm


các tec sản phẩm

Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)

1 Vệ sinh lần 1 870 734 674

2 Vệ sinh lần 2 723 627 580

3 Vệ sinh lần 3 225 243 235

4 Vệ sinh lần 4 131 127 130

Sau lần 1 và lần 2, quá trình vệ sinh vẫn không thay ñổi ñáng kế. ðến

lần 3, ở tất cả các tec ñều ñạt kết quả dưới 300 RLU. Cũng như ở máy lọc sản

phẩm, tec sản phẩm cũng ñạt yêu cầu sau 3 lần vệ sinh.

3.3. ðánh giá sự tương thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phương pháp

truy ền thống và ño ATP quang sinh

3.3.1. Mẫu ñã biết trước nồng ñộ

ðể so sánh sự tương thích, chúng tôi chuẩn bị các mẫu thử ñã biết trước

nồng ñộ. Mẫu ñược chuẩn bị từ nấm men Saccharomyces carlbergensis dùng

trong sản xuất bia, với nồng ñộ ban ñầu là 3.5 x 106 tế bào/mL Các mẫu ñược

chuẩn bị với nhiều mức nồng ñộ khác nhau với hệ số pha loãng là 10-1, 10-2,

10-3, 10-4 kết quả ñược trình bày ở bảng dưới ñây.

38

Bảng 14: Kết quả phân tích mẫu ñã biết trước nồng ñộ bằng cả

phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh.

Tên mẫu Tổng vi sinh vật

(CFU) ðo ATP (RLU)

Mẫu ban ñầu 3.5 x 106 2302

Mẫu 10-1 3.5 x 105 747

Mẫu 10-2 3.5 x 104 243

Mẫu 10-3 3.5 x 103 158

Mẫu 10-4 3.5 x 102 132

Qua bảng kết quả ta thấy kết quả ño ñược từ phương pháp ATP quang

sinh và tổng số tế bào nấm men ñếm ñược có sự tương thích, số ñơn vị RLU

tăng dần khi số lượng tế bào tăng dần. Ở giai ñoạn pha loãng giữa nồng ñộ

mẫu 10-4 và mẫu 10-3, kết quả thay ñổi không nhiều, nhưng có sự nhảy vọt

giữa mẫu 10-1 và 10-2 và ñặc biệt là từ mẫu ban ñầu so với mẫu ñã pha loãng

10 lần ( Mẫu 10-1).

3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia

a. Kiểm tra ở tec lên men

� Tec 1

Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phương pháp truyền

thống và phương pháp ATP quang sinh


hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)

Rửa lần 1 5.8 x 106 6608

39

Rửa lần 2 5.4 x106 5460

Rửa lần 3 5.2 x 104 520

Rửa lần 4 1.5 x 103 295

� Tec 2

Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phương pháp

truyền thống và phương pháp ATP quang sinh



Rửa lần 1 4.2 x 106 5500

Rửa lần 2 3.7 x106 4673

Rửa lần 3 2.1 x 104 510

Rửa lần 4 1.0 x 103 297

� Tec 3

Bảng 17: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phương pháp




Rửa lần 1 5.7 x 106 6740

Rửa lần 2 5.5 x106 6580

Rửa lần 3 4.7 x 104 495

Rửa lần 4 1.8 x 103 285

Nhận xét:

40

Quá trình vệ sinh, rửa lần 1 và lần 2 chưa có sự thay ñổi nhiều thể hiện

ở cả phương pháp xác ñịnh truyền thống và phương pháp ATP quang sinh. Từ

lần rửa thứ 3, ở các tec lên men mới thấy biểu hiện rõ rệt sự thay ñổi vệ sinh,

và ñến lần rửa cuối (lần 4) cùng thì sự ñảm bảo vệ sinh mới ñược hoàn tất.

Nếu dùng phương phương kiểm tra nhanh bằng ATP quang sinh thì tec lên

men hoàn thành quá trình vệ sinh khi chỉ số RLU nhỏ hơn 300.

b. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm

� ðợt 1

Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 1 bằng phương

pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh



Rửa lần 1 6.2 x 103 790

Rửa lần 2 5.9 x103 792

Rửa lần 3 3.0 x 102 254

Rửa lần 4 0.5 x 102 150

� ðợt 2





Rửa lần 1 6.1 x 103 795

Rửa lần 2 6.0 x103 620

Rửa lần 3 2.0 x 102 265

41

Rửa lần 4 0.4 x 102 120

� ðợt 3





Rửa lần 1 5.9 x 103 787

Rửa lần 2 5.7 x103 690

Rửa lần 3 1.0 x 102 235

Rửa lần 4 2.0 x 10 117

Nhận xét: Ở máy lọc sản phẩm từ sau lần rửa thứ ba sự ñảm bảo vệ sinh

ñã ñược hoàn tất, ở cả ba ñợt chỉ số RLU ño ñược ñều nhỏ hơn 300.

c. Kiểm tra ở các tec sản phẩm

� Tec 1

Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phương pháp




42

Rửa lần 1 6.3 x 103 870

Rửa lần 2 6.2 x103 723

Rửa lần 3 10 x 102 225

Rửa lần 4 2.0 x 10 131

� Tec 2



Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu

khí (CFU) ðo ATP (RLU)

Rửa lần 1 6.0 x 103 734

Rửa lần 2 6.1 x103 627

Rửa lần 3 8.0 x 102 243

Rửa lần 4 1.2 x 10 127

� Tec 3





Rửa lần 1 5.4 x 103 674

43

Rửa lần 2 4.8 x103 580

Rửa lần 3 9.0 x 102 235

Rửa lần 4 1.7 x 10 130

Nhận xét: Ở các tec lên men sau lần rửa vệ sinh thứ 3, các tec ñã ñạt

yêu cầu về vệ sinh, các chỉ số RLU ño ñược ở cả 3 tec sau lần rửa thứ 3 ñều

nhỏ hơn 300.

3.4. Khảo sát ứng dụng phương pháp tạo màu xác ñịnh tổng số Coliforms

trên máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre)

Sử dụng nước thải sau vệ sinh của xưởng sản xuất ñể kiểm tra Coliformss. Từ nguồn nước thải ñã xác ñịnh ñược Coliformss tổng số (ký hiệu M) ñem pha loãng ra các nồng ñộ khác nhau M x 5 -1; M x 10 -1; M x 10 -2 ñược các mẫu có chứa Coliformss khác nhau ñể nuôi cấy, sau ñó ñem ño trên quang phổ UV-VIS.

Chúng tôi tiến hành scan bước sóng ở ba mức ñộ nồng ñộ ( M x 5 -1; M

x 10 -1; M x 10 -2). từ bước sóng 190nm -1100nm, tốc ñộ 100nm/phút. Kết quả

thu ñược như sau:

� Nồng ñộ M x 10-2mL

Bảng 24: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 10-2 ở bước sóng

190 – 1100nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

1 967 0.467 1078 0.265

2 655 0.930 908 0.322

3 614 0.957 644 0.897

44

4 284 3.587 559 0.830

5 243 3.776 277 3.551

� Nồng ñộ M x 10-1


190 – 1100nm

Peak Valley


1 972 0.409 1074 0.220

2 292 3.646 907 0.258

3 242 3.753 273 3.591

� Nồng ñộ M x 5-1


190 – 1100nm

Peak Valley


45

1 970 0.447 910 0.306

2 655 0.951 644 0.914

3 614 0.979 558 0.840

4 292 3.637 276 3.587

5 241 3.793

Hình 1: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 190 – 1100 nm

46


Ở cả 3 mức nồng ñộ, ñộ hấp thụ ñạt cao nhất ở bước sóng 241nm –

243nm. Tuy nhiên dung dịch tạo màu có màu xanh lục, là vùng nhìn thấy nằm

trong dải phổ từ 400 nm- 800nm. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo ở vùng

bước sóng từ 400 nm – 800 nm. Kết quả thu ñược như sau:

� Nồng ñộ ban ñầu M

Bảng 27: Kết quả scan mẫu M ở bước sóng 400 – 800nm

Peak Valley


1 613.5 0.928 569.0 0.825

� Nồng ñộ M x 5 -1

47

Bảng 28: Kết quả scan mẫu M x 5-1 ở bước sóng 400 – 800nm

Peak Valley


1 615 0.992 568 0.886


Bảng 29: Kết quả scan mẫu M x 10-1 ở bước sóng 400 – 800nm

Peak Valley


1 615 0.909 588.5 0.775


Bảng 30: Kết quả scan mẫu M x 10-2ở bước sóng 400 – 800nm

Peak Valley


1 656 1.301 640.5 1.272

2 617 1.301 565.5 1.089


Bảng 31: Kết quả scan mẫu M x 10-3ở bước sóng 400 – 800nm

Peak Valley

48


1 657 0.972 636.5 0.960

2 617.5 0.985 561 0.823


Ở cả 5 mức nồng ñộ, scan từ bước sóng 400nm – 800nm, chúng tôi thu

ñược ñộ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 617 nm. Chúng tôi tiến hành ño mẫu

nước thải lấy ở bể chứa nước thải sau khi vệ sinh ở bước sóng 617 nm, thu

ñược kết quả như sau:

Bảng 32: Kết quả phân tích mẫu lấy ở bể chứa nước thải sau khi vệ

sinh bằng phương pháp truyền thống và ño bằng máy UV-VIS 1900

của Hitachi.

Tên mẫu ABS MPN

(Coliformss)

M 1.634 13 x 105

M x 10-1 1.442 80 x 104

49

M x 10-2 1.266 50 x 103

M x 10-3 1.223 40 x 102

M x 10-4 0.852 23 x 10

M x 10-5 0.074 40

Nhận xét:

Nhìn vào bảng kết quả trên chúng ta thấy có sự tương thích giữa ñộ hấp

thu ño ñược trên máy quang phổ UV-VIS 1900 và phương pháp xác ñịnh

Coliforms truyền thống (Phương pháp nhiều ống xác ñịnh Coliforms: ISO

9308-2). Sự khác nhau về ñộ hấp thụ ABS giữa các mức nồng ñộ khác nhau

rất rõ. Qua ñó, cho thấy ban ñầu có thể dùng thiết bị UV – VIS 1900 của

Hitachi vào xác ñịnh sự có mặt của Coliforms.

50

Chương IV.

KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ Từ kết quả nghiên cứu cử ñề tài cho chúng ta một số kết luận sau:

1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống và phương pháp ño ATP

quang sinh học có sự tương thích nhất ñịnh.

2. Phương pháp ATP quang sinh có nhiều ưu ñiểm, dễ thực hiện và cho kết

quả nhanh, tương ñối chính xác ñể cho các phép thử nhanh về vệ sinh an

toàn thực phẩm.

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, khi ño bằng phương pháp ATP quang

sinh có kết quả nhỏ hơn 300 RLU, thì một số khu vực vệ sinh trong dây

truyền sản xuất bia ñã ñạt yêu cầu về vệ sinh.

Phương pháp ATP quang sinh có những ưu ñiểm như sau:

+ Là phương pháp ño nhanh, ñơn giản, dễ thực hiện, dễ mang ñi hiện

trường.

+ Từ kết quả ño ñược bằng ATP quang sinh không chỉ phát hiện ñược số

lượng vi sinh vật sống mà còn kiểm tra ñược hàm lượng tồn dư các chất

dinh dưỡng làm môi trường cho vi sinh vật phát triển.

+ Nhờ vậy giúp các nhà máy, cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm khắc

phục ñược các sự cố vệ sinh tức thời.

Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số hạn chế:

+ Phương pháp chỉ kiểm tra ñược tổng số vi sinh vật mà chưa có phân loại

ñược từng loại vi sinh vật.

+ Giá thành của mỗi que thử lấy mẫu cũng tương ñối ñắt và mỗi que lấy

mẫu chỉ dùng ñược một lần duy nhất, nếu thao tác lấy mẫu không ñúng sẽ

khá tốn kém khi lấy ñi, lấy lại nhiều lần.

3. Ở trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử ứng dụng của máy quang

phổ UV-VIS 1900 Hitachi và thấy có sự tương thích khá chặt chẽ giữa ñộ

hấp thụ và tổng số Coliforms trong mẫu. Bước ñầu có thể ứng dụng máy

51

ño UV-VIS 1900 Hitachi vào việc xác ñịnh mức ñộ có mặt của Coliforms

một cách tương ñối.

3. Kiến nghị:

1. Phương pháp ño ATP quang sinh còn là phương pháp mới, ñể có thể ñem

ra ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả hơn, chúng ta cần phải ñầu tư thời

gian ñể nghiên cứu và tham khảo nhiều hơn nữa.

2. Có những nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của máy quang phổ UV-VIS

vào việc xác ñịnh tổng số vi sinh vật nói chung cũng như tổng số

Coliformss. Củng cố thêm mối tương quan giữa ñộ hấp thụ và nồng ñộ vi

sinh vật, từ ñó có thể cho ra một kết quả tương ñương giữa ñơn vị ñộ hấp

thụ ABS và ñơn vị của vi sinh vật tổng số cũng như tổng số Coliformss.

52

TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Tiếng Việt

1. Kiều Hữu Ảnh (2010), Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất bản

giáo dục Việt Nam.

2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn ðăng ðức, ðặng Hồng Miên (1976), Một số

phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất bản khoa học kỹ

thuật, tập3.

3. Nguyễn Lân Dũng (1971), Kiểm tra số lượng và phân lập các nhóm vi sinh

vật, Nhà xuất bản ñại học tổng hợp, tập 1

4. Nguyễn Văn ðạt (1974), Phân tích lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản

khoa học kỹ thuật.

5. Nguyễn Quang Hào (1980), Thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo

dục.

6. Lưu Lâm, Nguyễn Yên, Trần Quang (1969), Vệ sinh thực phẩm, Vụ kỹ

thuật.

7. Hoàng Tích Mịch, Hà Huy Khôi (1977), Vệ sinh dinh dưỡng và vệ sinh

thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.

8. Vũ Văn Ngũ (1987), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Y

học.

9. ðào Thị Nguyện (1995), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y hoc.

10. Lương ðức Phẩm (2000), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm,

Nhà xuất bản Nông nghiệp.

11. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiến (1975), Vệ sinh

thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.

53

12. Phạm Văn Thành (2002), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích

nhanh ñể ñể kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm. Báo cáo ñề tài năm

2002. Bộ Công nghiệp

13. Văn Tình (1983), Kiểm tra chất lượng sản phẩm nông nghiệp, Nhà xuất

bản Thành phố Hồ Chí Minh.

14. Bùi Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh ðức (1991), Kiểm nghiệm

chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Y

học.

15. Ứng dụng các phương pháp phân tích công cụ trong kiểm soát môi trường

và thực phẩm (1999), Hội thảo khoa học Hà nội.

16. Ứng dụng các phương pháp phân tích công cụ hiện ñại trong môi trường

và an toàn lương thực thực phẩm (1994), Hội thảo khoa học Hà nội.

17. Phạm Thu Yến (2001), “Kiểm tra quá trình vệ sinh trong sản xuất thực

phẩm, ñánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra truyền

thống và phương pháp ño ATP quang sinh học”, khóa luận tốt nghiệp.

Tiếng Anh

18. Adam M.R anh Moss M.O (1995), “ Food Microbiology”, The Royal

Society Of Chemistry.

19. Claude Moreau (1974), “ Mousissures toxique dans Ladimentation

edition”, Pari.

20. Harry H (1962), “Practical food Microbiology and Technology Wesport”,

Connecticut.

21. R.D. Gonzalez. L.M. Tamagnini, P.D. Olmos, G.B. de Sousa (2003),

“Evalution of a chromogenic medium for total Coliformss and

Escherichia coli determination in ready-to-eat foods”, Food

Microbiology, 20, pp. 601-604.

22. Denis Byamukama, Frank Kansiime, Robert L. Mach, and Andreas H.

Farnleitner (200), “ Determination of Escherichia coli Cotamination

with Chromocult Coliforms Agar Showed a High Level of

Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in

54

Tropical Waters of Kampala, Uganda “, Applied and Environmental

Microbiology, pp. 864-868

23. K. Geissler, M. Manafi, I. Amoros and J.L. Alonso (2000), Quantitative

detarmination of total Coliforms and Escherichia coli in marine waters

with chromogenic and flourogenic media, Joural of Applied

Microbiology, 88, pp. 280-285.

24. ICMSF (2005), Microorganisms in food, Second Edition, kluwer

Academic, Plenum Publishers

25. Jay, J.M. (2000), Modern food microbiology, Sixth edition, Aspen

Pushlisher

26. Manning, S.D., (2004), Escherichia coli infections, Chelsea House

Publishers.

27. Standard Method the Examination of Water and Wastewater 21th edition,

2005, 9215B.

28. Standard Method the Examination of Water and Wastewater 21th edition,

2005, 9215D

29. ISO 9308-2: First edition 1990-10-01

Documents

LUAN VAN Tran Thi Hao (119).p… · 3 1.3.2.Ph ương pháp ñánh giá thông qua vi ệc giám sát các thông s ố của h ệ th ống t ự ñộng ho ặc thông qua vi ệc