Logros y límites de la epidemiología molecular. 

Una visión desde el laboratorio

Fernando González Candelasfernando.gonzalez@uv.es

Un camino con dos sentidos…

“En su virtud, y dado lo tajante de sus términos, el Tribunal ha tenido por probado el que efectivamente todos los afectados, incluidos por los peritos genetistas en los clados del brote, han sido contagiados de VHC por el acusado.”

Una historia (casi) interminable…

Muestras 362

Secuencias 4184

42/473 controles

47/559 casos excluidos

0.02

Muestras 273

Secuencias 3152

González‐Candelas et al. 2013. BMC Biol. 11: 76Fecha de infección (informe del fiscal)

Fecha de

 infección (reloj m

olecular re

lajado

)

In 176 casos (65%) el HPD incluía la fecha de infección

25/05/1979

18/02/1982

14/11/1984

11/08/1987

07/05/1990

31/01/1993

28/10/1995

24/07/1998

19/04/2001

11/08/1987 23/12/1988 07/05/1990 19/09/1991 31/01/1993 15/06/1994 28/10/1995 11/03/1997 24/07/1998

3'UTR

Nucleocápsida

Proteínas de cubierta

5'UTR

Transmembrana Cofactor

MetaloproteasaSerín-proteasaRNA helicasa

NS3NS2C E2E1 NS4A NS4B NS5BNS5A

IFN-PKRrepresor

RNA polimerasaRNA-dependiente

1 192 384 810 1027 1658 1973 2421 3011

0.3-7.8

1.2 – 9.80.7-15.7

0.7-13.2

0.3-10.3

0.17-11.3

0.3-10.3

0.4-7.5

0.1-0.7

0.15-1.0

Basados en DNA

No basados en DNA

‐ Serotipado‐ Serogrupo

‐ Isozimas – Alozimas‐MLEE

Basados en la movilidad electroforética de las proteínas

Basados en reconocimiento de antígenos

‐ PFGE ‐ SSCPs ‐ Curvas de fusion – HRM

‐ RFLPs ‐ CAPs ‐ RAPDs ‐ SCARs‐ AFLPs

‐ VNTRs ‐ STRs‐ ISSRs‐MLVAs‐ CRISPRs

‐ SNPs‐Microarrays‐MLSTs – SBTs‐ Next Generation Sequencing (NGS)

Basados en propiedades bioquímicas del DNA

Basados en PCR

Basados en secuencias repetidas

Basados en secuenciación

Marcadores moleculares

Levy & Myers (2016) Ann. Rev. Genom. Human Genet.

Epidemiología genómica: muchas herramientas, algunas pasadas de moda

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011H. Vanaclocha, DGSP (pers.comm.)

2

1 Casos de legionelosis en Alcoy, 1997‐2011

33

122

13

29

50

12

62

1

46

25

13

1

Semana epidemiológica

0

1

1 2

3

4

5 6 7

8 9 10 11

1314

15

12

1617

18

Extracción de DNA totalExtracción de DNA total PCR de 7 SBT genesPCR de 7 SBT genes Purificación y secuenciaciónSanger

Purificación y secuenciaciónSanger

Tipado por MSLT en la investigación de brotes y vigilancia de Legionella

fliC pilE asd mip proAmompS neuA

ST 11 4 3 1 1 1 1

ST 5786 10 15 13 9 14 6

Outbreak identification Clinical information

ID Fechas Duración(días) Casos Sex ratio Edad Rango

Factores riesgo Tasahospitalización

(%)

Letalidad (%)

Aislados (C+E)Fumador

(%)

Enf.crónica(%)

ALCOY 1 Sept. 1999  ‐ Feb. 2000 160 36 2,27 61,8 18 ‐ 92 44,00 50,00 100,0 8,30 6

ALCOY 2 April ‐ July 2000 113 11 2,67 63,3 38 ‐ 86 45,00 27,30 63,6 0,00 2

ALCOY 3 Sept. – Dec. 2000 76 97 1,8 66,3 22 ‐ 95  27,80 50,50 86,5 7,20 10

ALCOY 4 May ‐ June 2001 12 5 4 57,2 35 ‐ 85  0,00 80,00 100,0 20,00 2

ALCOY 5 July ‐ August 2002 13 9 8 56,2 32 ‐ 83  66,60 77,70 100,0 0,00 1

ALCOY 6 Oct. – Nov. 2002 12 5 All males 62,8 44 ‐ 82 20,00 40,00 80,0 0,00 0

ALCOY 7 Nov. – Dec. 2002 24 12 5 66,0 30 ‐ 88 25,00 25,00 91,0 0,00 0

ALCOY 8 April ‐May 2003 32 11 2 66,0 38 ‐ 84 36,36 81,00 100,0 0,00 1

ALCOY 9 July 2003 14 4 All males 72,2 47 ‐ 86 50,00 75,00 100,0 0,00 0

ALCOY 10 Sept. – Oct. 2003 9 3 All males 65,3 54 ‐ 77 33,30 66,60 100,0 0,00 1

ALCOY 11 Oct. – Nov. 2003 30 31 2,1 67,5 41 ‐ 89 31,00 59,00 100,0 9,70 6

ALCOY 12 Oct. – Nov. 2004 50 12 1,4 76,2 61 ‐ 90 17,00 91,00 100,0 25,00 2

ALCOY 13 June 2005 10 12 1 69,0 36 ‐ 89 33,00 65,00 92,0 0,00 3

ALCOY 14 June ‐ July 2005 26 27 2 66,0 39 ‐ 93 59,26 44,40 92,0 0,00 6

ALCOY 15 Sept. – Oct. 2005 25 19 1,1 66,0 35 ‐ 93 37,00 52,60 86,0 0,00 2

ALCOY 16 July ‐ August 2009 38 11 4,5 70,0 49 ‐ 88 45,50 81,80 100,0 9,00 2

ALCOY 17 Sept. – Oct. 2009 18 22 2,14 70,1 46 ‐ 86 13,60 59,10 86,0 0,00 4

ALCOY 18 May ‐ July 2010 38 16 2,2 64,6 38 ‐ 85 68,70 50,00 75,0 0,00 6

343 66,1 18‐95 5,25 54

Brotes de legionelosis declarados en Alcoy, 1999‐2010

Casos /

 Aislados

Alcoy1

Alcoy2

Alcoy3

Alcoy4

Alcoy5

Alcoy6

Alcoy7

Alcoy8

Alcoy9

Alcoy10

Alcoy11

Alcoy12

Alcoy13

Alcoy14

Alcoy15

Alcoy16

Alcoy17

Alcoy18

Epidemiología genómica de L. pneumophila en Alcoy

• 46 ST‐578, 5 ambientales

• 10 ST‐1, amb.• 7 ST‐637, 2 amb.• 6 otros STs.• 21 casos esporádicos• 48 relacionados con brotes

Muestras de Alcoy

Genomas de referencia

• Philadelphia• Paris• Corby• Lorraine• Alcoy• Lens• Lp 130b• Lp ATCC43290• Lp HL06041035

Sánchez‐Busó et al. (2014) Nat. Genet. 46:1205.

ST51

ST804

Sánchez‐Busó et al. (2014) Nat. Genet. 46:1205.

Árbol ML, basado en SNPs

Line

ageA

Line

ageB

ST51

Árbol ML, basado en SNPs

Sánchez‐Busó et al. (2014) Nat. Genet. 46:1205.

Line

ageA

Line

ageB

Cepas de brotes (2009‐2010 )

Sánchez‐Busó et al. (2014) Nat. Genet. 46:1205.

Room Samplingpoint 1 2 3 4 5 6 7

111 AFCH111 ACS115 AFCH115 ACS119 AFCH119 ACS201 AFCH201 ACS211 AFCH211 ACS308 AFCH308 ACS310 AFCH310 ACS311 AFCH311 ACS315 AFCH315 ACS401 AFCH401 ACS403 AFCH403 ACS411 ACS412 AFCH412 ACS415 AFCH415 ACS504 AFCH504 ACS506 AFCH506 ACS507 AFCH507 ACS512 AFCH512 ACS513 AFCH513 ACS514 AFCH514 ACS522 AFCH522 ACS604 AFCH605 AFCH605 ACS617 AFCH617 ACS620 AFCH620 ACS705 AFCH705 ACS708 AFCH708 ACS711 AFCH719 AFCH719 ACS721 AFCH721 ACS811 AFCH811 ACS816 AFCH816 ACS1009 ACS1201 AFCH1201 ACS1214 AFCH

WToilet AFCHMToilet AFCH

Bar (Hall) ACSSpa AFCH

E. solar SolarEPozo Well

Acumul 3 AcumPersDress ACS

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

19/01/12 31/01/2012 15/02/2012 17/02/2012 23/02/2012 29/02/2012 15/03/12 29/03/2012

% L. p

neum

ophila‐positive

 biofilm sa

mples

Semana muestreo

Biofilms  muestreados (Hotel Diamante Beach) 

Diamante Beach (spa)

Diamante Beach(spa)

Cultivospositivos

(muestras agua)

Hab. 311

Sánchez‐Busó et al. (2016) Front. Microbiol.6: 1556.

MUESTRAS AMBIENTABLES 

Tipo de muestra N L. pneumophila Legionella spp.Biofilms 206 120 (58.3%) ‐Aguas (DGISP) 491 8 (1.6%) 2 (0.4%)Aguas (MicroServices) 102 5 (4.9%) 2 (2.0%)Aguas (S. Crespi) 136 3 (2.2%) 3 (2.2%)

Legionella ST/spp NST 23 1ST 578 5ST 1164 2ST 23 (incompletas)  2ST 578 (incompletas) 95No determinada 15

Legionella ST/spp NST 23 12ST 1236 3ST B 2L. micdadei 7Legionella spp. 3No determinada 1

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR 

Biofilms Aguas

Sánchez‐Busó et al. (2016) Front. Microbiol.6: 1556.

MuestraTipo de muestra

fliC pilE asd mip mompS proA neuA ST

125Esputo + Cultivo 2 3 9 10 2 1 6 23

191712 Esputo 6 10 15 13 ‐ 14 6 (578)192147 Esputo 6 10 1 13 2 ‐ 6 ‐192091 BAS + Cultivo 2 3 9 10 2 1 6 23163655 Esputo 6 3 9 10 9 1 6 A50291 Cultivo 2 3 9 10 2 1 6 2350726 Cultivo 2 3 9 10 2 1 6 23193975 Esputo 6 3 ‐ ‐ 2 1 6 ‐191620 Esputo 2 3 9 10 2 1 6 23

9138 Esputo ‐ ‐ 9 ‐ ‐ ‐ ‐160613 Esputo 2 3 9 10 2 1 6 2318484 Esputo 2 3 9 ‐ 2 1 6 (23)160717 BAS 2 3 9 10 2 1 6 23

CNM_2736 BAS + Cultivo 2 3 9 10 2 1 6 23CNM_2800 Esputo ‐ 3 18 10 2 1 6 ‐CNM_2806 Esputo 6 ‐ 14 15 2 ‐ 6 ‐CNM_2999 Cultivo

MUESTRAS CLÍNICAS

• Brote extremadamente complejo: distintas fuentes y cepas bacterianas difundidas por diversos circuitos y sistemas. 

• La secuenciación de muestras no cultivadas (esputos y biofilms) permite explicar la aparente desconexión entre la mayoría de aislados clínicos (ST23) y los ambientales (ST578), al revelar cada uno de estos STs en muestras no cultivadas, tanto clínicas como ambientales.

• La secuenciación de aislados clínicos del ST23 permitió establecer la fecha de colonización de las instalaciones del hotel por Legionella, que resultó ser previa a la inauguración del hotel, coincidente con las obras de construcción del mismo.

Un camino con dos sentidos…

1808 secuencias de la región PR/RT de muestras de la CV en el periodo 2006‐2014.

Los subtipos se determinan mediante análisis filogenético con un panel de secuencias de bases de datos públicas.

El análisis de mutaciones de resistencia de cada muestra se realiza en el servidor de la Universidad de Stanford.

HIV‐1 Cepa HXB2

Secuencia PR/RT parcial, 1302 pb2253 3555

ANÁLISIS DE RESISTENCIAS A ANTIRRETROVIRALES EN HIV-1

Distribución de secuencias multi-resistentes

Distribución Subtipos HIV

B A1 CRF01_AE F1 G

CRF14_BG CRF02_AG CRF03_AB CRF12_BF CRF47_BF

CRF18_cpx CRF19_cpx Others

SubtipoN 

(total)N 

(agrupados)N

(mayor grupo)Vía de transmision másfrecuente

B 1514 893 111 MSMA1 34 12 4 HT,MSMCRF01_AE 2 2 2 UNKF1 35 12 5 MSMG 20 7 3 HTCRF14_BG 28 23 21 HT,IDUCRF02_AG 66 34 5 HT,MSMCRF03_AB 4 4 4 IDUCRF12_BF 12 8 2 MSMCRF47_BF 7 5 3 MSMCRF18_cpx 3 2 2 HTCRF19_cpx 14 9 6 MSMOthers 69 35 5 (recombinant A,J) HTTOTAL 1808 1046 111

Cluster size B Non‐B2 120 373 43 64 16 55 12 46 47 68 49 210 113 115 116 118 119 120 221 2 1*111 1

Cluster 893 153No cluster 621 141Total analysis 1514 294% cluster 58.98% 52.04%#clusters 218 53

OR Value 95% CI P‐valueFisher's exact test 1.32 1,02 ‐ 1,72 0.028

*CRF14_BG, UDIs+HTs

Análisis de los grupos de transmisión en la CV

Análisis de los grupos de mayor tamaño

0

50

100

150

200

250

300

350

2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

All (Valencia city)

MSM clade (Valencia city)

Año

Núm

ero

de p

acie

ntes

• Cluster de 113 personas, la mayoría de la ciudad de Valencia, asociado a otras secuencias de distintas localidadesespañolas.

• La mayoría de personas incluidas en el cluster indicant sexono protegido con otros hombres como factor de riesgo para la infección.

• Podemos datar el inicio de la cadena de transmisión en 2001 (HPD al 95%: 1998‐2004).

• Hasta 2010, las secuencias del cluster representan el 3.5% (5/143) de las secuencias analizadas en Valencia, pero desdeese año pasan a representar el 12.64% (100/791).

Análisis de un gran cluster de MSM

Epidemiología genómica de TB en la CV

Epidemiología genómica de TB en la CV

Epidemiología genómica de TB en la CV

50

16

5 30 1 1

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5 6 7 8

Tamaño del grupo

Número de casos en grupo

Distribución del tamaño de los grupos de transmisión

Movilidad en las transmisiones recientes

Klebsiella pneumoniae BLEE - HGUC

Brote de Pseudomonas aeruginosa multirresistente HGUE

Neisseria gonorrhoeae, Com. Valenciana + Cataluña

Casey et al. (2013) Gut

NGS “pipeline”

Problemas en el uso de WGS/NGS en epidemiología (vigilancia e investigación de brotes)

• Complejidad y reproducibilidad de los datos de secuencia producidos.

• Diferencias entre las distintas plataformas de NGS.

• Comparabilidad entre laboratorios.

• Disponibilidad de procedimientos bioinformáticos estandarizados.

• Nomenclatura de las cepas obtenidas por WGS.

• Comparabilidad y retro‐compatibilidad con las técnicas de tipado existentes.

• Traslación de los datos epidemiológicos y secuencias genómicas en 

información útil para los responsables de Salud Pública. 

• Además, el acceso de los laboratorios de Salud Pública a las tecnologías 

genómicas difiere entre países de la UE y también dentro de ellos. 

La epidemiología molecular, basada en la secuenciación de genes o de genomas

completos, es una herramienta esencial para la investigación de brotes de infecciones

transmisibles así como para la vigilancia continua de las mismas, incluidas las

resistencias a antibióticos y antivirales. Es complementaria a los métodos empleados

tradicionalmente en epidemiología y debería ser incorporada a la cartera de

actuaciones en los correspondientes servicios de vigilancia. Sin embargo, debe tenerse

en cuenta que se estudian organismos vivos, capaces de evolucionar en tiempo real, y

que los resultados obtenidos y su interpretación deben tener en cuenta estos

procesos. Además, en la actualidad hay una variedad de procedimientos de

laboratorio y de análisis de los datos que no siempre producen los mismos resultados

en réplicas independientes, por lo que su aplicación debe aún en colaboración con

expertos en epidemiología, microbiología, bioinformática o evolución, entre otros. Esta

aproximación integradora de disciplinas ofrece un gran potencial para convertir los

datos generados en el laboratorio en información útil para la vigilancia y control de los

organismos patógenos.

A modo de conclusión…

María Alma Bracho LapiedraIñaki ComasLeonor Sánchez‐BusóJuan Ángel Patiño Galindo

Paula Ruiz HuesoÁlvaro Chiner OmsCarlos Francés CuestaLorena Mejía CastañedaNeris García GonzálezMarta Pla DíazBeatriz Beamud Aranguren

Iván AnsariAntonio Espert

Agradecimientos

Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad. Ministerio de Ciencia e Innovación. Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Sport. Conselleria de Sanitat Universal i Salut Pública (GV)

Gracias también a: Centro de Salud Pública de Alcoy, Hospital Virgen de los Lírios (Alcoy) y restantes CSP de la CV

Herme VanaclochaConcepción GimenoNuria TormoRosario MorenoTomás PumarolaAntonia AndreuJudit SerraJavier ColominaJuan Carlos GalánMarisa MorosiniRafael CantónNatasha Arora