i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và

kết quả được nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, 2015

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này, tôi đã nhận

được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc

nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Ngô Quốc Anh và PGS.TS

Đỗ Quang Kháng đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản

luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Phòng Quản lý

Tổng hợp, anh chị em phòng Công nghệ Vật liệu và Môi trường – Viện Hóa Học

các đồng nghiệp trong và ngoài Viện đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực

hiện luận án và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và

bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và

hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả Luận án

iii

MỤC LỤC

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ v

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii

MỞ ĐẦU. ................................................................................................................... 1

Chương 1- TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. VAI TRÒ VÀ TIỀM NĂNG CỦA ETHANOL SINH HỌC ........................... 3

1.1.1. Vai trò của ethanol sinh học ...................................................................... 3

1.1.2. Tiềm năng sản xuất ethanol sinh học ......................................................... 5

1.1.3. Sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học .................................................... 6

1.1.4. Các nguyên liệu thường dùng để sản xuất ethanol ngày nay ..................... 6

1.1.5. Lên men sản xuất ethanol ......................................................................... 10

1.2. RONG BIỂN .......................................................................................................... 12

1.2.1. Giới thiệu chung ....................................................................................... 12

1.2.2. Hình thái - Phân loại các loài rong biển ở Việt Nam ............................... 12

1.2.3. Phân bố, khai thác sản xuất rong biển ...................................................... 14

1.2.4. Tổng quan về rong nâu ............................................................................. 16

1.3. PHẾ THẢI NÔNG NGHIỆP: RƠM, RẠ Ở VIỆT NAM ............................... 23

1.3.1. Phế thải nông nghiệp ................................................................................ 23

1.3.2. Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp ........................................ 23

1.4. VI SINH VẬT TRONG XÚC TÁC QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN ............... 29

1.4.1. Vi sinh vật ................................................................................................ 29

1.4.2. Xúc tác sinh học trong quá trình thủy phân ............................................. 31

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC THUỘC LĨNH

VỰC CỦA LUẬN ÁN .................................................................................................. 39

1.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ............................................................ 39

1.5.2. Các nghiên cứu trong nước ...................................................................... 43

Chương 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 47

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................................... 47

iv

2.1.1. Các nguyên vật liệu chứa cellulose .......................................................... 47

2.1.2. Các chủng vi sinh ..................................................................................... 48

2.1.3. Hóa chất .................................................................................................... 50

2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 51

2.2.1. Phương pháp hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ .................................... 51

2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm của rong biển khô ..................................... 52

2.2.3. Xác định protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl ............................. 52

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng tro ...................................................... 53

2.2.5. Xác định hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch ................... 54

2.2.6. Phương pháp định lượng đường khử theo phương pháp acid

dinitrosalicylic (DNS) ........................................................................................ 55

2.2.7. Phương pháp tiền xử lý phế thải rong nâu ............................................... 57

2.2.8. Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................... 60

2.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU .................................................... 61

2.3.1. Quy trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu và phế thải nông nghiệp

............................................................................................................................ 61

2.3.2. Quy trình dự kiến lên men dịch đường tạo ethanol sinh học ................... 64

2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân

carbohydrate trong rong nâu............................................................................... 65

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men

tạo ethanol .......................................................................................................... 70

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 75

3.1. Nghiên cứu và chuẩn bị nguyên vật liệu sản xuất nhiên liệu sinh học .......... 75

3.1.1. Xác định hàm lượng carbohydrate trong rong nâu thu tại Nha Trang và

Hải Phòng ........................................................................................................... 75

3.1.2 Xác định hàm lượng cellulose tách từ rơm rạ ........................................... 76

3.1.3. Nghiên cứu thu nhận xúc tác sinh học cho sản xuất bioethanol .............. 78

3.2. Nghiên cứu quá trình thủy phân carbohydrate từ các nguồn nguyên liệu

thành saccharide hòa tan ............................................................................................. 81

3.2.1. Thủy phân carbohydrate trong rong nâu .................................................. 81

3.2.2. Nghiên cứu thủy phân cellulose tách chiết từ rơm rạ ............................... 91

3.2.3. Đánh giá chung về quá trình thủy phân chuyển hóa carbohydrate trong

rong biển, phế thải nông nghiệp thành đường .................................................. 106

v

3.3. Nghiên cứu quá trình lên men các sản phẩm trung gian hòa tan................ 108

3.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rong nâu và phế

thải nông nghiệp ............................................................................................... 110

3.3.2. Nghiên cứu lên men bằng sản phẩm trung gian glucose từ quá trình thủy

phân rơm rạ bởi chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 ............................. 116

3.4. Chuyển hóa phế thải rong nâu thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học kết

hợp với acid .................................................................................................................. 118

3.4.1. Hàm lượng cellulose có trong phế thải rong nâu sau quá trình tách alginate 118

3.4.2. Hiệu quả quá trình thủy phân và lên men ............................................... 119

Nhận xét............................................................................................................ 120

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 126

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .............. 128

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 130

PHỤ LỤC

Đỗ Trung Sỹ

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Diễn giải

1 ADP Adenosin diphosphate

2 ATP Adenosin triphosphate

3 BGL Glucosidase

4 BHT Butylated hydroxy toluen

5 CBH Cellobiohydrolase

6 DNS Acid dinitrosalicylic

7 EG Endoglucanase

8 FAO Food and Agriculture Organization

9 HPLC High performance liquid chromatography

10 IR Infrared spectroscopy

11 IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

12 NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

13 OD Optical density

14 PVA Polyvinyl alcohol

15 SHF Separate hydrolysis and fermentation

16 SPSS Statistical Package for the Social Sciences

17 SSF Simultaneous saccharification and fermentation

18 UV – VIS Ultraviolet–visible spectroscopy

Đỗ Trung Sỹ

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất hoá lý quan trọng của một số nhiên liệu ................................. 4

Bảng 1.2 Sản lượng ethanol trên thế giới ............................................................... 6

Bảng 1.3 Một số dự án sản xuất ethanol tại Việt Nam ........................................... 7

Bảng 1.4 Các dạng carbohydrate trong 3 ngành rong biển. ................................. 14

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp (%) .............................. 23

Bảng 1.6 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu .................................................. 24

Bảng 1.7 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose ...................................................... 31

Bảng 2.1 Các loài rong nâu được thu hái để nghiên cứu ...................................... 48

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose ....................................... 49

Bảng 2.3 Các chủng vi sinh vật cho lên men ethanol ........................................... 49

Bảng 2.4 Các hóa chất được sử dụng trong luận án ............................................. 50

Bảng 2.5 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phương pháp

DNS ....................................................................................................... 57

Bảng 3.1 Kết quả xác định thành phần sinh hóa của 4 loài rong nâu ................... 75

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân rong nâu bởi các lượng enzyme Cellic HTech2 khác

nhau ....................................................................................................... 81

Bảng 3.3 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các giá trị pH

khác nhau ............................................................................................... 83

Bảng 3.4 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các nhiệt độ

khác nhau ............................................................................................... 85

Bảng 3.5 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic

HTech2 ................................................................................................... 87

Bảng 3.6 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rong

nâu đã qua xử lí acid kết hợp với enzyme Cellic HTech2..................... 89

Đỗ Trung Sỹ

vi

Bảng 3.7 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của

chủng vi khuẩn C32 ................................................................................ 92

Bảng 3.8 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của

chủng vi khuẩn C36 ................................................................................ 92

Bảng 3.9 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men

của chủng vi khuẩn Hud 4-1 ................................................................. 93

Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men

của chủng xạ khuẩn 7P .......................................................................... 93

Bảng 3.11 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men

của chủng nấm A. terreus ...................................................................... 93

Bảng 3.12 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi một

số chủng vi sinh của Việt Nam .............................................................. 94

Bảng 3.13 Hiệu suất thủy phân cellulose của các chủng vi sinh ............................ 95

Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân cellulose bởi dịch enzyme của nấm Aspergillus terreus

tại các thời điểm khác nhau và ở các giá trị pH khác nhau ................... 99

Bảng 3.15 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân cellulose bởi enzyme của nấm Aspergillus terreus tại

nhiệt độ khác nhau ............................................................................... 100

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của lượng cellulose và enzyme ban đầu tới lượng

glucose thu được .................................................................................. 101

Bảng 3.17 Ma trận kế hoạch thực nghiệm và kết quả .......................................... 101

Bảng 3.18 Xác địnhh giá trị tối ưu cho hàm lượng glucose nhận được ............... 104

Đỗ Trung Sỹ

vii

Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi thay đổi

tỷ lệ nấm men trong quá trình lên men bằng chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae V7028 ....................................................... 110

Bảng 3.20 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men

của nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 ở các giá trị pH khác

nhau ..................................................................................................... 113

Bảng 3.21 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men

bằng nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 tại các thời điểm khác

nhau ..................................................................................................... 115

Bảng 3.22 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol bởi chủng

Saccharomyces cerevisiae V7028 ....................................................... 117

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ acid loãng tới hàm lượng khử tạo thành

trong quá trình thủy phân .................................................................... 119

Đỗ Trung Sỹ

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức Haworth của hai gốc polymer trong phân tử acid alginic .... 19

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của alginate .............................................................. 19

Hình 1.3 Cấu trúc của alginate ............................................................................. 20

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một loại fucoidan được chiết tách từ rong nâu ... 21

Hình 1.5 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan ................................................... 21

Hình 1.6 Cấu trúc của phân tử cellulose và hemicellulose .................................. 25

Hình 1.7 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose ................................... 26

Hình 1.8 Cấu trúc của lignin ................................................................................. 28

Hình 1.9 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy gián đoạn ....... 29

Hình 1.10 Cơ chế thủy phân cellulose .................................................................... 36

Hình 1.11 Sơ đồ thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase ........................... 36

Hình 1.12 Cơ chế thủy phân glycoside bằng enzyme -glucosidase ..................... 37

Hình 1.13 Sơ đồ thiết bị thủy phân bằng phương pháp acid tại Brazil , ................ 39

Hình 2.1 Các mẫu rong nghiên cứu ...................................................................... 47

Hình 2.2 Phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) trước và sau khi xử lý cơ học .............. 48

Hình 2.3 Phương pháp Hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ ................................ 51

Hình 2.4 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ ............ 57

Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme ................... 60

Hình 2.6 Sơ đồ quá trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu ....................... 61

Hình 2.7 Sơ đồ quá trình thuỷ phân carbohydrate trong phế thải nông nghiệp .. 63

Hình 2.8 Quy trình dự kiến sản xuất ethanol........................................................ 64

Hình 2.9 Sơ đồ thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy

phân ....................................................................................................... 66

Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme ................... 70

Đỗ Trung Sỹ

ix

Hình 2.11 Sơ đồ xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo ethanol.

............................................................................................................... 71

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng carbohydrate trong 4 loài rong nâu thu tại

Hải Phòng và Nha Trang ....................................................................... 76

Hình 3.2 Ảnh cellulose tách được từ rơm, rạ (trái) và phổ IR của cellulose thu

được (phải)............................................................................................. 77

Hình 3.3 Ảnh của một số chủng vi sinh vật và vòng phân giải của chúng .......... 79

Hình 3.4 Chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 do phía Nga chuyển giao. ... 79

Hình 3.5 Ảnh các hạt xúc tác tạo thành từ các chủng vi sinh vật được cố định trên

PVA (trái) và hình ảnh sử dụng các tế bào cố định này để thủy phân

cellulose thành glucose (phải) ............................................................... 80

Hình 3.6 Tế bào nấm men cố định trên PVA (trái) và tế bào nấm men cố định

trên PVA tham gia vào lên men ethanol (bên phải) .............................. 81

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi các lượng enzyme Cellic HTech2 khác nhau .......... 82

Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các giá trị pH khác nhau. 84

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các nhiệt độ khác nhau. .. 85

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân rong nâu bằng enzyme Cellic

HTech2 .................................................................................................. 87

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rong nâu

đã qua xử lí acid kết hợp với enzyme Cellic HTech2 ........................... 90

Hình 3.12 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose bằng dịch enzyme của các chủng vi

sinh vật ................................................................................................... 92

Hình 3.13 So sánh thủy phân cellulose bằng các chủng vi sinh ............................. 94

Hình 3.14 Hiệu suất thủy phân cellulose thành glucose bằng các chủng vi sinh ... 95

Hình 3.15 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme

cellulase của nấm A. terreus .................................................................. 96

Đỗ Trung Sỹ

x

Hình 3.16 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme

cellulase của vi khuẩn C32 .................................................................... 97

Hình 3.17 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme

cellulase của xạ khuẩn 7P ...................................................................... 97

Hình 3.18 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme

cellulase của vi khuẩn Hud 4-1 ............................................................. 97

Hình 3.19 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme

cellulase của vi khuẩn C36 .................................................................... 98

Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng glucose tạo thành trong quá trình

thủy phân cellulose bằng chủng nấm Aspergillus terreus ..................... 99

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng glucose tạo thành trong quá

trình thủy phân cellulose bằng nấm A. terreus .................................... 100

Hình 3.22 Đồ thị xác định giá trị tối ưu của glucose thu được từ quá trình thủy

phân cellulose ...................................................................................... 105

Hình 3.23 Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol ............................................ 110

Hình 3.24 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại khi thay đổi tỷ lệ nấm

men trong quá trình lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae V7028 ................................................................................. 111

Hình 3.25 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại sau khi lên men của

nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 ở các giá trị pH khác nhau .... 114

Hình 3.26 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại sau khi lên men bằng

Saccharomyces cerevisiae V7028 tại các thời điểm khác nhau .......... 115

Hình 3.27 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng chủng

Saccharomyces cerevisiae V7028 (của Nga) ..................................... 117

Hình 3.28 Ảnh hưởng của nồng độ acid loãng đến hàm lượng đường trong quá

trình thủy phân phế thải rong .............................................................. 120

1

MỞ ĐẦU

Nền kinh tế thế giới cho đến nay phụ thuộc rất nhiều vào nhiên liệu hóa

thạch, nhu cầu năng lượng cũng không ngừng gia tăng theo sự phát triển kinh tế - xã

hội, an ninh quốc phòng của mỗi quốc gia. Theo tính toán của các chuyên gia năng

lượng, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm khoảng 60-80% cán cân năng lượng thế giới.

Với tốc độ tiêu thụ năng lượng như hiện nay và trữ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn

năng lượng này sẽ nhanh chóng bị cạn kiệt trong vòng 40-50 năm tới. Hơn nữa, các

chất đốt hóa thạch làm tăng lượng carbon dioxide trong khí quyển, là một trong

những nguyên nhân làm nhiệt độ trái đất ngày càng nóng lên, đây là một vấn đề

mà nhiều tổ chức, quốc gia muốn tìm cách hạn chế trong nhiều năm qua. Do đó,

nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đã được đặt ra trong

gần nửa thế kỷ qua và ngày càng trở nên cấp thiết.

Một trong những hướng đi để giải quyết nhiệm vụ này là sản xuất nhiên liệu

sinh học bằng cách sử dụng sinh khối, tức là các vật liệu có nguồn gốc hữu cơ để

đốt trực tiếp, nhằm tạo ra nhiệt năng, điện năng hoặc chuyển hóa sang các chất

mang năng lượng dạng khí hoặc nhiên liệu lỏng. Nhiên liệu sinh học được sản xuất

từ thực vật và phế thải ví dụ như: các loại cây nông nghiệp, chất thải đô thị hay phụ

phẩm nông lâm nghiệp [35].

Ethanol có thể được sản xuất từ thực vật bao gồm đường, tinh bột và

lignocellulose. Ethanol được sản xuất từ những vật liệu như đường và tinh bột được

coi như là thế hệ đầu tiên của nhiên liệu sinh học. Phần lớn nhiên liệu sinh học ngày

nay trên thế giới là từ thế hệ đầu tiên. Tuy nhiên, việc sử dụng các nguyên liệu thế

hệ này dẫn đến nhiều vấn đề nảy sinh bao gồm an ninh lương thực và việc thay thế

đất nông nghiệp do nhu cầu về nhiên liệu sinh học ngày càng cao [104].

Thế hệ thứ hai của nhiên liệu sinh học là sử dụng phế thải có chứa cellulose

làm nguyên liệu do có số lượng lớn và chi phí thấp. Việc sử dụng các phế thải có

thể làm giảm đáng kể áp lực về nhu cầu đất đai và đáp ứng nhu cầu nhiên liệu sinh

học trên thế giới [96]. Hiện tại, nguyên liệu được nghiên cứu trong sản xuất nhiên

liệu sinh học thế hệ thứ hai phần lớn là phế thải nông nghiệp từ vụ mùa, thực vật

tươi hoặc đã qua chế biến [52], rơm rạ [102], ngô mía [111]... với hàm lượng

hemicellulose cao [72]. Trong nguồn nguyên liệu có nguồn gốc từ biển,

2

Sargassum là loại rong nâu được sử dụng trong sản xuất alginate, mannitol... Việc

sử dụng các loài rong như một nguyên liệu thay thế để sản xuất nhiên liệu sinh học

đã được nghiên cứu [123]. Tuy nhiên vẫn còn rất ít các nghiên cứu về việc dùng

rong nâu làm nguyên liệu sản xuất ethanol. Trong khi đó, hàng năm một lượng lớn

các phế thải rong được tạo ra từ công nghiệp sản xuất alginate, gây ô nhiễm môi

trường nghiêm trọng do khả năng tái chế thấp. Các phế thải rong từ ngành công

nghiệp chế biến rong nâu có hàm lượng cellulose cao, hàm lượng hemicellulose và

lignin thấp. Vì vậy nó có tiềm năng cao trong quy trình chuyển hóa thành ethanol

sinh học.

Từ tình hình thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển hóa

rong biển, phế thải nông nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc

tác sinh học” làm đề tài nghiên cứu cho luận án của mình.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:

Xác định được thành phần lý hóa, sinh của rong biển và phế thải nông

nghiệp, lựa chọn được loài rong biển có hàm lượng carbohydrate cao

cho quá trình nghiên cứu luận án

Xác định được các điều kiện tối ưu để chuyển hóa carbohydrate từ

rong biển và phế thải nông nghiệp thành ethanol sinh học

Để thực hiện được các mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu đã được thực

hiện bao gồm:

1. Xác định hàm lượng carbohydrate trong các rong nâu và trong phế thải nông

nghiệp

2. Xác định các điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân rong nâu bằng acid

sulfuric loãng kết hợp với enzyme Cellic HTech2

3. Lựa chọn các chủng vi sinh vật thủy phân rơm, rạ thành các sản phẩm trung

gian sau đó nghiên cứu xây dựng quy trình thủy phân tối ưu

4. Xác định điều kiện tối ưu trong quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân

của rong biển và phế thải nông nghiệp

5. Đánh giá hiệu quả của các quá trình chuyển hóa carbohydrate từ rong biển

và phế thải nông nghiệp thành ethanol sinh học

3

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1. VAI TRÒ VÀ TIỀM NĂNG CỦA ETHANOL SINH HỌC

1.1.1. Vai trò của ethanol sinh học

Hiện nay, các nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, ước tính trữ

lượng dầu mỏ của thế giới đến năm 2050 sẽ cạn. Trong khi đó, hoạt động sống của

con người rất cần năng lượng. Mặt khác, nguồn năng lượng hóa thạch đã gây ra các

vấn đề nghiêm trọng về ô nhiễm môi trường, hiệu ứng nhà kính. Chính vì vậy, nhu

cầu về nguồn nguyên liệu thay thế cho xăng dầu đang là vấn đề cấp thiết cho toàn

thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Việc đầu tư nghiên cứu “nhiên liệu sạch”-

nhiên liệu sinh học ethanol sinh học đang trở thành đề tài được quan tâm hàng đầu

trên thế giới [18].

Nhiên liệu sinh học là nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn

gốc động thực vật trong đó bao gồm: ngũ cốc, chất thải nông nghiệp, sản phẩm thải

trong công nghiệp... Nhiên liệu sinh học được biết đến với nhiều lợi thế: là một

trong những biện pháp giảm thiểu hiện tượng nóng lên toàn cầu, giúp các quốc gia

chủ động, không bị lệ thuộc vào vấn đề nhập khẩu nhiên liệu, đặc biệt đối với các

quốc gia không có nguồn dầu mỏ và than đá, ổn định tình hình năng lượng cho thế

giới [7]. Nhiên liệu sinh học có thể được phân loại thành các nhóm chính như sau:

- Diesel sinh học (Biodiesel) là một loại nhiên liệu lỏng có thể sử dụng thay

thế cho loại dầu diesel truyền thống.

- Xăng sinh học (Biogasoline) là loại nhiên liệu lỏng, trong đó có sử dụng

ethanol như một loại phụ gia nhiên liệu pha trộn vào xăng thay cho phụ gia chì.

Ethanol được sản xuất thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh

bột, cellulose, lignocellulose. Ethanol được pha chế với tỷ lệ thích hợp với xăng tạo

thành xăng sinh học có thể thay thế loại xăng sử dụng phụ gia chì truyền thống.

- Khí sinh học (Biogas) có thành phần chủ yếu là CH4 (50-60%) và CO2

(>30%) còn lại là các chất khác như hơi nước, O2, N2, CO... Biogas được tạo ra sau

quá trình ủ lên men các sinh khối hữu cơ, phế thải nông nghiệp tạo thành sản phẩm

dạng khí.

Cho tới nay, ethanol sinh học được coi là nguồn năng lượng thay thế số một

cho dầu mỏ [8]. Để chứng minh rằng, ethanol thực chất có thể làm nhiên liệu thay

4

thế xăng, có thể xem xét một số tính chất quan trọng của dung môi này [18].

- Tính chất hóa lý của ethanol:

Ethanol (C2H5OH) là một chất lỏng không màu, sôi ở 78,3oC và là một dung

môi hữu cơ đa dụng, có thể sản xuất từ dầu khí thông qua phản ứng hydrat hóa

ethylene (ethanol tổng hợp, không sử dụng vào mục đích năng lượng) hoặc từ nguyên

liệu sinh học (ethanol sinh học, sử dụng chủ yếu vào mục đích năng lượng).

Ethanol sinh học có khả năng thay thế hoàn toàn xăng sản xuất từ dầu mỏ hoặc

có thể pha trộn với xăng để tạo ra xăng sinh học. Xăng sinh học là hỗn hợp của xăng

truyền thống và ethanol sinh học (bio-ethanol), được sử dụng làm nhiên liệu cho các

loại động cơ đốt trong như xe gắn máy, ôtô. Được ghi danh bằng kí tự E kèm theo

một con số chỉ số % của ethanol sinh học được pha trộn trong xăng đó.

Trên thị trường người ta thường gặp các loại xăng sinh học như E5, E20,

E95... tức là xăng chứa 5%, 20%, 95% ethanol.

Công thức hóa học của ethanol: C2H5OH, CH3-CH2-OH, viết tắt là C2H6O.

Ethanol là một loại nhiên liệu thay thế, được sản xuất bằng phương pháp lên men

và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn,

như bắp, lúa mì, lúa mạch, mía, củ cải đường, sắn, các phế phẩm nông nghiệp.

Ngoài ra, ethanol còn được sản xuất từ cây, cỏ có chứa cellulose, gọi là ethanol

sinh học.

- Các phản ứng quan trọng của ethanol:

Phản ứng đốt cháy (Combustion) C2H5OH + 3 O2 2 CO2 + 3 H2O

Lên men (Fermentation) C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2

Để thấy rằng ethanol có bản chất là nguyên liệu có thể so sánh các chỉ số đặc

trưng với một số nhiên liệu khác (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tính chất hoá lý quan trọng của một số nhiên liệu

Nhiên liệu Ethanol Xăng Hydrogen Diesel Benzen

Điểm sôi, °C 78,39 35-195 - 252,6 180-360 80,1

Điểm nóng chảy, °C -114,15 -259,1 5,53

Tỷ trọng, d420, g/ml 0,79 0,70-

0,78

70,8 (lỏng) 0,79-0,86 0,876

5

Nhiệt cháy ở 25°C, kJ/g 29,8 26,0 141,9 45,0

Nhiệt độ tự bốc cháy,°C 422,8 246°C 571°C 210°C 534

Giới hạn cháy trong

không khí:

- Dưới, vol%

- Trên, vol%

4,3

19,0

1,4

7,6

4,0

75,0

1,3

7,1

1.1.2. Tiềm năng sản xuất ethanol sinh học

Ethanol sinh học trộn với xăng chế biến từ dầu thô để chạy xe. Sản xuất đủ

ethanol thì thế giới sẽ giải quyết được vấn đề về năng lượng. Ngoài ra ethanol khi

cháy thải ít khí nhà kính vào bầu khí quyển hơn là xăng chế biến từ dầu mỏ [8].

Ethanol là chất phụ gia để tăng trị số Octan (trị số đo khả năng kích nổ) và giảm

khí thải độc hại của xăng. Trong chính sách năng lượng của mình, từ khối EU đến Mỹ,

Trung Quốc, Australia, Nhật Bản… đều chú trọng đến ứng dụng ethanol.

Bên cạnh đó, thế giới đang lo ngại trữ lượng dầu mỏ toàn cầu đang có nguy

cơ bị cạn kiệt. Trữ lượng dầu mỏ trên thế giới, qua nhiều thăm dò và nghiên cứu của

những cơ quan khác nhau như: Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (1997), Báo Washington Post

(1996), Kỷ yếu Năng lượng quốc tế 1998 (International Energy Annual), Phòng

thống kê LHQ (1994) kết luận là trữ lượng dầu thô hiện chiếm vào khoảng

1.000 tỷ thùng (barrel) (1 barrel = 42 Gallon = 159 lít = 0,16 m3). Cũng theo ước

tính của Cơ quan Địa chất Hoa Kỳ (US GS) thì với trữ lượng này, nhân loại chỉ

có triển vọng sử dụng trong vòng 50 năm tới mà thôi.

Ethanol đã được điều chế từ gạo, nếp, bắp... từ hàng ngàn năm trước qua

sự lên men rượu do vi khuẩn [9]. Hiện nay, với nhu cầu giải quyết nạn khan hiếm

năng lượng xăng dầu và giảm thiểu ô nhiễm môi trường, ethanol quả thật là một

nhu cầu cấp bách cho thế giới... Ngoài ra, sự có mặt của ethanol trong xăng không

chỉ giảm thiểu được một phần lượng xăng nhập khẩu mà còn góp phần không nhỏ

vào việc giảm thiểu lượng lớn khí thải độc hại ra môi trường, hạn chế ô nhiễm môi

trường, góp phần tăng khả năng đảm bảo an ninh năng lượng của một quốc gia, nhất

là các quốc gia không có nguồn dầu mỏ [5].

6

1.1.3. Sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học

Có thể nói, chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học (ethanol) đang được

thực hiện hoặc được chuẩn bị và sẵn sàng tại nhiều nước trên thế giới.

Sản lượng ethanol trên thế giới trong những năm gần đây được trình bày

trong bảng sau:

Bảng 1.2 Sản lượng ethanol trên thế giới

(Đơn vị triệu L)

Khu vực 2008 2009 2010 2011 2012

Châu Âu 2,885 3,645 4,254 4,429 4,973

Châu Phi 65 100 130 150 235

Bắc và Trung Mỹ 35,946 42,141 51,584 54,765 54,580

Nam Mỹ 24,456 24,275 25,964 21,637 21,335

Châu Á/ Thái Bình Dương 2,753 2,927 3,115 3,520 3,965

1.1.4. Các nguyên liệu thường dùng để sản xuất ethanol ngày nay

Dựa vào nguyên liệu sản xuất, nhiên liệu ethanol sinh học được chia làm 2

thế hệ:

Thế hệ I:

Thế hệ I được sản xuất từ các nguồn tinh bột như ngô, sắn, mía đường trong

đó chủ yếu là tinh bột chứa amylose và một phần nhỏ là amylopectin. Tinh bột gồm

amylose (10-20%) và amylopectin (80-90%) [9].

Amylose

Amylose là polymer mạch thẳng của -D-glucose với liên kết -(1→4) có

cấu trúc chặt chẽ.

Amylopectin

7

Amylopectin là polymer mạch thẳng, đa nhánh của glucose với liên kết

-(1→4). Các mạch nhánh được tạo bởi các liên kết -(1→6). Khoảng từ 24 đến 30

glucose lại có một liên kết mạch nhánh.

Tình hình sản xuất ethanol sinh học từ mía, đường

Ngày 20/11/2007, Thủ tướng chính phủ đã ban hành quyết định số

177/2007/QĐ-TT về việc phê duyệt đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm

2015, tầm nhìn đến năm 2025 nhằm mục tiêu “phát triển nhiên liệu sinh học, một

dạng năng lượng mới tái tạo được để thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền

thống, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và bảo vệ môi trường”. Trong 2-3 năm

gần đây, việc sản xuất ethanol làm nhiên liệu đã được quan tâm với nhiều góc độ

khác nhau về nghiên cứu cũng như sản xuất.

Bảng 1.3: Một số dự án sản xuất ethanol tại Việt Nam

Tên dự án Công suất Vốn đầu tư Nguyên liệu

Nhà máy Ethanol Phú Thọ 100 triệu lít/năm 1.600 tỉ đồng 240 ngàn tấn sắn lát/năm

Nhà máy Bio-ethanol Dung Quất 100 triệu lít/năm 1.600 tỉ đồng 240 ngàn tấn sắn lát/năm

Nhà máy Bio-ethanol Bình Phước 100 triệu lít/năm 1.600 tỉ đồng 240 ngàn tấn sắn lát/năm

Nhà máy Ethanol Đại Tân 125 triệu lít/năm > 900 tỉ đồng 300 ngàn tấn sắn lát/năm

Nhà máy Ethanol Tùng Lâm 60 triệu lít/năm - -

Tính đến cuối năm 2012, năng lực sản xuất ethanol nhiên liệu của cả nước đạt

535 triệu lít/năm, đủ để phối trộn 8,35 triệu tấn xăng E5 (5% ethanol) hoặc 4,17 triệu

tấn xăng E10 (10% ethanol), đảm bảo đủ cung cấp cho thị trường cả nước. Theo lộ

8

trình đã được Chính phủ phê duyệt, xăng sinh học E5 sẽ được phép pha trộn và tiêu thụ

tại 7 tỉnh, thành phố như Hà Nội, Hải Phòng, TPHCM, Cần Thơ, Đà Nẵng, Bà Rịa -

Vũng Tàu và Quảng Ngãi từ cuối năm 2014. Từ 1/12/2015 xăng E5 sẽ tiêu thụ đại trà

trên cả nước. Điều này sẽ giúp các nhà sản xuất ethanol có được đầu ra.

Vào năm 2007, khi các dự án sản xuất nhiên liệu sinh học được lập, giá sắn lát

chỉ khoảng 1.200-1.500 đ/kg, đến năm 2011 giá sắn lát đã tăng lên 5.500- 5.800 đ/kg.

Năm 2012 giá có giảm chút ít những vẫn khoảng 4.000-4.700 đ/kg. Nếu mỗi lít ethanol

cần khoảng 2,4 kg sắn lát thì riêng giá vốn cho nguyên liệu chính đã là 11.280 đồng,

cộng thêm các chi phí khác như: điện, phụ phẩm, lương lao động, khấu hao máy móc,

lãi vay... giá thành làm ra một lít ethanol khoảng 18.000-19.000 đồng/lít .

Các công ty hiện nay chỉ đầu tư xây dựng các nhà máy sản xuất ethanol sinh

học thế hệ I, sản xuất ethanol từ lương thực sắn, mía đường. Như vậy, chúng ta chỉ

đầu tư vào những công nghệ đã lạc hậu trên thế giới. Điều này không chỉ lạc hậu về

mặt khoa học công nghệ và còn tác động xấu tới chiến lược an ninh lương thực

Quốc gia.

Thế hệ II

Thế hệ II được sản xuất từ sinh khối thực vật như các phế thải nông nghiệp

của các loại thân cây lúa, ngô, lúa mỳ. Lignocellulose là thành phần chính cấu tạo

nên sinh khối thực vật, chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin. Thí dụ,

trong sinh khối của thực vật như gỗ, cellulose có từ 30-50%, hemicellulose – 23-

32% và lignin – 15-25%. Hemicellulose gồm có Xylan (hemicellulose A) [5].

Cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích

β-D-Glucose.

Xylan (hemicellulose A)

9

Xylan – polymer mạch thẳng của D-xylose với liên kết -(1 4)

Arabinoxylan (hemicellulose B) có mạch phân nhánh.

Thế hệ III

Rong biển bao gồm 3 ngành rong: Lục, Đỏ và Nâu. Rong Đỏ chứa chất xơ

fibrin khoảng 15-25%, galactan khoảng 50-70%, protein dưới 15% và lipid dưới 7%

tổng trọng lượng khô. Rong Lục chứa chất xơ fibrin khoảng 5%, tinh bột 40-50%.

Rong nâu chứa acid alginic khoảng 30-40% [15]. Agar là 1 polymer galactose có

thể chuyển thành đường galactose và 3,6-anhydrogalactose. Fibrin gồm cellulose.

Tinh bột là một polysaccharide của glucose, chất được tổng hợp từ carbohydrate ở

trong lục lạp của thực vật và được dự trữ trong tế bào chất [6]. Galactose và

Glucose có thể sử dụng như cơ chất cho quá trình lên men ethanol nhiên liệu. Quá

trình đường hóa sẽ cho galactose, 3,6-anhydrogalactose, glucose, frucose…

Lựa chọn loại nguyên liệu nào phù hợp để sản xuất ethanol tùy thuộc vào

điều kiện đất đai, khí hậu, chính sách phát triển của mỗi quốc gia. Các nguyên

liệu chủ lực để sản xuất ethanol ở các nước như sau: Mỹ: bắp, Brazil: mía, Pháp:

củ cải đường, Ấn Độ: mía, Việt Nam: sắn... Tính theo diện tích canh tác, hiệu

quả sản xuất ethanol từ củ cải đường cao nhất, có thể đạt 7.000 lít/ha, kế đến là mía

và bắp. Tuy nhiên, sẽ thu được nhiều ethanol hơn khi lên men từ ngô, gần 400

lít/tấn hạt, trong khi củ cải đường chỉ đạt 100 lít/tấn. Dầu diesel sinh học được chế

biến từ dầu thực vật và mỡ động vật. Vì vậy, nhiều nước đã tiến hành nghiên cứu

trồng các loài cây nông, lâm nghiệp để cung cấp nguyên liệu sản xuất nhiên liệu

sinh học.

Các loài cây sau đây đang được sử dụng để cung cấp nguyên liệu sản xuất

nhiên liệu sinh học. Với ưu thế về diện tích canh tác, Mỹ sử dụng ngô để sản xuất

ethanol. Ấn Độ dùng cây Cọ dầu và Jatropha curcas L để sản xuất diesel sinh học.

Uỷ ban phát triển nhiên liệu sinh học của Ấn Độ đề nghị trồng Cọ dầu trên diện tích

11,2 triệu ha đất thoái hoá, đất bỏ hoang và các loại đất khác.

Từ năm 1975 Brazil đã có kế hoạch dùng mía làm nguyên liệu sản xuất cồn

thay thế xăng và khuyến khích sử dụng nhiên liệu sinh học bằng các biện pháp như:

sử dụng xăng để chạy xe phải pha một tỷ lệ ethanol nhiên liệu, đầu tư trồng và cải

tạo giống mía để sản xuất nhiên liệu sinh học, cải tiến công nghệ sản xuất

10

ethanol, nghiên cứu sản xuất ô tô chạy bằng ethanol, miễn giảm thuế sản xuất và

tiêu thụ ethanol [8].

Các nước EU sử dụng đậu tương, hạt cải dầu và dầu mỡ phế thải từ động,

thực vật để sản xuất nhiên liệu sinh học.

Thuỵ Điển dự kiến sau 2020, ethanol sinh học từ cellulose sẽ thay thế toàn

bộ nhiên liệu hoá thạch nhằm chấm dứt phụ thuộc vào dầu mỏ.

Cách đây không lâu tại Indonesia chiếc xe ô tô đầu tiên chạy bằng 100%

nhiên liệu sinh học chế biến từ hạt cây Jatropha đã hoàn tất cuộc chạy thử 3200 km

ở tỉnh Tây Timor. Như vậy, hiện nay trên thế giới cũng như trong khu vực các

loài cây mía, sắn thường được dùng để sản xuất ethanol sinh học còn cọ dầu và

Jatropha dùng để sản xuất diesel sinh học, trong đó Jatropha đang được quan tâm ở

nhiều nước.

1.1.5. Lên men sản xuất ethanol

Ở nước ta, trong những năm gần đây, sản lượng lương thực đạt gần 40 triệu

tấn/năm, phế thải nông nghiệp ước tính chừng 80 -100 triệu tấn. Phế thải nông

nghiệp là dạng sinh khối chủ yếu chứa các polysaccharide (cellulose, hemicellulose)

bỏ lãng phí không được sử dụng một cách có hiệu quả [5].

Việc tái sử dụng các loại phế thải này như một nguồn năng lượng tái tạo là

một vấn đề có nhiều ý nghĩa trong khi các nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng

cạn kiệt. Một trong các hướng tái sử dụng các loại phế thải chứa các polysaccharide

(cellulose, hemicellulose) này (gọi chung là lignocellulose) là lên men chuyển thành

nhiên liệu sinh học ethanol thế hệ II.

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất ethanol từ sinh khối.

Sinh khối là phế thải của nông nghiệp như thân cây ngô, sắn, thân cây lúa mì,

mía đang trở thành đối tượng có nhiều tiềm năng để sản xuất ethanol sinh học. Thân

cây ngô và các loài thân gỗ khác cũng đang được chú ý. Thân gỗ các loài thông là

loại sinh khối được chú ý nhiều để lên men sản xuất ethanol. Đặc biệt, ở Bắc Mỹ

các loài thông (lodgepole pine) Pinus contorta mọc rất nhiều, có thể cao tới 50m,

đường kính đạt 2m cho khối lượng gỗ rất nhiều, nên là nguồn nguyên liệu rất dồi

dào để sản xuất ethanol từ sinh khối.

11

Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol dựa trên nguyên liệu từ các loài cây trồng

nông nhiệp như trên đều ảnh hưởng đến giá lương thực và thực phẩm, nguồn nước

ngọt, đất canh tác, cũng như ảnh hưởng đến sự nghèo kiệt và xói mòn đất. Để tháo

gỡ vấn đề này, các nhà khoa học đã tìm kiếm và nhận thấy rằng sinh khối rong biển

có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu thay thế để sản xuất ethanol sinh học [8].

Quá trình lên men sản xuất ethanol từ sinh khối rong biển ngoài các khâu

tiền xử lý nguyên liệu, gồm 2 giai đoạn chính: Thủy phân nguyên liệu (đường hóa)

và lên men:

Thủy phân (đường hóa) là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành các sản

phẩm trung gian tan như các oligosaccharide, các đường đơn chủ yếu như glucose.

Lên men là quá trình chuyển hoá các sản phẩm trung gian tan thành ethanol

Phương pháp lên men ethanol

“Thủy phân và Lên men riêng biệt” và “Đường hóa và Lên men đồng thời”

Sản xuất ethanol từ sinh khối rong biển có thể thực hiện bằng phương pháp

“Thủy phân và Lên men riêng biệt” (separate hydrolysis and fermentation – SHF)

hoặc bằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời” (simultaneous

saccharification and fermentation - SSF). Trong phương pháp “Thủy phân và Lên

men riêng biệt” hai giai đoạn: thủy phân (đường hóa) và lên men ethanol được tiến

hành nối tiếp nhau trong hai bình phản ứng riêng biệt (thủy phân có thể tiến hành

trong bình thứ nhất. Sản phẩm của giai đoạn này được chuyển sang bình thứ hai để

lên men) hoặc trong cùng một bình phản ứng (khi giai đoạn thủy phân kết thúc thì

bắt đầu giai đoạn lên men). Khi thực hiện phương pháp “Đường hóa và Lên men

đồng thời” hai giai đoạn trên được tiến hành đồng thời trong cùng một bình phản

ứng (giai đoạn lên men được bắt đầu ngay sau khi sản phẩm của giai đoạn thủy

phân hình thành). Một ưu điểm rõ nét nhất của phương pháp “Đường hóa và Lên

men đồng thời” là sản phẩm của giai đoạn đầu (glucose sinh ra trong thủy phân

nguyên liệu) không tích lũy nhiều trong bình phản ứng, không gây nên hiện tượng

ức chế giai đoạn sau (lên men ethanol).

Đã có nhiều nghiên cứu và thực nghiệm chứng minh rằng phương pháp “Đường

hóa và Lên men đồng thời”, trong nhiều trường hợp, có nhiều ưu điểm hơn so với

phương pháp “Thủy phân và Lên men riêng biệt”.

12

Nhưng để thực hiện “Đường hóa và Lên men đồng thời” cần chú ý rằng,

trong sản xuất nhiên liệu sinh học - ethanol từ sinh khối rong biển, giai đoạn thủy

phân có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 45 - 50оC. Như vậy, để sản xuất nhiên liệu

sinh học - ethanol có hiệu quả bằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng

thời”, cần phải lựa chọn các chủng vi sinh vật lên men hoạt động có hiệu lực cao tại

nhiệt độ nêu tối ưu cho giai đoạn thủy phân. Các chủng vi sinh vật đáp ứng được

yêu cầu ấy thường là các nấm men chịu nhiệt.

1.2. RONG BIỂN

1.2.1. Giới thiệu chung

Việt Nam có hệ động, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều nguồn gen qúy

hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Một trong những điều kiện tạo nên

sự phong phú và giàu có ấy chính là doViệt Nam có vùng biển nhiệt đới với diện

tích rộng hơn 3,5 triệu km2 và đường bờ biển dài hơn 3600 km bao bọc hết phía

đông và phía nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và giàu

có của vùng biển chúng ta chính là rong biển [15].

Rong biển (tên tiếng Anh là marine-alage, marine plant hay seaweed) là thực

vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể đơn bào, đa bào sống thành

quần thể, có kích thước hiển vi hoặc có thể dài hàng chục mét. Hình dạng có thể là

hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Rong biển thường phân bố

ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triều sâu, vùng biển cạn... Chúng hấp

thụ một lượng thức ăn phong phú hay trôi dạt từ lục địa ra. Đời sống của rong biển

phụ thuộc vào các yếu tố: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sáng, độ muối, độ pH,

muối dinh dưỡng, khí hòa tan, mức triều, sóng, gió, hải lưu [18].

Trên thế giới, việc nghiên cứu về rong biển đã được tiến hành từ thế kỷ 18,

vào thời kỳ đó cũng có những công trình công bố về rong biển thuộc vùng biển Việt

Nam. Đó là những công trình điều tra, nghiên cứu về sinh thái, sinh học của rong.

Việc nghiên cứu sử dụng rong biển mới được đẩy mạnh trong thế kỷ 20.

1.2.2. Hình thái - Phân loại các loài rong biển ở Việt Nam

So với các nước vùng Đông Nam Á, nước ta thuộc vào nước có nguồn rong

biển phong phú và đa dạng. Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển

Việt Nam, các tác giả Việt Nam đều cùng một quan điểm xếp chúng vào 4 ngành

13

trong hệ thống phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977: rong Lam

Cyanophyta; rong Đỏ Rhodophyta; rong nâu Phaeophyta và rong Lục Chlorophyta.

10 ngành rong theo phân loại của Gollerbakh là:

- Rong Lam – Cyanophyta.

- Rong Giáp – Pyrophyta.

- Rong Vàng ánh – Chrysophyta.

- Rong Khuê - Bacillariophyta.

- Rong nâu – Phaeophyta.

- Rong Đỏ - Rhodophyta.

- Rong Vàng - Xanthophyta.

- Rong Mắt – Euglenophyta.

- Rong Lục – Chlorophyta.

- Rong Vòng – Charophyta.

Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong Lục, rong nâu, rong Đỏ.

Ngành rong Lục: có trên dưới 360 chi và hơn 5.700 loài, nét đặc trưng của

loài rong này là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột. Rong có dạng tế bào

đơn giản hoặc phức tạp, nhiều tế bào hình phiến hay dạng sợi, chia nhánh hoặc

không chia nhánh. Trừ một số trường hợp rong chỉ là tế bào trần không có vỏ còn

lại đại đa số có vỏ riêng như chất pectin hay cellulose.

Ngành rong nâu: Có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển,

số chi, loài tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm. Rong có cấu tạo nhiều tế

bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh,

dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, lá, thân. Rong

sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các rong. Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến

chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt.

- Ngành rong Đỏ: có 2.500 loài, gồm 400 chi, thuộc nhiều họ, phần lớn sống

ở biển, có cấu tạo từ nhiều tế bào, trừ một số dạng từ một tế bào hay quần thể.

Rong có dạng hình trụ dẹp dài, phiến chia hoặc không chia nhánh. Sinh trưởng

chủ yếu ở đỉnh, ở giữa đốt hay phân tán. Đặc trưng của loài này là chứa nhiều sắc

tố đỏ.

14

Các dạng carbohydrate trong 3 ngành rong nâu [87] được thể hiện trong

bảng sau:

Bảng 1.4. Các dạng carbohydrate trong 3 ngành rong biển.

Carbohydrate Đỏ Lục Nâu

Hemopolysaccharide

Cellulose Cellulose Cellulose

Xylan Xylan -

Mannan Mannan -

Heteropolysaccharide

Agar Hetero - complex Alginate

Carrageenan Ion/trung tính Fucoidan

Carragar - -

Xylan sulfate hóa - -

Các loại khác - -

Trong tế bào Tinh bột

Floridean

Tinh bột Laminaran

Dạng khối lượng

phân tử thấp

Floridosid - Mannitol

Iso-floridosid - -

Sorbitol - -

1.2.3. Phân bố, khai thác sản xuất rong biển

Xét về số lượng các loài rong, thì rong lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu

phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là Indonesia, Nhật Bản

và ít hơn là ở Việt Nam với các loài Caulerpa racemosa, Ulva reticulata, Ulva

lactuca. Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước bao gồm: Achentina,

Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia, Myanmar,

Bồ Đào Nha, Thai Lan... Rong đỏ (Rhodophyta) phân bố nhiều ở Việt Nam bao gồm

một số loài như: Betaphycus gelatinum, Calaglossa leprieurii, Gelidiella acerosa,

Gigartinaintermedia, Gloiopeltis spp., Gracilaria spp., Gracilaria asisatica,

Gracilariacoronopifera, Gracilaria eucheumoides, Gracilaria firma,

Gracilariaheteroclada, Gracilaria salicornia, Gracilaria tenuistipitata var. liui,

Hypneamuscoides, Hypnea valentiae, Kappaphycus cottonii, Porphyra crispata,

Porphyra suborbiculata, Acanthophora spicifera. Sau đó cùng với số lượng loài

15

tương đương nhau ở Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin, Canada, Hàn Quốc tiếp

theo sau là Thái Lan, Brazil, Pháp, Bồ Đào Nha, Trung Quốc, Hawaii, Myanmar,

Nam Phi, ít hơn nữa là Anh, Bangladesh, Caribbe, Ireland, Peru, Tây Ban Nha,

Achentina, Ấn Độ, Italy, Malaysia, Mexico, New Zealand, Mỹ, rải rác có mặt ở

Iceland, Alaska, Kenya, Madagascar, Kiribati, Ai Cập, Israel, Namibia, Tanzania.

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt

Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina,

Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha.

Hệ thống phân loại Sargassum spp. trên thế giới rất phức tạp, năm 1753 ba

loài thuộc chi Fucus: Fucus natans, F. acinarius và F. lendigerus do Linnaeus mô tả

lần đầu tiên nay được thay thế bằng chi Sargassum. Giữa những năm 1808 đến 1819,

36 loài rong thuộc chi Fucus được mô tả ngày nay cũng được chuyển sang chi

Sargassum, năm 1820 J. Agardh giới thiệu chi Sargassum với số loài lúc này là 62

loài. Sau thời gian đó rất nhiều tác giả khác tiếp tục giới thiệu về Sargassum như

Yendo (1907), Reinbold (1913), Grunow (1915, 1916) và Setchell (1931). Số loài

Sargassum lên đến 230.

Năm 1954 Womersley công bố hệ thống phân loại Sargassum của mình ở

Úc, cùng với các tác giả đương thời ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như

Phạm Hoàng Hộ của Việt Nam, Chou, Chiang của Taiwan và Ang, Trono của

Philippin [6], đến nay tổng số loài của chi Sargassum đã lên đến hơn 500.

Sargassum tại Việt Nam hiện nay có khoảng 70 loài (theo Thực vật chí Việt

Nam), số lượng loài Sargassum phân bố trên các nước luôn thay đổi theo các nghiên

cứu gần đây nên khó có thể kết luận hiện nay Sargassum phân bố nhiều nhất ở nước

nào. Riêng tính đến 1998 thì nhiều nhất là ở Ấn Độ, Philippin và Việt Nam. Phân bố

về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ, tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải,

điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản

lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong.

Rong biển đã được sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công

nguyên ở Trung quốc. Sze Teu đã viết rằng 600 năm trước công nguyên, rong biển

đã được chế biến thành một món ăn quí dành cho vua chúa [18]. Thuốc “trường

sinh bất tử” được vị hoàng đế đầu tiên của Trung Hoa là Tần Thuỷ Hoàng sử

16

dụng vào năm 200 trước Công nguyên đã được khoa học hiện đại chứng minh đó

chính là thành phần của rong nâu sau hơn 2000 năm. Tại Nhật rong nâu đã

được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V, cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực

phẩm và dược phẩm đã xem xét và cấp phép cho các sản phẩm thực phẩm chức

năng của Nhật được bổ sung thêm thành phần fucoidan để tăng cường hệ miễn

dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu… và trở thành thực phẩm hỗ trợ trị bệnh nan

y phổ biến của nước Nhật [88].

Rong biển đã được dùng làm thực phẩm trên toàn thế giới rất quen

thuộc với chúng ta (rong đỏ: agar, carrageenan, rong nâu: alginate), chúng cũng

là nguồn bổ sung dưỡng chất (protein, vitamin, khoáng vi lượng) cho thức ăn nuôi

tôm, thức ăn gia súc, được dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn

điện, lọc và hấp phụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy vi

sinh, điện di, agar, nó còn là nguyên liệu không thể thiếu cũng như trong công

nghiệp nước giải khát và đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp (carrageenan), ngoài ra

rong biển còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng với chất oligo alginate,

laminaran (rong nâu) cùng các hợp chất như auxin, gibberelin, cytokinin (trong

hầu hết các ngành rong). Rong biển còn được sử dụng chữa trị ung thư theo các

bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác [26] và

polyphenol trong rong nâu cũng được dùng làm trà chống lão hoá. Đặc biệt trong

thời gian gần đây tại trung tâm đăng ký phát minh sáng chế của Mỹ đã có qui trình

sản xuất biodiesel từ rong.

Rong biển thuộc vào loại những tài nguyên quý hiếm, có vai trò quan trọng

và là một trong những nguồn lợi kinh tế lớn trong nền kinh tế biển.

1.2.4. Tổng quan về rong nâu

1.2.4.1. Nguồn gốc, đặc điểm

Rong nâu là một trong các loại rong biển, sinh sống ở biển là chủ yếu. Rong

nâu có nhiều loài, có độ đậm nhạt của màu nâu khác nhau do sự khác nhau về các

thành phần sắc tố trong cấu tạo. Cây rong sẽ tùy vào từng loại sẽ có độ dài khác

nhau nhưng đều là loài rong to, mọc thành bụi, gồm vài chục chính quanh nhánh,

nhánh mang phiến có dạng lá, phiến có răng mịn, hầu như các loài rong nâu đều có

phao, tuy nhiên số lượng và kích thước của phao khác nhau, hình dạng của phao

17

là hình cầu hay trái xoan, đường kính của phao nhỏ khoảng 0,5-0,8 mm, phao lớn

khoảng 5-10 mm.

1.2.4.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển

Là loài mọc ở những vùng biển ấm nóng, trên nền đá vôi, san hô chết, nơi

sóng mạnh và nước trong, nhất là ven các đảo. Chúng mọc trên tất cả các loài vật

bám cứng, trên vách đá dốc cứng, trên các vách đá dốc đứng, các bãi đá tảng. Trên

các bờ dốc đứng, chúng phân bố thành các đai hẹp ở các mức thủy triều thấp đến

sâu khoảng 0,5 m. Đa số chúng thích mọc ở nơi sóng mạnh, ở các đảo, bờ phía đông

chúng mọc dày và phong phú hơn bờ phía tây. Ở các bãi đá hướng ra biển khơi,

chúng phát triển mạnh và có số lượng nhiều hơn.

Chúng sinh trưởng mạnh vào các tháng 2-3, đa số các loài có kích thước tối

đa vào tháng 3-4 và hình thành cơ quan sinh sản, sau đó bị sóng biển nhổ đánh

tấp vào bờ và tàn lụi. Đến tháng 7 các bãi rong đều trơ.

1.2.4.3. Thành phần hóa học của rong nâu

Sắc tố

Sắc tố trong rong nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xantophyl),

sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tùy theo tỷ lệ các loại sắc tố

mà rong có màu từ nâu - vàng nâu - nâu đậm - vàng lục. Nhìn chung sắc tố của

rong nâu khá bền.

Carbohydrate

a. Monosaccharide

Mannitol: có công thức là HOCH2-(CHOH)4–CH2OH

Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào

năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913.

Mannitol cũng là một thành phần đáng chú ý trong rong mơ. Ở trong rong

Việt Nam hàm lượng này nằm trong khoảng 3,20 – 17,68% (trọng lượng rong khô).

Trong đó rong Sargassum mcclurei có hàm lượng cao nhất (7,66 - 17,68%). Cũng

như các hợp chất khác trong rong, mannitol tích lũy trong rong thay đổi theo mùa

và nơi sống. Các kết quả nghiên cứu cho thấy rong ở vùng biển phía Nam có hàm

lượng mannitol cao hơn ở phía Bắc [11]. Hàm lượng này thường cao vào các tháng

18

mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong. Một số tác giả

cũng đã nghiên cứu và đề xuất quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí

nghiệm dựa trên nguyên tắc: làm lạnh dung dịch mannitol sau khi đã được chiết

bằng cồn nóng để thu các tinh thể mannitol [11].

Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm

nguyên liệu tổng hợp một số chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp

thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có

độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh.

b. Polysaccharide

Alginic: Acid alginic với công thức tổng quát (C6H8O6)n là một

polysaccharide làm nguyên liệu cấu tạo thành tế bào của các loài rong biển thuộc

ngành Phaeophyta. Khi được chiết ra khỏi tế bào của rong biển thì polysaccharide

này có thể ở dạng acid hoặc dạng muối (alginate) tùy thuộc vào điều kiện chiết tách

[24]. Alginate là tên gọi chung họ các muối của acid alginic.

Alginate được khám phá đầu tiên ở Anh vào năm 1883 và đến năm 1896 mới

tách được ở dạng tinh khiết [23].

Alginate tồn tại khá phong phú trong tự nhiên, trong thành phần cấu trúc

trong rong nâu lên đến 40% khối lượng khô và dưới dạng các polysaccharide vỏ

ngoài của vi khuẩn đất. Gần đây đã có một số kết quả nghiên cứu theo hướng sản

xuất alginate bằng phương pháp vi sinh cũng như bằng phương pháp biến tính

polymer hóa phân tử alginate. Tuy nhiên, toàn bộ alginate thương mại hiện nay vẫn

lấy từ nguồn tách ra từ rong biển [21].

Alginate là một polysaccharide mạch thẳng có phân tử lượng lớn từ 105 -

106 Da tùy thuộc vào từng loại rong biển và phương pháp chiết tách. Người ta đã

thu được alginate thương phẩm có khối lượng phân tử lên đến 150.000 Da với độ

polymer hóa là 750 [119], [120].

Về mặt cấu trúc, alginate là co-polymer của acid -D- mannuronic (ký hiệu

là M) và acid -D-guluronic (ký hiệu là G) qua liên kết glycoside 14.

Cấu tạo của 2 polymer theo công thức cổ điển Haworth được chỉ ra trên hình

1.1, theo công thức này, 2 polymer chỉ khác nhau ở chỗ nhóm carboxyl nằm ở trên

và dưới mặt phẳng của vòng pyranose [24].

19

Acid β-D-mannuronic Acid α-D-mannuronic

Hình 1.1. Công thức Haworth của hai gốc polymer trong phân tử acid alginic

Hai polymer này gắn với nhau bằng các liên kết 14 glycoside. Nhưng sự

kết hợp này không phải là ngẫu nhiên mà thành 3 loại chuỗi như sau (hình 1.2):

Chuỗi homopolymannuronic: gồm các gốc mannuronic MMMMMM

Chuỗi homopolyguluronic: gồm các gốc guluronic GGGGGG

Chuỗi luân phiên: 2 gốc luân phiên nhau MGMGMGM

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của alginate

Trong phân tử alginate, các gốc acid -D-mannuronic và acid -D-guluronic

này có thể kết hợp với nhau tạo thành các block kiểu M-block, G-block và MG-

block. Thành phần và cấu trúc của các block này ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất

alginate [105].

20

a) polymer, b) cấu trúc không gian, c) cẩu trúc chuỗi

Hình 1.3. Cấu trúc của alginate

Ở dạng acid hay muối kết hợp với các ion kim loại hóa trị 2 trở lên, polymer

này không tan trong nước nhưng có khả năng hút nước rồi trương nở tạo thành thể

gel. Khi kết hợp với các cation hóa trị một như Na+, K+, NH4+, alginate tan trong

nước tạo thành các dung dịch có độ nhớt cao. Các muối alginate tan trong nước được

sử dụng như các chất làm tăng độ nhớt, các chất ổn định và các tác nhân tạo màng...

trong các ngành công nghiệp dược, thực phẩm, dệt và công nghiệp giấy [16].

Fucoidan: Năm 1913, Kylin tìm ra một loại fucoidan đầu tiên, sau đó cấu

trúc của nhiều loại fucoidan của nhiều loại rong nâu được tìm ra [73], [97].

Theo IUPAC, fucan sulfate hóa là một polysaccharide có nền chính là

L-fucose sulfate hóa với các đường đơn khác nhỏ hơn 10%. Fucan sulfate hóa của

rong nâu thường được gọi là fucoidan [44]. Cấu trúc của fucoidan trong rong biển là

vô cùng phức tạp và không giống nhau với những thay đồi trong liên kết, sự phân

nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường đơn khác nhau trong polysaccharide

[62], [100]. Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Vì vậy,

cho tới nay, việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề khó khăn, ngay

cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất [64], [90].

Trong rong nâu, fucoidan chiếm hàm lượng khoảng 0,6 - 4%, alginate chiếm

hàm lượng khoảng 40% và mannitol chiếm khoảng 3,1-17% trọng lượng khô, cấu

trúc của nó thay đổi theo loài nhưng thành phần chính vẫn là fixcose và sulfate [12].

21

Fucoidan là một polysarccharide sulfate hóa, có cấu tạo chủ yếu từ α -L-

fucose sulfate, ngoài ra còn có các tỷ lệ khác nhau của các đường đơn khác là D-

galactose, D-mannose, D-xylose, acid uronic và sulfate. Nhóm sulfate tham gia

trong cấu trúc của fucoidan gắn vào vị trí C-4 (tới 30% trong mắt xích fucose) [47].

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của một loại fucoidan được chiết tách từ rong nâu

Conchie và Percival [47] đã chiết fucoidan bằng nước sôi trong 24 giờ, xác

định được trong dịch thủy phân từ Fucus vesiculosus, Fucus spiralis, Himanthalia

lorea và Laminaria cloustoni ngoài fucose còn có acid uronic, galactose, xylose, với

tổng sulfate 32,4%. Lần đầu tiên đã xác định được cấu trúc của một phân đoạn

fucoidan, đó là flican polysulfate, với liên kết 12 glycoside và sulfate ở vị trí C-4.

Cấu trúc này được khẳng định lại một lần nữa bởi O' Neill [95].

Hình 1.5. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan

Gần đây một số dạng cấu trúc khác của fucoidan đã được công bố. Năm 2001,

Marais và các cộng sự [83] đã tìm ra cấu trúc fucoidan từ rong nâu Ascophyllum

nodosum có công thức với mạch fucan có liên kết 13, 14, nhánh 12 và nhóm

22

sulfate ở vị trí C-2, C-3. Trong khi đó vào năm 2007, Roogis Daniel và cộng sự [49]

tìm được cấu trúc fucoidan của loài rong này với nhóm sulfate chỉ ở vị trí C-2.

Laminarin: Laminarin có hàm lượng từ 10-15% trọng lượng rong khô tùy

thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong nâu.

Cellulose: là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng cellulose trong

rong nâu nhiều hơn trong rong đỏ.

Protein

Protein của rong nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo. Do vậy rong nâu có

thể dùng làm thực phẩm. Protein của rong nâu thường ở dạng kết hợp với iot tạo nên

iot hữu cơ như: Mono IodInzodizin. Iot hữu cơ rất có giá trị trong y học. Do vậy rong

nâu còn được dùng làm thuốc phòng chống bệnh bướu cổ. Hàm lượng protein rong nâu

vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05- 21,11% so với trọng lượng rong khô.

Chất khoáng

Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong nâu thường lớn hơn nước biển.

Hàm lượng khoáng của các loài rong nâu Nha Trang dao động từ 15,51- 46,30% phụ

thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng. Ngoài ra trong rong nâu còn có mặt các

chất khác như acetogenin, polyphenolic, terpenoids, lipid... Rong nâu phân bố tại Việt

Nam chủ yếu là rong mơ bao gồm các loài Sargassum spp. và turbinaria spp..

1.2.4.4. Tình hình chế biến và nghiên cứu ứng dụng các sản phẩm từ rong nâu

Rong biển được sử dụng chế biến rộng rãi trong công nghệ thực phẩm,

thức ăn chăn nuôi, hóa học, mỹ phẫm và dược phẩm. Công nghệ chế biến các sản

phẩm từ rong biển chủ yếu ở các nước ở châu Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn

Quốc, Triều Tiên, Indonesia... Mỹ, Canada và một số nước châu Âu như Pháp, Đức

đang cố gắng thiết lập sản xuất rong biển ở quy mô lớn [22].

Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo quan trọng như

agar, alginate, carrageenan, furcellazan dùng cho thực phẩm và nhiều ngành công

nghiệp khác. Các loại keo rong biển là các loại polysaccharide có tính keo khi hòa

tan trong nước, được chiết suất từ rong biển. Từ rong nâu có thể chiết suất được:

alginic, alginate, laminarin.

Keo alginate, agar và carrageenan được chiết rút từ khoảng 1.300.000 tấn rong

tươi các loại. Tổng sản lượng keo rong biển gồm: 35.000 tấn alginate, 25.000 tấn

carrageenan và 10.000 tấn agar, với tổng giá trị lên đến 750 triệu USD [18].

23

Ở nước ta cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng các hợp chất

được chiết rút từ rong nâu. Cụ thể là các đề tài “Nghiên cứu sử dụng Iod chiết rút từ rong

nâu để phối chế nước mắm Iod”, “Nghiên cứu hoàn thiện và cải tiến quy trình công nghệ

sản xuất Alginate Natri” của tác giả Trần Thị Luyến [32].

Ngày nay, các hợp chất khác có hoạt tính sinh học của rong nâu như

mannitol, fucoidan cũng đang được nghiên cứu rộng rãi.

1.3. PHẾ THẢI NÔNG NGHIỆP: RƠM, RẠ Ở VIỆT NAM

1.3.1. Phế thải nông nghiệp

Năm 1977, tại Ấn Độ có 38,6 triệu ha đất trồng lúa đã thu hoạch 42,8 triệu

tấn lúa và 81 triệu tấn phế thải nông nghiệp, bao gồm 66 triệu tấn rơm, rạ và 15

triệu tấn trấu (husks-vỏ hạt lúa) [5] .

Tình hình ở Việt Nam cũng tương tự: diện tích đất trồng lúa năm 2007 là 7,3

triệu ha, tăng 20% so với năm 1977 nhưng sản lượng lúa tăng gấp hơn 3 lần năm

1977 và đạt 35,5 triệu tấn thóc.

Với sản lượng lúa như vậy, theo kinh nghiệm nêu trên của Ấn Độ “khối lượng

phế thải nông nghiệp sẽ gấp gần 2 lần sản lượng lúa” thì lượng phế thải nông nghiệp

ước tính sẽ thu được khoảng 70 - 80 triệu tấn. Như vậy, một cách tương đối có thể

cho rằng khối lượng phế thải nông nghiệp (rơm rạ) tăng tuyến tính với sản lượng lúa.

1.3.2. Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp

Thành phần của các phế thải nông nghiệp chứa chủ yếu là cellulose,

hemicellulose và số ít các hợp phần khác [5] (bảng 1.5).

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp (%)

Thành phần hóa học Rơm, rạ Trấu

Cellulose 43 35

Hemicellulose 25 25

Lignin 12 20

Protein thô (N x 6.25) 3-4 3

Hàm lượng tro 16-1

(silic 83%)

17

(silica 94%)

24

Tính chất và đặc trưng cấu trúc của cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật và có lẽ là hợp chất

sinh học phong phú nhất trên trái đất, hàng năm được tạo thành với khối lượng lớn

đến mức vượt tất cả các sản phẩm tự nhiên khác. Theo tính toán của một số tác giả

khác nhau, sinh khối thực vật của trái đất là 2-3.1012 tấn trong đó cellulose chiếm

40%. Do vậy, tổng lượng cellulose của toàn thế giới là 7-8.1011 tấn, còn lượng

cellulose tạo thành hàng năm là 4.1010 tấn [5].

Trong vách tế bào thực vật cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với

các polysaccharide khác: hemicellulose, pectin, ligin tạo thành những phức hợp bền

vững. Hàm lượng cellulose trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50 -

80%, trong giấy là 61%, trong trấu là 31%, bã mía là 46% (tính theo trọng lượng

khô), trong sợi bông hàm lượng này vượt trên 90% (bảng 1.6).

Bảng 1.6 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu [5]

Nguyên liệu % Cellulose tinh khiết

Sợi bông 90 – 99

Cây lanh 70 – 75

Cây gai dầu 75 – 80

Đay 60 – 65

Bông gạo 70 – 75

Gai (cây) 70 – 75

Phế thải nông nghiệp

Thân cây ngô, lúa

40 – 50

Rơm lúa mì 48

Rơm lúa nước 43

Cây dứa sợi 40 – 45

Bã mía 42

Tre 40 – 50

Gỗ 40 – 50

Mùn cưa 38

Vỏ hạt bông 42

Cỏ 33

Lõi ngô 29

25

Cellulose, có công thức: (C6H10O5)n là polymer mạch thẳng của β-D-glucose

với liên kết -(1 4) (gọi là polysaccharide), cấu tạo từ 10.000 - 20.000 gốc

glucose, nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucosid. Kiểu liên kết này đối lập với liên

kết α-1,4-glucosid có trong tinh bột, glycogen và các carbohydrate khác. Cellobiose

là đơn vị cấu trúc lặp lại của cellulose gồm có 2 gốc glucose [64].

Cellulose

Xylan – Hemicellulose A

Arabinoxylan Hemicellulose B

Hình 1.6 Cấu trúc của phân tử cellulose và hemicellulose

Phân tử cellulose chứa 3 dạng anhydroglucose. Dạng thứ nhất có đầu khử

với nhóm bán acetal tự do (hoặc aldehyd) ở C-1. Dạng thứ hai có đầu không khử

với nhóm hydroxyl tự do ở C-4 và dạng thứ 3 có vòng nối giữa C-1 và C-4 [67].

Không giống như các alcohol đơn giản, phản ứng thủy phân cellulose bị kiểm soát

nhiều bởi yếu tố không gian hơn so với khả năng phản ứng được dự tính theo tính

chất vốn có của các nhóm hydroxyl trong vòng anhydroglucose.

26

Các nhóm hydroxyl của gốc glucose ở mạch này tạo liên kết hydro với

nguyên tử oxy của mạch khác giữ cho các mạch ở bên cạnh nhau một cách vững

chắc, hình thành nên các vi sợi (microfibril) với độ bền cao.

Đặc điểm quan trọng và đặc trưng của cellulose tự nhiên đó là cấu trúc

không đồng nhất, gồm hai phần. Phần cellulose có cấu trúc tinh thể với trật tự cao

rất bền vững và phần có cấu trúc vô định hình không chặt chẽ kém bền vững

(hình 1.7).

- Vùng kết tinh có trật tự cao và rất bền vững với các tác động bên ngoài

- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ do đó kém bền vững hơn

Hình 1.7. Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose

Cellulose có cấu trúc tinh thể là cellulose chỉ tạo nên từ polymer glucose.

Cellulose có cấu trúc tinh thể (Cellulose microcrystalline) còn gọi là α cellulose

hoặc “cellulose thực”. Khi cho tác động với dung dịch 17,5% NaOH ở 20°C,

cellulose tinh thể (α cellulose) có đặc trưng là không tan, phần tan trong dung dịch

này là β cellulose và γ cellulose, β cellulose kết tủa khi cho thêm acid, phần còn lại

không kết tủa với acid là γ cellulose. β cellulose gọi là hemicellulose A (xylan), γ

cellulose gọi là hemicellulose B (Arabinoxylan) [67].

Cellulose của bông có trật tự cao nhất, tuy vậy, trong cấu trúc lượng đường

glucose chỉ đạt 90%, còn lại là các đường xylose, arabinose và rất ít rhamnose.

Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinh

mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này.

Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của cellulose có cấu trúc dạng sợi. Mỗi đơn

vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có

đường kính 10 – 40 nm, dài 100 - 40000 nm và bao gồm đến 40 chuỗi cellulose

[78]. Những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dưới kính hiển vi quang

học. Toàn bộ bó sợi có một lớp vỏ hemicellulose và lignin bao bọc bên ngoài làm

vùng kết tinh vùng vô định hình

vùng kết tinh

27

cho sự xâm nhập của enzyme vào cấu trúc bên trong hết sức khó khăn. Điều này

làm tăng thêm độ bền vững của cellulose nói chung.

Cellulose kết tinh là hợp chất bền vững, nếu như nấu ở 60-70oC, tinh bột đã

từ trạng thái kết tinh chuyển sang vô định hình, đối với cellulose nấu ở 320oC mới

xảy ra chuyển trang thái như vậy.

Cellulose không tan trong nước, trong nhiều dung môi hữu cơ và các dung

dịch kiềm loãng. Cellulose có thể bị phân hủy thành glucose khi đun nóng với acid

hoặc kiềm. Liên kết glucoside không bền với acid, dưới tác dụng của acid, cellulose

tạo thành các sản phẩm thủy phân, có độ bền cơ học kém hơn, cellulose khi bị thủy

phân hoàn toàn sẽ thu được sản phẩm cuối cùng là đường hòa tan D-glucose [79].

Hemicellulose là một số polymer dị thể, cùng có mặt với cellulose trong

thành tế bào thực vật. Trong khi cellulose có cấu trúc tinh thể bậc cao chặt chẽ rất

khó bị thủy phân thì hemicellulose có cấu trúc vô định hình (amorphous structure)

với mạch ngắn cấu trúc vô định hình dễ bị thủy phân bởi kiềm hoặc acid cũng như

bởi các enzyme hemicellulose. Hemicellulose chứa phần lớn các đường D-pentose,

và rất ít đường dạng L. Xylose luôn có mặt với lượng lớn, ngoài ra còn có acid

mannuronic và acid galacturonic. Khi bị thủy phân thì hemicellulose cho glucose,

và các đường khác như xylose, mannose, galactose, rhamnose, arabinose.

Không có mạch dài như cellulose, hemicellulose có mạch ngắn hơn bao gồm

chừng 500-3000 gốc đường đơn [79]. Trong khi cellulose là polymer có mạch dài

thẳng, thì hemicellulose là polymer có mạch phân nhánh.

Hemicellulose bao gồm chủ yếu xylan (gọi là hemicellulose A) và

arabinoxylan (gọi là hemicellulose B). Xylan là polymer mạch thẳng của D-xylose

với liên kết -(1 4). Arabinoxylan gồm mạch chính là xylan gắn với mạch nhánh

là L-arabinofuranose bởi các liên kết (1→2). Như vậy, đơn vị thành phần tạo nên

cấu trúc hemicellulose chính là D-xylose và một ít L-arabinofuranose.

Lignin

Lignin là polyme tạo nên bởi các monome là p-coumaryl alcohol, coniferyl

alcohol và sinapyl alcohol. Lignin coi như là một số polyme dị thể, cùng có mặt với

cellulose trong thành tế bào thực vật, cùng với cellulose bao bọc xung quanh

cellulose tạo thành những bó sợi vững chắc. Lignin có thể bị thủy phân bởi các tác

28

nhân hóa học hoặc bởi các enzyme như manganese peroxidase, lignin peroxidase

cellobiose dehydrogenase [78]. Khi nhiệt phân, lignin cho sản phẩm là methoxy

phenol.

Các monome này có các liên kết với nhau tạo nên mạng lưới polyme –lignin.

Hình 1.8 Cấu trúc của lignin [22]

29

1.4. VI SINH VẬT TRONG XÚC TÁC QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN

1.4.1. Vi sinh vật

1.4.1.1. Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

Quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong nuôi cấy gián đoạn có thể chia thành 4

giai đoạn như hình sau:

Hình 1.9 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy gián đoạn

Pha tiềm phát (giai đoạn tiềm phát): Đây là giai đoạn vi khuẩn bắt đầu thích

nghi với môi trường.

Pha lũy thừa (giai đoạn tăng trưởng): Các tế bào vi khuẩn tiến hành phân bào

và tăng nhanh về số lượng. Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phát triển

theo lũy thừa.

Pha cân bằng (giai đoạn ổn định): Mật độ vi khuẩn được giữ ở một số lượng

ổn định do các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình tăng trưởng của vi khuẩn đã

sử dụng hết và số lượng vi khuẩn sinh ra bằng số lượng vi khuẩn chết đi.

Pha suy vong (giai đoạn suy vong): Trong giai đoạn này, số lượng vi khuẩn

chết đi nhiều hơn số lượng vi khuẩn sinh ra. Nguyên nhân là do: chất dinh dưỡng

trong môi trường bị cạn kiệt và môi trường bị nhiễm độc.

1.4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

Phần lớn các vi sinh vật phát triển thuận lợi trong môi trường có pH trong

khoảng pH 5,5 - pH 7,5. Rất ít các vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH nhỏ

hơn 4,0 hoặc cao hơn 9,0. Tuy vậy, vẫn tồn tại các vi sinh vật phát triển trong môi

trường thậm chí nhỏ hơn 2,0 hoặc cao hơn 10,0. Các chủng vi sinh vật phát triển

30

trong môi trường có pH thấp (tính acid cao) gọi là Ưa acid (acidophile). Các chủng

vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH trung tính (quanh vùng 7) gọi là

obligate (acidophile). Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH cao

(tính kiềm cao) gọi là Ưa kiềm (alkaliphile).

Đồ thị hoạt tính thủy phân cellulose của các chủng vi sinh thụ thuộc vào pH

thường có dạng quả chuông với cực đại ở pH tối ưu. Vị trí cực đại đồ thị thụ thuộc

vào pH tối ưu của các chủng vi sinh [19].

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình phát triển của vi sinh vật

Căn cứ vào khả năng chịu nhiệt, vi sinh vật có thể được chia thành 3 nhóm như

sau: Vi sinh vật ưa lạnh (thấp hơn 25oC), Vi sinh vật ưa ẩm (25-40oC), Vi sinh vật ưa

nóng (35-60oC). Ngoài các chủng vi sinh vật thuộc 3 nhóm nêu trên, còn có chủng

thích nghi với nhiệt độ rất thấp dưới vùng nhiệt độ cho các chủng vi sinh vật thuộc

nhóm chịu lạnh, chúng được gọi là “Quá ưa lạnh”, các chủng vi sinh vật này có thể

phát triển ở nhiệt độ rất thấp - 100C đến -150C. Chúng được tìm thấy ở những biển

băng giá thuộc 2 cực của trái đất như Arthrobacter sp., Psychrobacter sp.. Đối nghịch

với các chủng vi sinh vật thuộc nhóm “Quá ưa lạnh”, có một số loài vi sinh vật này có

thể phát triển ở nhiệt độ rất cao, cao hơn cả nhiệt độ phát triển cho các chủng thuộc

nhóm Ưa nóng, có thể tới 70°C hoặc cao hơn nữa. Chúng được gọi là “Quá ưa nóng”.

Một số chủng còn thích hợp với nhiệt độ 80°C đến 105°C, được gọi là

Hyperthermophile. Những chủng này được tìm thấy ở các vùng cận núi lửa, suối nước

nóng như ở công viên Yellowstone National Park châu Phi hoặc vùng Kamchatka của

Nga.

1.4.1.3. Vi sinh vật phân hủy cellulose

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân huỷ bởi vi sinh vật cả trong điều

kiện hiếu khí và kị khí. Các loài vi sinh vật có thể có tác động hiệp lực hoặc thay

phiên nhau phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Các loài vi sinh

vật tham gia phân huỷ cellulose rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi

khuẩn, thậm chí cả nấm men [9]. Hiện nay, người ta đã biết được một số vi sinh vật

có khả năng phân huỷ cellulose (bảng 1.7)

31

Bảng 1.7 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose

Xạ khuẩn Nấm Vi khuẩn

Actinomyces Aspergillus Bacillus

Actinomyces diastaticus A. oryzae B. amylogenas

Actinomyces roseus A. terreus B. flavefacicus

Actinomyces thermofucus A. syndovii B. megaterium

Actinomyces diastaticus A. flarus B. menssenteroides

A. niger B. ruminicola

Streptomyces Trichoderman Clotridium

Str. Rectus T. reseii Clos. Butyricum

Str. Thermofuscus T. viridae Clos. Lochehesdii

Str. Thermonitrificans T. lignorum Acetobacter xylinum

Str. Thermoviolaceus T. hazianum Pseudomonas fluorescens

Str. Thermovulgaris Pen. Notatum

Str. violaceus Cephalosporium Ruminococcus albus

Thermomonospora curvata Neurospora Bacteroides amylophilus

Thermomonospora vulgaris AaBasii diomycetes amylophillus sp

Fusarium culmorum Cellulosemonas

1.4.2. Xúc tác sinh học trong quá trình thủy phân

1.4.2.1. Khái niệm về xúc tác enzyme

Xúc tác là hiện tượng làm thay đổi tốc độ của phản ứng hay kích thích

phản ứng, xảy ra dưới tác động của một số chất và các chất này được gọi là các

chất xúc tác

Xúc tác enzyme: Mỗi enzyme xúc tác một quá trình hóa học nhất định hay

một nhóm nhất định các biến đổi hóa học. Xúc tác sinh học đóng vai trò quan trọng

trong hoạt động sống của các cơ thể và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và

đời sống, đặc biệt là trong chế biến thực phẩm (sản xuất bánh mì, chế biến sữa, sản

xuất rượu bia...), ở đây các quá trình lên men đóng vai trò chính.

32

Các đặc điểm của xúc tác sinh học

Enzyme có nhiều ưu điểm so với các chất xúc tác hoá học truyền thống. Nổi

bật nhất là tính hiệu quả, tính đặc hiệu và tính chọn lọc của chúng không chỉ đối với

các phản ứng hoá học đặc biệt mà chúng xúc tác mà cả trong sự phân biệt giữa các

phần khác nhau của các phân tử và cấu trúc không gian hay các đồng phân lập thể,

trung tâm bất đối của phân tử cơ chất. Chúng chỉ xúc tác các phản ứng với một phổ

cơ chất rất hẹp, một nhóm chất duy nhất, điều này có nghĩa là phản ứng đã lựa chọn

có thể được xúc tác để loại trừ các phản ứng phụ, loại bỏ các sản phẩm phụ không

mong muốn [19]. Như vậy, có thể đạt được hiệu suất cao nhờ giảm các chi phí về

vật chất. Điểm lợi là sản phẩm tạo ra ở dạng không bị tạp bẩn, nên làm giảm chi phí

cho làm sạch và gánh nặng cho môi trường. Tính hiệu quả của xúc tác sinh học

được thể hiện ở làm tăng tốc độ các phản ứng hóa học. Tốc độ phản ứng có xúc tác

enzyme so với phản ứng model (mẫu) thường tăng từ 106 - 1012 lần. Nhiều phản ứng

khi không có enzyme xúc tác, xảy ra rất chậm hoặc hầu như không xảy ra. Các phản

ứng trong cơ thể sống thường xảy ra rất nhanh từ 10 tới 30 giây và hầu như không

xảy ra nếu đưa ra ngoài cơ thể.

Tính chọn lọc hóa học là tính phản ứng chọn lọc của một nhóm chức khi có

mặt các nhóm chức khác. Trong xúc tác sinh học tính chọn lọc hóa học thể hiện ở

khía cạnh sau: thường mỗi chất phản ứng cùng một lúc có thể tham gia vào nhiều

phản ứng hóa học, vì vậy khi tiến hành phản ứng hóa học của một chất thì ngoài

phản ứng chính ra còn xảy ra một số phản ứng phụ. Tuy nhiên trong xúc tác sinh

học không có phản ứng phụ nào xảy ra (không có sản phẩm phụ nào được tạo

thành). Enzyme tác động lên một nhóm chức duy nhất, chỉ thúc đẩy một phản ứng

hóa học duy nhất trong số các phản ứng hóa học có thể đối với cơ chất đã cho [19].

Tuy nhiên, cũng có một số hạn chế trong sử dụng các enzyme mà không dễ

khắc phục. Đặc biệt, giá thành cao của tách chiết và làm sạch vẫn cản trở việc sử

dụng chúng, nhất là trong các lĩnh vực có một quy trình (hay sự lựa chọn) khác đã

được thiết lập. Bản chất nói chung là không bền của các enzyme khi bị tách khỏi

môi trường tự nhiên của chúng, cũng là một trở ngại lớn cho việc sử dụng chúng.

33

1.4.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Năm 1913 hai nhà khoa học Michaelis và Menten đưa ra mô hình động học

để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan

hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme [19]. Theo mô hình này,

enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES).

Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải

phóng enzyme (E). Enzyme được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới.

Trong đó: k+1, k-1, k2: là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.

Phương trình Michaelis – Menten:

V = VM[S]0

KM + [S]0

Trong đó VM = k2[E]0 và KM = k2 + k-1

k+1

Từ phương trình xác định nồng độ cơ chất và enzyme thích hợp để đạt được

vận tốc phản ứng cao nhất.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Do bản chất của enzyme là protein nên sự thay đổi về nhiệt độ thường ảnh

hưởng tới hoạt tính enzyme. Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích

hợp nằm trong khoảng 40oC – 50oC, ở nhiệt độ cao hơn 70oC đa số enzyme bị bất

hoạt. Do vậy, nhiệt độ 70oC được coi là nhiệt độ tới hạn của enzyme. Theo quy luật

của các phản ứng hóa học thông thường trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị

biến tính, khi tăng nhiệt độ lên 10oC thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên

1,4 – 2 lần. Nhiệt độ tối thích cho một enzyme không phải là hằng số mà nó phụ

thuộc vào nhiều yếu tố: cơ chất, pH môi trường, nồng độ enzyme…

Ảnh hưởng của pH môi trường

pH có ảnh hưởng rất lớn tới vận tốc phản ứng enzyme, mỗi enzyme chỉ

hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH tối ưu của enzyme. pH

34

tối ưu của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hoặc trung tính, chỉ

một số ít hoạt động trong vùng acid mạnh hoặc kiềm mạnh.

Ảnh hưởng của thời gian

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của

quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm thủy phân. Hoạt tính sinh học

của sản phẩm thủy phân phụ thuộc nhiều vào đội dài của các mạch carbohydrate

trong sản phẩm thủy phân. Thời gian kéo dài, enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt

để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian thủy

phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động, sản sinh nhiều sản

phẩm thứ cấp, đồng thời làm giảm thời gian thủy phân.

1.4.2.3. Cơ chế thủy phân cellulose bằng phương pháp xúc tác enzyme

Hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose

Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose là do chúng có thể tiết ra các

enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase. Các enzyme hệ cellulase này

xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn mạch cellulose [53].

Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính sau đây:

- Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase (Cx). Enzyme này

tác động thuỷ phân lên các liên kết bên trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm

trương phồng cellulose, dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các

nhóm khử. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động

yếu ở vùng kết tinh của cellulose.

- Exo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase (C1).

Enzyme này giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose.

Enzyme này tác động yếu lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng

tác động mạnh lên mạch bên ngoài của cellulose kết tinh hoặc cellulose đã bị phân

giải một phần. Hai enzyme exo và endo-glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu

quả rõ rệt.

- -1,4-glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase. Enzyme này thuỷ

phân cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi

chiều dài của mạch cellulose tăng lên. Tuỳ theo vị trí mà -glucosidase được coi là

35

nội bào, ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào. Chức năng của -glucosidase có

lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase.

Người ta cho rằng tính đa hình của cellulase là nhằm phù hợp với cấu trúc

phức tạp của mạch phân tử cellulose, gồm nhiều vùng có hoạt tính thủy phân khác

nhau. Tuỳ thuộc vào các chủng vi sinh vật cũng như các điều kiện môi trường nuôi

cấy, tỷ lệ các thành phần trong hệ enzyme, hiệu lực phân giải cellulose của các hệ

cellulase là khác nhau, nhưng để phân giải hoàn toàn cellulose, cần có sự tác động

hiệp đồng của cả ba enzyme trong hệ cellulase [65].

- Cơ chế thủy phân cellulose được giả thiết có ít nhất hai bước (hình 1.10):

Bước 1: Endoglucanase (ký hiệu Cx) sẽ làm trương hoặc hydrat hóa các liên

kết trong mạch cellulose.

Bước 2: Exoglucanase (ký hiệu C1) và β-glucosidase (cellobiase) thủy phân

các liên kết mạch phía ngoài giải phóng glucose.

36

Hình 1.10. Cơ chế thủy phân cellulose

Hình 1.11. Sơ đồ thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase

37

Hình 1.12. Cơ chế thủy phân glycoside bằng enzyme -glucosidase

Trung tâm phản ứng của enzyme -glucosidase bao gồm hai amino acid

glutamic và aspartic. Quá trình phản ứng trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn đầu là sự

bám dính của cơ chất vào trung tâm phản ứng của enzyme phụ thuộc vào cấu hình

của carbonanome trong hợp phần carbohydrate, với enzyme -glucosidase chỉ liên

kết -glucoside mới bám dính được. Giai đoạn thứ hai là quá trình phân cắt liên kết

glycoside dưới tác dụng của tác nhân nucleophil glutamte tách proton của nước tạo

thành tác nhân nucleophil thứ cấp, tác nhân nucleophil thứ cấp là anion hydroxy

phản ứng với trung tâm cacbonanome electrophil và phản ứng chuyển proton từ hợp

phần aspartic vào nguyên tử oxi trong hợp phần aglycol. Trong trình tự peptid của

enzyme, amino acidaspatic chuyển thành dạng muối aspartate, muối glutamte

chuyển thành dạng acid glutamic. Sản phẩm của quá trình là glucose.

Phương pháp công nghệ sinh học sử dụng enzyme, vi sinh có phần ưu điểm

hơn. Các liên kết (1-4), có trật tự cao của cellulose rất dễ bị phá vỡ bởi các vi sinh

có chứa enzyme cellulase.

Các thí nghiệm thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase thường được tiến

hành trong tủ ấm với các điều kiện tối ưu để enzyme có hoạt tính cao nhất (40-

38

45°C, pH = 4,0-4,5). Năm 2010, người ta đã xây dựng hệ enzyme cellulase công

nghiệp bao gồm chế phẩm Cytolase CL (Genencor, Menlo Park, CA) và β-

glucosidase (Novozyme 188) có hoạt tính thủy phân cao ở pH = 4,8 [78].

1.4.2.4. Cơ chế thủy phân cellulose bằng phương pháp hóa học

Việc thủy phân cellulose để tạo nên các mạch/đoạn oligocellulose ngắn hơn

và cho tới glucose có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế. Việc sử dụng các cơ chất

cellulose sau thủy phân sẽ trở nên đơn giản hơn và thuận lợi hơn rất nhiều. Việc tìm

ra biện pháp thích hợp và rẻ tiền là rất quan trọng, tính chất phức tạp và chi phí cao

cho các cách xử lý này đang là một trong những yếu tố cơ bản đối với vấn đề khai

thác cellulose cũng như sử dụng cellulose ở quy mô công nghiệp [68], [69], [78].

Phương pháp hoá học ít có hiệu quả đối với các phần cellulose có cấu trúc tinh thể

hoặc cấu trúc trật tự bậc cao với liên kết (1 - 4), song lại thích hợp để phá vỡ

thành phần lignin của sợi cellulose.

Trong phương pháp hóa học, người ta hay dùng acid với nồng độ loãng, thí

dụ H2SO4 5% hoặc H2SO4 5% và HCl 5%. Để tránh bị phá hủy glucose, sản phẩm

của thủy phân, người ta còn dùng hỗn hợp dung dịch HCl 0,5% cùng ZnCl2 (65% -

74%) (pH = 4,8, 100°C, 4 giờ). Sau 4 giờ thủy phân, 80% của cellulose chuyển

thành dextrin hòa tan [97], [108], [120].

Phương pháp hóa học đòi hỏi những trang thiết bị rất tốn kém mà lại khó thu

được sản phẩm tinh khiết, vì vậy hiệu quả kinh tế thấp (hình 1.13). Trong khi đó,

phương pháp sinh học sử dụng enzyme vi sinh vật có tính đặc hiệu cao nên có thể

thu được sản phẩm tinh khiết, dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất thường.

39

Hình 1.13. Sơ đồ thiết bị thủy phân bằng phương pháp acid tại Brazil ,

công ty “Usina Nova America S/A (Tarumax/SP Brazil)”

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC THUỘC LĨNH

VỰC CỦA LUẬN ÁN

1.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, công nghệ sản xuất ethanol sinh học đã được nghiên cứu và

ứng dụng thành công ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, nguyên

liệu phục vụ cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học chủ yếu từ các cây lương

thực, rơm rạ [46], [88], [1] còn từ nguồn rong biển chưa được nghiên cứu và ứng

dụng nhiều. Đối với Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ và đang thu hút sự

quan tâm của nhiều nhà khoa học.

Rong biển là sinh vật tự dưỡng nhờ quá trình quang hợp mà sinh

trưởng, phát triển nên sản lượng rong biển trên thế giới rất dồi dào. Theo số liệu

của tổ chức FAO, năm 2006 thống kê, nguồn rong biển tự nhiên ở các vùng biển

trên thế giới rất lớn, có thể sử dụng nguồn này để sản xuất ethanol sinh học thay thế

cho các nguồn lương thực khác, như Trung Quốc sản lượng rong tươi hàng năm là

323 nghìn tấn/năm, Chile là 305 nghìn tấn/năm, Na Uy là 145 nghìn tấn/năm,

Nhật Bản là 113 nghìn tấn/năm, Pháp là 75 nghìn tấn/năm và Ireland là 29

nghìn tấn/năm. Ngoài ra, tổ chức FAO cũng thống kê các nước trồng rong lớn nhất

thế giới thuộc vào các nước Châu Á, như Trung Quốc là 10,800 nghìn tấn/năm,

40

Philippin là 1,300 nghìn tấn/năm, Indonesia là 900 nghìn tấn/năm và những nước

khác là 2,000 nghìn tấn/năm [61]

Những nguyên liệu có thể dùng để sản xuất ethanol là đường, tinh bột và

nguyên liệu chứa cellulose. Monosaccharide có thể biến đổi trực tiếp thành

ethanol nhưng tinh bột phải được thủy phân thành monosaccharide dưới tác dụng

của enzyme rồi mới lên men thành ethanol, còn cellulose cũng phải biến đổi thành

monosaccharide. Sở dĩ có thể dùng rong biển để sản xuất ethanol vì nhiều loài rong

biển có chứa hàm lượng carbohydrate cao, có thể dùng để chuyển hóa lên men

rượu. Đã có nhiều tài liệu nước ngoài công bố về vấn đề này như rong nâu

Laminaria ở vùng biển Ireland được đất nước này khai thác để sản xuất ethanol

sinh học có chứa 6% cellulose, 23% alginate, 12% mannitol, fucoidan 5%,

laminaran 14%, proteins 2%, lipid 2%, không thấy có tinh bột, hemicellulose và

lignin. Khác với rong nâu, rong lục có hàm lượng ẩm cao hơn rất nhiều, hàm

lượng khoáng 24%, protein 19%, lipid 2%, cellulose 18%, ulvan 20%, tinh bột

2%, hợp chất sunfat 8% và chất màu nhỏ hơn 1% [32], [61].

Alginate là một polysaccharide trong rong nâu không thể lên men nhờ

những vi sinh vật truyền thống, mà muốn lên men được phải qua xử lý ở nhiệt độ

cao trước khi lên men hoặc dùng những vi sinh vật lên men thích hợp. Năm 2004, ở

Na Uy, Horn và cộng sự đã tìm ra chủng nấm men P. angophorae để lên men

rong nâu nhưng hiệu suất lên men không cao, còn các nhà nghiên cứu của trường

đại học quốc gia Ireland (NUIG) đã tách được một enzyme từ nấm kỵ khí

Talaromyces emersonii được xem là cắt đứt rất tốt các hợp chất saccharide phức

tạp để tạo ra saccharide đơn giản [61].

Năm 2007, nhóm tác giả Aizawa, của trường Đại học Tokai Nhật Bản đã

công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học của Nhật Bản do Tokyo

Fisheries Promotion Foundation đầu tư trên tạp chí Oceans 2007. Dự án sản xuất

ethanol từ rong biển Sargassum horneri là một loại rong nâu, có hàm lượng

carbohydratee 5,8%, kết quả thu được 29,6 kg ethanol hoặc 38 lít ethanol trên 1

tấn rong tươi có độ ẩm 90% [27].

Năm 2009, nhóm tác giả Dubok Choi và các cộng sự của hai trường Đại học

Cho-dang và Chusun Hàn Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất đường từ

41

nguyên liệu rong biển thô trên tờ báo Industrial and Engineering Chemistry. Kết quả

công bố, rong biển thô được cắt nhỏ 5 cm, sau đó bổ sung HCl, ascorbic acid và

NaOH từ 0,25 ÷ 2%, hỗn hợp được gia nhiệt ở 121oC; 0,98 bar, trong thời gian 1-3h,

tác giả so sánh hiệu quả thủy phân giữa các mẫu bằng cách so sánh độ nhớt giữa các

hỗn hợp sau khi kết thúc thủy phân, trường hợp rong biển thủy phân trong ascorbic

acid cho thấy độ nhớt giảm một cách nhanh chóng, tiếp đến là mẫu xử lý HCl và cuối

cùng mẫu xử lý NaOH. Nhóm tác giả cũng công bố khi rong biển thủy phân bằng hỗn

hợp enzyme Liquozyme, Dextrozyme, Cellic HTech2 và Rapidase trong điều kiện

nhiệt độ 30oC, thời gian 360 phút thì hàm lượng đường sinh ra nhiều hơn so với dùng

ascorbic acid [55].

Năm 2010 nhóm tác giả Churl Kim và các cộng sự của trường đại học Kyung

Hee đã công bố kết quả nghiên cứu trên tạp chí Bull. Korean Chem. Soc về sử dụng

chất lỏng ion để chuyển hóa agar thành hỗn hợp đường. Phản ứng đường hóa agar

được tiến hành như sau: Một hỗn hợp 10 g agar được trích ly từ Gelidium amansii

cho vào hỗn hợp nước chứa chất lỏng ion có tính chất acid ([Chol][HSO4]). Phản ứng

thủy phân được thực hiện ở 121oC trong 15 phút, sau đó điều chỉnh pH hỗn hợp về

5,5 bằng cách bổ sung CaCO3 và chất lỏng ion được tách ra bằng cách ly tâm [46].

Năm 2011, nhóm tác giả Kazunori Nakashima và cộng sự của trường Đại

học Kobe Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất bioethanol từ

cellulose bằng cách kết hợp giữa nấm men có chứa enzyme cellulase với tiền xử

lý chất lỏng ion (ionic liquid). Cellulose được tiền xử lý với các chất lỏng ion như

[Emim][Cl]; [Emim][OAc]; [Emim][DEP] ở điều kiện 80oC, thời gian 30 phút; sau

đó hỗn hợp được trung hòa bằng dung dịch đệm acetate, điều chỉnh pH về 5,0.

Hỗn hợp tiếp tục được bổ sung 5 ml hỗn hợp enzyme endoglucanase (EG),

cellobiohydrolase (CBH), và glucosidase (BGL), đồng thời bổ sung 5 ml nấm

men S. cerevisiae tiến hành lên men ở nhiệt độ 30oC, thời gian 96 h thì hiệu suất

thu ethanol lên đến 90% và có thể tái sử dụng các chất lỏng ion đến 82% [67].

Na Uy đã nghiên cứu sản xuất ethanol từ hai loài rong nâu là Laminaria

hyperborea và Ascophyllum nodosum thành công, họ đã chiết laminaran, mannitol

từ rong nâu Laminaria hyperborea để sản xuất ethanol [70], [88]. Hàm lượng

mannitol và laminaran trong rong nâu khô khoảng 25 ÷ 30%. Quá trình lên men

42

ethanol từ mannitol nhờ vi khuẩn Zymobacter palmae, còn vi khuẩn Pichia

angophorae có thể tham gia sản xuất ethanol từ cả hai nguồn mannitol và

laminaran. Những vi sinh vật phổ biến được sử dụng để lên men ethanol là

Saccharomyces cerevisiae V 7028 và vi khuẩn Zymomonas mobilis [61].

Năm 2011 nhóm tác giả Krish Purnawan và các cộng sự của trường Đại học

Mulawarman Indonesia đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học

từ rong đỏ Eucheuma cottonii trên vùng biển Baotang của Indonesia theo quy trình

sau: Rong sau khi thu hoạch được phơi khô và bảo quản trong các túi nilon, đưa về

phòng thí nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ phòng, 100 g rong khô cho vào 300 ml

nước, sau đó đun sôi ở nhiệt độ 80oC trong 2 giờ cho đến khi gel được hình thành, sau

đó làm nguội xuống nhiệt độ phòng 25 ml H2SO4 5% rót vào một lọ thủy tinh chứa

100 g gel rong biển đem đun sôi ở 100oC trong 2 giờ, sau đó dung dịch được điều

chỉnh về pH = 5 bằng cách nhỏ 0,1 M NaOH, hàm lượng đường được xác định theo

phương pháp Nelson Somogyi là 15,8 mg/ml dịch thủy phân. Hỗn hợp được lên men

từ 5-6 ngày ở nhiệt độ phòng từ 28-300C bằng nấm men Saccharomyces cereviceae

thì thu được sản lượng ethanol tối đa là 4,6% [70].

Năm 2011 nhóm tác giả Leilei Ge và các cộng sự của trường College of Food

Science and Engineering và Ocean University của Trung Quốc đã công bố kết quả

nghiên cứu trên tạp chí Renewable Energy về nghiên cứu công nghệ đường hóa bã

rong để sản xuất ethanol. Nguyên liệu dùng nghiên cứu là phần bã thừa của quá

trình sản xuất alginate được xay nhỏ và sấy khô ở 40oC, sau đó bảo quản ở nhiệt độ

phòng. Bã rong được tiền xử lý bằng acid sulfuric loãng lần lượt là 0,1; 0,2; 0,5 và

1% trong thời gian 0,5; 1,0 và 1,5 giờ tại nhiệt độ 121oC. Sau đó, phần bã không tan

được lọc tách ra và rửa với nước nóng. Hỗn hợp được điều chỉnh về pH = 4,8 bằng

dung dịch đệm acetate, tiếp tục bổ sung enzyme cellulase và cellobiase để thủy phân

cellulose, hemicellulose và lignin không tan ở nhiệt độ 50oC trong 48 h. Sau đó hỗn

hợp được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae V7028 ở nhiệt độ 30oC trong

36 h, thu được lượng ethanol là 41,2%, tương ứng với hiệu suất 80,8% [77].

Nhóm tác giả Mitsunori Yanagisawa và các cộng sự của Viện công nghệ

Tokyo và trường đại học công nghệ Kochi Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên

cứu thủy phân các loài rong có chứa polysaccharide để sản xuất ethanol sinh học

43

trên tạp chí Process Biochemistry. Nhóm tác giả đã nghiên cứu trên ba đối tượng

rong: rong lục Ulva pertusa Kjellman, rong nâu Alaria crasssifolia và rong đỏ

Gelidium elegans Kuetzing, đối với rong lục và rong nâu sau khi thu hoạch về

được phơi nắng trong 5 h để dùng làm thí nghiệm, còn rong đỏ được sấy ở 60oC

trong 2 ngày. Tất cả các loại rong đều xay nhỏ đến 0,5 mm. Tổng hàm lượng

carbohydrate trong 3 loại rong này được xác định bằng tổng của NFE (nitrogen –

free extract) và phần sợi thô được xác định bằng phương pháp chuẩn dùng phân

tích thực phẩm lần lượt là 68,8; 61,0 và 83,2%, glucan trong các loại rong này lần

lượt là 22,0; 24,5 và 21,8% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Galactan chỉ có trong

rong đỏ với hàm lượng 26,5% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Đây là những

polysaccharide chứa các đường có thể lên men một cách dễ dàng [87].

Như vậy, kết quả nghiên cứu của nhiều nhóm tác giả đã công bố cho thấy,

sản xuất ethanol sinh học từ rong biển có thể sử dụng nhiều phương pháp thủy

phân rong để tạo dung dịch đường như thủy phân bằng acid H2SO4 [77], [110], HCl

[55], acid ascorbic [55], xút (NaOH) [55], enzyme [77], [87] hoặc kết hợp giữa các

phương pháp với nhau [77]. Sử dụng chất lỏng ion kết hợp với phương pháp dùng

enzyme hoặc acid hiệu quả đối với nguyên liệu chứa nhiều cellulose như phụ

phẩm nông nghiệp [46]. Hàm lượng cellulose trong rong biển không cao [32], [61],

[8] trong khi chất lỏng ion lại đắt nên việc sử dụng chất lỏng ion để tiền xử lý

rong biển không hiệu quả.

1.5.2. Các nghiên cứu trong nước

Hiện nay, tại Việt Nam cũng đã và đang bắt đầu những nghiên cứu sản xuất

ethanol nhiên liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối (phế thải). Theo hướng này, đã có

một số công trình, nhưng trong quá trình thực hiện đang còn gặp những khó khăn

rất lớn. Về nghiên cứu sử dụng nguồn phế thải nông nghiệp thành nhiên liệu sinh

học theo 2 hướng:

- Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất ethanol sinh học

- Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất diesel - sinh học

Theo hướng sử dụng nguồn phế thải nông, lâm nghiệp để sản xuất ethanol

sinh học đã có một số đề tài, công trình sau:

44

- “Sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp”, Chủ nhiệm đề tài

PGS. TS Vũ Nguyên Thành, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ Bông Thương,

(2009-2011).

- “Nghiên cứu công nghệ hiện đại để sản xuất ethanol nhiên liệu từ gỗ phế

liệu nguyên liệu giấy”, Thuộc Đề án thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến

năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 của Bộ Bông Thương. Chủ nhiệm đề tài PGS.TS

Doãn Thái Hòa, ĐHBK Hà Nội. (2009 - 2010).

- “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ”, Trần Diệu Lý, Luận

văn, 2009, Mã số: 7759, Trường ĐH Bách Khoa Tp. HCM.

Dùng enzyme để thủy phân phế thải để tạo đường tan nhìn chung đạt hiệu

quả thấp, chưa tìm được enzyme thích hợp cho hiệu suất cao (đề tài của PGS. TS

Vũ Nguyên Thành).

- Hầu hết sinh khối từ thực vật và phế thải nông nghiệp rơm rạ chứa nhiều

hemicellulose 23-32% và lignin – 15-25%. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp thực

sự hiệu quả thủy phân thành phần hemicellulose, lignin.

- Một số hợp phần có trong phế thải như Silic làm giảm hiệu suất thủy phân.

- Dùng acid để thủy phân phế thải để tạo đường tan thì gặp khó khăn trong

việc tạo thiết bị chịu acid, nhiệt độ (1800C, áp suất 15 atm) (đề tài của PGS.TS

Doãn Thái Hòa)

Hiện nay, tại Việt Nam chưa có bất kỳ tác giả nào công bố kết quả nghiên

cứu về sản xuất ethanol sinh học từ rong biển mà chỉ dừng ở việc nghiên cứu khảo

sát sản lượng rong biển phục vụ sản xuất ethanol và nghiên cứu một số thành phần

hóa học của một số loại rong có tại Việt Nam, trong đó có hàm lượng

polysaccharide, như tác giả Lê Như Hậu và cộng sự của Viện Nghiên cứu và Ứng

dụng Công nghệ Nha Trang với đề tài “Nghiên cứu và đề xuất giải pháp khai thác

hợp lý và bền vững cho rong nguyên liệu sản xuất ethanol ở ven biển Nha Trang”

năm 2010 đã công bố, trữ lượng các ngành rong biển tại Nha Trang như sau: Khu

vực vịnh Nha Trang có diện tích rong Mơ 546,20 ha. Rong Mơ phát triển thành

thảm với sinh lượng trung bình đạt 571,90 g.khô/m2, trữ lượng 4840,4 tấn khô/năm.

Rong Đỏ là 231,97 tấn khô/năm và rong lục là 16,53 tấn khô/năm [2]. Tác giả cũng

công bố kết quả nghiên cứu trong báo cáo hội nghị khoa học nhân dịp kỷ niệm 35

45

năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam diễn ra tại Hà Nội vào tháng 10 năm

2010 là Rong biển Việt Nam gồm những chi có sản lượng lớn Sargassum,

Hormophysa, Hydroclathrus (rong nâu); Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea,

Kappaphycus (Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục), hiện nay

có thể khai thác 79.126,3 tấn rong khô trên diện tích 75.322,0 ha. Diện tích mặt

nước có tiềm năng nuôi trồng và khai thác rong biển trong thời kỳ 2010-2015

khoảng 900.000 ha với sản lượng 600-700.000 tấn khô/năm. Như vậy, rong biển

Việt Nam, cũng như rong biển tại các vùng biển Khánh Hòa có trữ lượng rất lớn, có

khả năng đáp ứng nguồn nguyên liệu cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học ở quy

mô công nghiệp bằng khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên và nuôi trồng bằng mô

hình kết hợp hoặc luân canh trong các ao nuôi tôm và ở các bãi triều ven biển, đặc

biệt vùng ven biển Nha Trang các nhóm rong có trữ lượng lớn là rong đỏ, rong lục

và rong mơ.

Nghiên cứu về hàm lượng carbohydrate trong rong biển:

Monosaccharide quan trọng trong rong nâu là đường mannitol được

Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Hàm

lượng mannitol trong rong nâu dao động từ 14-25% trọng lượng rong khô tùy

thuộc vào hoàn cảnh địa lý và nơi sinh sống. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Hải

Dương học Nha Trang năm 1979, xác định sự biến động hàm lượng mannitol trên

2 đối tượng rong nâu S. mcclurie và S. kjellmanianum tại vùng biển Hòn Chồng,

Nha Trang lần lượt là 15,79 – 16,36% (từ tháng 3 đến tháng 5); 12,40-13,82%

(từ tháng 3 đến tháng 4). Còn kết quả nghiên cứu của Trần Thị Luyến, Nguyễn

Anh Tuấn, Trường Đại học Nha Trang, xác định hàm lượng mannitol vào tháng 4

trong rong nâu S. mcclurie ở vùng biển Quảng Nam - Đà Nẵng, Bình Định, Khánh

Hòa, Ninh Thuận lần lượt là 15,6; 11,3; 15,4 và 14,8%. Nếu rong bảo quản không

tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy. Hàm lượng mannitol trong rong nâu

ở vùng biển Khánh Hòa được phân tích có hàm lượng trung bình vào khoảng

6,3 – 11,35% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Trong đó, loài S. mcclurie có hàm

lượng cao hơn cả. Tháng 4 và 5 là lúc rong nâu đã trưởng thành, có kích thước

lớn nhất, hàm lượng acid alginic và mannitol cao nhất [22].

46

Polysaccharide trong rong nâu chủ yếu là alginic, hàm lượng alginic dao

động từ 13-15% trọng lượng rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và

vị trí địa lý môi trường rong sinh sống. Theo các tài liệu tổng kết của Miyake

(1995) cho thấy hàm lượng alginic trong các loài rong nâu ở các vùng biển

Liên Xô cũ dao động từ 13-40%. Theo tài liệu phân tích các chuyên gia Bộ Thủy

sản cho thấy hàm lượng alginic trong các loại rong nâu ở Hải Phòng dao động từ

22-40%. Theo số liệu nghiên cứu của Viện Hải Dương học năm 1979, hàm lượng

alginic trong rong S. mcclurie và S. kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt

Nam dao động từ 39,24 – 44,40% so với rong khô tuyệt đối từ tháng 3 đến tháng

5. Còn kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang năm

1998 - 2000, hàm lượng alginic trong rong S. mcclurie và S. kjellmanianum ở vùng

biển miền trung Việt Nam trong tháng 4 dao động từ 35,9 đến 39,4% so với trọng

lượng rong khô tuyệt đối [22].

Như vậy, từ các tài liệu đã công bố tại Việt Nam và thế giới cho thấy, sản

lượng rong biển rất dồi dào với giá thành thấp, trong rong biển chứa một hàm

lượng carbohydrate cao nên việc sử dụng rong biển để sản xuất ethanol sinh học

có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

47

Chương 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Các nguyên vật liệu chứa cellulose

2.1.1.1. Các mẫu rong nâu

Các mẫu rong biển được thu ngay sau thời kỳ sinh sản. Thời gian thu hoạch

tùy thuộc vào từng loại rong nhưng thông thường vào khoảng thời gian từ tháng 3

đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong được giám định và xác định tên khoa học bởi

TS. Lê Như Hậu (Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Sau khi thu

hái, mẫu được rửa sạch bằng nước để loại muối, cát và phơi trong bóng râm. Rong

được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 40-50°C, cắt nhỏ. Rong khô đã cắt nhỏ được

nghiền thành bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng

Hình 2.1. Các mẫu rong nghiên cứu

Sargassum henslowianum Sargassum swartzii

S.oligocystum S. binderi

48

Bảng 2.1 Các loài rong nâu được thu hái để nghiên cứu

STT Tên loài rong Địa điểm thu mẫu

1 Sargassum swartzii Nha Trang

2 Sargassum henslowianum Hải Phòng

3 Sargassum binderi Nha Trang

4 Sargassum oligocystum Nha Trang

2.1.1.2. Phế thải rơm rạ

Thu nhận lấy mẫu rơm, rạ của một số tỉnh trong nước. Tại miền Bắc chúng

tôi lấy mẫu ở rơm thuộc giống lúa Thiên Hương HYT – 100 của vùng Đông Hưng

Thái Bình.

Mẫu lấy về được rửa sạch, phơi khô, cắt từng đoạn nhỏ có chiều dài từ 5 đến

10 cm, cho vào lọ nhựa, dán tên, đậy nắp kín và bảo quản tại nhiệt độ phòng từ 26

đến 32oC (hình 2.2).

Trước khi phân tích mẫu, tiến hành xử lý cơ học: cắt nhỏ mẫu cho tới khi có

chiều dài < 0,5 cm. Mẫu được sấy khô, sau đó cho nghiền trong máy nghiền thực

vật chuyên dụng cho tới kích thước 0,5 - 1,0 mm.

Hình 2.2. Phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) trước và sau khi xử lý cơ học

2.1.2. Các chủng vi sinh

Bao gồm các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose tạo thành các sản

phẩm trung gian tan (hydrolizat) (bảng 2.2) và các chủng vi sinh vật để chuyển hóa

(lên men) các sản phẩm trung gian tan thành ethanol (bảng 2.3).

49

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose

Chủng vi sinh vật Xuất xứ

1 Chủng vi khuẩn C32 Phân lập ở Hà Nội

2 Chủng Xạ khuẩn 7P Phân lập ở Hà Nội

3 Chủng nấm Aspergillus terreus (fungus) Nga chuyển giao

4 Chủng Vi khuẩn VK Hud 4-1 Phân lập tại Hà Nội

5 Chủng vi khuẩn C36 Phân lập ở Hà Nội

Bảng 2.3 Các chủng vi sinh vật cho lên men ethanol

STT Chủng nấm men Xuất xứ

1 Saccharomyces cerevisiae V7028 Việt Nam

2 Kluyveromyces sp. Việt Nam

3 Candida sp. Việt Nam

4 Kluyveromyces marxianus Nga

5 Saccharomyces cerevisiae V7028 Nga

6 Saccharomyces cerevisiae V7028 Т2 Nga

Nấm men

Nấm men được dùng để lên men ethanol là loài nấm men Saccharomyces

cerevisiae V7028 do phía Nga chuyển giao.

Điều kiện hoạt động:

Nhiệt độ hoạt động: 42 – 46oC

pH hoạt động: 5,0 – 5,5

50

2.1.3. Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng có xuất xứ Trung Quốc, một số hóa chất chuẩn

chỉ thị có xuất xứ từ MERCK đảm bảo các chỉ tiêu chất lượng về hóa chất sử dụng

trong phòng thí nghiệm.

Bảng 2.4 Các hóa chất được sử dụng trong luận án

Hóa chất Trạng thái, tính chất

Một số chỉ tiêu chất lượng

Độ tinh

khiết

(≥ %)

Cl

(≤%)

SO4

(≤%)

Fe

(≤%)

As

(≤%)

Acid sulfuric

Chất lỏng sánh, không màu

CTPT: H2SO4

M = 98,08

95-98

0,0003

-

0,00005

0,000003

Acid 3,5-

dinitrosalicylic

Chất rắn, màu vàng

CTPT:C7H4N2O7

M = 228,12

98

- - - -

Na-K-tactarat

Tinh thể màu trắng

CTPT: C4H4O6KNa.4H2O

M = 282,22

99 0,001 0,005 - -

Natri hydroxid

Chất rắn khan, màu trắng

CTPT: NaOH

M = 40

96 0,005 0,005 - -

Acid acetic

Chất lỏng sánh, không màu

CTPT: CH3COOH

M = 60,05

99,5 0,001 0,0001 0,002 -

Natri acetate

Tinh thể màu trắng

CTPT:CH3COONa

pH = 7,5-9,0

99 0,002 - - -

Enzyme Cellic HTech2

Cellic HTech2 là chế phẩm enzyme thương mại của hãng Novozymes Đan

Mạch, Cellic HTech2 là một phức hợp đa enzyme bao gồm các enzyme hoạt tính:

cellulase, hemicellulose, xylanase... Nó cũng hoạt động trên các nhánh giống như

pectin chất được tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Chế phẩm enzyme thương

mại Cellic HTech2 hoạt động tối ưu ở pH 5,0-5,5, nhiệt độ 45-50oC.

51

Enzyme Cellic HTech2 cũng có thể sử dụng trong ngành công nghiệp, đặc

biệt là nơi các sản phẩm hữu ích được chiết xuất từ nguyên liệu thực vật trong chế

biến các loại ngũ cốc và rau quả. Nó có thể tăng cường sự sẵn có của tinh bột trong

quá trình lên men làm giảm polysaccharide trong nguyên liệu thực vật. Nó thường

làm giảm độ nhớt của vật liệu có nguồn gốc từ thực vật và do đó có thể cải thiện

sản lượng khai thác.

2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ

Tách riêng cellulose từ nguyên liệu thực hiện theo phương pháp sau [37][109]

Cân 10 g rơm đã được nghiền nhỏ (cỡ 1,0 mm) cho vào cốc thủy tinh, thêm

vào đó 500 ml nước cất và 50 ml NaOH 10%. Cốc sau đó được đặt trong nồi đun

cách thủy, cho đun sôi trong 5 phút, sau đó lọc dung dịch bằng cách đổ lên một

mảnh vải popeline màu trắng đặt trên miệng phễu. Khi lọc xong, rơm được rửa với

nước nhiều lần. Tiếp theo rơm được chuyển từ mảnh vải vào trong cốc thủy tinh

bằng bình tia và thể tích khoảng 500 ml bằng nước cất, thêm vào đó 50 ml HCl

10%, hỗn hợp được đem đun sôi trong bình cách thủy 5 phút. Rơm lại được lọc rửa

như trên. Tiếp theo, thêm 5 ml dung dịch NaClO. Hỗn hợp này được để ở chỗ tối

trong 20 phút. Rơm được lọc, rửa, chuyển vào cốc thủy tinh và được clo hóa lần hai

với NaClO trong 20 phút. Tiếp đó rơm được lọc qua vải, rửa sạch với nước lạnh,

với 500 ml H2O2 2%, rồi rửa nhiều lần với nước sôi, cuối cùng cellulose còn lại sau

khi đã được rửa sạch, được chuyển vào cốc đã biết khối lượng và sấy đến khô ở

100oC. Cân và xác định lượng cellulose thu được.

Hình 2.3. Phương pháp Hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ

52

2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm của rong biển khô

Nguyên tắc

Dùng nhiệt độ cao làm bay hết hơi nước trong rong. Cân khối lượng

rong trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm (%) nước có trong rong.

Cách tiến hành

Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Rửa sạch cốc, để khô, sấy ở nhiệt độ

130oC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm, cân, tiến hành sấy

tiếp ở nhiệt độ 130oC khoảng 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, sấy tiếp đến

khi nào khối lượng cốc giữa hai lần cân không lệch nhau quá 5.10-4 là được.

Cân chính xác 1,0 g rong biển khô (đã cắt nhỏ) cho vào cốc sấy đã xác

định khối lượng không đổi. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80oC trong 30

phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 130oC trong 1 giờ. Sau đó lấy ra để nguội trong

bình hút ẩm, cân khối lượng rồi tiếp tục cho vào tủ sấy trong thời gian 1 giờ, lấy ra

để nguội ở bình hút ẩm và cân như trên cho tới khi khối lượng không đổi. Kết

quả giữa 2 lần cân không lệch nhau quá 0,5 mg cho mỗi mẫu chất thử.

Tính kết quả

Độ ẩm tính theo %

X = Hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi sấy

Khối lượng mẫu trước khi sấy

2.2.3. Xác định protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl

Nguyên tắc

Vô cơ hóa rong biển bằng H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác đặc biệt, rồi

dùng kiềm đặc mạnh NaOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 ra thể tự do, NH3 được

hấp thụ bởi H2SO4 tiêu chuẩn. Sau đó định lượng H2SO4 tiêu chuẩn dư bằng

NaOH tiêu chuẩn.

Các phản ứng xảy ra

53

Cách tiến hành

Protein thô được xác định bằng phương pháp micro Kjeldahl, đưa vào bình

nón chịu nhiệt 1 g mẫu rong, thêm vào đó 30 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp

theo 10 g K2SO4 và 1 g CuSO4. Ban đầu hỗn hợp được đun nhẹ cho đến khi hết sủi

bọt thì được tăng mạnh lên. Khi dung dịch trở nên không màu hoặc trong suốt, được

đun thêm 1 h nữa, để nguội, pha loãng với nước cất và chuyển vào bình Kjeldahl

800 ml. Đưa vào bình 3 hoặc 4 hạt kẽm kim loại và 100 ml dung dịch NaOH 40%

và bình được nối với đầu phun của thiết bị chưng cất. Tiếp theo đưa 25 ml dung

dịch H2SO4 0,1 N vào trong bình hứng và chưng cất. Khi hai phần ba lượng chất

lỏng đã được chưng cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hòa toàn chưa. Bình thu

được lấy ra chuẩn với dung dịch NaOH nồng độ 0,1 N. Từ lượng H2SO4 bị mất đi

xác định hàm lượng nitơ. Sau đó chuyển đổi về hàm lượng protein:

Tính kết quả

Protein tổng số của rong biển được tính bằng công thức sau:

mProtein = mNitrogen x 6,25

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng tro

Nguyên tắc

Tro hoá mẫu bằng nhiệt, sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp

khối lượng.

Cách tiến hành

Chén nung được rửa sạch và nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600oC đến khối lượng

không đổi, sau đó cân mẫu rong 1,0 g cho vào cốc nung, đem đun trên bếp điện đến

khi hóa than đen. Sau khi hóa than ta chuyển vào lò nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600oC để

hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lượng

không đổi.

Tính kết quả

Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau:

X = (A - B).100

m %

A: Khối lượng chén nung + tro (g)

B: Khối lượng chén nung (g)

m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm.

54

2.2.5. Xác định hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch

Nguyên tắc

Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform : Methanol với tỉ lệ 2:1 để hòa tan tất

cả chất béo trong thực phẩm, tách lớp và chiết qua phễu lọc nhiều lần. Sau khi làm

bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100 g

thực phẩm.

Cách tiến hành

Tách lipid từ mẫu:

Cân 1 g mẫu đã được bằm nhuyễn và trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial

cao thể tích 20 ml. Cho thêm 600 μl nước cất, 5 ml methanol, 10 ml chloroform và

200 μl BHT (Butylated hydroxy toluen). Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10

phút. Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút. Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy

lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn. Cho thêm 5ml

methanol và 10 ml chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây. Đổ dung

dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn. Sử dụng pitton xilanh để ép

tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 ml. Cho thêm 7,5 ml

NaCl 0,9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần

và giữ mẫu ở 5oC trong khoảng 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp.

Chiết rút dung dịch lipid

Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy

vào phễu chiết thể tích 50 ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp

gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein….).

Xác định thể tích chiết ở trên (V).

X = ¼ V (ml)

Cho thêm 5 ml MeOH 50% vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100 ml. Đảo trộn

ngược phễu chiết nhiều lần. Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 5oC.

Định lượng lipid

Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100 ml. Cô quay chân không làm

bay hơi dung môi trong bình cầu ở 37oC đến khi còn lại thể tích khoảng 1 ml. Hòa

tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp

xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khô với không khí). Chuyển lượng mẫu qua bình

55

định mức 5 ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ

5 ml. Sau khi xử lý xong, dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng

lipid tổng. Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đông –20oC.

Xác định hàm lượng lipid tổng

Lấy chính xác 2 ml dung dịch mẫu đã xử lý cho vào một ống thuỷ tinh có

nắp 4 ml đã được sấy chân không và cân với lượng không đổi. Làm khô bằng khí

nitơ. Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70

psi trong một giờ.

Lipid tổng số (%) tính theo công thức:

% Xt (g/g) = (m1 - m0).Vdm.100

m.Vm

% Xk (g/g) = (m1 - m0).Vdm.100

m.T.Vm

Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi của mẫu

Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu

m1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau sấy (g).

m0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g).

m: Trọng lượng cân mẫu (g).

Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (ml)

Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml)

T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100

W: Độ ẩm của mẫu (%)

2.2.6. Phương pháp định lượng đường khử theo phương pháp acid

dinitrosalicylic (DNS)

a. Nguyên lý

Glucose hay đường khử nói chung phản ứng tạo màu với thuốc thử DNS.

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường Glucose trong

một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so

màu ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với

thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường của mẫu nghiên cứu [85].

Phương trình phản ứng như sau:

56

OH

OOH

O2N

NO2

3

O

H

R+ + OH2

OH

OOH

NH2

NO2

O

OH

R3+

Axit dinitrosalicylic Axit 3-amino, 5-dinitrosalicylic

b. Hóa chất:

- Thuốc thử DNS: Cân 10 g DNS và hòa tan vào 200 ml dung dịch NaOH

2 M. Đun nóng dung dịch và khuấy mạnh. Thêm chất ổn định màu Na-K-tactarat

(hòa tan 300 g Na-K-tactarat trong 500 ml nước cất). Trộn đều hai dung dịch trên và

lên định mức 1 lít bằng nước cất. Đựng trong lọ thủy tinh sẫm màu. Chuẩn độ 3 ml

thuốc thử DNS với dung dịch chuẩn HCl 0,1 N với chỉ thị phenolphtalein, nếu hết

5-6 ml là được.

- Dung dịch tiêu chuẩn glucose có nồng độ 10 mg/ml

c. Cách tiến hành :

- Từ dung dịch tiêu chuẩn glucose 10 mg/ml, pha thành các dung dịch chuẩn

0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mg/ml.

- Xây dựng thang chuẩn Glucose:

+ Lần lượt hút chính xác 1,0 ml các dung dịch chuẩn từ 0,1 – 0,6 mg/ml cho

vào các ống nghiệm, sau đó cho vào các ống mỗi ống 1,0 ml dung dịch thuốc thử

DNS, tiếp đó cho vào mỗi ống 2,0 ml nước cất, lập tức lắc đều. Đun các ống

nghiệm trong nước sôi 5 phút. Thuốc thử DNS sẽ phản ứng với đường trong quá

trình đun nóng cho sản phẩm có màu nâu đỏ. Làm lạnh các ống nghiệm và thêm

6 ml nước cất vào mỗi ống. Lắc đều các ống nghiệm.

+ Chuẩn bị hai mẫu trắng (không có dung dịch đường chuẩn) bằng cách hút

1,0 ml nước cất và thêm vào 1,0 ml dung dịch DNS, tiến hành các bước tiếp theo

như các mẫu của thang chuẩn.

- Mẫu phân tích: Cũng tiến hành như với thang chuẩn. Hút 1 ml dung dịch

cần xác định hàm lượng glucose cho vào ống nghiệm, cho thêm 1 ml DNS và 2 ml

nước cất, đun sôi trong nước 5 phút, làm lạnh. Thêm vào 6 ml nước cất, khuấy đều

và tiến hành đo.

- So màu thang chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 540 nm.

Kết quả so màu thang chuẩn được ghi trong bảng sau :

57

Bảng 2.5 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phương pháp DNS

(Đo trên máy UV-VIS Labomed, INC)

C (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

OD 540nm 0,253 0,289 0,399 0,566 0,656 0,783 0,949

Từ các kết quả trong bảng trên, dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ

Glucose và độ hấp thụ trong Microsoft Exel (Hình 2.4).

Đồ thị phương trình đường chuẩn Glucose

y = 1.19x + 0.1996

R2 = 0.9826

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C (mg/ml)

OD540nm

Hình 2.4 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ

2.2.7. Phương pháp tiền xử lý phế thải rong nâu

Phế thải rong là sản phẩm phụ từ quy trình chiết xuất alginate bao gồm hàm

lượng lớn cellulose. Lượng phế thải rong trong quá trình chế biến alginate rất cao

khoảng 6 tấn phế thải trên 1 tấn sản phẩm. Trong bã thải, cellulose là thành phần

hữu cơ chiếm tỷ lệ cao và rất khó bị phân hủy bởi cấu trúc phức tạp của nó. Hiện

nay, trên thế giới người ta đã tiến hành xử lý phế liệu rong biển để làm thức ăn gia

súc bằng một số phương pháp thủy phân trong môi trường kiềm hoặc acid. Tuy

nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn

kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các phế thải rong chứa

cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào

từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Tính

khả thi của việc sử dụng phế thải rong như một nguồn năng lượng tái tạo cần được

nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu biện pháp thu hồi cellulose

từ phế thải rong nâu này để chuyển hóa thành ethanol sinh học.

58

Để thực hiện nghiên cứu này, đầu tiên phế thải rong được nghiền nhuyễn và

lọc qua rây có 20-80 mắt lưới và được sấy ở 40oC trước khi tiến hành tiền xử lý và

phân tích hàm lượng cellulose. Vật liệu thô sau khi nghiền xong nếu chưa sử dụng

ngay thì bảo quản trong tủ sấy với nhiệt độ phòng.

Phương pháp để xác định hàm lượng cellulose có trong phế thải rong sau quá

trình chế biến alginate của rong nâu như sau: Cân 1 g mẫu cho vào bình cầu cất.

Tiếp đó cho vào bình 100 ml H2SO4 1,5% đã đun sôi sẵn, lắp ống sinh hàn ngược

vào bình cầu đun trên bếp cách thủy sôi trong 30 phút lắc luôn để tránh mẫu bị

carbon hóa, lọc mẫu đã thủy phân acid (dùng máy li tâm, máy hút chân không hoặc

phễu lọc). Rửa phần không hòa tan nhiều lần bằng nước cất đun sôi cho đến khi

nước rửa không còn acid, thử bằng giấy đo pH. Chuyển toàn bộ bã không tan đã

thủy phân acid và rửa sạch vào bình cầu cất, tráng kĩ giấy lọc hoặc ông chứa bã

bằng nước cất đun sôi, lượng nước tráng tổng cộng là 100 ml. Thêm 100 ml dung

dịch NaOH 2-5% đã đun sôi vào bình, lắp ống sinh hàn, đun sôi và giữ trên bếp

cách thủy sôi 30 phút. Lọc lấy sơ bã không hòa tan, rửa sạch bằng nước sôi đến

trung tính thử bằng giấy đo pH. Để ráo nước rửa bằng cồn 96o hai lần, mỗi lần

khoảng 5 ml.

Chuyển toàn bộ xơ bã vào một chén nung đã sấy khô, cân bì. Sấy chén có xơ

bã trong tủ sấy ở 105oC trong 1 h để nguội sau đó cân lại. Sấy cho đến khi khối

lượng không đổi. Chuyển chén nung vào lò nung đến tro trắng, làm nguội trong

bình hút ẩm, cân đến khối lượng không đổi.

Hàm lượng cellulose thô được tính bằng % theo công thức

X = (m1 - m2).100

m

Trong đó:

m1: khối lượng chén nung và xơ bã sau sấy (g)

m2 : khối lượng chén nung và tro sau khi nung (g)

m : khối lượng cân mẫu (g)

Hàm lượng cellulose thô còn được tính theo khối lượng thành phần thô

như sau:

59

X = (m1 - m2).100

m.(100 - H)

Trong đó:

H : Độ ẩm của mẫu tính bằng %

Tiếp theo đó là quá trình tiền xử lý mẫu bằng acid loãng và thủy phân bằng

enzyme.

Thí nghiệm thủy phân cellulose có trong phế thải rong sau quá trình chế biến

alginate của rong nâu bằng cách kết hợp acid và enzyme Cellic HTech2 để làm tăng

hiệu quả thủy phân carbohydrate trong rong nâu được tiến hành như sau:

Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm để thủy phân ở các điều kiện:

Khối lượng mẫu: 5 ml

Nước cất bổ sung: 100 ml

Thời gian thủy phân 50 h

pH cho quá trình thủy phân 5,0

Nhiệt độ thủy phân 50oC

Bã phế thải đã được phơi khô, đem xay nhỏ. Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu cân

1 g bã phế thải đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100 ml nước cất. Bổ sung

acid sulfuric loãng sử dụng nồng đô acid sulfuric H2SO4 lần lượt là 0, 0,1, 0,2, 0,5

và 1%. Mẫu thủy phân bằng acid được đem đi trung hòa để loại hết acid còn lại

trong mẫu. Sau đó, điều chỉnh pH môi trường bằng 5,0 bằng cách sử dụng dung

dịch đệm CH3COOH/CH3COONa. Tiếp theo, bổ sung enzyme Cellic HTech2 để đạt

5%. Đem đi thủy phân ở nhiệt độ 50oC thời gian thủy phân thích hợp cho thủy

phân carbohydrate trong rong nâu là 50 h. Lấy mẫu ra đem đi vô hoạt enzyme bằng

cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút.

Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nồng độ enzyme

thủy phân kết hợp thích hợp nhất cho quá trình thủy phân

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

60

Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme

Sản phẩm sau thủy phân được cô bằng phương pháp cô quay và được tiệt

trùng ở 121oC trong 15 phút. Quá trình lên men được thực hiện trong bình thí

nghiệm ở pH 5,0 và 30oC gồm sản phẩm sau thủy phân đậm đặc bổ sung nấm men

5%. Các bình thí nghiệm được bịt kín bằng nắp cao su thông qua đó kim tiêm dưới

da đã được chèn vào nhằm loại bỏ lượng CO2 được tạo ra. Các bình được ủ trong 36

giờ và khuấy nhiều lần. Các mẫu được lấy ra sau khi lên men trong 0, 12, 24 và 36

giờ và đem đi phân tích hàm lượng ethanol và glucose dư.

2.2.8. Phương pháp xử lí số liệu

Xử lí nghiên cứu theo phương pháp thống kê, mỗi thí nghiệm làm 3 lần. Kết

quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm, xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft

Excel 2007, SPSS 1.60.

61

2.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU

2.3.1. Quy trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu và phế thải nông

nghiệp

2.3.1.1. Quy trình dự kiến thủy phân carbohydrate trong rong nâu

Hình 2.6. Sơ đồ quá trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu

Nguyên liệu rong nâu: Rong nâu sau khi thu hoạch vận chuyển về phòng thí

nghiệm, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản trong điều kiện tốt nhất để tránh

ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sau này. Chất lượng nguyên liệu ban đầu ảnh

hưởng lớn đến chất lượng sau này.

Xử lí và xay nhỏ

Xử lí nhằm mục đích loại những tạp chất khô không mong muốn trong

nguyên liệu. Dùng tay để phân loại, loại những loài rong tạp, cát, sạn, san hô và tạp

chất còn bám trên rong.

62

Cắt và xay nhỏ nhằm mục đích phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng

diện tích tiếp xúc giữa acid và cơ chất. Tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn

ra với hiệu suất cao nhất. Dùng kéo và máy xay khô để thực hiện.

Bổ sung nước

Nước là nhân tố không thể thiếu cho quá trình thủy phân. Nước tạo môi

trường thuận lợi để phản ứng thủy phân diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu suất cao

nhất. Nước dùng để thí nghiệm là nước cất một lần.

Thủy phân 1

Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của rong nâu thành các

oligosaccharide hòa tan. Thủy phân carbohydrate trong rong nâu bằng acid H2SO4

2% ở nhiệt độ 120oC, thời gian 120 phút.

Trung hòa

Trung hòa lượng acid còn dư trong mẫu sau thủy phân, tạo điều kiện thuận

lợi cho Cellic HTech2 hoạt động sau này.

Thủy phân 2

Thủy phân carbohydrate trong rong nâu bằng ezyme Cellic HTech2 với nồng

độ từ 4-6% so với nước, đem đi thủy phân ở nhiệt độ 45oC – 60oC, trong thời gian

từ 40 – 55 giờ, pH môi trường 4 – 6. Và khuấy đều trong quá trình thủy phân.

Bất hoạt enzyme

Mục đích là bất hoạt enzyme chế phẩm Cellic HTech2 bằng cách đun cách

thủy mẫu đã thủy phân ở 90oC trong vòng 10 phút.

Lọc và kiểm tra hàm lượng đường khử

Lọc bỏ cặn rong nâu đã thủy phân xong, tạo điều kiện thuận lợi cho việc

xác định các chỉ tiêu hóa học và các công đoạn tiếp theo. Lấy dịch thủy phân đem

đi kiểm tra hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.

63

2.3.1.2. Quy trình thủy phân carbohydrate trong phế thải nông nghiệp

Hình 2.7 Sơ đồ quá trình thuỷ phân carbohydrate trong phế thải nông nghiệp

Tiền xử lý

Để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong

lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử

đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy

nhiên, bản chất của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme,

nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt.

Cellulose ban đầu có thể bị phá hủy bởi acid mà không cần được tiền xử lý.

Tiền xử lý bao gồm các việc: rửa sạch nguyên liệu đồng thời băm, nghiền

nhỏ nguyên liệu nhằm phá vỡ cấu trúc màng tế bào thực vật, tạo điều kiện thuận lợi

để quá trình thủy phân diễn ra tốt hơn, tăng hiệu suất quá trình. Sau đó tiến hành

tách cellulose từ rơm rạ theo phương pháp Hypoclorit

Thủy phân

Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của phế thải nông nghiệp thành

các monosaccharide hòa tan. Thủy phân bằng 10 ml dịch enzyme của vi sinh vật ở

nhiệt độ từ 37-40oC, lắc 240 vòng/phút trong 72 h.

Bất hoạt enzyme

64

Mục đích là đình chỉ hoạt động của enzyme Cellic HTech2 bằng cách đun

cách thủy mẫu đã thủy phân ở 90oC trong 10 phút.

Li tâm và đo hàm lượng đường tạo thành

Tại các thời điểm khác nhau hút dịch lên men, li tâm thu dịch trong và đo hàm

lượng đường tạo thành bằng phương pháp DNS.

2.3.2. Quy trình dự kiến lên men dịch đường tạo ethanol sinh học

Hình 2.8 Quy trình dự kiến sản xuất ethanol

Thuyết minh quy trình lên men sản xuất ethanol sinh học từ dịch thủy phân

carbohydrate trong rong nâu và phế thải nông nghiệp.

Sau khi thủy phân carbohydat trong rong nâu và phế thải nông nghiệp ta thu

được dịch đường, dịch này đem đi làm mẫu cho các thí nghiệm nghiên cứu các

thông số tối ưu cho quá trình lên men ethanol tiếp theo.

Trung hòa dịch đường

Công đoạn này nhằm mục đích trung hòa lượng acid đem đi thủy phân, để

tạo môi trường thuận lợi cho nấm men hoạt động sau này.

65

Tiến hành cho vài giọt chỉ thị phenolphatalenin 1% trong cồn 90o, sau đó

dùng NaOH 20% và 1% chuẩn đến khi dịch đường đổi màu, dùng giấy đo pH để

kiểm tra pH dịch đường.

Lên men ethanol

Mục đích của công đoạn này là chuyển hóa các loại đường đơn có trong dịch

thủy phân rong nâu và phế thải nông nghiệp thành ethanol sinh học.

Tiến hành lên men với pH môi trường, tỷ lệ nấm men và thời gian lên men

thích hợp. Lên men ở nhiệt độ phòng.

Chưng cất

Sau khi quá trình lên men kết thúc, thu được dịch lên men với nồng độ

ethanol còn thấp. Để nâng cao nồng độ ethanol thu được tiến hành chưng cất phân

đoạn nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm ethanol tạo thành.

Bảo quản ethanol

Dịch ethanol thu được sau chưng cất được bảo quản trong các lọ thủy tinh

có nắp đậy kín, giữ trong khu vực thông gió tốt, tránh xa ánh sáng mặt trời, các

nguồn gây cháy và các nguồn nhiệt khác.

Kiểm tra hàm lượng đường còn lại bằng phương pháp acid

dinitrosalicylic (DNS)

Dịch sau khi chưng cất thu nhận ethanol xong được đem đi kiểm tra lại hàm

lượng đường khử còn lại sau lên men.

2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân

carbohydrate trong rong nâu

Xác định ảnh hưởng của các yếu tố: pH môi trường, nồng độ enzyme, nhiệt

độ, thời gian đến quá trình thủy phân theo sơ đồ như sau:

66

Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy

phân

2.3.3.1. Xác định nồng độ enzyme thủy phân thích hợp

Mục đích

Xác định được nồng độ enzyme Cellic HTech2 bổ sung vào dịch thủy phân

nâng cao hiệu quả thủy phân carbohydrate trong rong nâu đạt hiệu quả và tiết kiệm

kinh phí nhất.

67

Cách tiến hành

Chuẩn bị 8 mẫu thí nghiệm. Thủy phân ở các điều kiện:

Nước cất bổ sung: 100 ml

Nhiệt độ thủy phân: 500C

Thời gian thủy phân: 50 h

pH môi trường: 5,0

Rong nâu đã được phơi khô, đem xử lí và xay nhỏ, chuẩn bị 8 mẫu, mỗi

mẫu cân 1 g rong nâu đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100 ml nước cất.

Sau đó điều chỉnh pH của môi trường bằng 5 bằng cách cho vào 10 ml dung

dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pH bằng 5. Tiếp theo bổ sung enzyme

Cellic HTech2 theo tỷ lệ so với 100ml nước lần lượt là 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,

6% và 7%. Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ 50oC trong thời gian

50 h. Lấy mẫu ra đem đi bất hoạt enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước

đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm

lượng đường khử. Chọn nồng độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phân

carbohydrate trong rong nâu

2.3.3.2. Xác định pH môi trường thủy phân thích hợp

Mục đích

Xác định được pH môi trường thủy phân thích hợp nâng cao hiệu quả thủy

phân carbohydrate trong rong nâu và tiết kiệm kinh phí nhất.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm. Thủy phân ở các điều kiện:

Nước cất bổ sung: 100 ml

Nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 1)

Nhiệt độ thủy phân: 50oC

Thời gian thủy phân: 50 giờ

Rong nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ, chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu cân

1 g rong nâu đã xay cho vào bình định mức, thêm vào 100 ml nước cất. Sau đó

điều chỉnh pH của môi trường lần lượt bằng 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 và 6 , 0 bằng cách

cho vào 10 ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pH lần lượt là 4,0; 4,5;

5,0; 5,5; 6,0. Tiếp theo bổ sung enzyme Cellic HTech2 với nồng độ thích hợp cho

68

quá trình thủy phân carbohydrate (KQTN 1). Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy

phân ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 50 giờ. Lấy mẫu ra đem đi bất hoạt enzyme

bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10

phút. Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn pH môi

trường thích hợp nhất cho quá trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu

2.3.3.3. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp

Mục đích

Xác định được nhiệt độ thủy phân dịch nâng cao hiệu suất thủy phân

carbohydrate trong rong nâu và tiết kiệm kinh phí nhất.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm. Thủy phân ở các điều kiện:

Nước cất bổ sung: 100 ml

Nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 1)

pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 2)

Thời gian thủy phân: 50 giờ

Rong nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ. Chuẩn bị 4 mẫu, mỗi mẫu cân

1 g rong nâu đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100 ml nước cất. Sau đó

điều chỉnh pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN 2) bằng cách

cho vào 10 ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa. Tiếp theo bổ sung

enzyme Cellic HTech2 với nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN

1). Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ lần lượt là 45oC, 50oC, 55oC,

60oC trong thời gian 50 h. Lấy mẫu ra đem đi bất hoạt enzyme bằng cách cho mẫu

thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Rồi lọc, đem

dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp

nhất cho quá trình thủy phân.

2.3.3.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp

Mục đích

Xác định được thời gian thủy phân thích hợp nâng cao hiệu suất thủy

phân carbohydrate rong nâu và tiết kiệm kinh phí nhất.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm. Thủy phân ở các điều kiện:

69

Nước cất bổ sung: 100 ml

Nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 1)

pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 2)

Nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN3)

Rong nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ. Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu cân

1 g rong nâu đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100 ml nước cất. Sau đó

điều chỉnh pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN2) bằng cách

cho vào 10 ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa. Tiếp theo bổ sung enzyme

Cellic HTech2 với nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN 1). Sau đó

đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ thích hợp (KQTN 3) trong thời gian lần

lượt là 40, 45, 50 và 55 h. Lấy mẫu ra đem đi bất hoạt enzyme bằng cách cho mẫu

thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Rồi lọc, đem

dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp

nhất cho quá trình thủy phân.

2.3.3.5. Thủy phân carbohydrate trong rong nâu bằng cách kết hợp thủy phân

rong nâu bằng acid và enzyme Cellic HTech2

Mục đích

Làm tăng hiệu quả thủy phân carbohydrate trong rong nâu

Cách tiến hành

Chuẩn bị 8 mẫu thí nghiệm. Thủy phân ở các điều kiện:

Khối lượng mẫu: 5 ml

Nước cất bổ sung: 100 ml

Thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN1)

pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 2)

Nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN3)

Rong nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ. Chuẩn bị 8 mẫu, mỗi mẫu cân 1 g

rong nâu đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100 ml nước cất. Bổ sung 2 ml

acid H2SO4, đem đi thủy phân ở 120oC, trong 120 h. Mẫu thủy phân bằng acid được

đem đi trung hòa để loại hết acid còn lại trong mẫu. Sau đó, điều chỉnh pH môi

trường về pH thích hợp cho quá trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu (KQTN

2) bằng cách sử dụng dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa. Tiếp theo, bổ sung

70

enzyme theo tỷ lệ lần lượt là 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% và 6%. Đem đi thủy

phân ở nhiệt độ thủy phân thích hợp (KQTN 3), thời gian thủy phân thích hợp cho

thủy phân carbohydrate trong rong nâu (KQTN 4). Lấy mẫu ra đem đi bất hoạt

enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi

trong 10 phút. Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nồng độ

enzyme thủy phân kết hợp thích hợp nhất cho quá trình thủy phân.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên

men tạo ethanol

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo ethanol như: tỷ lệ

nấm men, pH môi trường và thời gian lên men theo sơ đồ sau:

71

Hình 2.11. Sơ đồ xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo

ethanol.

2.3.4.1. Xác định tỷ lệ nấm men sử dụng

Mục đích

Xác định được tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae V 7028 bổ sung vào

dịch thủy phân để quá trình lên men diễn ra đạt hiệu quả và tiết kiệm chi phí.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm. Lên men ở cùng điều kiện

Khối lượng mẫu: 1 g

pH môi trường: 5

Nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng

72

Thời gian lên men: 3 ngày

Cân 1 g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác

250 ml. Sau đó cho thêm 100 ml nước cất, 6 ml dung dịch acid H2SO4 đậm đặc.

Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân trong nồi thanh trùng ở nhiệt độ 120oC,

trong thời gian 120 phút, sau đó trung hòa, điều chỉnh pH = 5,0, bổ sung 5 ml

enzyme Cellic HTech2, đem thủy phân ở nhiệt độ 50oC/50 h. Tiếp đó lọc loại bã và

trung hòa lượng acid trong dịch bằng dung dịch NaOH 20% với chỉ thị là dung

dịch phenolphtalein 1%. Rồi điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm

CH3COOH/CH3COONa có pH = 5. Tiếp theo, bổ sung nấm men với tỷ lệ tương

ứng là 1%, 2%, 3%, 4%, 5% và 6%. Đem mẫu lên men ở nhiệt độ phòng với

thời gian lên men là 5 ngày. Chú ý phải khuấy đảo dịch lên men trong 24 h đầu.

Sau đó đem mẫu đi chưng cất ethanol bằng thiết bị cô quay chân không với số vòng

quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 50oC, áp suất <100 mbar. Tiến hành xác định thể tích

dịch thu hồi, xác định hàm lượng đường khử còn còn lại. Sau khi có kết quả đánh

giá, lựa chọn mẫu cho hàm lượng đường còn lại thấp nhất.

2.3.4.2. Xác định pH môi trường lên men thích hợp

Mục đích

Điều chỉnh pH môi trường nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển

tăng sinh khối của nấm men, để quá trình lên men đạt hiệu quả tốt nhất.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm. Lên men ở cùng điều kiện:

Khối lượng mẫu: 1 g

Tỷ lệ nấm men (kết quả thí nghiệm 6)

Nhiệt độ lên men nhiệt độ phòng

Thời gian lên men 3 ngày

Cân 1 g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác

250 ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất, 2 ml dung dịch acid H2SO4 đậm đặc. Tiến

hành bọc kín bình, đem thủy phân trong nồi thanh trùng ở nhiệt độ 120oC,

trong thời gian 120 phút, sau đó trung hòa, điều chỉnh pH = 5,0, bổ sung 5 ml

enzyme Cellic HTech2, đem thủy phân ở nhiệt độ 50oC/ 50 h. Tiếp đó lọc loại bã và

trung hòa lượng acid trong dịch bằng dung dịch NaOH 20% với chỉ thị là dung

73

dịch phenolphtalein 1%. Rồi điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm

CH3COOH/CH3COONa có pH tương ứng là 4; 4,5; 5,0 và 5,5. Tiếp theo, bổ

sung nấm men với tỷ lệ tương ứng kết quả thí nghiệm 1. Đem mẫu lên men ở

nhiệt độ phòng với thời gian lên men là 5 ngày. Chú ý phải khuấy đảo dịch lên

men trong 24 h đầu. Sau đó đem mẫu đi chưng cất ethanol bằng thiết bị cô quay

chân không với số vòng quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 50oC, áp suất <100 mbar và

thời gian cô quay là 60 phút. Tiến hành xác định thể tích dịch thu hồi, xác định

hàm lượng đường khử còn còn lại. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn mẫu cho

hàm lượng đường cong lại thấp nhất.

2.3.4.3. Xác định thời gian lên men thích hợp

Mục đích

Việc bố trí thời gian thích hợp nhằm để tận thu được lượng sinh khối nấm

men cao nhất, đồng thời cũng nhằm tiết kiệm thời gian và chi phí lên men.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm. Lên men ở cùng điều kiện:

Tỷ lệ nấm men thích hợp cho lên men ethanol (KQTN 6).

Nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng.

pH môi trường thích hợp cho lên men ethanol (KQTN 7).

Cân 1 g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác

250 ml. Sau đó cho thêm 100 ml nước cất, 2 ml dung dịch acid H2SO4 đậm đặc.

Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân trong nồi thanh trùng ở nhiệt độ 120oC,

trong thời gian 120 phút, sau đó trung hòa, điều chỉnh pH = 5,0, bổ sung 10 ml

enzyme Cellic HTech2, đem thủy phân ở nhiệt độ 50oC/ 50 h. Tiếp đó lọc loại bã và

trung hòa lượng acid trong dịch bằng dung dịch NaOH 20% với chỉ thị là dung

dịch phenolphtalein 1%. Rồi điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm

CH3COOH/CH3COONa có pH thích hợp xác định ở thí nghiệm 2. Tiếp theo, bổ

sung nấm men với tỷ lệ tương ứng kết quả thí nghiệm 1. Đem mẫu lên men ở nhiệt

độ phòng với thời gian lên men tương ứng là 2; 3; 4; 5; 6 ngày. Chú ý phải

khuấy đảo dịch lên men trong 24 h đầu. Sau đó đem mẫu đi chưng cất ethanol

bằng thiết bị cô quay chân không với số vòng quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 50oC,

áp suất <100 mbar và thời gian cô quay là 60 phút. Tiến hành xác định thể tích dịch

74

thu hồi, xác định hàm lượng đường khử còn lại. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa

chọn mẫu cho hàm lượng đường còn lại thấp nhất.

75

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu và chuẩn bị nguyên vật liệu sản xuất nhiên liệu sinh học

3.1.1. Xác định hàm lượng carbohydrate trong rong nâu thu tại Nha Trang và

Hải Phòng

- Hàm lượng carbohydrate trong rong biển được xác định bằng phương pháp:

Carbohydrate % = 100% - (hàm lượng tro + protein thô + chất béo thô)

Sử dụng các phương pháp phân tích và tính toán kết quả, thí nghiệm được

lặp lại 3 lần thu được kết quả hàm lượng carbohydrate trong 4 loài rong nghiên cứu

(% rong khô tuyệt đối) như bảng 3.1

Bảng 3.1. Kết quả xác định thành phần sinh hóa của 4 loài rong nâu

Tên rong Thành phần Hàm lượng

(%)

Sargassum henslowianum

Protein thô 7,66 ± 0,13%

Lipid 3,14 ± 0,11%

Tro 40,97 ± 0,62%

Carbohydrate 48,23 ± 0,49%

Sargassum swartzii

Protein thô 7,27 ± 0,15%

Lipid 1,93 ± 0,04%

Tro 37,94 ± 0,69%

Carbohydrate 52,86 ± 0,62%

Sargassum binderi

Protein thô 7,75 ± 0,11%

Lipid 2,96 ± 0,05%

Tro 39,46 ± 0,55%

Carbohydrate 49,83 ± 0,57%

Sargassum oligocystum

Protein 7,93 ± 0,15%

Lipid 3,57 ± 0,11%

Tro 39,59 ± 0,68%

Carbohydrate 48,91 ± 0,45%

76

Kết quả phân tích hàm lượng carbohydrate trong 4 loài rong nâu thu thập tại

biển Hải Phòng và biển Nha Trang được thể hiện trên hình 3.1

Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng carbohydrate trong 4 loài rong nâu thu

tại Hải Phòng và Nha Trang

Kết quả ở trên cho thấy:

Mỗi loài rong nâu khác nhau có hàm lượng carbohydate khác nhau.

Hàm lượng carbohydrate trong 4 loài rong nâu khá cao, cụ thể: Sargassum

henslowianum 48,23%, Sargassum swartzii 52,86%, Sargassum binderi 49,83% và

Sargassum oligocystum 48,91% . Vì vậy, rong nâu có thể xem là một nguồn nguyên

liệu sản xuất ethanol sinh học trong tương lai. Từ kết quả trên ta thấy, sử dụng

Sargassum swartzii làm nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học là tốt nhất.

3.1.2 Xác định hàm lượng cellulose tách từ rơm rạ

Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp (rơm, rạ lúa) chứa chủ yếu là

các polysaccharide như cellulose và hemicellulose và số ít các hợp phần khác tách

cellulose khỏi các thành phần hỗn hợp của nguyên liệu cũng là khâu làm sạch

cellulose. Khâu này đóng vai trò hết sức quan trọng.

Glucose và các đường đơn khác sau khi được tạo thành ở giai đoạn thủy

phân, sẽ được chuyển hóa thành ethanol. Để giai đoạn lên men có hiệu quả, cần tách

và chỉ sử dụng cellulose từ nguyên liệu. Điều này được giải thích bởi 2 nguyên nhân

chính sau:

77

Thứ nhất: Chỉ sử dụng cellulose của nguyên liệu để loại bỏ xylose trong

dịch thủy phân chỉ cần thu glucose. Trong cellulose tinh thể lượng glucose có thể

đạt đến 90%, các đường như xylose, arabinose còn lại không đáng kể và rất ít

rhamnose. Như vậy, chỉ sử dụng cellulose sẽ thu được hầu như chỉ có glucose. Điều

này sẽ thuận tiện cho giai đoạn lên men ethanol từ glucose.

Thứ hai: Nguyên nhân thứ hai cần tách và chỉ sử dụng cellulose từ nguyên

liệu cũng không kém phần quan trọng so với nguyên nhân đầu. Tách và chỉ sử dụng

cellulose từ các thành phần hỗn hợp của nguyên liệu, coi như làm sạch cellulose,

loại bỏ các tạp chất mà các tạp chất này là những chất ức chế rất mạnh hệ enzyme

cellulase trong thủy phân cellulose, đó là hemicellulose, lignin, silic cũng như các

dư lượng các chất còn lại khác trong nguyên liệu.

Tách riêng cellulose từ nguyên liệu được thực hiện theo phương pháp nêu

trong Chương 2 và thu được mẫu cellulose (hình 3.2), cellulose tách từ rơm rạ

(phương pháp Hypoclorit), từ 10 g rơm khô thu được 3,9 g cellulose.

Hình 3.2 Ảnh cellulose tách được từ rơm, rạ (trái) và phổ IR của cellulose thu

được (phải)

Từ phổ IR của cellulose ta thấy các nhóm píc đặc trưng cho các nhóm chức

trong phân tử. Các píc nằm trong vùng 3365 – 3228 cm1 đặc trưng cho dao động

hóa trị của các nhóm OH tự do trong cellulose. Các píc dao động hóa trị nằm gần

1124-1105 cm1 đặc trưng cho các liên kết C–O-C (ether). Ngoài ra trong píc trong

phổ còn chỉ ra các bước sóng hấp thụ đặc trưng cho các liên kết C-H alkyl ở 2955-

2880 cm-1.

78

3.1.3. Nghiên cứu thu nhận xúc tác sinh học cho sản xuất bioethanol

3.1.3.1. Nghiên cứu lựa chọn các chủng vi sinh vật thủy phân rơm rạ thành

saccharide hòa tan

Kết quả lựa chọn các chủng Xạ khuẩn

Kết quả sơ tuyển được 8 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, ký

hiệu là XK 2P, XK 7P, XK1, XK6... trong đó có các chủng có hoạt tính mạnh như

XK 2P, XK 7P.

Kết quả sơ tuyển được 12 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, ký

hiệu là C32, C36, VK 424, VK Hud 4-1... trong đó có các chủng có hoạt tính C23,

C36, VK Hud 4-1.

Xạ khuẩn XK 2P và XK 7P

Vi khuẩn C32 và C36

Vi khuẩn VK Hud 4- 1

79

Chủng Aspergillus terreus.

Hình 3.3. Ảnh của một số chủng vi sinh vật và vòng phân giải của chúng

3.1.3.2. Nghiên cứu lựa chọn các chủng vi sinh vật lên men

Đã khảo sát quá trình lên men ethanol của 6 chủng nấm men, trong đó có 3

chủng do phía Nga cung cấp và 3 chủng của Việt Nam để so sánh.

Kết quả cho thấy, chủng (Saccharomyces cerevisiae V7028) thích hợp hơn

cả với các điều kiện nóng và ẩm của Việt Nam cho thông số động học lên men quan

trọng nhất là nồng độ ethanol cực đại đạt giá trị cao (87,1 g/L) và hiệu suất tế bào

theo ATP (YATP) đạt 2,84 x 108 (mol/g)

Hình 3.4 Chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 do phía Nga chuyển giao.

Như vậy, có thể kết luận rằng, trong các chủng phía Nga chuyển giao, chủng

Saccharomyces cerevisiae V7028 thích hợp hơn cả.

3.1.3.3. Nghiên cứu tạo chất xúc tác sinh học ở dạng tế bào cố định

Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kĩ thuật bao bọc hoặc định vị

các tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các

hoạt tính xúc tác mong muốn”.

Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các

tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có

trong tự nhiên. Nhiều vi sinh vật tự nó có khả năng gắn lên trên những bề mặt khác

nhau trong tự nhiên.

a) Tạo tế bào vi sinh vật cố định cho chuyển hóa cellulose thành glucose

80

Nghiên cứu cố định các vi sinh vật tạo chất xúc tác có hoạt lực cao phục vụ

thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan

Sau khi nuôi cấy vi sinh đạt nồng độ sinh khối đạt 16 g/lít, tiến hành tạo huyền

phù sinh khối trong dung dịch PVA 15% (15 g PVA trong 100 ml H2O) với tỷ lệ 1/9

theo trọng lượng sinh khối / PVA.

- Huyền phù này được tạo hình trong khuôn hình trụ (Ф ~ 7 mm, h ~ 7 mm; V

~ 250 mm2, M ~300 mg).

Các hạt xúc tác hình trụ thu được màu trắng ngà có độ đàn hồi như cao su tự

nhiên, với các thông số sau: thể tích hạt V ≈ 250 mm3; khối lượng hạt M ≈ 300 mg;

hàm lượng protein ~ 0,25 mg/hạt.

Enzyme cellulase cố định trên PVA Enzyme cellulase thủy phân cellulose

Hình 3.5. Ảnh các hạt xúc tác tạo thành từ các chủng vi sinh vật được cố định

trên PVA (trái) và hình ảnh sử dụng các tế bào cố định này để thủy phân

cellulose thành glucose (phải)

Các tế bào cố định này được sử dụng để thủy phân cellulose từ rơm rạ thành

glucose, tạo cơ chất cho quá trình lên men ethanol.

b) Tạo tế bào nấm men cố định cho lên men ethanol

Sau khi nuôi cấy tế bào nấm men đạt nồng độ sinh khối đạt 16 g/lít, tiến hành

tạo huyền phù sinh khối trong dung dịch PVA 15% (15 g PVA trong 100 ml H2O)

với tỷ lệ 1/9 theo trọng lượng sinh khối / PVA. Huyền phù này được tạo hình trong

khuôn hình trụ (Ф ~ 7 mm, h ~ 7 mm; V ~ 250 mm2, M ~300 mg).

Các hạt xúc tác hình trụ thu được màu trắng ngà có độ đàn hồi như cao su tự

nhiên, với các thông số sau: thể tích hạt V ≈ 250 mm3; khối lượng hat M ≈ 300 mg;

hàm lượng protein ~ 0,25 mg/hạt.

81

Hình 3.6. Tế bào nấm men cố định trên PVA (trái) và tế bào nấm men cố định

trên PVA tham gia vào lên men ethanol (bên phải)

Các kết quả của quá trình cố định tế bào vi sinh vật chuyển hóa cellulose

thành glucose của chủng nấm A. terreus,vi khuẩn C32, xạ khuẩn 7P, vi khuẩn Hud

4-1, vi khuẩn C36 được trình bày rõ trong phần Phụ lục 3.2.

3.2. Nghiên cứu quá trình thủy phân carbohydrate từ các nguồn nguyên liệu

thành saccharide hòa tan

3.2.1. Thủy phân carbohydrate trong rong nâu

3.2.1.1. Thủy phân carbohydrate trong rong nâu bởi chế phẩm enzyme Cellic

HTech2 thành saccharide hòa tan

a) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme lên quá trình thủy phân

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân được xác định

thông qua hàm lượng đường khử tạo thành. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả

được thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân rong nâu bởi các lượng enzyme Cellic HTech2 khác nhau

Nồng độ enzyme (%) Hàm lượng đường khử

(mg/g)

0 14,5 ± 0,07

1 20,4 ± 0,11

2 30,3 ± 0,19

82

3 38,1 ± 0,23

4 148,2 ± 0,25

5 204,9 ± 0,28

6 197,4 ± 0,39

7 187,2 ± 0,37

Từ kết quả trong bảng trên, xây dựng đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng

độ enzyme tới hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân 1g cơ

chất.

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi các lượng enzyme Cellic HTech2 khác nhau

Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy:

Khi nồng độ enzyme càng tăng hiệu quả thủy phân càng cao có nghĩa là

lượng đường khử tạo thành càng nhiều và đạt cực đại tại nồng độ enzyme 5%

(204,9 mg/g). Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme lên 6% và 7% thì lượng đường khử

tạo thành không tăng nữa. Hàm lượng đường khử tăng rất chậm từ nồng độ 0% -

3%. Hàm lượng đường khử tạo thành tăng mạnh từ nồng độ enzyme 3% - 5%, cụ

thể hàm lượng đường khử tạo thành ở 5% là 204,9 mg/g trong khi đó lượng đương

khử ở 3% chỉ là 38,1 mg/g và ở 4% là 148,2 mg/g.

83

Điều đó có thể được giải thích như sau:

Enzyme Cellic HTech2 xúc tác cho các phản ứng thủy phân carbohydrate trong

rong nâu làm các liên kết trong các hợp phần cao phân tử như cellulose, laminaran,

mannitol... bị phân cắt, sau đó sản phẩm thủy phân được tách ra khỏi cơ chất và khuếch

tán vào trong dung dịch, dẫn đến tăng độ hòa tan của các phân tử trong nước.

Khi nồng độ enzyme thấp 0 – 3%, lượng cơ chất lớn, vận tốc thủy phân

phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ

phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn V = Vmax thì nếu tiếp tục tăng

nồng độ enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân bởi enzyme tăng không đáng kể, thậm

chí không tăng.

Khi nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động

tự do và sự cung cấp hạn chế cơ chất sẽ xác định tốc độ phản ứng. Ngược lại,

nồng độ cơ chất cao, hầu hết các trung tâm hoạt động bị chiếm lĩnh do đó lúc này

số lượng phân tử enzyme lại là yếu tố quyết định phản ứng.

Phản ứng thủy phân rong nâu hiệu quả cao, triệt để và tốn ít chi phí khi

nồng độ cơ chất có trong rong nâu và nồng độ enzyme Cellic HTech2 bổ sung bên

ngoài vào phải tương ứng với nhau.

Từ các kết quả thu được cho thấy thủy phân carbohydrate trong rong nâu

bằng enzyme Cellic HTech2 đạt hiệu cao ở nồng độ enzyme 5%.

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên quá trình thủy phân

Ảnh hưởng của pH môi trường được xác định thông qua hàm lượng đường

khử tạo thành trong quá trình thủy phân. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thu

được, được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các giá trị pH khác nhau

pH thủy phân Hàm lượng đường khử

(mg/g)

4 98,7 ± 0,37

4,5 139,5 ± 0,29

84

5 176,4 ± 0,23

5,5 158,7 ± 0,31

6 135,6 ± 0,24

Từ kết quả thu được xây dựng biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của pH lên hàm

lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân như hình 3.8

Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các giá trị pH khác nhau.

Kết quả thể hiện ở hình 3.8 cho thấy:

pH môi trường khác nhau cho hiệu quả thủy phân rong nâu khác nhau

Ở pH = 4,5, 6,0 không có sự khác nhau đáng kể nghĩa là ở mức pH này

enzyme Cellic HTech2 hoạt động như nhau và hiệu quả thủy phân rong nâu (tạo

đường khử) không đạt hiệu quả cao, hàm lượng đường khử tạo thành từ 135,6 –

139,5 mg/g.

pH môi trường thủy phân dịch rong nâu là 5,5 hiệu quả thủy phân tốt hơn ở

3 mức pH = 4,0, 4,5, 6,0, hàm lượng đường khử tạo thành là 158,7 mg/g.

Nhưng hàm lượng đường khử tạo ra đạt cực đại ở pH = 5,0 tới 176,4 mg/g.

Kết quả trên có thể được giải thích như sau:

pH môi trường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt

động của enzyme trong quá trình thủy phân, mỗi enzyme có một khoảng hoạt động

85

tối ưu riêng. Ở enzyme Cellic HTech2 đề tài sử dụng có khoảng pH hoạt động từ

5-5,5 nhưng tùy vào mỗi điều kiện môi trường hoạt động khác nhau mà giá trị pH

của enzyme trong điều kiện đó có sự thay đổi để enzyme hoạt động tốt nhất.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy thủy phân carbohydrate trong rong

nâu bằng enzyme Cellic HTech2 đạt hiệu cao ở pH = 5,0.

c) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân được xác định thông qua

hàm lượng đường khử tạo thành. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thu được,

được thể hiện trong bảng 3.4 từ đó xác định được nhiệt độ thích hợp để thủy phân.

Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ (oC) Hàm lượng đường khử (mg/g)

45 167,7 ± 0,39

50 202,5 ± 0,33

55 196,2 ± 0,34

60 184,8 ± 0,26

Từ kết quả thu được như bảng 3.4 xây đựng biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng

của nhiệt độ đến hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân.

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy

phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các nhiệt độ khác nhau.

86

Kết quả thể hiện ở hình 3.9 cho thấy:

Ở các nhiệt độ khác nhau có hiệu quả thủy phân tạo đường khử khác nhau.

Nhiệt độ càng tăng hiệu quả thủy phân càng cao và đạt cực đại ở 50oC

(202,5 mg/g), nếu tiếp tục tăng nhiệt độ đến 55oC (196,2 mg/g) và 60oC (184,8

mg/g) thì hiệu quả thủy phân có xu hướng giảm với tốc độ không đáng kể. Từ kết

quả trên có thể kết luận ở nhiệt độ 50oC hiệu quả thủy phân là cao nhất.

Những kết quả trên có thể được giải thích như sau: Bản chất của enzyme là

protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thường có thể ảnh hưởng tới hoạt tính

của enzyme, enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ thích

hợp nhất định. Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp

nằm trong khoảng từ 40 – 50oC, ở nhiệt độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị mất

hoạt tính. Do vậy, nhiệt độ 70oC gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme.

Trong phạm vi lý học, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của

nhiệt độ. Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme

xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme. Kết quả này

phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản

ứng enzyme đạt cực đại. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau. Sự khác

nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện từng

sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme.

Ngoài ra, rong nâu phơi khô nên hàm lượng chất khô sẽ tăng, khi cắt và xay

nhỏ, một phần cấu trúc tế bào của rong bị phá vỡ. Đây là điều kiện để enzyme

tiếp xúc với cơ chất dễ dàng, đồng thời nhiệt độ cao các tế bào rong nâu dãn nở

tối đa nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy thủy phân carbohydrate trong rong

nâu bằng enzyme Cellic HTech2 đạt hiệu cao nhiệt độ 50oC.

d) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân

Ảnh hưởng của thời gian được xác định thông qua hàm lượng đường khử tạo

thành trong quá trình thủy phân. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thu được,

được biểu diễn qua bảng 3.5 và hình 3.10

87

Bảng 3.5 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành tại các thời điểm khác

nhau trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2

Thời gian thủy phân (h) Hàm lượng đường khử (mg/g)

40 141,9 ± 0,28

45 172,5 ± 0,32

50 209,1 ± 0,27

55 183,6 ± 0,25

Từ kết quả trên xây dựng biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến

quá trình tạo thành đường khử.

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân rong nâu bằng enzyme Cellic HTech2

Kết quả thể hiện ở hình 3.10 cho thấy:

Thời gian thủy phân cũng là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu

quả thủy phân.

Thời gian càng dài thì hiệu quả thủy phân tăng và đạt cực đại ở 50 giờ,

nhưng nếu tiếp tục kéo dài thời gian đến 55 giờ hiệu quả thủy phân lại không

tăng, ngược lại hàm lượng đường còn giảm đi và sau 50 giờ tạo ra 209,1 mg/g

đường khử nhưng kéo dài đến 55 giờ lượng đường khử giảm còn 183,6 mg/g.

Vậy thời gian thủy phân rong nâu trong 50 giờ cho hiệu quả thủy phân cao nhất tức

lượng đường khử tạo thành là lớn nhất.

88

Từ những kết quả thu được cho thấy rằng: Thời gian thủy phân kéo dài hay

rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình xúc tác bởi enzyme tác động

và chất lượng sản phẩm thủy phân thu được. Thời gian kéo dài thì enzyme có

điều kiện để cắt mạch triệt để, tăng thời gian tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất,

dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân

quá mức thì các vi sinh vật lạ phát triển, hoạt động sinh ra nhiều sản phẩm thứ

cấp, đồng thời khi thời gian kéo dài hiệu quả kinh tế giảm.

Thời gian thủy phân rút ngắn, sự phân cắt cellulose trong rong nâu chưa

triệt để. Hiệu suất thủy phân kém và gây lãng phí nguyên liệu và khó khăn cho

công đoạn tinh chế sau này.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy thủy phân carbohydrate trong rong

nâu bằng enzyme Cellic HTech2 đạt hiệu cao khi thủy phân trong 50 giờ.

Nhận xét chung: Để thu được các loại đường đơn, đường phân tử thấp trong

quá trình thủy phân rong nâu Sargassum swartzii sau đó lên men tạo thành ethanol

có nhiều yếu tố ảnh hưởng. Trong đó các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

rong nâu Sargassum swartzii đã được nghiên cứu là:

- Nồng độ enzyme Cellic HTech2 bổ sung là 5% thích hợp cho quá trình thủy

phân, tại nồng độ đó lượng đường khử tạo thành là cao nhất (204,9 mg/g).

- pH môi trường thủy phân dịch rong nâu là pH = 5,0 hàm lượng đường

khử tạo thành là 176,4 mg/g.

- Nhiệt độ thủy phân thích hợp là 50oC hàm lượng đường khử tạo thành

202,5 mg/g.

- Thời gian thủy phân thích hợp là 50 giờ, hàm lượng đường khử tạo thành

209,1 mg/g.

3.2.1.2. Xác định nồng độ Cellic HTech2 thủy phân carbohydrate trong rong nâu

khi kết hợp sử dụng acid và enzyme

Qua khảo sát thí nghiệm cho thấy, acid H2SO4 có khả năng thủy phân

carbohydrate trong rong nâu ở điều kiện thích hợp là:

Nồng độ acid H2SO4: 2%

Nhiệt độ thủy phân: 120oC

Thời gian thủy phân: 120 phút

89

Vì vậy, tiến hành cố định các thông số trên để thủy phân carbohydrate

trong rong nâu bằng acid H2SO4 trước. Sau đó trung hòa lượng acid còn lại trong

mẫu thủy phân, bổ sung enzyme Cellic HTech2 với nồng độ lần lượt là 0,1%, 0,5%,

1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% và 7%. Tiếp tục đem đi thủy phân carbohydrate còn lại

trong rong nâu ở những điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân

carbohydrate bằng Cellic HTech2 đã nghiên cứu ở trên là:

Nhiệt độ thủy phân: 50oC

Thời gian thủy phân: 50 giờ

pH môi trường thủy phân: 5,0

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thu được, được biểu diễn trong bảng

3.6 và hình 3.11

Bảng 3.6 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rong

nâu đã qua xử lí acid kết hợp với enzyme Cellic HTech2

Nồng độ enzyme Cellic HTech2 (%) Hàm lượng đường khử tạo thành

(mg/g)

0,1 110,82 ± 0,26

0,5 130,77 ± 0,18

1 148,89 ± 0,28

2 165,48 ± 0,35

3 177,96 ± 0,29

4 196,41 ± 0,36

5 251,37 ± 0,35

6 241,62 ± 0,26

7 235,38 ± 0,30

Từ kết quả thu được như bảng trên, xây dựng biểu đồ biển diễn sự ảnh hưởng

của nồng độ enzyme Cellic HTech2.

90

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rong

nâu đã qua xử lí acid kết hợp với enzyme Cellic HTech2

Kết quả thể hiện ở hình 3.11 cho thấy:

Khi thủy phân có sử dụng kết hợp với acid và enzyme, hiệu quả thủy phân

carbohydrate trong rong nâu cao hơn so với chỉ thủy phân bằng enzyme Cellic HTech2.

Nồng độ enzyme Cellic HTech2 càng tăng, hiệu quả thủy phân càng cao,

nhưng tăng đến nồng độ bằng 6% thì hiệu quả thủy phân không tăng nữa mà

lại giảm dần.

Ở các nồng độ 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% hiệu quả thủy phân tăng lên

không đáng kể. Từ nồng độ 5% - 7% hiệu quả thủy phân tăng lên nhanh và đạt cực

đại ở nồng độ 5%. Để tiết kiệm chi phí sản xuất, nồng độ enzyme Cellic HTech2

bổ sung vào thủy phân kết hợp 5% cho hiệu quả thủy phân là tối ưu nhất.

Các kết quả thu được trên có thể được giải thích như sau: Ban đầu khi thủy

phân carbohydrate bằng acid trước, dưới tác dụng của chất xúc tác là acid và nhiệt

độ cao các liên kết trong cơ chất bị phân cắt, sản phẩm thủy phân được tách ra

khỏi cơ chất và khuếch tán vào trong dung dịch. Đồng thời, rong nâu sau khi làm

khô được xay nhỏ đã bị phá vỡ một phần cấu trúc tế bào nên acid dễ dàng ngấm

sâu và tăng cường tiếp xúc với cơ chất. Ngoài ra dưới tác động của nhiệt độ cao

và xúc tác acid, mannitol trong tế bào khuếch tán ra ngoài. Tiếp tục thủy phân

bằng enzyme, enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân phá hủy tế bào cắt các liên

91

kết trong cellulose, laminaran, fuccodin… còn lại trong mẫu rong nâu tạo ra các sản

phẩm đường có phân tử thấp như cellobiose và cuối cùng là glucose.

- Khi nồng độ enzyme thấp từ 0,1-4%, lượng cơ chất lớn, vận tốc thủy phân

phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ enzyme tăng lên 5%, tốc độ

phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn V = Vmax thì nếu tiếp tục tăng

nồng độ enzyme đến 6% và 7%, tốc độ phản ứng thủy phân bởi enzyme giảm dần.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy thủy phân carbohydrate trong rong

nâu bằng phương pháp sử dụng kết hợp acid và enzyme Cellic HTech2 đạt hiệu suất

cao ở nồng độ enzyme Cellic HTech2 5%.

Từ những nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ của acid loãng,

enzyme, pH môi trường, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân. Chúng tôi đã

tìm ra được điều kiện tối ưu để tạo ra hàm lượng đường khử cao nhất trong quá

trình thủy phân từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất ethanol. Kết quả thu được là từ 1g

rong nâu thủy phân trong điều kiện tối ưu thu được 253,7 mg/g đường khử, hiệu

suất thủy phân đạt 48%.

3.2.2. Nghiên cứu thủy phân cellulose tách chiết từ rơm rạ

3.2.2.1. Thuỷ phân cellulose từ rơm rạ bởi dịch enzyme của các chủng vi sinh

khác nhau

Lấy 100ml dịch môi trường cho vào bình tam giác 250 ml, cho thêm vào đó

2 g cellulose. Tiến hành khử trùng tại áp suất 1 atm trong 30 phút. Sau khi khử

trùng, cho thêm 10 ml dịch enzyme (dịch giống) và đem lắc với tốc độ 240

vòng/phút tại nhiệt độ phòng. Tại các thời điểm khác nhau hút ra một lượng dịch lên

men nhất định cho ly tâm lấy dịch trong để đo hàm lượng glucose được tạo ra.

92

Hình 3.12 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose bằng dịch enzyme của các chủng

vi sinh vật

Trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme các chủng vi sinh, lượng

đường khử glucose dần được hình thành. Lượng đường khử glucose này được xác

định theo thời gian, các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả phân tích thủy phân

cellulose bởi các chủng vi sinh được ghi vào các bảng 3.7-3.11

Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác

nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng vi khuẩn C32

Thời gian, ngày 0 1 2 3 4 5 6

Cellulose (g/l) 20 18 12 7 4,9 4 3,5

Glucose (g/l) 0

1.5 ±

0,03

3 ±

0,05

5,3 ±

0,07

7 ±

0,09

8 ±

0,17

8,2 ±

0,12

Bảng 3.8. Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác

nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng vi khuẩn C36

Thời gian, ngày 0 1 2 3 4 5 6

Cellulose (g/l) 20 17,5 10,5 6,4 4,7 3,5 3

Glucose (g/l) 0

2,3 ±

0,03

3,6±

0,05

4,0±

0,11

4,3±

0,13

4,2±

0,09

4,4±

0,18

93

Bảng 3.9 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng vi

khuẩn Hud 4-1

Thời gian, ngày 0 1 2 3 4 5 6

Cellulose (g/l) 20 18,5 13 8,5 5,5 5,2 5

Glucose (g/l) 0 2,0±

0,05

3,5 ±

0,08

4,5±

0,15

5,1 ±

0,12

5,8 ±

0,07

5,9 ±

0,09

Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng xạ

khuẩn 7P

Thời gian, ngày 0 1 2 3 4 5 6

Cellulose (g/l) 20 19 15 10 6,5 6,2 6

Glucose (g/l) 0 1 ±

0,03

2,3 ±

0,06

4,5 ±

0,05

6,0 ±

0,11

7,4 ±

0,16

7,8 ±

0,15

Bảng 3.11 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm

khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng

nấm A. terreus

Thời gian, ngày 0 1 2 3 4 5 6

Cellulose (g/l) 20 17 10 5,6 3,9 2,65 2

Glucose (g/l) 0

1,1 ±

0,05

2,5 ±

0,07

5,0 ±

0,08

7,5 ±

0,13

8,9 ±

0,09

9,1 ±

0,11

Từ các kết quả thủy phân cellulose bởi các chủng vi sinh được ghi trong các

bảng trên, xây dựng đồ thị hình thành glucose theo thời gian trong quá trình thủy

phân đối với các chủng vi sinh.

94

Tổng hợp các kết quả thủy phân cellulose bởi các chủng vi sinh ghi vào bảng

3.12, xây dựng đồ thị hình thành glucose theo thời gian trong quá trình thủy phân

đối với các chủng vi sinh để so sánh (hình 3.13).

Bảng 3.12 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi một số

chủng vi sinh của Việt Nam

t, ngày

Chủng 0 1 2 3 4 5 6

A. terreus 0 1.1 2.5 5 7.5 8.9 9.1

C 32 0 1.5 3 5.3 7 8 8.2

7P 0 1 2.3 4.5 6 7.4 7.8

Hud 4-1 0 2 3.5 4.5 5.1 5.8 5.9

C 36 0 2.3 3.6 4 4.3 4.2 4.4

Thủy phân cellulose

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 7Thời gian, ngày

Nồ

ng

độ

glu

co

se

. g

/l

1

2

3

4

5

Hình 3.13 So sánh thủy phân cellulose bằng các chủng vi sinh

1- Nấm A. terreus; 2- Vi khuẩn C32;; 3- Xạ khuẩn 7P;

4 -Vi khuẩn Hud 4-1; 5-Vi khuẩn C36.

Từ các kết quả phân tích, cho phép tính hiệu suất thủy phân của các chủng vi

sinh. Hiệu suất thủy phân A (%) được tính bằng lượng glucose (g) thu được sau quá

95

trình thủy phân so với lượng cellulose (g) trong một thời gian nhất định (tính tới

thời điểm 6 ngày). Kết quả tính hiệu suất thủy phân của các chủng vi sinh vật được

trình bày trong bảng 3.13. Tổng hợp kết quả thủy phân cellulose của các chủng vi

sinh được trình bày trên hình 3.14 để so sánh.

Bảng 3.13 Hiệu suất thủy phân cellulose của các chủng vi sinh

Chủng vi sinh C32 7P A. terreus Hud 4-1 C36

V, g/lít.giờ 0,068 0,065 0,076 0,49 0,037

A (%) 41,0 39,0 45,5 28,5 22,0

Hiệu suất thủy phân

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5

Chủng vi sinh

A,

%

Hình 3.14 Hiệu suất thủy phân cellulose thành glucose bằng các chủng vi sinh

1- Vi khuẩn C32; 2 - Xạ khuẩn 7P; 3- Nấm A. terreus;

4- Vi khuẩn Hud 4-1; 5- Vi khuẩn C36

Từ các kết quả thu được cho thấy: Vi khuẩn C32; Xạ khuẩn 7P; Nấm

A. terreus cho hiệu suất thủy phân cao, trong đó nấm A. terreus cho hiệu suất thủy

phân cao hơn cả. Kết quả nghiên cứu cho thấy từ 2 g cellulose tách từ rơm rạ sau

khi thủy phân bằng chủng nấm A. terreus thu được 0,91 g glucose đạt hiệu suất là

45,5%.

96

3.2.2.2. Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose rơm rạ bằng tế bào vi sinh vật

cố định

Trong các thí nghiệm tiếp theo tế bào vi sinh vật cố định đã được sử dụng để

thủy phân cellulose thành glucose nhằm tìm hiểu khả năng sử dụng dạng chất xúc

tác sinh học mới này trong công nghệ sản xuất bioethanol, bởi vì việc sử dụng nhiều

lần các chất xúc tác sinh học được cố định sẽ mang lại hiệu quả kinh tế đáng kể

trong sản xuất công nghiệp.

Kết quả các thí nghiệm này ghi trong các bảng trong phần phụ lục và được

trình bày ở dạng đồ thị trên các hình dưới đây.

0 - Thủy phân với tế bào chưa cố định

I - Lần thứ nhất sử dụng tế bào cố định

II - Lần thứ hai sử dụng tế bào cố định

III - Lần thứ ba sử dụng tế bào cố định

A. terreus

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian, ngày

Glu

co

se

,g/l

0

III

III

Hình 3.15 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose

bằng enzyme cellulase của nấm A. terreus

97

Vi khuẩn C 32

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian, ngày

Glu

co

se

, g/l

0

II

I

III

Hình 3.16 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose

bằng enzyme cellulase của vi khuẩn C32

Xạ khuẩn 7P

0

2

4

6

8

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian,ngày

Glu

co

se

,g/l

0III

III

Hình 3.17 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose

bằng enzyme cellulase của xạ khuẩn 7P

Vi khuẩn T2

0

2

4

6

8

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian, ngày

Glu

co

se

, g

/l

0III

III

Hình 3.18 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose

bằng enzyme cellulase của vi khuẩn Hud 4-1

Vi khuẩn Hud 4-1

98

Vi khuẩn C36

0

2

4

6

8

0 1 2 3 4 5 6 7Thời gian, ngày

Glu

co

se

. g/l

I

III

0

II

Hình 3.19 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose

bằng enzyme cellulase của vi khuẩn C36

Các đồ thị trên cho thấy các tế bào cố định có thể được sử dụng nhiều lần cho

quá trình xúc tác, tuy nhiên sau mỗi lần sử dụng hoạt tính xúc tác của chúng có

giảm đi một chút. Hơn nữa, hiệu quả xúc tác của các tế bào cố định cũng thấp hơn

của các tế bào tự do. Điều này là hợp với quy luật, bởi vì cơ chất cellulose có kích

thước phân tử lớn, nên nên tốc độ khuếch tán của nó vào bên trong các hạt xúc tác

nhỏ hơn nhiều so với tốc độ khuếch tán của cơ chất này trong dung dịch. Mặt khác,

so sánh hiệu quả xúc tác bởi các chủng vi sinh vật cố định khác cho thấy các tế bào

cố định của nấm A. terreus có hoạt tính xúc tác cao nhất.

3.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau lên quá trình thủy

phân cellulose bởi dịch enzyme của chủng nấm A. terreus

a) Ảnh hưởng của pH

Mục đích là tìm pH tối ưu cho quá trình thủy phân nguyên liệu tạo thành các

sản phẩm trung gian hòa tan đạt hiệu quả cao nhất để phục vụ lên men ethanol. Đối

với mỗi chủng vi sinh, thủy phân cellulose được tiến hành ở các điều kiện môi

trường có pH khác nhau từ 4,5 đến 7,0 trong thời gian 6 ngày.

Trong quá trình thủy phân, lượng đường khử glucose dần được hình thành,

được xác định theo thời gian, kết quả phân tích được ghi vào các bảng sau.

99

Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân cellulose bởi dịch enzyme của nấm Aspergillus terreus tại các thời

điểm khác nhau và ở các giá trị pH khác nhau

t (ngày)

pH

0 1 2 3 4 5 6

4.5 0 1.5 3.1 5.3 7.0 7.7 8.0

5.0 0 2.5 4.2 6.1 7.3 8 8.3

5.5 0 2.9 4.3 5.2 6.1 6.8 7.1

6.0 0 1.2 2.6 4.5 5.7 6.5 6.7

6.5 0 1.3 3.4 4.1 4.7 5.2 6.0

7.0 0 2 3.5 4.5 5.1 5.3 5.4

Từ các số liệu trong bảng 3.14, vẽ đồ thị để tìm pH tối ưu cho hoạt động thủy

phân của chủng nấm Aspergillus terreus (hình 3.20)

Aspergillus tereus

4

5

6

7

8

9

4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5

pH

Glu

co

se

, g

/l

Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng glucose tạo thành trong quá trình

thủy phân cellulose bằng chủng nấm Aspergillus terreus

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mục tiêu là tìm nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân nguyên liệu tạo thành

các sản phẩm trung gian hòa tan đạt hiệu quả cao nhất để phục vụ lên men ethanol.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu tạo

thành các sản phẩm trung gian hòa tan.

100

Bảng 3.15 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân cellulose bởi enzyme của nấm Aspergillus terreus tại nhiệt độ khác

nhau

Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới hàm lượng glucose tạo thành trong

quá trình thủy phân cellulose bằng A. terreus

t, ngày

Nhiệt độ, 0C 0 1 2 3 4 5 6

30 0.2 1.5 2.8 4.0 4.8 5.2 5.4

35 0.2 1.5 3.2 5.0 6.2 7.0 7.5

40 0.2 1.9 4.2 6.2 7.5 8.2 8.5

45 0.2 1.5 3.0 5.3 7.0 7.7 8.0

50 0.2 0.9 2.1 3.5 4.7 5.6 6.0

Từ các kết quả phân tích trong bảng 3.15 xây dựng đồ thị hình thành

glucose để tìm nhiệt độ tối ưu cho hoạt động thủy phân của chủng A. terreus

2

4

6

8

10

25 30 35 40 45 50 55

Glu

co

se

, g

/l

Aspergillus tereus

Nhiệt độ, 0C

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng glucose tạo thành trong quá

trình thủy phân cellulose bằng nấm A. terreus

3.2.2.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thuỷ phân cellulose (nguyên liệu) tạo

thành glucose

Sau khi tiến hành các thí nghiệm trong cùng điều kiện pH = 5,0; nhiệt độ

50oC với tỉ lệ thay đổi hàm lượng cellulose và enzyme cellulase. Đo hàm lượng

glucose và chọn giá trị lớn nhất của mỗi thí nghiệm, ta thu được kết quả ở bảng 3.16

o

101

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của lượng cellulose và enzyme ban đầu tới lượng glucose

thu được

TN

z1

(Cellulose, g)

z2

(Enzyme, ml)

y

(Glucose, mg/ml)

1 0,6 4,0 4,397

2 2,0 4,0 13,101

3 0,6 10,0 4,765

4 2,0 10,0 13,849

5 0,6 7,0 4,650

6 2,0 7,0 13,619

7 1,3 4,0 8,691

8 1,3 10,0 8,863

9 1,3 7,0 8,710

và 3 thí nghiệm bổ sung

10 1,65 8,5 11,394

11 1,65 8,5 11,279

12 1,65 8,5 11,167

Thực hiện phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm, mã hóa số liệu bảng 3.16

ta có bảng ma trận trực giao bậc hai 2 biến (bảng 3.17).

Bảng 3.17 Ma trận kế hoạch thực nghiệm và kết quả

TT x0 x1 x2 x1x2 x1’ x2’ Y Ŷ

1 +1 -1 -1 +1 0,3333 0,3333 4,397 4,286

2 +1 +1 -1 -1 0,3333 0,3333 13,101 13,205

3 +1 -1 +1 -1 0,3333 0,3333 4,765 4,716

4 +1 +1 +1 +1 0,3333 0,3333 13,849 13,635

5 +1 -1 0 0 0,3333 -0,6667 4,650 4,501

6 +1 +1 0 0 0,3333 -0,6667 13,619 13,420

102

7 +1 0 -1 0 -0,6667 0,3333 8,691 8,746

8 +1 0 +1 0 -0,6667 0,3333 8,863 9,175

9 +1 0 0 0 -0,6667 -0,6667 8,710 8,961

Sử dụng phần mềm xử lý số liệu quy hoạch thực nghiệm bằng ngôn ngữ

thuật toán FORTRAN ( xem phần Phụ lục) ta nhận được các kết quả sau:

Phương sai tái sinh xác định từ 3 thí nghiệm bổ sung ở x1 = 0,5 và x2 = 0,5

với y là: 11,394; 11,279 và 11,167.

28,113

3

1 u

uy

y

0129,0

2

3

1

2

2

u

u

ts

yy

s

Trong bảng 3.17 ta có:

N

x

xxxx

N

ji

jjjj

1

2

222' (3.1)

Ta tìm phương trình hồi quy

'

222

'

11121122211

'

0ˆ xbxbxxbxbxbby (3.2)

và dễ dàng đưa về dạng thông thường :

2

222

2

111211222110ˆ xbxbxxbxbxbby (3.3)

với

2

222

2

111

'

00 xbxbbb (3.4)

Các hệ số của phương trình (3.2) được xác định như sau:

N

i

ji

N

i

iji

j

x

yx

b

1

2

1 (3.5)

và phương sai của các hệ số

103

N

i

ji

tsbj

x

ss

1

2

22

(3.6)

Theo kết quả tính toán ta có:

Hệ số bj b0’=8,961 b1=4,459 b2=0,215 b12=0,095 b11=0,307 b22=0,05

ai số xác

định Sbj Sb0=0,0378 Sb1=Sb2=0,0463 Sb12=0,0567 Sb11= Sb22 = 0,0802

Giá trị

tbj tb0=236,84 tb1=96,24 tb2=4,63 tb12=1,67 tb11=3,83 tb22=0,62

Chuẩn số Student tra bảng:

tp(f) = t0,05 (2) = 4,3

Chỉ những tbj > 4,3 mới có nghĩa

tức là: b0 = b’0= 8,961

b1= 4,459

b2= 0,251

và ta có phương trình hồi quy:

ŷ = 8,961+ 4,459x1 + 0,215x2 (3.7)

Theo (7) tính các giá trị iy và đưa vào bảng.

Phương sai tương hợp:

lN

yy

s

N

ii

th

2

2

ˆ

(3.8)

trong đó N = 9 và l = 3 (số hệ số có nghĩa của phương trình hồi quy)

0494,02 ths

Ta tính:

836,30129,0

0494,02

2

ts

th

s

sF

Giá trị tra bảng

Fp (f1, f2)= F0,05 (6, 2) = 19,2

F < Fp (f1, f2)

104

Vậy phương trình tương hợp

Chuyển phương trình (3.7) từ dạng biến mã hóa về biến thực trên cơ sở sử

dụng công thức mã hóa

j

jj

jz

zzx

0

(3.9)

Ta được:

ŷ = 0,176+ 6,37z1 + 0,072z2 (3.10)

Căn cứ vào (3.7) thì

635,13ˆmax y

Từ các giá trị thực nghiệm ta có nhận xét sau: Hai yếu tố nồng độ cellulose

và nồng độ enzyme đều ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình thủy phân glucose, trong

đó ảnh hưởng của nồng độ cellulose (yếu tố 1) mạnh hơn (theo giá trị hệ số thuộc

yếu tố này so với hệ số yếu tố thứ 2).

Theo phương trình (3.7), cần làm tiếp thí nghiệm, theo hướng tăng x1 và x2

tức nồng độ cellulose và enzyme.

Kết quả thí nghiệm để chọn giá trị y cực đại như sau:

TN z1 (g cellulose) z2 (ml enzyme) y (CGlucose mg/ml)

1* 2,3 14 15,388

2* 2,5 15 15,867

3* 2,6 15 15,821

Ở thí nghiệm 2* ta nhận được hiệu suất cao nhất

ymax = 15,867 mg/ml

Chọn các số liệu: Từ quy hoạch thực nghiệm và thí nghiệm bổ sung để vẽ đồ

thị ta có bảng 3.18

Bảng 3.18 Xác địnhh giá trị tối ưu cho hàm lượng glucose nhận được

TT z1 z2 Y

1 0,6 10 4,765

105

2 1,3 10 8,863

3 1,65 8,5 11,279

4 2.0 10 13,849

5 2,3 14 15,388

6 2,5 15 15,867

(7*) 2,6 15 15.821

Ta chọn giá trị tối ưu là:

ymax = 15,876

ở thí nghiệm số 6 trong bảng 3.17

7*

0

4

8

12

16

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

z1

y

y

Hình 3.22 Đồ thị xác định giá trị tối ưu của glucose thu được

từ quá trình thủy phân cellulose

Từ các nghiên cứu về quá trình thủy phân cellulose (rơm rạ) thành glucose

có thể kết luận như sau:

Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp (rơm, rạ lúa) chứa chủ yếu là

các polysaccharide như cellulose và hemicellulose và số ít các hợp phần khác tách

cellulose việc tách cellulose chính là bước tiền xử lý nguyên liệu đóng vai trò hết

sức quan trọng.

106

Trong cellulose tinh thể lượng đường glucose có thể đạt đến 90%, các đường

như xylose, arabinose còn lại không đáng kể và rất ít rhamnose. Như vậy, chỉ sử

dụng cellulose sẽ thu được hầu như chỉ có glucose.

Tối ưu hóa quá trình thuỷ phân nguyên liệu, tìm được phương trình hồi quy

mô tả hiệu quả thủy phân (biểu thị qua nồng độ glucose) phụ thuộc vào thành phần

tham gia thủy phân: nồng độ cellulose (x1), nồng độ enzyme cellulase (x2) (ổn định ở

nhiệt độ 45oC, pH = 5,0) có dạng:

ŷ = 8,961 + 4,495x1 + 0,215x2

giá trị ymax = 15,876

Từ các kết quả trên chúng tôi đã nghiên cứu tối ưu hóa. Từ đó nâng cao hiệu

quả quá trình thủy phân để đạt hiệu suất ethanol cao nhất.

3.2.3. Đánh giá chung về quá trình thủy phân chuyển hóa carbohydrate trong

rong biển, phế thải nông nghiệp thành đường

3.2.3.1. Thành phần carbohydrate chủ yếu

Rong biển có một số đặc tính hấp dẫn hơn như hàm lượng đường cao (50 –

70%). Thêm vào đó, trong rong biển có chứa một số loại polysaccharide không tìm

thấy trong các loại sinh khối phát triển trên mặt đất (lignocellulose):

- Laminarin có thể bị thủy phân bới hóa chất, enzyme hoặc vi sinh để cho

đường glucose.

- Mannitol: bị oxy hóa thành fructose và bị chuyển hóa bởi quá trình đường

phân. Quá trình lên men không chỉ tạo ra ethanol và CO2.

- Alginate : Một số lượng lớn các vi sinh vật biển có thể sử dụng alginate bởi

quá trình hiếu khí

Trong khi đó hầu hết sinh khối từ thực vật và phế thải nông nghiệp rơm rạ

chứa thành phần rất cao hemicellulose 23-32% và lignin – 15-25% hiện nay phương

pháp thủy phân thành phần hemicellulose, lignin còn gặp nhiều khó khăn

Các nghiên cứu dùng vật liệu lignocellulose chuyển hóa thành nhiên liệu

sinh học cho hiệu suất chuyển hóa thấp của cellulose và hemicellulose, vì sự hiện

diện của lignin. Một số công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose khác nhau

chủ yếu tập trung vào khâu tiền xử lý, giúp cải thiện hiệu suất của các enzyme phân

107

hủy cellulose. Các phương pháp tiền xử lý hoặc mang tính vật lý hoặc mang tính

hóa học, một số phương pháp khác kết hợp cả hai tác dụng. Số phương pháp như

tiền xử lý vi sinh vật, acid loãng, nước nóng, vôi và oxy hóa ướt bằng kiềm, đã

được sử dụng để cải thiện quá trình đường hóa các nguyên liệu. Nghiên cứu về tính

khả thi của việc chuyển đổi ethanol sinh học từ nguồn giàu cellulose như tảo có thể

được thực hiện bằng kỹ thuật tương tự như với sinh khối trên mặt đất.

3.2.3.2. Phương pháp và hiệu quả của quá trình thủy phân chuyển hóa

carbohydrate trong rong biển, phế thải nông nghiệp thành đường

Từ những kết quả nghiên cứu thu được ở phần trên cho thấy rằng:

Thủy phân chuyển hóa phế thải nông nghiệp thành đường: vì hàm lượng

hemicellulose cao và có mặt lignin, để chuyển hóa cellulose trong lignocellulose

thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn

trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, cấu trúc

của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử

lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt; tiền xử lý vật liệu

để tách cellulose thường phải thực hiện dưới điều kiện khắc nghiệt: nhiệt độ cao,

nồng độ cao của các dung môi hóa học hay thời gian dài.

Quá trình thủy phân: Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của phế

thải nông nghiệp thành các monosaccharide hòa tan. Thủy phân bằng dịch enzyme

của vi sinh vật ở nhiệt độ từ 37- 40oC, lắc 240 vòng/phút.

Kết quả: Quá trình thủy phân phế thải nông nghiệp từ 1 g rơm rạ thu được

177,4 mg đường glucose đạt hiệu suất 45,5%.

- Thủy phân chuyển hóa rong nâu thành đường: Rong biển có chứa hàm

lượng carbohydrate cao: 6% cellulose, 23% alginate, 12% mannitol, fucoidan 5%,

laminaran 14%, protein 2%, lipid 2%, không thấy hàm lượng tinh bột,

hemicellulose và lignin nên phần tiền xử lý đơn giản hơn. Xử lí nhằm mục đích loại

những tạp chất khô không mong muốn trong nguyên liệu. Cắt và xay mục đích

phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng diện tích tiếp xúc giữa acid và cơ chất.

Tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất.

Quá trình thủy phân: Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của rong

nâu thành các monosaccharide hòa tan. Gồm 2 giai đoạn thủy phân.

108

Thủy phân 1: Thủy phân carbohydrate trong rong nâu bằng acid H2SO4 2%

ở nhiệt độ 120oC, thời gian 120 phút.

Thủy phân 2

Do thành phần carbohydrate rất đa dạng nên thủy phân carbohydrate trong

rong nâu bằng ezyme Cellic HTech2 phức hệ đa enzyme như carbohydrases

arabanase, cellulase, beta-glucanase, hemicellulose và xylanase

Kết quả quá trình thủy phân rong nâu: từ 1 g rong nâu thu được 253,7 mg

đường khử đạt hiệu suất 48%

3.3. Nghiên cứu quá trình lên men các sản phẩm trung gian hòa tan

Quá trình lên men tạo ethanol là quá trình yếm khí khi không có oxy

(anaerobic) được thực hiện nhờ các vi sinh vật chuyển hoá các loại nguyên liệu

thành ethanol. Nguyên liệu phục vụ cho quá trình lên men có thể chia làm 3 loại:

đường, tinh bột, sinh khối chứa cellulose, hemicellulose.

Hiệu quả của quá trình lên men không chỉ phụ thuộc vào bản chất của các

chủng vi sinh, mà còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong quá trình lên men

như nhiệt độ, pH, nồng độ dung dịch cơ chất...

Đường có thể chuyển hóa trực tiếp thành ethanol. Tinh bột phải qua giai

đoạn thủy phân thành đường sau đó có thể lên men được. Sinh khối chứa cellulose,

hemicellulose phải qua bước thủy phân chuyển hóa thành đường. Lập tức sau khi

được tạo thành, đường được các enzyme vi sinh lên men chuyển hóa thành ethanol.

Như vậy, quá trình lên men là quá trình nhờ các vi sinh vật thực hiện chuyển

hoá các đường như glucose, fructose, sucrose, xylose, arabinose, lactose, galactose,

mannose thành ethanol .

Sau đó glucose và fructose được hệ enzyme Zymase xúc tác chuyển hóa

thành ethanol

Zymase

C6H12O 2 C2H5OH + 2 CO2

CH3CHO + NADH →

C2H5O- + NAD+

Invertase

sucrose + H2O glucozơ + fructose

CH3CHO + NADH →

C2H5O- + NAD+

109

Quá trình lên men được bắt đầu khi glucose bị phá huỷ tạo thành pyruvate

Khởi đầu này gọi là quá trình đường phân (glycolysis):

Sau glycolysis, quá trình lên men được bắt đầu.

Quá trình lên men gồm 2 bước;

Bước đầu: pyruvate chuyển thành acetaldehyde và carbon dioxide. Pyruvate

decarboxylase xúc tác chuyển hóa này. Enzyme này cần thiamine pyrophosphate

làm cofactor:

Bước sau: Acetaldehyde được NADH sinh ra trong glycolysis chuyển thành

ethanol. Trong khi đó, NADH bị oxy hóa thành NAD+

Ethoxide anion (C2H5O-) có thể bị proton hóa bởi acid Bronsted sinh ra trong

giai đoạn glycolysis tạo thành ethanol:

Nấm men (yeasts) thực hiện 2 phản ứng trên chỉ trong điều kiện không có

mặt oxy. Ngược lại, nếu có mặt oxy thì pyruvate lại chuyển thành carbon dioxide và

nước. Thực hiện lên men có thể là các nấm men.

Pyruvate decarboxylase

CH3COCOO− + H+ → CH3CHO + CO2

CH3CHO + NADH → C2H5O- + NAD+

C2H5O- + H+ → C2H5OH

C6H12O6 → 2 CH3COCOO - + 2H+

110

Hình 3.23 Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol

3.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rong nâu và phế

thải nông nghiệp

3.3.1.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men đến quá trình lên men

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của tỷ lệ

nấm men đến quá trình lên men tạo ethanol được trình bày trong bảng 3.19

Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi thay đổi tỷ

lệ nấm men trong quá trình lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae V7028

Tỷ lệ nấm men (%)

Hàm lượng

đường trước

khi lên men

(mg)

Hàm lượng

đường sau

khi lên men

(mg)

Hàm lượng

đường tiêu tốn

trong quá trình

lên men (mg)

1

Rong nâu 253,7 21,03 232,67 ± 0,56

Phế thải nông nghiệp 177,4 17,06 160,34 ± 0,47

2

Rong nâu 253,7 19,46 234,24 ± 0,52

Phế thải nông nghiệp 177,4 11,54 165,86 ± 0,48

Rong nâu 253,7 17,93 235,77 ± 0,61

111

3 Phế thải nông nghiệp 177,4 5,36 172,04 ± 0,56

4

Rong nâu 253,7 13,51 240,19 ± 0,49

Phế thải nông nghiệp 177,4 6,11 171,29 ± 0,62

5

Rong nâu 253,7 9,84 243,86 ± 0,41

Phế thải nông nghiệp 177,4 6,94 170,46 ± 0,56

6

Rong nâu 253,7 10,65 243,05 ± 0,58

Phế thải nông nghiệp 177,4 7,23 170,17 ±0,64

Từ kết quả thu được trong bảng trên, xây dựng biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng

của tỷ lệ nấm men thêm vào trong quá trình lên men đến hàm lượng đường khử trên

hình 3.24

Hình 3.24 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại khi thay đổi tỷ lệ nấm

men trong quá trình lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae

V7028

Kết quả thể hiện ở hình 3.24, bảng 3.19 cho thấy:

Tỷ lệ nấm men (%)

112

- Nồng độ nấm men bổ sung vào dịch lên men là một trong những yếu tố quan

trọng ảnh hưởng đến hiệu quả lên men ethanol. Ở mỗi nồng độ nấm men khác

nhau cho hiệu quả lên men khác nhau.

Với rong nâu: nồng độ nấm men bổ sung vào dịch lên men càng tăng thì

hiệu quả lên men càng cao, hàm lượng đường khử còn lại càng ít và đạt cực tiểu

tại nồng độ nấm men 5% (9,84 mg) kết quả này cho thấy lượng đường khử tiêu

tốn cho quá trình lên men so với ban đầu chưa lên men (253,7 mg) là 243,86 mg.

Nhưng nếu tăng nồng độ nấm men lên 6% thì hiệu qủa lên men không tăng nữa

mà giảm nhẹ. Như vậy, nồng độ nấm men bổ sung vào dịch lên men là 5% cho

hiệu quả lên men cao nhất.

Với phế thải nông nghiệp: Quá trình lên men xảy ra nhanh chóng, hàm lượng

đường khử còn lại ít và đạt cực tiểu tại nồng độ nấm men là 3% (5,36 mg). Nếu tăng

hàm lượng nấm men lên hiệu quả lên men không tăng nữa.

Qua kết quả thực nghiệm trên cho thấy:

Đường là nguồn nguyên liệu chính mà nấm men sẽ sử dụng chuyển hóa

thành ethanol. Tuy nhiên nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất

thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lí nấm men. Kết quả là rượu

nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà còn cả nấm men.

Trong quá trình lên men, nấm men thông qua con đường trao đổi chất và

năng lượng để chuyển hóa các đường phân tử lượng thấp thành ethanol và CO2. Vì

vậy, số lượng tế bào nấm men phải đủ để quá trình lên men ethanol diễn ra triệt để

và hiệu suất thu hồi ethanol cao.

Đối với đường khử của rong nâu: ở 1% - 4%, nồng độ nấm men bổ sung quá

ít trong khi đó lượng cơ chất lớn, tốc độ lên men phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

nấm men bổ sung có nghĩa là hiệu quả lên men tăng dần từ 1% - 4%, nhưng hiệu

suất lên men không cao, lượng đường còn lại nhiều do thiếu tế bào nấm men sử

dụng. Mặt khác, nấm men sẽ sử dụng nhiều đường cho quá trình sinh trưởng, phát

triển làm tiêu tốn thời gian và nguyên liệu. Khi tăng nồng độ nấm men lên 5%, nồng

độ nấm men và nồng độ cơ chất tương ứng với nhau nên cho hiệu quả lên men là

cao. Nếu tiếp tục tăng nồng độ nấm men lên 6%, nồng độ cơ chất không tăng thì tốc

113

độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, khi đó nồng độ cơ chất giảm, làm nồng

độ ethanol giảm theo và gây lãng phí trong sản xuất

Đối với đường của phế thải nông nghiệp: Sau giai đoạn thủy phân phế thải

nông nghiệp thu được đường là đường glucose do đó quá trình lên men xảy ra dễ

dàng hơn, cần ít nấm men hơn. Vì vậy ở nồng độ nấm men là 3% thì tỷ lệ đường

còn lại đã đạt cực tiểu.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy lên men ethanol dịch rong nâu đạt

hiệu quả cao khi bổ sung nấm men ở 5% và trong dịch phế thải nông nghiệp đạt

hiệu quả cao nhất khi bổ sung nấm men ở 3%.

3.3.1.2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình lên men

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi

trường lên quá trình lên men đường khử tạo ethanol được trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.20 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men

của nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 ở các giá trị pH khác nhau

pH môi trường

4,0 4,5 5,0 5,5

Rong

nâu

Phế

thải

NN

Rong

nâu

Phế

thải

NN

Rong

nâu

Phế

thải

NN

Rong

nâu

Phế

thải

NN

Hàm lượng

đường trước

khi lên men

(mg)

253,7

177,4

253,7

177,4

253,7

177,4

253,7

177,4

Hàm lượng

đường sau khi

lên men (mg)

19,83

18,13

15,63

10,41

9,16

5,09

14,97

6,32

Hàm lượng

đường mất đi

trong quá trình

lên men (mg)

233,87

± 0,37

159,27

± 0,33

238,07

± 0,28

166,99

± 0,19

244,54

± 0,23

172,31

± 0,27

238,73

± 0,26

171,08

± 0,15

114

Từ kết quả trên, xây dựng biểu đồ biểu thị hàm lượng đường còn lại dưới

ảnh hưởng của pH môi trường trong quá trình lên men tạo ethanol.

Hình 3.25 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại sau khi lên men của

nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 ở các giá trị pH khác nhau

Kết quả thể hiện ở hình 3.25 cho thấy:

pH khác nhau cho hiệu quả lên men khác nhau.

Ở pH = 4, hiệu quả lên men là thấp nhất, hàm lượng đường còn lại trong

dịch lên men nhiều. Ở pH = 4,5 và 5,5 hiệu quả lên men tuy cao hơn ở pH = 4

nhưng hàm lượng đường còn lại chưa được nấm men sử dụng vẫn còn nhiều.

Hiệu quả lên men dịch rong nâu đạt cao nhất ở pH = 5,0 lượng đường khử

trước khi đem lên men đạt 253,7 mg đối với rong nâu và 177,4 mg đối với phế

thải nông nghiệp, sau lên men ở pH = 5,0 thì rong nâu còn lại lại 9,16 mg và phế

thải nông nghiệp còn lại 5,09 mg.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy lên men ethanol dịch rong nâu và

phế thải nông nghiệp đạt hiệu quả cao khi pH môi trường lên men bằng 5,0.

3.3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian

đến quá trình lên men tạo ethanol được ghi lại trong bảng sau:

115

Bảng 3.21 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men

bằng nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 tại các thời điểm khác nhau

Thời gian lên men (ngày)

Hàm lượng

đường trước

lên men (mg)

Hàm lượng

đường sau

lên men

(mg)

Hàm lượng

đường tiêu tốn

trong quá trình

lên men (mg)

2 Rong 253,7 19,27 234,43 ± 0,56

Phế thải NN 177,4 12,93 164,47 ± 0,43

3 Rong 253,7 13,39 240,31 ± 0,47

Phế thải NN 177,4 5,06 172,34 ± 0,59

4 Rong 253,7 7,53 246,17 ± 0,42

Phế thải NN 177,4 6,13 171,27 ± 0,56

5 Rong 253,7 8,16 245,54 ± 0,53

Phế thải NN 177,4 6,87 170,53 ± 0,74

6 Rong 253,7 9,05 244,65 ± 0,68

Phế thải NN 177,4 7,21 170,19 ± 0,45

Từ kết quả thu được trong bảng trên, xây đựng biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng

của thời gian lên men đến quá trình lên men tạo ethanol thông qua hàm lượng

đường khử còn lại sau các ngày trong quá trình lên men.

Hình 3.26 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại sau khi lên men bằng

Saccharomyces cerevisiae V7028 tại các thời điểm khác nhau

116

Kết quả thể hiện ở hình 3.26 cho thấy:

Thời gian là một trong các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả lên men. Theo

thời gian lên men hàm lượng đường còn lại trong dịch giảm dần. Với rong nâu kéo

dài tới ngày thứ 4 thì lượng đường còn lại ít nhất có nghĩa là lượng đường chuyển

hóa nhiều, hiệu quả lên men đạt cao nhất, ta thấy nếu kéo dài thời gian đến 5, 6

ngày thì hiệu quả lên men không tăng nữa. Thời gian 2, 3 ngày hàm lượng đường

còn lại nhiều, hiệu quả lên men không cao. Với phế thải nông nghiệp thì lên men

đến ngày thứ 3 hàm lượng đường còn lại đã đạt mức thấp nhất.

Các kết quả thu được, được giải thích như sau: Thời gian lên men phụ thuộc

vào tỷ lệ nấm men bổ sung vào và pH dịch môi trường lên men. Nếu nồng độ nấm

men lớn thì thời gian lên men sẽ kết thúc nhanh. Khoảng thời gian đầu 1, 2 ngày khi

có mặt của oxy, nấm men sử dụng cơ chất để tăng sinh khối, sinh trưởng và phát

triển, còn sự lên men chưa được mạnh mẽ. Bắt đầu ngày thứ 3 trở đi là thời gian

lên men ethanol mạnh hơn, khi đó hàm lượng ethanol sinh ra càng tăng và hàm

lượng đường giảm dần đến một mức thời gian nào đó hiệu suất lên men đạt cực

đại quá trình lên men kết thúc. Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men sẽ tổn thất

lượng ethanol tạo thành, các vi sinh vật lạ phát triển mạnh đặc biệt là vi khuẩn lactic

làm chua dịch lên men, xuất hiện mùi lạ.

Từ các số liệu và phân tích trên cho thấy lên men ethanol dịch rong nâu đạt

hiệu cao khi lên men trong thời gian 4 ngày, phế thải nông nghiệp đạt hiệu quả lên

men cao khi lên men trong 3 ngày.

Từ các nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nấm men, pH môi trường và thời

gian lên men ta thấy: Phế thải nông nghiệp đạt hiệu quả lên men với nồng độ nấm

men thấp hơn, thời gian lên men cũng nhanh hơn so rong nâu.

3.3.2. Nghiên cứu lên men bằng sản phẩm trung gian glucose từ quá trình thủy

phân rơm rạ bởi chủng Saccharomyces cerevisiae V7028

Sau khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: tỷ lệ nấm men, pH

môi trường, thời gian lên men. Chúng tôi tiến hành lên men sản phẩm trung gian là

đường glucose từ quá trình thủy phân rơm rạ bằng chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae V7028 với điều kiện: Nồng độ nấm men bổ sung vào quá trình lên men là

117

3%, pH môi trường là 5,0, thời gian lên men là 3 ngày, tốc độ lắc 240 vòng/ phút,

nồng độ cơ chất glucose 200 g/L trong bình yếm khí, ở nhiệt độ phòng,

Xác định lượng ethanol tạo thành trong dung dịch sau quá trình lên men bằng

phương pháp chuẩn độ với K2Cr2O7 đồng thời nghiên cứu xác định thông số động

học với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae V7028 và thu được các kết quả

như sau:

Bảng 3.22 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol

bởi chủng Saccharomyces cerevisiae V7028

Thời gian, giờ 0 1 3 12 24 36 48 60 72

Glucose, g/L 200 198 193 153 69 37 27 19 17

Ethanol, g/L 0 2 5 17 47 73 83 86 87

Mật độ tế bào, g/L 6 14 29 38 40 41 42 42

Từ các kết quả thu được cho phép xây dựng đồ thị xác định thông số động

học của quá trình lên men bới chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae V7028.

Saccharomyces cerevisiae V7028

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Thời gian, giờ

Nồ

ng

độ

, g

/l

2

13

Hình 3.27 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng

chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 (của Nga)

1 - Glucose (g/l); 2 - Ethanol (g/l); 3 - Mật độ tế bào (g/l)

118

Hiệu suất tế bào theo ATP là đại lượng biểu thị khối lượng tế bào được tạo

thành khi vi sinh vật sử dụng 1 mol ATP để lấy năng lượng cho quá trình tích luỹ

polyphosphat nồng độ АТP trong tế bào chứng tỏ khả năng sống của các tế bào

ATP + (phosphat)n ADP + (phosphat) n + 1

Kết quả cho thấy, chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 thích hợp hơn cả

cho thông số động học lên men quan trọng nhất là nồng độ ethanol cực đại đạt giá

trị cao (87 g/L), tỉ lệ chuyển hóa ethanol đạt 43,5% và hiệu suất tế bào theo ATP

(YATP) đạt 2,84 x 108 (mol/g protein).

Từ các kết quả nghiên cứu về quá trình lên men của rong nâu và phế thải

nông nghiệp trong điều kiện tối ưu cho kết quả như sau: Từ 1 kg phế thải nông

nghiệp thu được 97 ml ethanol và hiệu suất chuyển hóa toàn quá trình là 19,8%.

Trong khi đó, từ 1 kg rong biển thu được 115 ml ethanol và hiệu suất quá trình

chuyển hóa rong nâu thành ethanol là 21%

3.4. Chuyển hóa phế thải rong nâu thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học kết

hợp với acid

3.4.1. Hàm lượng cellulose có trong phế thải rong nâu sau quá trình tách alginate

Thành phần nguyên liệu thô: Cellulose, hemicellulose và acid lignin không

tan được phân tích bằng phương pháp TCVN 4594 – 88. Kết quả thu được chỉ ra

rằng phế thải hữu sau quá trình chế biến alginate của rong nâu có thể là nguồn nhiên

liệu sinh học, chứa hàm lượng cao cellulose (30 ± 0.07%) và lượng ít hemicellulose

(2,2 ± 0.86%)

Phân tích hành phần hóa học của phần bã sau quá trình tiền xử lý bằng acid

sulfuric loãng và thủy phân bằng enzyme cho thấy, khi nguyên liệu thô được xử lý

trực tiếp bằng thủy phân enzyme, hàm lượng cellulose trong phần bã là 5,9%. Tuy

nhiên, giá trị này giảm xuống còn 4,1% khi tiền xử lý bằng acid sau đó thủy phân

bằng enzyme. Điều này chỉ ra rằng phương pháp tiền xử lý bằng acid giúp làm

tăng khả năng phân hủy cellulose trong quá trình thủy phân. Trong khi đó, gần

như không phát hiện thấy hemicellulose và lượng acid lignin trong cả hai mẫu chất

thải rắn.

119

3.4.2. Hiệu quả quá trình thủy phân và lên men

Sự thủy phân đạt hiệu quả cao hơn khi sử dụng acid loãng kết hợp với

enzyme. Glucose sản phẩm đạt tới mức tối đa tương đối sau 50 giờ do sự thủy

phân của enzyme Cellic HTech2. Đầu tiên, đánh giá phế thải rong nâu sau khi

được tiền xử lý bằng phương pháp acid loãng ở 120oC. Các mẫu tiền xử lý sẽ được

sử dụng trong thủy phân bằng enzyme, lượng glucose thu được sau đó sẽ dùng để

đánh giá hiệu suất của quá trình tiền xử lý. Nồng độ acid loãng là nhân tố quan

trọng trong quá trình tiền xử lý. Quá trình tiền xử lý tối ưu là khi nồng độ acid

bằng 0,1%. Trong điều kiện tối ưu của quá trình tiền xử lý (0,1%, 120oC, 1 giờ),

lượng glucose thu được đạt tới 215mg/g và chuyển hóa cellulose trong phế thải

rong nâu đạt 71,2%. Tuy nhiên, lượng glucose thu được từ phế thải rong nâu nếu

không qua tiền xử lý chỉ có 162,5 mg/g, cho thấy tiền xử lý có tác dụng tăng

cường hiệu suất thủy phân bằng enzyme. Bên cạnh đó, lượng glucose được tạo ra

khoảng 159,5-177,5 mg/g khi tiền xử lý ở 120oC trong 0,5-1,5 giờ mà không có

thêm acid. Khi tăng nồng độ acid sunfuric quá 0,1%, nồng độ glucose sẽ giảm

dần, và khi nồng độ acid lên tới 1,0% sản phẩm tạo ra chỉ còn 93,5-126 mg/g. Thí

nghiệm được lặp lại 3 lần, thu được kết quả như bảng 3.23

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ acid loãng tới hàm lượng khử tạo thành

trong quá trình thủy phân

Nồng độ acid H2SO4 loãng (%) Hàm lượng khử tạo thành (mg/g)

0 162,5 ± 0,46

0,1 215 ± 0,37

0,2 177,5 ± 0,41

0,5 159,5 ± 0,52

1 126 ± 0,48

Từ các kết quả nghiên cứu được, xây dựng đồ thị ảnh hưởng của nồng độ

acid loãng đến hàm lượng đường trong quá trình thủy phân

120

Hình 3.28 Ảnh hưởng của nồng độ acid loãng đến hàm lượng đường trong quá

trình thủy phân phế thải rong

Thời gian trung bình của tiền xử lý cũng là một nhân tố quan trọng, có ảnh

hưởng lớn tới sự sản xuất glucose, thời gian tối ưu là 1 giờ. Tốc độ đường hóa

không tăng theo thời gian. Tăng thời gian tiền xử lý hay tăng nồng độ acid có thể

đẩy nhanh sự phân hủy của cellulose và tạo ra đường tan từ mẫu tiền xử lý, điều này

dẫn tới sự sụt giảm lượng glucose tạo ra.

Để chứng minh điều này, sự giảm khối lượng của các mẫu được phân tích ở

từng giai đoạn. Tổng khối lượng thụt giảm lớn nhất là 197,8 mg/g, xuất hiện sau

tiền xử lý (0,1%, 1200C, 1 giờ) và thủy phân các chất bằng enzyme. Kêt quả là đồng

nhất với lượng glucose thu được. Tổng khối lượng sụt giảm dao động từ 154,3 tới

197,8 mg/g với nồng độ acid sulfuric thay đổi từ 0 đến 1,0% tương ứng với xu

hướng thay đổi của lượng glucose. Khối lượng mất đi ở bước tiền xử lý với acid

cũng được theo dõi. Không có sự khác biệt rõ ràng về sự giảm khối lượng (40-60

mg/g chất) khi nồng độ acid từ 0-0,5%. Khi đó lượng glucose sản phẩm cũng không

đáng kể. Tuy vậy, sự thất thoát khối lượng tăng mạnh khi nồng độ acid đạt tới 1,0%.

Sản phẩm sau thủy phân được cô bằng phương pháp cô quay. Hiệu suất của

quá trình sản xuất ethanol bằng S. cerevisiae từ glucose và sản phẩm sau thủy phân

cô đặc. Sau khi cấy trong 36 giờ, tỷ lệ chuyển hóa ethanol là 46,9%, tương đương

92% hiệu suất lý thuyết. Kết quả chứng minh rằng từ 1 kg phế thải trong chế biến

rong biển có thể thu được 0,128 L ethanol

Nhận xét

121

Từ những kết quả trên cho thấy rằng, lượng lớn phế phẩm của quy trình sản

xuất alginate là nguồn nguyên liệu sinh học mới và tiềm năng cho quá trình chuyển

hóa ethanol sinh học. Sản lượng của alginate, carrageenan và agar hàng năm trên

thế giới lần lượt là 30 000-40 000, 20000 và 10000 tấn. Trong đó, hiệu suất alginate

của Trung Quốc chiếm 1/4-1/3 toàn cầu. Cùng một lượng chất thải như vậy được

tạo ra sau quá trình sản xuất alginate. Điều này gây nên ô nhiễm môi trường nghiêm

trọng do khả năng tái chế thấp. Nhờ những ưu điểm về thành phần hóa học và cấu

trúc không gian, phế thải từ rong trở thành nguồn nguyên liệu sinh học lý tưởng.

Điều này là cần thiết cho việc phát triển hơn nữa những phương pháp chuyển hóa

ethanol sinh học, tạo điều kiện cho một quy mô thí điểm sản xuất ethanol sinh học.

Tuy nhiên, vì hàm lượng hemicellulose cao và có mặt lignin, tiền xử lý

thường phải thực hiện dưới điều kiện khắc nghiệt: nhiệt độ cao (165-210oC), nồng

độ cao của các dung môi hóa học hay thời gian dài (4 tuần). Hiệu suất thu hồi

cellulose tối đa từ rơm lúa mì được báo cáo là 92% trong điều kiện tiền xử lý thủy

nhiệt ở 195oC từ 6-12 phút trước khi thủy phân enzyme [34]. Phương pháp acid

loãng thường cần nhiệt độ cao (160-220 oC) cùng nồng độ acid thấp (0-2,0%). Trái

lại, nhiệt độ có thể thấp hơn (120oC) khi dùng nồng độ acid cao hơn. Trong những

nghiên cứu trước, các giá trị đường hóa tối đa (36,3 g đường / 100 g nguyên liệu

thô) có được khi sinh khối cây ô liu được xử lý trước đó ở 180oC với acid sulfuric

1,0%, tổng cộng 75% thành phần tất cả các loại đường trong nguyên liệu thô [35].

Trên hết, mặc dù tiền xử lí có hiệu quả cao và cho hiệu suất chuyển đổi cellulose

cao từ cây mặt đất, quá trình tiền xử lý giảm kết tinh của cellulose, loại bỏ lignin và

hemicellulose làm tăng thời gian xử lý, tăng tiêu thụ năng lượng và chi phí sản xuất.

Một ưu điểm khác của quá trình tiền xử lý bằng acid nồng độ thấp là mẫu

chưa qua đã qua tiền xử lý có thể được thêm trực tiếp vào hệ thống thủy phân bằng

enzyme mà không cần trung hòa. Ngoài ra, chất thải sau sản xuất ethanol sinh học

có thể được tận dụng làm phân bón. Nó có thể làm tăng tốc độ sinh trưởng của cây

trồng do chứa đựng rất nhiều thành phần có hoạt tính sinh học, bao gồm những hợp

chất phenolic, các chất polysaccharide chỉ có trong rong, chất điều hòa sinh trưởng

và các nguyên tố kim loại.

122

Trong nghiên cứu hiện nay, nhờ những ưu điểm có được từ thành phần hóa

học của phế thải, nồng độ acid sulfuric và nhiệt độ thấp được áp dụng cho quy trình

tiền xử lý. Sự thủy phân bằng enzyme và lên men sản phẩm sau thủy phân bằng S.

cerevisiae đã được khảo sát và đạt được những điều kiện tối ưu. Sau quá trình tiền

xử lý tối ưu (0,1%, 120oC, 1 giờ), sự thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 50oC, pH

5,0 trong 50 giờ. Hiệu suất glucose đạt được cao nhất đạt được là 215 mg/g, và

chuyển hóa cellulose đạt 71,2%. Cuối cùng từ 1 kg phế thải rong thu được 0,128 L

ethanol. Mặc dù nồng độ acid trong quy trình khá thấp (0,1%), trên thực tế nó đã

thúc đẩy quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme.

123

Nhận xét chung

Về phương pháp nghiên cứu:

Việt Nam cũng đã và đang bắt đầu những nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên

liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối (phế thải). Theo hướng này, đã có một số công

trình, nhưng trong quá trình thực hiện đang còn gặp những khó khăn rất lớn. Theo

hướng sử dụng nguồn phế thải nông, lâm nghiệp để sản xuất ethanol sinh học đã có

một số đề tài, công trình sau:

- “Sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp” Viện Công nghiệp

thực phẩm, Bộ Công Thương, (2009-2011). Dùng enzyme để thủy phân phế thải để

tạo đường tan nhìn chung đạt hiệu quả thấp, chưa tìm được enzyme thích hợp cho

hiệu suất cao. Hầu hết sinh khối từ thực vật và phế thải nông nghiệp rơm rạ chứa

nhiều hemicellulose 23-32% và lignin – 15-25%. Hiện nay vẫn chưa có phương

pháp thực sự hiệu quả để thủy phân thành phần hemicellulose, lignin. Một số hợp

phần có trong phế thải như Silic làm giảm hiệu suất thủy phân.

Nếu dùng acid để thủy phân phế thải để tạo đường tan thì gặp khó khăn trong

việc chế tạo thiết bị chịu acid nhiệt độ (1800C, áp suất 15 atm) thuộc Đề án phát

triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 của Bộ Công

Thương (2009 - 2010).

Để khắc phục một số nhược điểm của các phương pháp nghiên cứu cứu sản

xuất ethanol nhiên liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối (phế thải) trên. Việc đưa ra

phương pháp thủy phân các polysaccharide đạt hiệu quả cao hơn khi sử dụng acid

loãng kết hợp với enzyme. Glucose sản phẩm đạt tới mức tối đa tương đối sau 50

giờ do sự thủy phân của enzyme Cellic HTech2. Quá trình thủy phân giai đoạn 1 tối

ưu là (0,1%, 1200C, 1 giờ), lượng glucose thu được đạt tới 215 mg/g và chuyển hóa

cellulose trong phế thải rong nâu đạt 71,2%. Tuy nhiên, lượng glucose thu được từ

phế thải rong nâu nếu không qua thủy phân giai đoạn 1 bằng acid chỉ có 162,5

mg/g, cho thấy việc kết hợp phương pháp thủy phân các polysaccharide đạt hiệu

quả cao hơn khi sử dụng acid loãng kết hợp với enzyme.

Trong nghiên cứu này, do quá trình tiền xử lý được thực hiện ở nhiệt độ thấp

(120oC) với nồng độ acid sulfuric thấp (0,1%), hàm lượng những chất ức chế sau

khi thủy phân là rất thấp. Trong khi đó ở những điều kiện thủy phân bằng acid mạnh

124

cũng không đáng chú ý, vì những hợp chất lignin dễ hòa tan thường là những chất

ức chế cho quá trình lên men, lượng glucose tạo thành từ cellulose có thể bị chuyển

hóa thành hydroxymethylfurfural (HMF) và những hợp chất phenolic dễ hòa tan, có

thể cây ức chế quá trình lên men ethanol.

Một ưu điểm khác của quá trình tiền xử lý bằng acid nồng độ thấp là mẫu

chưa qua đã qua tiền xử lý có thể được thêm trực tiếp vào hệ thống thủy phân bằng

enzyme mà không cần trung hòa độ pH sau tiền xử lý là khoảng 5,0 khi nồng độ

acid là 0,1%.

Về đối tượng nghiên cứu:

Rơm, rạ: Việc sử dụng phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) làm nguyên liệu cho

sản xuất ethanol còn gặp nhiều khó khăn trong quá trình tiền xử lí, chi phí sản xuất

cao và hiệu suất thấp. Bên cạnh đó, quá trình sản xuất còn gây ô nhiễm môi trường

do tạo ra các sản phẩm thứ cấp.

Rong nâu: Việc sử dụng rong nâu làm nguyên liệu cho việc sản xuất nhiên

liệu sinh học chưa mang lại hiệu quả cao về mặt kinh tế. Mặc dù hàm lượng

carbohydrate trong rong nâu là khá cao xong việc xử lý rong cần phải dùng đến

phức hệ đa enzyme. Thêm vào đó, trong rong nâu có nhiều thành phần có thể dùng

trong các lĩnh vực y học, dược phẩm... do đó việc sử dụng rong nâu chỉ để sản xuất

nhiên liệu ethanol sinh học gây lãng phí nguồn nguyên liệu.

Vì vậy việc lựa chọn phế thải rong nâu để làm đối tượng sản xuất ethanol là

một hướng đi mới, có ý nghĩa thực tiễn cao. Việc sử dụng phế thải rong có ưu điểm

như: Có thể bỏ qua bước tiền xử lý, hàm lượng cellulose trong phế thải rong cao khi

thủy phân chỉ tạo ra đường glucose đồng thời nó cũng giải quyết được các vẫn đề về

môi trường.

Về vấn đề tạo xúc tác thế hệ mới cố định tế bào vi sinh vật.

Việc thủy phân cellulose để tạo nên các mạch đoạn oligocellulose ngắn hơn

và cho tới glucose có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế. Phương pháp công nghệ sinh

học sử dụng xúc tác sinh học cố định tế bào vi sinh vật có phần ưu điểm hơn, có

tính chọn lọc và có tính đặc hiệu cao do đó các liên kết (1-4) của cellulose rất dễ

bị phá vỡ bởi các vi sinh có chứa enzyme cellulase, hemicellulose nên thu được sản

phẩm tinh khiết, dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất thường. Trong phương pháp hóa

125

học, người ta hay dùng acid với nồng độ loãng, thí dụ H2SO4 5% hoặc H2SO4 5% và

HCl 5%. Để tránh bị phá hủy glucose, sản phẩm của thủy phân, người ta còn dùng

hỗn hợp dung dịch HCl 0,5% cùng ZnCl2 (65% -74%) (pH = 4,8, 100oC, 4 giờ). Sau

4 giờ thủy phân, 80% của cellulose chuyển thành dextrin hòa tan. Phương pháp hóa

học đòi hỏi những trang thiết bị rất tốn kém mà lại khó thu được sản phẩm tinh

khiết, vì vậy hiệu quả kinh tế thấp. Việc tìm ra biện pháp thích hợp và rẻ tiền là rất

quan trọng, tính chất phức tạp và chi phí cao cho các cách xử lý này đang là một

trong những yếu tố cơ bản đối với vấn đề khai thác cellulose cũng như sử dụng

cellulose ở quy mô công nghiệp.

126

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra những kết luận như sau:

1. Thành phần carbohydrat trong 4 loài rong nâu là: Sargassum henslowianum

48,23%, Sargassum swartzii 52,86%, Sargassum benderi 49,83%, Sargassum

oligocystum 48,91%. Như vậy, Sargassum swartzii có hàm lượng carbohydrat

cao nhất vì vậy loại rong này được chọn làm nguyên liệu để nghiên cứu quá trình

sản xuất ethanol sinh học.

2. Quá trình thủy phân bằng acid loãng kết hợp với enzyme cho hàm lượng đường

khử cao hơn, hiệu quả hơn so với việc chỉ dùng enzyme để thủy phân

carbohydrat có trong rong nâu. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân rong nâu

đạt hiệu quả cao là:

Nồng độ H2SO4 thủy phân rong nâu là 2%

Nhiệt độ thủy phân bằng acid là 120oC

Thời gian thủy phân bằng acid là 120 phút

Nồng độ của enzyme là 5%

Nhiệt độ thủy phân bằng enzyme là 50oC

pH môi trường thủy phân là 5,0

Thời gian thủy phân là 50 h

3. Trong các chủng vi sinh vật sử dụng thủy phân cellulose từ rơm rạ cho hiệu suất

thủy phân cao như vi khuẩn C32; Xạ khuẩn 7P; Nấm A. terreus, thì nấm A.

terreus cho hiệu suất thủy phân cao nhất. Điều kiện tối ưu để chuyển hóa

cellulose từ rơm rạ thành đường glucose là pH: 5, nhiệt độ: 40oC với sự có mặt

của nấm Aspergillus terreus với phương trình hồi quy mô tả hiệu quả thủy phân

(biểu thị qua nồng độ glucose ) phụ thuộc vào thành phần tham gia thủy phân:

nồng độ cellulose (x1), nồng độ enzyme cellulase (x2) có dạng:

ŷ = 8,961 + 4,495x1 + 0,215x2

Với giá trị ymax = 15,876 phù hợp với kết quả thực nghiệm thu được.

4. Nghiên cứu cố định các tế bào vi sinh vật và đã tạo được các hạt xúc tác trong lên

men chuyển hóa glucose thành ethanol. Các hạt xúc tác mang tế bào vi sinh cố

định qua nhiều chu kỳ sử dụng vẫn duy trì được khả năng sống cao. Điều này đã

127

chứng minh khả năng sử dụng lại nhiều lần các chất xúc tác này trong sản xuất

công nghiệp.

5.Tìm được các thông số tối ưu cho quá trình lên men thu nhận ethanol sinh học:

Nồng độ nấm men bổ sung vào quá trình len men của rong nâu là 5%, phế

thải nông nghiệp là 3%.

pH môi trường lên men hiệu quả của rong nâu và phế thải nông nghiệp là

5,0.

Thời gian lên men hiệu quả của rong nâu là 4 ngày và của phế thải nông

nghiệp là 3 ngày.

6.Từ những kết quả nghiên cứu, so sánh, đánh giá quá trình thủy phân chuyển hóa

carbohydrat trong rong biển và phế thải nông nghiệp cho thấy rằng, rong biển chính

là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học trong

hiện tại và tương lai. Mặt khác, những kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng, phế

thải rong sau quá trình tách alginat và mannitol cũng có thể sử dụng có hiệu quả cao

để sản xuất ethanol sinh học.

128

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1- Đỗ Trung Sỹ, Nguyễn Đình Tuyến, Đỗ Thu Hương, Hoàng Thị Bích, Tạ Thủy

Nguyên, Nguyễn Ngọc Tùng, Trần Thị Hiền, Nguyễn Thị Trang, Trần Đình

Toại, N. Stepanov A., Efremenko E. N., S.Varfolomeev D. Chất xúc tác sinh

học trên cơ sở các tế bào nấm men chịu nhiệt để lên men đồng thời chuyển hóa.

Tạp chí hóa học 2012, 59-62.

2- Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên, Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung

Sỹ, Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân cellulose tách từ rơm rạ thành

đường tan của nấm mốc Aspergillus terreus để sản xuất ethanol – nhiên liệu

sinh học, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, Tập 49, Số 3, trang 87 – 96, 2011.

3- Đỗ Trung Sỹ, Trần Đình Toại, Hoàng Lương, Trần Mạnh Hải, Trần Thị Phương,

Hoàng Thị Bích, Nguyễn Hồng Nhung, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bích Thủy,

Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học để chuyển hóa phế thải nông nghiệp (rơm rạ)

thành ethanol. Tạp chí Hóa học, 2011, T.49, Số 5AB, 509-512. Hội nghị Xúc

tác hấp phụ toàn quốc lần thứ 6. Thừa Thiên Huế, Tháng 11-2011

4- Nguyễn Thị Hồng Nhung, Trần Đình Toại, Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung Sỹ .Cố

định các chủng nấm men trên polyvinyl alcohol (PVA) để tạo chất xúc tác sinh

học lên men rơm rạ thành ethanol. Tạp chí Khoa học Công nghệ & Môi trường

Công an, Số 19 tháng 12 năm 2011, 20-21.

5- I.V. Lyagin, O.V. Senko, A.B. Nikolskaya, F.T. Mamedova, N.A Stepannov,

Tran Dinh Toai, Do Trung Sy, E.N. Efremenko. Conversion of renewable

resources into products useable for chemical and fuel industries. 1st Symposium

on Marine Enzyme and Polysaccharides. Nha Trang, December 2012, 10-17.

6- Elena N. Efremenko, Olga V. Senko, Nikolay A. Stepanov, Olga V. Maslova,

Ilya V. Lyagin, Ngo Quoc Anh, Do Trung Sy, Nguyen Van Tuyen.

Biocatalytic conversion of seaweed biomass to semi-product for chemical

industry. Asian-Pacific Aquaculture 2013. December 10-13, 2013.

7- Do Trung Sy, Ngo Quoc Anh, Hoang Thi Bich, Tran Quoc Toan, Le Tat Thanh,

Nguyen Huy Tung, Dang Thu Thao, Le Mai Huong. Determination of glucose

129

in Aspergillus terrius af 67 hydrolysate of cellulose from Vietnamese seaweed.

Hội nghị Toàn quốc về Đa dạng sinh học và Phát triển bền vững Hải phòng

2014.

8- Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Đỗ Quang Kháng, Ngô Quốc Anh. Nghiên cứu

phương pháp thủy phân phế thải rong nâu sử dụng kết hợp acid và enzyme. Hội

thảo 40 năm thành Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2015. Tạp

chí hóa học (đã nhận đăng), 2015.

130

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Bilan M.I. và Usov

A.I (2012), Nghiên cứu cấu trúc của Fucoidan tách chiết từ tảo nâu

Sargassum Polycystumn, Tạp chí Hóa học, T. 50 (4A), tr. 215 – 218.

2. Cao Thị Thúy Hằng, Bùi Minh Lý, Huỳnh Hoàng Như Khánh, Phan Thị Hoài

Trinh và Nguyễn Duy Nhứt (2009), Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển phân

cắt fuicodan từ rong nâu, Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh học biển và

phát triển bền vững, tr. 640-644.

3. Đàm Văn Tiến (2003), Thành phần loài và phân bố của rong biến miền Bắc

Việt Nam, Hội thảo khoa học Đề tài hợp tác Việt Nam-Italia “Bảo tồn đa dạng

sinh học dải ven biển Việt Nam”.

4. Đặng Ngọc Thanh (chủ biên) và nhiều tác giả (2003), Biển Đông Sinh vật và

sinh thải Biển, Tập IV, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

5. Hoàng Minh Nam, (2009), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và thiết bị liên tục

xử lý rơm xạ bằng hơi nước để lên men ethanol”, Báo cáo đề tài cấp Bộ,

Trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh.

6. Lâm Ngọc Trâm, Đỗ Tuyết Nga, Nguyễn Phi Đính, Phạm Quốc Long và Ngô

Đăng Nghĩa (1999), Các hợp chất tự nhiên trong sinh vật biển Việt Nam, Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

7. Lê Như Hậu và công sự, (2000), Đề tài “Nghiên cứu và đề xuất giải pháp

khai thác hợp lý và bền vững cho rong nguyên liệu sản xuất ethanol ở ven

biển Nha Trang”.

8. Lê Như Hậu và cộng sự, (2010), “Tiềm năng rong biển làm nguyên liệu sản

xuất ethanol nhiên liệu tại Việt Nam”, Báo cáo hội nghị Khoa học kỷ niệm 35

năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội.

9. Lương Đức Phẩm, (2006), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

10. Ngô Đăng Nghĩa (1999), Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất

alginate từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng vào một số lĩnh vực sản xuất, Luận

án tiến sĩ, Đại học Thủy Sản Nha Trang.

131

11. Nguyễn Duy Nhứt (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của polysacharide từ một sổ loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa, Luận án tiến

sĩ Hóa học.

12. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung

(2007), Phân lập và đặc điếm của fucoidan từ 5 loài rong mơ Miền Trung, Tạp

chí Hóa học, số 3, tập 45, tr. 339-345.

13. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung

(2008), Fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii: phương pháp tách, hoạt

tính gây độc tế bào ung thư và nghiên cứu cấu trúc, Tạp chí Hóa học, số 1, tập

46, tr. 52-56.

14. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Cường,

Trân Văn Sung (2009), Nghiên cứu cấu trúc của fucoidan có hoạt tính gây độc

tế bào tách từ rong nâu Sargassum swartzii bằng phương pháp phổ khối nhiều

lần, Tạp chí Hóa học, số 3, tập 47, tr. 300-307.

15. Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút và Nguyễn Văn Tiến

(1993), Rong biển Việt Nam phần phía Bắc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

16. Nguyễn Kim Đức (1991), Biến động hàm lượng acid alginic và chất lượng

natri alginate của loài rong mơ (Sargassum) vùng biển Hòn Chồng-Nha Trang,

Tuyển tập Nghiên cứu biển, Viện Nghiên cứu biển, Tập VII, tr. 208-216.

17. Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Nguyễn

Tiến Tài, Đặng Vũ Lương, Chu Đình Kính (2012), Isolation and structure of

alginate extracted from brown seaweed Sargassum swartzii collected at Nha

Trang, Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ 5.

18. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2004), Tiềm năng rong biển Việt Nam, Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

19. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải (2005), Động học các quá trình xúc tác

sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

20. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Năm (2007), Fucoidan - polysaccharide chiết từ

rong nâu, sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, ứng dụng trong y học và nuôi

trồng thủy sản, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Tập 45, số 1, tr. 39-46.

132

21. Trần Thị Luyến và Ngô Đăng Nghĩa (1999), Nghiên cứu sản xuất natri

algỉnate theo phương pháp xử lý CaCl2 0,1%, Tập san KHCN - Trường Đại

học Thủy sản Nha Trang.

22. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa,

(2004), Chế biến rong biển, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

23. Trần Văn Ân (1982), Góp phần nghiên cứu chất lượng rong mơ (Sargassum)

và chiết alginate từ rong mơ ở Hòn Chồng-Nha Trang, Luận án tiến sĩ, Học

viện quân y, Hà Nội.

24. Trần Vĩnh Thiện (2009), Điều chế khảo sát cấu trúc và tính chất của alginate

và oligosaccarit tách từ rong biến khu vực Bắc Hải Vân và ứng dụng của

chủng, Luận án Tiến sĩ Hóa học.

Tiếng Anh

25. Abdel - Fattah, A.F., Hussein, M.M.D., and Fouad, S.T.(1978),

“Carbohydrates of the brown seaweed Dictyota dichotoma”, Phytochemistry

17 741-743.

26. Aisa Y et al (2005) Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells

accompanied by activation of caspase-3 and down-regulationc of ERK

pathways. Am J Hematol 78:7–14.

27. Aizawa, M; Asaoka, K; Atsumi, M; Sakou, T (2007). Seaweed bioethanol

production in Japan. Oceans 2007.

28. Alves A., Sousa R. A. and Reis R. L. (2012) In vitro cytotoxicity assessment

of ulvan, a polysaccharide extracted from green algae. Phytotherapy Research,

10, p.4843.

29. Anastyuk S.D., Imbs T.I., Shevchenko N.M., Dmitrenok p.s. and

Zvyagintseva T.N. (2012) ESIMS analysis of fucoidan preparations from

Costaria costata, extracted from alga at different life-stages. Carbohydrẻ

Polym.,90, pp. 993-1002.

30. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L., Dmitrenok p.s. and

Zvyagintseva T.N. (2009) Structural analysis of a fucoidan from the brown

alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry.

Carbohydr. Res., 344, pp. 779-787.

133

31. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L., Imbs T.Iể, Dmitrenok p.s.

and Zvyagintseva T.N. (2010) Structural analysis of a highly sulfateed fucan

from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI mass

spectrometry. Carbohydr. Res., 345, pp. 2206-2212.

32. Anders S Carlsson, Jan B van Beilen, Ralf Moller and Divid Clayton,

(2007). Micro – and macro – Algae: Utility for industrial applicaion. CPL

Press, Tall Gables, The Sydings, Speen, Newbury, Berks RG14 1RZ, UK

33. Angulo Y, Lomonte B (2003) Inhibitory effect of fucoidan on the activities of

crotaline snake venom myotoxic phospholipases A2.Biochem Pharmacol

66:1993–2000.

34. Awad N.E., Motawe H.M., Selim M.A. and Matloub A.A. (2009)

Antitumourigenic polysaccharides isolated from the brown algaes Padina

pavonia (L.) Gaill and Hydroclathrus clathratus (C.A) Howe. Medicinal and

Aromatic Plant Science and Biotechnology, 3, pp. 6-11.

35. Balat M, Balat H. Recent trends in global production and utilization

of bio - ethanol fuel. Appl Energ 2009; 86(11): 2273e82.

36. Balk M., Heilig H.G. H. J., van Eekert M .H. A., Stams A. J. M., Rijpstra I.C.,

Sinninghe-Damsté J.S., de Vos W.M., and Kengen S.W.M. (2009), “Isolation

and characterization of a new CO-utilizing strain, Thermoanaerobacter

thermohydrosulfuricus subsp. carboxydovorans, isolated from a geothermal

spring in Turkey”, Extremophiles 13(6), Pages 885–894.

37. Benko Z., Andersson A., Szengyel Z., Gaspar M., Reczey K. and Stalbrand

H.(2007), “Heat extraction of corn fiber hemicellulose”, Applied Biochemistry

and Biotechnology, Volume 137-140, Numbers 1-12 / April.

38. Bilan M.I. and Usov A.I. (2008) Structural analysis of fucoidans. Nat. Prod.

Commun., 3, pp. 1639-1648.

39. Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S., Kelly M., Sanderson C.J., Nifantiev

N.E. and Usov A.I. (2010) Further studies on the composition and structure of

a fucoidan preparation from the brown alga Saccharina latissima. Carbohydr.

Res., 345, pp. 2038-2047.

40. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E.

134

and Usov A.I. (2002) Structure of a fucoidan from brown seaweed Fucus

evanesscens C.Ag. Carbohydrate Research, 337(8), pp. 719-730.

41. Bilan M.L, Vinogradova E.V., Tsvetkova E.A., Grachev A.A., Shashkov A.S.,

Nifantiev N.E. and Usov A.I. (2008) A sulfateed glucuronofucan containing

both fucofuranose and fucopyranose residues from the brown alga Chordaria

flagelliformis. Carbohydr. Res., 343, pp. 2605-2612.

42. Brock T.D., Brock K.M., Belly R.T., Weiss R.L. (1972), "Sulfolobus: a new

genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature",

Arch. Mikrobiol. 84 (1): 54–68.

43. Bui M.L., Nguyen D.N., Ngo Q.B. and Tran T.T.V (2005) Studies on fucoidan

and its production from Vietnamese brown seaweeds. Asean Journal on

Science and technology for Development, Vol 22, Isue 4, pp. 371-380.

44. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervarec N., Sinquin C., Fisher A.M.

and Boisson-Vidal C. (1999) Further data on the structure of brown seaweed

fucans: relationships with anticoagulant activity. Carbohydrate Research, 319,

pp. 154- 165.

45. Choosawad D., Leggat U., Dechsukhum C., Phonggdara A. and Chotigeat W.

(2005) Anti-tumour activities of fucoidan from the aquatic plant Utricularia

aurea lour. Songklanakarin J. Sci. Technol., 27 (3), pp. 799-807.

46. Churl Kim, Hyun Jin Ryu, Sang Hyoun Kim, Jeong – Jun Yoon, Hoon Sik

Kim and Yong Jin Kim, (2010). Acidity Tunable Ionic Liquids as Catalysts

for Conversion of Agar into Mixed Sugars. Bull. Korean Chem.Soc, Vol 31,

No 2 511

47. Conchie J. and Percival E. (1950) Fucoidin part II The hydrolysis of a methylated

fucoidin prepared from Fucus vesiculosus. J. Chem. Soc, pp. 827-833.

48. Cristina Chuck-Hernandez, Esther Perez-Carrillo, Sergio O. Serna- Saldivar,

(2009). Production of bioethanol from steam-flaked sorghum and maize.

Journal of Cereal Science, 50, 131-137.

49. Daniel R., Chevolot L., Carrascal M., Tissot B., Mourao P.A.S. and Abian J.

50. Daniel R.M., Peterson M.E., Danson M.J. (2010), "The molecular basis of the

effect of temperature on enzyme activity", Biochem Journal, 425 (2): 353–60.

135

51. Das S., Paul S., Bag S.K., Dutta C. (2006), "Analysis of Nanoarchaeum

equitans genome and proteome composition: indications for hyperthermophilic

and parasitic adaptation", BMC Genomics 7: 186.

52. Del Campo I, Alegria I, Zazpe M, Echeverria M, Echeverria I. Diluted acid

hydrolysis pretreatment of agri-food wates for bioethanol production. Ind Crop

Prod 2006;24:214e21.

53. Demain A. L., Newcomb M., Wu J. H. D. (2005), Cellulase, Clostridia, and

Ethanol, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69: 124-154.

54. Doi R. H. (2008), Cellulases of Mesophilic Microorganisms: Cellulosome and

Noncellulosome Producers, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1125: 267-279.

55. DuBok Choi, Heung Sun Sim, Yu Lan Piao, Wu Ying, Hoon Cho, (2009).

Sugar production from raw seaweed using the enzyme method. Industrial and

Engineering Chemistry, 15, 12-15.

56. Elifantz H., Malmstrom R. R., Cottrell M. T., Kirchman D. L. (2005),

“Assimilation of Polysaccharides and Glucose by Major Bacterial Groups in

the Delaware Estuary”, Appl. Environ. Microbiol. 71, Pages 7799-7805.

57. Fan L., Jiang L., Xu Y., Zhou Y., Shen Y., Xie W., Long Z. and Zhou J.

(2011) Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfatees.

Carbohydrate Polymers, Vol. 83, Issue 4, pp. 1797-1803.

58. Fukamizo T., Hayashi K., Tamoi M., Fujimura Y., Kurotaki H., Kulminskaya

A., Kitaoka M. (2008), “Enzymeatic hydrolysis of 1,3-1,4-β-glucosyl

oligosaccarits by 1,3-1,4-β-glucanase from Synechocystis PCC6803: A

comparison with assays using polymer and chromophoric oligosaccarit

substrates”, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 478, Issue 2,

Pages 187-194.

59. Guo GL, Chen WH, Men LC, Hwang WS. Characterization of dilute acid

pretreatment of slivergrass for ethanol production. Bioresour technol

2008;99:6046e53.

60. Guo Y., Wu G., Su X., Yang H. and Zhang J. (2009) Antiobesity action of a

daidzein derivative on male obese mice induced by a high-fat diet. Nutrition

Research, 29, pp. 656-663.

136

61. Henry Lyons, Yannick Lerat, Micheles Stanley, Michael Bo Rasmussen,

(2009). A review of the potential of marine algae as a source of biofuel in

Ireland. Sustanable energy Ireland (SEI).

62. Holtkamp A.D., Kelly S., Ulber R. and Lang S. (2009) Fucoidan and

fucoidanases-focus on techniques for molecular structure elucidation and

modification of marine polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol 82, pp. 1-11.

63. Huang Y., Krauss G., Cottaz S., Driguez H. and Lipps G.( 2005 ), “A highly

acid-stable and thermostable endo-b-glucanase from the thermoacidophilic

archaeon Sulfolobus solfataricus”, Biochem J. 385(Pt 2): 581–588.

64. Janson P.E., Kene H., Lidegren B. and Longren J. (1976) Structural analysis

of carbohydrates. Chem. Comm. Univ. Stockholm 8.

65. Jones B.E., Grant W.D., Duckwrth A.W., Schumann P., Weiss N. and

Stackebrandt E. (2005), “Cellulomonas bogoriensis sp. nov., an alkaliphilic

cellulomonad”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol 55, Pages 1711-1714.

66. Kazuhiko M., Hikaru W., Tômyuki N., Michio K., Hiroto C., Shigeharu F.,

Masashi K., Yoshio T. (2006), “Acceptor Specificity of Trehalose

Phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii: Production of Novel

Nonreducing Trisaccarit, 6-O-.ALPHA.-D-Galactopyranosyl Trehalose”,

Biosci Bioeng, Volume 101(5), Pages 385-390.

67. Kazunori Nakashima et al, (2011). Direct bioethanol product from cellulose

by the combination of cellulase-displaying yeast and ionic liquid pretreatment.

Green Chemistry, 13, 2948.

68. Klyosov A.A., Berezin I.V. (1981), “The Enzymeatic Conversion of

Carbohydrate to Glucose: Kinetics and Mechanism of Action of the Cellulase

Complex”, Cellulases of Microorganisms, Pages 73-82, Наука, Moscow.

69. Klyosov A.A., Churilova I.V. (1980), “Hydrolysis of Microcrystalline

Carbohydrate by Multienzyme Cellulase Complexes of Various Origin”,

Биохимия, 45, Pages 1685-1695.

70. Krish Purnawan Candra, Sarwono, Sarinah, (2011). Study on bioethanol

production using red seaweed Eucheuma cottonii from BonTang sea water.

Journal of Coastal Development, Vol 15, No 1, 45-50.

137

71. Kublanov I.V., Prokofeva M.I., Kostrinkina N.A., Kolganova T.V., Tourova

T.P., Wiegel J. and Bonch-Osmolovskaya E.A. (2007),

“Thermoanaerobacterium aciditolerans sp. nov., a moderate thermoacidophile

from a Kamchatka hot spring”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 57, 260-264.

72. Kumar A, Singh LK, Ghosh S. Bioconversion of lignocellulosic fraction of

water - hyacinth (Eichornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to

ethanol by Pichia stipitis. Bioresour technol 2009; 100: 3293e.

73. Kusaykin M., Bakunina I., Sova V., Ermakova S., Kuznetsova T., Besednova

N., Zaporozhets T. and Zvyagintseva T. (2008) Structure, biological activity,

and enzymeatic transformation of fucoidans from the brown seaweeds.

Biotechnol. J., 3 pp. 904-915

74. Kylin H. (1913) Biochemistry of sea algae. Phys. Chem., 83, pp. 171-197.

75. Lao P.J., Forsdyke D.R. (2000), "Hermophilic Bacteria Strictly Obey

Szybalski's Transcription Direction Rule and Politely Purine-Load RNAs ith

Boh Adenine and Guanine", Genome Res. 10 (10): 228–36.

76. Laurie-Eve Riouxa L. E., Turgeona S. L. and Beaulieub M. (2010) Structural

characterization of laminaran and galactofucan extracted from the brown

seaweed Saccharina longicruris. Phytochemistry, Volume 71, Issue 13, pp.

1586- 1595.

77. Leilei Ge, Peng Wang, Haijin Mou, (2011). Study on saccharification

techniques of seaweed wastes for the transformation of ethanol. Renewable

Energy, 36, 84-89.

78. Lenihan P., Orozco A., O’Neill E., Ahmad M.N.M., Rooney D.W. and Walker

G.M. (2010), “Dilute acid hydrolysis of lignocellulosic biomass”, Chemical

Engineering Journal, Volume 156, Issue 2, Pages 395-403 .

79. Lenihan P., Orozco A., O’Neill E., Ahmad M.N.M., Rooney D.W. and Walker

G.M. (2010), “Dilute acid hydrolysis of lignocellulosic biomass”, Chemical

Engineering Journal, Volume 156, Issue 2, Pages 395-403.

80. Lo Y-C., Bai M-D., Chen W-M., and Chang J-S. (2008), Cellulosic hydrogen

production with a sequencing bacterial hydrolysis and dark fermentation

strategy, Bioresources Technology 99, 8299-8303.

138

81. Makarenkova I.D., Deryabin P.G., Lvov D.K., Zvyagintseva T.N. and

Besednova N.N. (2010) Antiviral activity of sulfateed polysaccharide from the

brown algae Laminaria japónica against avian influenza A (H5N1) virus

infection in the cultured cells. Probl. Virol.,55, pp. 41—45.

82. Manish Gulati, Karen Kohlmann, Michael R. Ladisch, Robert Hespell &

Rodney J. Bothast, (1996). Assessment of ethanol production option for corn

products, 58, 253-264.20.

83. Marais M.F. and Joseleau J.P. (2001) A fucoidan fraction from Ascophyllum

nodosum. Carbohydrate Research, Volume 336, Issue 2, pp. 155-159.

84. Masahito Aizawa, Ken Asaoka, Masaya Atsumi, Toshitsugu Sakou, (2007).

Seaweed Bioethanol Production in Japan–The Ocean Sumrise Project.

85. Miller G.L. (1959), “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar”, Anal. Chem. 3, pp. 426-428. Phương pháp xác định glucose

bằng acid dinitro salicylic (DNS)

86. Miller I.J. and Blunt J.W. (2002) Evaluation of the structure of the

polysaccharides from Chondria macrocarpa and Ceramium rubrum as

determined by 13C-NMR spectroscopy. Bot. Mar., 45, pp. 1-8. 61

87. Mitsunori Yanagisawa, Kanami Nakamura, Osamu Ariga, Kiyohiko Nakasaki,

(2011). Production of high concentrations of bioethanol from seaweeds that contain

easily hydrolyzable polysaccharides. Process Biochemistry, 46, 2111-2116.

88. Mori, H., Kamei, H., Nishide, E., and Nisizawa, K. (1982), “Sugar

constituents of some sulfateed polysaccharides from the sporophylls of

wakame (Undaria pinnatifida) and their biological activities”, In

“Marinealgae in pharmaceutical science”, Walter de Gruyter, Berlin and New

York,109-121.

89. Mori, H., Kamei, H., Nishide, E., and Nisizawa, K. (1982), “Sugar

constituents of some sulfateed polysaccharides from the sporophylls of

wakame (Undaria pinnatifida) and their biological activities”, In “Marine

algae in pharmaceutical science”, Walter de Gruyter, Berlin and New York,

109-121.

139

90. Motabar O., Shi Z.D., Goldin E., Liu K., Southall N., Sidransky E., Austin C.P.,

Griffiths G.L., Zheng W. (2009), “A new resorufin-based alpha-glucosidase assay

for high-throughput screening”, Anal Biochem. 390(1), 79-84.

91. Murata Y. (2006), "Genome-wide expression analysis of yeast response during

exposure to 4C," Extremophiles 10, pp. 117–128.

92. Nagaoka, M., Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Hashimoto, S.,Kimura, K.,

Makino, T., Aiyama, R., Ueyama, S., and Yokokura, T. (1999), “Structural

study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida”. Glycoconj. J., 16

(1) 19-26.

93. Nakajima K., Hirota K., Nodasaka Y., Yumoto I. (2005), "Alkalibacterium

iburiense sp. nov., an obligate alkaliphile that reduces an indigo dye", Int J

Syst Evol Microbiol. 55 (Pt 4): 1525–30.

94. Nowlan B., Dodia M.S., Singh S.P., Patel B.K. (2006), "Bacillus okhensis sp.

nov., a halotolerant and alkalitolerant bacterium from an Indian saltpan", Int J

Syst Evol Microbiol. 56 (Pt 5): 1073–7.

95. O’Neill A.N. (1954) Degradative studies on fucoidan. J. Amer. Amer. Chem.

Soc., 76, pp. 5074-5076.

96. Ozdemir ED, Hardtlein M, Eltrop L. Land substitution effects of biofuel side

products and implications on the land area requirement for EU 2020 biofuel

targets. Energ Policy 2009; 37: 2986e96

97. Pason P., Kyu K. L., Ratanakhanokchai K. (2006), "Paenibacillus curdlanolyticus

Strain B-6 Xylanolytic-Cellulolytic Enzyme System That Degrades Insoluble

Polysaccharides”, Appl. Environ. Microbiol. 72: 2483-2490.

98. Pessoa A. J. R., Mancilha I.M., Sato S.(1997), ”Acid Hydrolysis of

hemicarbohydrate from sugarcane bagasse ”, Braz. J. Chem. Eng. vol. 14 no. 3 .

99. Pomin V.H. (2009) An overview about the structure-function relationship of

marine sulfateed homopolysaccharides with regular chemical structure.

Publised online 4.2009, Wiley InterScience.

100. Rajoka M. I. (2005), “Double Mutants of Cellulomonas biazotea for Production of

Cellulases and Hemicelluloses following Growth on Straw of a Perennial Grass”,

World Journal of Microbiology and Biotechnology 21(6-7):1063.

140

101. Ren N.Q., Cao G.L., Guo W.Q., Wang A.J., Zhu Y.H., Liu B.F., and Xu

J.F.(2010), “Biological hydrogen production from corn stover by moderately

thermophile Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16”, International

Journal of Hydrogen Energy, Volume 35, Issue 7, Pages 2708-2712.

102. Saha BC, Iten LB, Cotta MA, Wu YV. Dilute acid pretreatment, enzymeatic

saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochem

2005; 40:3693e700.

103. Sanaa A., Boulila A., Boussai M. and Fadhe N.B. (2013) Alginic acid and

derivatives, new polymers from the endangered Pancratium maritimum L.

Industrial Crops and Products, 44, pp. 290-293.

104. Sánchez ÓJ, Cardona CA. Trends in biotechnological production of fuel

ethanol from different feedstocks. Bioresour Technol 2007;99:5270e95.

105. Schwarz W. H .(2001), “The cellulosome and carbohydrate degradation by

anaerobic bacteria”, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 56,

Numbers 5-6 , 634-649.

106. Sheehan K.B., Patterson D. J., Dicks B. L., and Henson J.M. (2006). The

Microbes of Yellowstone. The Globe Pequot Press.

107. SJ Horn, IM Aasen and K Ostgaard, (2000). Ethanol product from seaweed

extract. Industrial Microbiology & Biotechnology, 25, 249-254.

108. Skriptsova A.V., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N. and Imbs T.I. (2010)

Monthly changes in the content and monosaccharide composition of fucoidan

from Undaria pinnatifida. J. Appl. Phycol., 22, pp. 79-86.

109. Sun J. X. and Sun R. C. (2004), “Isolation and characterization of cellulose

from sugarcane bagasse”, Journal Polymer Degradation and Stability

,Volume 84, Issue 2, Pages 331-339.

110. Sung-Soo Jang, Yoshihito Shiral, Motoharu Uchida and Minato Wakissaka,

(2012). Production of mono sugar from acid hydrolysis of seaweed. African

Journal of Biotechnology Vol. 11(8),pp. 1953-1963. 25

111. Suurs RAA, Hekkert MP. Competition between first and second generation

technologies: lessons from the formation of a biofuels innovation system in

The Netherlands. Energy 2009;34:669e79.

141

112. Svei Jarle Horn, (2000). Bioenergy from brown seaweeds. Department of

biotechnology Norwegian University of Science and Technology NTNU

Trondheim Norway.

113. Taherzadeh M. J., Karimi K. (2007), Acid-based hydrolysis processes for ethanol

from lignocellulosic materials, A review BioResources, 2(3), pp. 472-499.

114. Thanh T.T.T., Tran T.T.V., Yuguchi Y., Bui M.L. and Nguyen T.T. (2013)

Structure of Fucoidan from Brown Seaweed Turbinaria ornata as Studied by

Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESIMS) and Small Angle X-ray

Scattering (SAXS) Techniques. Mar. Drugs, 11, pp. 2431-2443.

115. Thanh T.T.T., Yasunaga H., Takano R., Urakawa H. and Kajiwara K. (2001)

Molecular characteristics and gelling properties of carrageenan family. 2:

Tri- sulfateed and tetra-sulfateed carrageenans. Polymer Bulletin. Vol.47,

ISSN: 1070- 0839, pp. 305-312.

116. Thanh T.T.T., Yuguchi Y., Mimura M., Yasunaga H., Takano R., Urakawa H.

and Kajiwara K. (2002) Molecular characteristics and Gelling Properties of

Carrageenan Family. 1: Preparation of novel carrageenan and dilute solution

properties. Macromolecular Chemistry and Physic. Vol.203, ISSN: 0122-

1352, pp. 15-23.

117. The World Wildlife Fund (2007). "Natural Wonder of the World Transformed

within Hours, says World Wildlife Fund", Earthtimes.org.

118. Tran T.H., Tran V.T. and Dinh Q.K. (2006) Composition and sequential

structure of alginate from brown seaweeds in Thua Thien-Hue province.

Journal of Chemistry and Application, 57(9), pp. 34-37.

119. Tran V.T., Chu D.K. Tran T.H. and Dinh Q.K. (2008) Characterization of

alginate prepared from brown seaweeds in Thua Thien-Hue province of

Vietnam. Asean Journal on Science and Technology for development, 25(2),

pp. 427-433.

120. Tsai S-L., Oh J., Singh S., Chen R., and Chen W. Functional assembly of

mini-cellulosomes on the yeast surface for carbohydrate hydrolysis and

ethanol production. Appl. Environ. Microbiol. 1,538-09 2009.

142

121. Tsao G.T., Ladisch M. R., Bose A.(1979), Acid hydrolysis of carbohydrate to

yield glucose, United States Patent 4174976 Publication.

122. Vauchel P., Kaas R., Arhaliass A., Baron R. and Legrand J. (2008) A new

process for extracting alginates from Laminaria digitata, Reactive Extrusion.

Food Bioprocess Technol 1, pp. 297-300.

123. Vergara-Fernández A, Vargas G, Alarcón N, Velasco A. Evaluation of marine

laminaria japonica as a source of biogas in a two-stage anaerobic reactor

system. Biomass Bioenerg 2007; 32:338e44

124. Volkov Y., Lunina N. A., Berezina O. V., Velikodvorskaya G. A. and Zverlov

V.V.(2005), “Thermoanaerobacter ethanolicus Gene Cluster Containing the α-

and β-Galactosidase Genes melA and lacA and Properties of Recombinant

LacA”.

125. Weber S., Stubner S., Conrad R. (2001), Bacterial Populations Colonizing and

Degrading Rice Straw in Anoxic Paddy Soil, Applied and Environmental

Microbiology, 67(3) , pp. 1318-1327.

126. Yamamoto T., Mukai K., Yamashita H., Kubota M., Fukuda S., Kurimoto M.,

Tsujisaka Y. (2005), “Enhancement of Thermostability of Kojibiose

Phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii ATCC3225047 by Random

Mutagenesis”. Journal of Bioscience and Bioengineering, 100(2), pp.212-215.

127. Zavarzina D.G., Kolganova T.V., Bulygina E.S., Kostrikina N.A., Turova

T.P., Zavarzin G.A. (2006), Geoalkalibacter ferrihydriticus gen. nov., sp. nov.,

the first alkaliphilic representative of the family Geobacteraceae, isolated from

a soda lake, Микробиология, 75(6), pp. 775–85.

128. Ziegelmann-Fjeld K. I., Musa M. M., Phillips R. S., Zeikus J. G. and Vieille

C.(2007), A Thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol

dehydrogenase mutant derivative highly active and stereoselective on

phenylacetone and benzylacetone, Protein Engineering Design and Selection,

20(2), pp. 47-55.

129. Коломиец Э. И., Лобанок А. Г. (2007), Микробные биотехнологии:

Фундаментальные и прикладные аспекты. Минск.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: RONG BIỂN

PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM