Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ÁÁllatkllatkíísséérletek az rletek az orvostudomorvostudomáánybannyban-- In vitroIn vitro
modellek modellek ééllőő áállatok llatok helyetteshelyettesííttéésséérere
Tuboly EszterSebészeti Műtéttani Intézet
Az alternatAz alternatíívváák szk szüükskséégessgesséégege• Élő modellek kiváltása
– Társadalmi megítélés, az igény egyre nő– Szervezeti fellépések– Törvényi szabályozás– Költségek, ellenőrzés
•• 2013. 03.112013. 03.11--ééttőől l Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését
– SEURAT-1 (50 millió €)
•• In vitro modellek elIn vitro modellek előőnyeinyei
– Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak– Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség– Sokszor szükségesek a publikáláshoz– Időmegtakarítás, elemszám
•• HHáátrtráányoknyok
– Nem feltétlenül költséghatékonyabb– Nem igazán életszerű– Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma)– Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem
alkalmas
A 3A 3 R:R:
• Replacement • Reduction• Refinement
Russell and Burch
A helyettesA helyettesííttéés egyre hats egyre hatéékonyabbkonyabb
LehetLehetőősséégek gek ééllőő áállatmodellek helyettesllatmodellek helyettesííttéésséérere
• Csak kémiai komponensek• Szöveti homogenizátum,
izolált organellum • Ex vivo kísérletek• Sejt-és szövetkultúrák• Mesterségesen növesztett
szövetek, szervek• Invazív beavatkozás
helyett kezelés
• Biokémiai tesztek• Immunkémiai technikák (bakteriális
toxinok azonosítására)• Szerv, szövet vagy sejtkultúrák
(biokémiai kutatások céljára)• Mikroorganizmusok (karcinogén ill.
mutagén anyagok tesztelésére)• Magasabbrendű növények• Néhány metazoa parazita• Komputer szimulációs modellek
SejttenySejttenyéésztsztééss• 1907 óta létező technika• ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás
– Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin
• Társaságok, sejt-és szövetbankok• Izolált-és mai napig fenntartott
sejtvonalak (HeLa)• Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése
(gyógyszergyártás)• Gén-és biotechnológia alappillére
(klónozás)• Rákkutatás (nanotechnológia)• Őssejt-és génterápia (etikai kérdések)• Szintetikus biológia (mesterséges
szervek, programozott sejtek)• Virológia (vakcinák készítése)
VizsgVizsgáálati lehetlati lehetőősséégekgek• Az adott sejt életfolyamatainak
nyomonkövetése (sejtanalízis)• sejt-sejt kölcsönhatások, a
sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok)• a sejtek különböző kémiai anyagokra adott
válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés)• különböző sejteredetű fehérje termékek
előállítására (biotechnológiai ipar) • “tissue engineering” céljára
• Sejttenyészetek eredete:• szöveti explantok ("explant kultúrák") • sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")
SejttenySejttenyéészetek tszetek tíípusaipusaiPrimer tenyészetek:
• embrionális ill. felnőtt szövetből• korlátozott ideig tarthatók fenn• élettartamuk véges (hetek,
néhány hónap)
• előnyük:– a sejtek nem tekinthetők módosított
ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri.
• hátrányuk: – a kultúrák korlátozott élettartama– minden egyes preparátum kicsit
eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk.
Sejtvonalak:
• abnormális, gyakran transzformált sejtek
• homogén sejtpopuláció• élettartamuk korlátlan• Leggyakrabban rákkutatási
célok• Könnyebb velük dolgozni, már
nem kell izolálni
Ami nAmi néélklküül nem megyl nem megy……• Laminaris fülke• HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít • Horizontális
– A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas
• Vertikális– A levegő felülről lefelé áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a
legalkalmasabb• CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom)• Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp
• Speciális tápfolyadék (médium)
• Ionikus homeosztázis
• Vitaminok, kofaktorok, fémek
• Fehérjék, lipidek• Energia• Szérum• Bakteriocid-fungicid
koktél
• Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés)
• Steril öltözet• UV-védelem• Speciális
tenyésztőedények• Saját eszközök• Vízfürdő,
hűtőszekrény• 70%-os alkohol• Dezinficiens
• A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk:
• Kollagen (kötőszöveti fehérje)• Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék)• Laminin (heteromer glycoprotein)• Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos
polimer)• Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav) • A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz
adott szuplementumok:• Foetal bovine vagy calf serum• Növekedési faktorok • Insulin
Alkalmas sejttAlkalmas sejttíípusokpusok• Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az
izom-és idegsejtek• Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem
osztódnak, rövid élettartam• Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak,
generációs idejük rövid,gyorsan nőnek• Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük,
gyorsan nőnek• Embrionális sejtek: jól szaporodnak,
kényesebbek• Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek,
rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)
SejtkultSejtkultúúra megvra megváálasztlasztáásasa• Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus,
sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt
• Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok• neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg
hibridómák, transzformált sejtek• Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés
üteme különböző• A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek
növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)
• Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter)
• Mosás, szűrés• Sejtek médiumba ágyazása, kezelése • Sejtnövesztés inkubátorban• Sejtszámolás időről-időre (ePetri)• Minden típus esetén szükséges a rendszer ki-
titrálása• Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra• Passzálás • Viabilitási-tesztek• Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)
A sejttenyA sejttenyéésztsztőő rréémmáálmalma……Befertőződés
• Kémiai anyagok által (lejárt médium)• Biológiai ágensek: baktériumok, gomba
(mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk)• Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus
aktivitást jelez a pH változása• Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és
mikrobiológiai vizsgálatot kérni• Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket• Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol• Félévente speciális takarítás ajánlott
ŐŐssejtek tulajdonsssejtek tulajdonsáágaigai
• képesek folyamatosan osztódni differenciálódás nélkül• stabil, diploid kromoszómakészletük van• külső hatásokra differenciálódhatnak és képesek
transzdifferenciálódni is, ez azt jelenti, hogy például a vérképző őssejtek képesek más ekto vagy endodermális sejttípussá alakulni, vagyis akár pluripotens is lehet
• telomeráz enzim megakadályozza a rövidülést – képes megnyújtani a kromoszómák végét: ennek az enzimnek az aktivitás az őssejtekben az idővel csökken, és az osztódással is
• majdnem halhatatlanok – az oxidatív folyamatok, genomiális DNS halmozódó mutációi, helyreállítómechanizmusok károsodása miatt ők is „öregszenek”
Honnan kaphatunk Honnan kaphatunk őőssejteket?ssejteket?
In vitro megtermékenyítés után fel nem használt embriók – akár totipotens
Elvetélt magzatokból – ivarmirigyekből
Szövetekből – korlátozott differenciálódási képességűek • vérképző őssejtek - csontvelőben találhatóak, felszíni markereik
alapján megtalálhatóak és izolálhatóak• mezenchima őssejtek-köldökzsinór
– Egyházi engedély• idegi őssejtek - az agykamrákat bélelő hámrétegben található• izom őssejteket - valószínűleg az izomrostokhoz szorosan kötődő
ún. kísérő (szatellita) sejtek között• Alig jelölődnek meg Hoechst 33342-es nevű fluoreszcens festékkel• Áramlási citométer segítségével izolálhatóak
SzSzöövettenyvettenyéésztsztééss• Sejtek szövetekként történő növesztése egy
speciális vázon (scaffold)• Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes
szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját• Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt
terápia • Fontos az immunrendszer válaszának
minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek
• Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk)
• Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)
ScaffoldScaffold• Hálózatos polymer, különböző anyagokból
készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid)
• Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni
• Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját
• Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet
• Megengedi a sejtek migrációját
Egy ideEgy ideáális scaffoldlis scaffold……• 3D• Keresztkötéseket tartalmaz• Pórusokat tartalmaz• Biológiailag lebontható• Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a
felszínén• Bírja a mechanikai terhelést• Biokompatibilis• Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat• Hozzáférhető• Nagyüzemben gyártható
Leggyakoribb tLeggyakoribb tíípusokpusok
• Polymerek– Kollagén– Laminin– Fibrin– Decellularized matrix (szív)
• Kristályos anyagok– Hydroxyapatite– Kálcium-foszfát– Bioglass
Elkopott porcok helyettesElkopott porcok helyettesííttéésese
– Porcsejtek– Kollagén váz– Nem igényel kiterjedt
érhálózatot
CsontnCsontnöövesztvesztééss
• Őssejtek csontsejtekkétörténődifferenciálódásával– A parancs növekedési
faktor függő• Nem szabad túl
nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént
3D Calcium- scaffold
BBőőrnrnöövesztvesztééss• Kollagén-kitozán,
vagy hialuronsav scaffold
• Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg
• Égési sérülteknél siker
Cukorbetegek Cukorbetegek ßß--sejtjeinek psejtjeinek póótltláásasaIn vivo Islet of Langerhans in pancreas
MestersMestersééges ges vvééredredéényeknyek
• By-pass műtéteknél használatos http://popularmechanics.com/popmec
h/sci/tech/9805TUMDOM.html
SzSzíív regenerv regeneráácicióójaja
• Szívizomsejt, véredények
• Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes
• Természetes scaffold (decellularized matrix)
• Sokféle sejttípus, bonyolult terület
LehetLehetőősséégek mgek máájbetegeknekjbetegeknek
BioprintingBioprinting• Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem)• Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele• Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket,
több rétegben, körben is (3D)• 2 nyomtatófejet használ: sejtek
nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása
• Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít• Véredények by-pass műtétekhez• Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása,
bőrpótlás, mint rutin kezelés
SkingunSkingun
In vitro In vitro meatmeat
KKööszszöönnööm szm széépen!!!pen!!!